JPS63169992A - 好塩菌による５′−ヌクレオチド類の製造法 - Google Patents
好塩菌による５′−ヌクレオチド類の製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、好塩菌による５゛−ヌクレオチド類の製造法
に関孝゛る。更に９本発明は、５゛−ヌクレオチド類の
更なる酵素分解を防止した効率的な５°−ヌクレオチド
類の製造方法に１刃する。
に関孝゛る。更に９本発明は、５゛−ヌクレオチド類の
更なる酵素分解を防止した効率的な５°−ヌクレオチド
類の製造方法に１刃する。
［従来の技術］
５゛−リボヌクレオチド類は調味料或いは医薬原料など
に有用であり、リボ核酸を原料にし、５′−フォスフオ
シエステラーゼを単独に、又は、５゛−フォスフオシエ
ステラーゼと５′−アデニノし酸デアミナーゼを働かせ
て酵素的に５゛−リボヌクレオチド類［即ち、５゛−ア
デニル酸、５′−グアニル酸。
に有用であり、リボ核酸を原料にし、５′−フォスフオ
シエステラーゼを単独に、又は、５゛−フォスフオシエ
ステラーゼと５′−アデニノし酸デアミナーゼを働かせ
て酵素的に５゛−リボヌクレオチド類［即ち、５゛−ア
デニル酸、５′−グアニル酸。
５゛−シチジル酸、５゛−ウリジル酸、そして５′−ア
デニル酸デアミナーゼを併用する場合は５′−イノシン
酸をも入る］を製造する方法は既に知られている（特公
昭３６−４９７７号、特公昭３６−５２８７号、特公昭
３６−１６６３０号）。
デニル酸デアミナーゼを併用する場合は５′−イノシン
酸をも入る］を製造する方法は既に知られている（特公
昭３６−４９７７号、特公昭３６−５２８７号、特公昭
３６−１６６３０号）。
一方、中度好塩性菌ミクロコツカス パリアンス サブ
スピーシーズ ハロフィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｖａｒｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｂａｌｏｐｈｉｌｕ
ｓ）（ＡｒＣＣ２１９７１）は。
スピーシーズ ハロフィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｖａｒｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｂａｌｏｐｈｉｌｕ
ｓ）（ＡｒＣＣ２１９７１）は。
菌体外に好塩性酵素ヌクレオチドを生成し、この酵素は
エキソ型分解で末端からリボ核酸を逐次分解して５′−
ヌクレオチド類を生成することができる。また、この菌
は、培地中に適量の無機燐酸とＭｇ１又はＣａ”イオン
を添加して培養す°ることにより菌体のフロックを形成
し、更に培養中に生成された好塩性酵素はフロック表面
に吸着されて、フロック自体が一種の固定化酵素となる
ことが知られている。従って、培養液中の好塩性ヌクレ
アーゼ又は好塩性ヌクレアーゼを吸着したフロックを用
いて、リボ核酸の分解反応による５゛−リボヌクレオチ
ドの生産が可能である。
エキソ型分解で末端からリボ核酸を逐次分解して５′−
ヌクレオチド類を生成することができる。また、この菌
は、培地中に適量の無機燐酸とＭｇ１又はＣａ”イオン
を添加して培養す°ることにより菌体のフロックを形成
し、更に培養中に生成された好塩性酵素はフロック表面
に吸着されて、フロック自体が一種の固定化酵素となる
ことが知られている。従って、培養液中の好塩性ヌクレ
アーゼ又は好塩性ヌクレアーゼを吸着したフロックを用
いて、リボ核酸の分解反応による５゛−リボヌクレオチ
ドの生産が可能である。
然し乍ら、この菌の生成する酵素には、５゛−ヌクレオ
チド類を分解して５゛−ヌクレオシド類を生成する酵素
（５゛−ヌクレオチダーゼ）が共存するために、リボ核
酸の分解により５′−ヌクレオチド類を生産する場合に
５゛−ヌクレオチド類の生産効率が著しく低下し、効率
的な５゛−ヌクレオチド類の生産が行なえないという問
題がある。
チド類を分解して５゛−ヌクレオシド類を生成する酵素
（５゛−ヌクレオチダーゼ）が共存するために、リボ核
酸の分解により５′−ヌクレオチド類を生産する場合に
５゛−ヌクレオチド類の生産効率が著しく低下し、効率
的な５゛−ヌクレオチド類の生産が行なえないという問
題がある。
［発明が解決しようとする問題点］
本発明者らは、上述のような従来技術の問題点を解決す
べく鋭意研究したところ、共存する５゛−メクレチＡダ
ーゼの酵素活性を阻害し、５゛−ヌクレオチド類の分解
反応を阻止する適当な添加剤をリボ核酸の分解反応系中
に添加して、効率良く５゛−ヌクレオチド類を生産する
ことができることを見出した。従って２本発明は、適当
な添加剤を添加することにより効率的なリボ核酸の酵素
分解による５゛−ヌクレオチド類の製造方法を提供する
ことを［Ｊ的とする。更に１本発明は、他の微生物によ
るコンタミネーションを肪止しながら、リボ核酸の分解
反応を行なうことのできる５゛−ヌクレオチド類の製造
方法を提供することを目的とする。
べく鋭意研究したところ、共存する５゛−メクレチＡダ
ーゼの酵素活性を阻害し、５゛−ヌクレオチド類の分解
反応を阻止する適当な添加剤をリボ核酸の分解反応系中
に添加して、効率良く５゛−ヌクレオチド類を生産する
ことができることを見出した。従って２本発明は、適当
な添加剤を添加することにより効率的なリボ核酸の酵素
分解による５゛−ヌクレオチド類の製造方法を提供する
ことを［Ｊ的とする。更に１本発明は、他の微生物によ
るコンタミネーションを肪止しながら、リボ核酸の分解
反応を行なうことのできる５゛−ヌクレオチド類の製造
方法を提供することを目的とする。
［発明の構成］
［問題点を解決するための手段］
本発明の要旨は、リボ核酸の酵素分解反応により５゛−
ヌクレオチド類を製造する方法において。
ヌクレオチド類を製造する方法において。
共存する５゛−ヌクレオチダーゼによる５゛−ヌクレオ
チド類の分解反応を抑制するために、中度好塩菌ミクロ
コツカス パリアンス サブスピーシーズ ハ（ｆｆフ
ィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓ ５
ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９
７１）の生産する好塩性酵素系を０．０５ｍＭ以上のＺ
ｎ”イオンの存在下で、５゛−ヌクレオチダーゼの活
性を抑制して前記分解反応を行なうことを特徴とする５
゛−ヌクレオチド類の製造法である。
チド類の分解反応を抑制するために、中度好塩菌ミクロ
コツカス パリアンス サブスピーシーズ ハ（ｆｆフ
ィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓ ５
ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９
７１）の生産する好塩性酵素系を０．０５ｍＭ以上のＺ
ｎ”イオンの存在下で、５゛−ヌクレオチダーゼの活
性を抑制して前記分解反応を行なうことを特徴とする５
゛−ヌクレオチド類の製造法である。
本発明によると、中度好塩菌ミクロコツカスパリアンス
サブスピーシーズ ハロフィラス（Ｍｘｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖａｒｉａａｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈ
ｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）の生産する好塩性酵
素ヌクレアーゼの作用により、リボ核酸を分解して５′
−ヌクレオチド類を製造する場合に、共存する５゛−ヌ
クレオチダーゼの作用による５゛−ヌクレオチド類の分
解反応を抑制、阻止するために反応液中に適量のＺ ｎ
”イオンを添加するものである。これにより５゛−ヌ
クレオチド類の生産効率を向上せしめるものである。
サブスピーシーズ ハロフィラス（Ｍｘｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖａｒｉａａｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈ
ｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）の生産する好塩性酵
素ヌクレアーゼの作用により、リボ核酸を分解して５′
−ヌクレオチド類を製造する場合に、共存する５゛−ヌ
クレオチダーゼの作用による５゛−ヌクレオチド類の分
解反応を抑制、阻止するために反応液中に適量のＺ ｎ
”イオンを添加するものである。これにより５゛−ヌ
クレオチド類の生産効率を向上せしめるものである。
本発明者らは、中度好塩菌ミクロコツカス パリアンス
サブスピーシーズ ハロフィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖａｒｔａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈ
ｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）の生産する好塩性酵
素系のうらの５゛−ヌクレオチダーゼの活性のみを選択
的に抑制する阻止剤について数多くの実験研究を重ねた
結果 Ｚ ｎ Ｒ４イオンが最も効果的であることを発
見した。この現象を用いることにより、中度好塩菌ミク
ロ：１ツカス パリアンス サブスピーシーズ ハロフ
ィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓ ５
ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９
７１）の生産する好塩性酵素中の５゛−ヌクレオチダー
ゼの活性を抑制阻止してリボ核酸の前記分解反応を行な
うと、効率良く５°−ヌクレオチド類を製造できた。
サブスピーシーズ ハロフィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｖａｒｔａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈ
ｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）の生産する好塩性酵
素系のうらの５゛−ヌクレオチダーゼの活性のみを選択
的に抑制する阻止剤について数多くの実験研究を重ねた
結果 Ｚ ｎ Ｒ４イオンが最も効果的であることを発
見した。この現象を用いることにより、中度好塩菌ミク
ロ：１ツカス パリアンス サブスピーシーズ ハロフ
ィラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓ ５
ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９
７１）の生産する好塩性酵素中の５゛−ヌクレオチダー
ゼの活性を抑制阻止してリボ核酸の前記分解反応を行な
うと、効率良く５°−ヌクレオチド類を製造できた。
中度好塩菌ミクロフッカス パリアンス サブスピーシ
ーズ ハｏ ｙ イラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖ
ａｒｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）
（ＡＴＣＣ２１９７１）の生産する好塩性酵素系は、培
地組成により、菌体外に生産された酵素が培養液中に存
在する場合（ｍ離型）と。
ーズ ハｏ ｙ イラス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖ
ａｒｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）
（ＡＴＣＣ２１９７１）の生産する好塩性酵素系は、培
地組成により、菌体外に生産された酵素が培養液中に存
在する場合（ｍ離型）と。
培地中に適量添加した無機燐酸とＭｇＩイオン又はｃａ
”イオンにより培養中に菌体がフロックを形成し、生産
された好塩性酵素がこの菌体フロック表面に吸着されて
いる場合（フロック型）の２通りの形態がある。この２
通りの形態の好塩性酵素に対する本発明による処理方法
を示す。
”イオンにより培養中に菌体がフロックを形成し、生産
された好塩性酵素がこの菌体フロック表面に吸着されて
いる場合（フロック型）の２通りの形態がある。この２
通りの形態の好塩性酵素に対する本発明による処理方法
を示す。
以下の実施例でこの２通りの形態に対する処理法につい
て説明するが１本発明はこれらの実施例により限定され
るものではない。
て説明するが１本発明はこれらの実施例により限定され
るものではない。
［実施例１−Ｔ１＃型酵素の場合］
遊離型酵素は、３ＭのＮａＣ１，カザミノ酸（Ｄｉｆｃ
ｏ）１．０％、酵ｆｌ ｙ−キス（Ｄｉｆｃｏ） １．
、０％からなる培地（ｐＨ７，０）で、３０°Ｃ，４
日間、中度好塩菌ミクロコツカス パリアンス サブス
ピーシーズ ハロフィラス（Ｍｔｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｖａｒｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ
）（ＡＴＣＣ２１９７ｔ）を培養後、５℃で１０．００
０ｒｐｍ＋。
ｏ）１．０％、酵ｆｌ ｙ−キス（Ｄｉｆｃｏ） １．
、０％からなる培地（ｐＨ７，０）で、３０°Ｃ，４
日間、中度好塩菌ミクロコツカス パリアンス サブス
ピーシーズ ハロフィラス（Ｍｔｃｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｖａｒｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ
）（ＡＴＣＣ２１９７ｔ）を培養後、５℃で１０．００
０ｒｐｍ＋。
１０分間遠心分離して得られた培養液上澄みを用いる。
培養液中に生成された好塩性ヌクレアーゼ及び好塩性５
゛−ヌクレオチダーゼの酵素活性に及ぼすＺｎ”（Ｚｎ
ＳＯ□）濃度の影響を調査した。その結果を第１図に示
す。
゛−ヌクレオチダーゼの酵素活性に及ぼすＺｎ”（Ｚｎ
ＳＯ□）濃度の影響を調査した。その結果を第１図に示
す。
ここでヌクレアーゼの活性測定法は、０．４ｍｆｆ１の
リボ核酸（Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ Ｘｌ、 １．２５ｍ
ｇ／ Ｒ）、 ０ 、４ ｍＰの０ 、１ ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（４ＭＮａ（１！含有、ｐＨ８，０）、
０．１ｍｆｆ１の２０％Ｍｇ ＳＯ，−７Ｈ，Ｏ溶液及
び０．１ｍｆｆ１の各種濃度のＺ ｎ Ｓ Ｏａ溶液か
らなる反応液Ｌ ｍ ｌに、酵素０．１ｍｆｆ１を添加
して４０°Ｃで２時間反応を行い１反応終了後に、３ｍ
！の９９．５％エタノールを添加して氷水中で１５分間
静置し、その後、３５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し
た上澄液の吸光度を２６゜ｒａｍで測定した。ここで、
ヌクレアーゼ活性ノ１単位（Ｕ）は、上記の条件下で吸
光度を１だけ増加させるのに要する酵素量とした。
リボ核酸（Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ Ｘｌ、 １．２５ｍ
ｇ／ Ｒ）、 ０ 、４ ｍＰの０ 、１ ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（４ＭＮａ（１！含有、ｐＨ８，０）、
０．１ｍｆｆ１の２０％Ｍｇ ＳＯ，−７Ｈ，Ｏ溶液及
び０．１ｍｆｆ１の各種濃度のＺ ｎ Ｓ Ｏａ溶液か
らなる反応液Ｌ ｍ ｌに、酵素０．１ｍｆｆ１を添加
して４０°Ｃで２時間反応を行い１反応終了後に、３ｍ
！の９９．５％エタノールを添加して氷水中で１５分間
静置し、その後、３５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し
た上澄液の吸光度を２６゜ｒａｍで測定した。ここで、
ヌクレアーゼ活性ノ１単位（Ｕ）は、上記の条件下で吸
光度を１だけ増加させるのに要する酵素量とした。
５°−ヌクレオチダーゼの活性測定法は、０．０５ｍｌ
の５゛−アデニル酸（２Ｑ＋ａｇ／ｍｆｆ１＞、０．８
ｍｆ！。
の５゛−アデニル酸（２Ｑ＋ａｇ／ｍｆｆ１＞、０．８
ｍｆ！。
の０ 、 Ｉ ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（４ＭＮａＣ
ｆｆｉ含有、１）Ｈ８，Ｏ）、０．０５ｍｌの２ｍＭの
ＣｏＣＲ２溶液、０．０５ｍｆｆ１の４０％Ｍｇ５Ｏ，
−７Ｈ，０溶液及び０．０５ｍｊ２の蒸留水からなる反
応液１ｍｌに、酵素液０．１ｍｊ！を添加して３０℃と
で４時間反応浮せた後に、２ＮＨ，ＳＯ，： ２．５％
（ＮＨ４）ａＭ Ｏ？Ｏ＊１−４ ＨＩＯ： １０％ア
ス′：Ｊルピン酷−３：１：１（Ｖ／Ｖ）の混合液１．
１ｍｊ！を添加し、４０°Ｃで９０分間反応させた後、
８２０ｎｍの吸光度を測定する。５゛−ヌクレオグ・ダ
ーゼ活性ｔ ＲＬ位（Ｕ）は、上記の条件下で、吸光度
を１だけ増加させるのに要する酵素量とした。
ｆｆｉ含有、１）Ｈ８，Ｏ）、０．０５ｍｌの２ｍＭの
ＣｏＣＲ２溶液、０．０５ｍｆｆ１の４０％Ｍｇ５Ｏ，
−７Ｈ，０溶液及び０．０５ｍｊ２の蒸留水からなる反
応液１ｍｌに、酵素液０．１ｍｊ！を添加して３０℃と
で４時間反応浮せた後に、２ＮＨ，ＳＯ，： ２．５％
（ＮＨ４）ａＭ Ｏ？Ｏ＊１−４ ＨＩＯ： １０％ア
ス′：Ｊルピン酷−３：１：１（Ｖ／Ｖ）の混合液１．
１ｍｊ！を添加し、４０°Ｃで９０分間反応させた後、
８２０ｎｍの吸光度を測定する。５゛−ヌクレオグ・ダ
ーゼ活性ｔ ＲＬ位（Ｕ）は、上記の条件下で、吸光度
を１だけ増加させるのに要する酵素量とした。
第１図に示されるように、遊離型のヌクレアーゼ及び５
゛−ヌクレオチダーゼの両酵素活性に対するＺ ｎ ”
イオン添加の影響は、ヌクレアーゼに比較して５″−ヌ
クレオチダーゼの方が低濃度のＺｎ■イオン添加で活性
が抑制阻害されるのが明らかである。然し乍ら、Ｚｎ”
イオンが５ｍＭ以上で＋ｔ ヌクレアーゼ活性も失なわ
れるものである。従って、この５ｍＭ以下のＺｎ”添加
が有効である［実施例２−フロック酵素の場合］ フロ７り酵素は、３ＭＮａＣり、カザミノ酸（Ｄｉｆｃ
ｏ） Ｌ 、 ０％、酵ｆ＝Ｊエキス（Ｄｉｆｃｏ）
１ 、０％、８０ｍＭＭ ｇ Ｓ Ｏａ 、 ９ ｍ
Ｍ Ｋ Ｈｒ Ｐ Ｏａからなる培地（ｐＨ７゜０）で
、３０℃、４日間、中度好塩菌ミクロコツカスパリアン
ス サブスピーシーズ ハロブイラス（Ｍｉｃｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｖａｒｔａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）を培養後、５℃
で８．００ Ｏｒｐｍ＋、１０分間遠心分離してフロッ
クを集め、これを培養液と同情の７５ ｍ ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（３ＭＮａＣｊ！ 。
゛−ヌクレオチダーゼの両酵素活性に対するＺ ｎ ”
イオン添加の影響は、ヌクレアーゼに比較して５″−ヌ
クレオチダーゼの方が低濃度のＺｎ■イオン添加で活性
が抑制阻害されるのが明らかである。然し乍ら、Ｚｎ”
イオンが５ｍＭ以上で＋ｔ ヌクレアーゼ活性も失なわ
れるものである。従って、この５ｍＭ以下のＺｎ”添加
が有効である［実施例２−フロック酵素の場合］ フロ７り酵素は、３ＭＮａＣり、カザミノ酸（Ｄｉｆｃ
ｏ） Ｌ 、 ０％、酵ｆ＝Ｊエキス（Ｄｉｆｃｏ）
１ 、０％、８０ｍＭＭ ｇ Ｓ Ｏａ 、 ９ ｍ
Ｍ Ｋ Ｈｒ Ｐ Ｏａからなる培地（ｐＨ７゜０）で
、３０℃、４日間、中度好塩菌ミクロコツカスパリアン
ス サブスピーシーズ ハロブイラス（Ｍｉｃｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｖａｒｔａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏ
ｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）を培養後、５℃
で８．００ Ｏｒｐｍ＋、１０分間遠心分離してフロッ
クを集め、これを培養液と同情の７５ ｍ ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液（３ＭＮａＣｊ！ 。
２％Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ・７ Ｈ＊ Ｏ、ｐ Ｈ８、０）
に懸濁した後に再遠心分離をしてフロχりを集め、この
フロックを同一の緩衝液に再び懸濁したものを用いた。
に懸濁した後に再遠心分離をしてフロχりを集め、この
フロックを同一の緩衝液に再び懸濁したものを用いた。
この酵素液のヌクレアーゼ及び５゛−ヌクレオチダーゼ
の酵素活性に及ぼすＺｎ”（ＺｎＳＯｔ）濃度の影響を
前述した活性測定法によって調査した。その結果を第２
図に示す。
の酵素活性に及ぼすＺｎ”（ＺｎＳＯｔ）濃度の影響を
前述した活性測定法によって調査した。その結果を第２
図に示す。
第２図に示すように、フロック表面に吸着された酵素の
場合もＴ１離型と回様に、ヌクレアーゼよりも５°−ヌ
クレオチダーゼの方が低濃度のＺ ｎ ”添加で活性が
抑制阻害されることが明らかである。
場合もＴ１離型と回様に、ヌクレアーゼよりも５°−ヌ
クレオチダーゼの方が低濃度のＺ ｎ ”添加で活性が
抑制阻害されることが明らかである。
第１図及び第２ＩＸＪの結果からＺｎ”の添加驕は、約
０．０５ｍＭ以上が最も効果的であることが分かる。そ
れ以下であるとヌクレアーゼの活性と５°−ヌクレオチ
ダーゼの残存活性の差が顕著でなく、実用的でないと思
われる。従って、遊離型及びフロック体吸着のいずれの
酵素の場合でもリボ核酸の分解反応時に、特に、０．０
５ｍＭ以上のＺｎ”イオンを添加することにより、ヌク
レアーゼと５゛−ヌクレオチダーゼの活性に対する阻害
効果の差を利用して、効率良く５゛−ヌクレオチド類を
生産することを可能にするものである。
０．０５ｍＭ以上が最も効果的であることが分かる。そ
れ以下であるとヌクレアーゼの活性と５°−ヌクレオチ
ダーゼの残存活性の差が顕著でなく、実用的でないと思
われる。従って、遊離型及びフロック体吸着のいずれの
酵素の場合でもリボ核酸の分解反応時に、特に、０．０
５ｍＭ以上のＺｎ”イオンを添加することにより、ヌク
レアーゼと５゛−ヌクレオチダーゼの活性に対する阻害
効果の差を利用して、効率良く５゛−ヌクレオチド類を
生産することを可能にするものである。
尚、Ｚｎ”源としては、 Ｚ ｎ Ｓ Ｏａに限らず。
Ｚ ｎ Ｃｊ！ １等のＺｎ含有塩を利用できる。
次にフロック体酵素を用いてリボ核酸を分解する実施例
を説′明するが１本発明の方法はこれにより限定される
ものではない。
を説′明するが１本発明の方法はこれにより限定される
ものではない。
［実施例３：５′−ヌクレオチド類の製造法］前述の培
養方法で得られたフロック体の酵素液（ヌクレアーゼ活
性−２７、６Ｕ／ｒｎｊ！、５ ’−ヌクレオチダーゼ
活性−７２．６Ｕ／ｍｆｆ１）を、水切りしたセライト
（Ｃｅｌｉｔｅ）５４５をフロック体酵素液［ｍｊ！］
：セライト５４５［ｇｌ−１２，５： １の割合で混合
したものを内径１１ｍｍのジャケット付きガラス製カラ
ムに１４ｃｍ充填し、この）ｒＪツク体酵素の充填カラ
ムを２系列作成した。ここで、１系列はリボ核酸の分解
反応時にＺ ｎ ”を０．２５ｍＭ添加した系であり、
他方はＺｎ″′″を添加しない系である。
養方法で得られたフロック体の酵素液（ヌクレアーゼ活
性−２７、６Ｕ／ｒｎｊ！、５ ’−ヌクレオチダーゼ
活性−７２．６Ｕ／ｍｆｆ１）を、水切りしたセライト
（Ｃｅｌｉｔｅ）５４５をフロック体酵素液［ｍｊ！］
：セライト５４５［ｇｌ−１２，５： １の割合で混合
したものを内径１１ｍｍのジャケット付きガラス製カラ
ムに１４ｃｍ充填し、この）ｒＪツク体酵素の充填カラ
ムを２系列作成した。ここで、１系列はリボ核酸の分解
反応時にＺ ｎ ”を０．２５ｍＭ添加した系であり、
他方はＺｎ″′″を添加しない系である。
Ｚｎ”を添加してリボ核酸を分解する系は、２ｎ Ｉ＋
を含有する２ ５ ｍ ＭＴｒｉｓ −ＨＣｊ！緩衝樹
液（２ＭＮａＣｊ！、０．２５ｍＭＺｎ ＳＯ，・７Ｈ
，０，２％Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ・７ Ｈｓ Ｏ、ｐ Ｈ８
、０）を流してカラムを十分に平衡化した後、リボ核酸
を１％濃度となるように緩衝液■に溶かした基質溶液Ｉ
ｏｎｌをカラム上端から流し、その後、緩衝液ｌを流し
て洗浄した。カラム内の液流速は、ｘｏｍｆｆｉ／時間
で、カラム下端からの溶出液を２ｇ／チューブのフラク
ションに分画分取した。尚１分解反応温度は、５０℃で
一定とした。
を含有する２ ５ ｍ ＭＴｒｉｓ −ＨＣｊ！緩衝樹
液（２ＭＮａＣｊ！、０．２５ｍＭＺｎ ＳＯ，・７Ｈ
，０，２％Ｍ ｇ Ｓ Ｏａ・７ Ｈｓ Ｏ、ｐ Ｈ８
、０）を流してカラムを十分に平衡化した後、リボ核酸
を１％濃度となるように緩衝液■に溶かした基質溶液Ｉ
ｏｎｌをカラム上端から流し、その後、緩衝液ｌを流し
て洗浄した。カラム内の液流速は、ｘｏｍｆｆｉ／時間
で、カラム下端からの溶出液を２ｇ／チューブのフラク
ションに分画分取した。尚１分解反応温度は、５０℃で
一定とした。
Ｚ ｎ ”を添加しないリボ核酸分解系は、２５ｍＭＴ
ｒｉｓ −ＨＣｌ ＊樹液夏（２ＭＮａＣｊ！、２％Ｍ
ｇ５Ｏ，・７ Ｈ＊Ｏ，ｐ Ｈ８、０）をカラムに流し
、充分に平衡化した後、リボ核酸を１％濃度となるよう
に緩衝液Ｉに溶かした基質溶液１０ｍ１を流し、その後
緩衝液Ｉを流して、Ｚｎ”添加系と同様に分画フラクシ
ョンを得た。
ｒｉｓ −ＨＣｌ ＊樹液夏（２ＭＮａＣｊ！、２％Ｍ
ｇ５Ｏ，・７ Ｈ＊Ｏ，ｐ Ｈ８、０）をカラムに流し
、充分に平衡化した後、リボ核酸を１％濃度となるよう
に緩衝液Ｉに溶かした基質溶液１０ｍ１を流し、その後
緩衝液Ｉを流して、Ｚｎ”添加系と同様に分画フラクシ
ョンを得た。
両系列の分画フラクション中で最もリポ核酸分解物の濃
度の高いフラクションを選び、Ｚｎ−添加及び無添加の
それぞれの系でのリボ核酸の分解率及び５゛−ヌクレオ
チド類、ヌクレオシド類の量を測定した。
度の高いフラクションを選び、Ｚｎ−添加及び無添加の
それぞれの系でのリボ核酸の分解率及び５゛−ヌクレオ
チド類、ヌクレオシド類の量を測定した。
その結果を第１表に示すが、Ｚｎ”を添加した方が、５
゛−ヌクレオチド類の含有量が多く、ｓ’−ヌクレオチ
ド類の分解により生じるヌクレオシド類（アデノシン、
グアノシン、シチジン、ウリジン）の址は少な（Ｉ Ｚ
ｎ ”添加の効果が認められた。特に、呈味性成分で
ある５゛−グアニル酸は。
゛−ヌクレオチド類の含有量が多く、ｓ’−ヌクレオチ
ド類の分解により生じるヌクレオシド類（アデノシン、
グアノシン、シチジン、ウリジン）の址は少な（Ｉ Ｚ
ｎ ”添加の効果が認められた。特に、呈味性成分で
ある５゛−グアニル酸は。
無添加の場合は、完全にグアノシンにまで分解してしま
うが、これに対して本発明のＺ ｎ ”添加を行なう５
゛−ヌクレオチド類の製造法によると分解液中に蓄積し
、Ｚｎ”添加による５゛−ヌクレオチド類の生産効率を
著しく高めたことが認められた。
うが、これに対して本発明のＺ ｎ ”添加を行なう５
゛−ヌクレオチド類の製造法によると分解液中に蓄積し
、Ｚｎ”添加による５゛−ヌクレオチド類の生産効率を
著しく高めたことが認められた。
尚１本実施例では、フロック体酵素をカラムに充填した
製造方法を示したが、遊離型の酵素或いはフロック体酵
素の酵素溶液を、容器中においてリボ核酸と反応させて
も、Ｚｎ”添加による５゛−ヌクレオチド類の効率的な
生産が可能であることは、当然のことながら実現される
。
製造方法を示したが、遊離型の酵素或いはフロック体酵
素の酵素溶液を、容器中においてリボ核酸と反応させて
も、Ｚｎ”添加による５゛−ヌクレオチド類の効率的な
生産が可能であることは、当然のことながら実現される
。
以下余白
第１表 リボ核酸分解生成物
“ は、サンプル・フラクション中の濃度で示す。
以下余白
［発明の効果］
本発明の５°−ヌクレオチド類の製造方法において、中
度好塩菌ミグ１ｊコ／カス パリアンス サブスピーシ
ーズ ハロフイシス（Ｍｉｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒ
ｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（Ａ
ＴＣＣ２１９７１）が生産する好塩性ヌクレアーゼ酵素
系を用いてリボ核酸の分解を行なう場合に、Ｚｎ”を添
加することにより共存する５゛−ヌクレオチダーゼを選
択的に抑制できるために、第１に１生成した５°−ヌク
レオチド類の分解反応を抑制し、効率良く５゛−ヌクレ
オチド類の製造ができること、第２に、好塩性酵素を用
いて塩濃度の高い条件ドで分解反応を行なうために、他
の微生物によるコンタミネーションを助＋）】できる５
゛−ヌクレオチド類の酵素分解による製造方法が提供で
きたことなどの顕著な技術的な効果が得られた。
度好塩菌ミグ１ｊコ／カス パリアンス サブスピーシ
ーズ ハロフイシス（Ｍｉｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒ
ｉａｎｓ ５ｕｂｓｐ、 ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（Ａ
ＴＣＣ２１９７１）が生産する好塩性ヌクレアーゼ酵素
系を用いてリボ核酸の分解を行なう場合に、Ｚｎ”を添
加することにより共存する５゛−ヌクレオチダーゼを選
択的に抑制できるために、第１に１生成した５°−ヌク
レオチド類の分解反応を抑制し、効率良く５゛−ヌクレ
オチド類の製造ができること、第２に、好塩性酵素を用
いて塩濃度の高い条件ドで分解反応を行なうために、他
の微生物によるコンタミネーションを助＋）】できる５
゛−ヌクレオチド類の酵素分解による製造方法が提供で
きたことなどの顕著な技術的な効果が得られた。
第１′図は、Ｔ１離型酵素を用いた場合の本発明の５°
−ヌクレオチド類製造法によるＺ ｎ ”添加の効果を
Ｚ ｎ ”添加濃度に対しての相対活性（％）の変化を
示すグラフである。 第２図は、フロック体酵素を用いた場合の本発明の５゛
−ヌクレオチド類製造法によるＺｎ’″″添加の効果を
Ｚｎ’＋添加濃度に対しての相対活性（％）の変化を示
すグラフである。 特許出願人 住友重機械工業株式会社・（恒、、：、
７ ゝ１・−／ 第 １ 図
−ヌクレオチド類製造法によるＺ ｎ ”添加の効果を
Ｚ ｎ ”添加濃度に対しての相対活性（％）の変化を
示すグラフである。 第２図は、フロック体酵素を用いた場合の本発明の５゛
−ヌクレオチド類製造法によるＺｎ’″″添加の効果を
Ｚｎ’＋添加濃度に対しての相対活性（％）の変化を示
すグラフである。 特許出願人 住友重機械工業株式会社・（恒、、：、
７ ゝ１・−／ 第 １ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 リボ核酸の酵素分解反応により５′−ヌクレオチド類を
製造する方法において、 共存する５′−ヌクレオチダーゼによる５′−ヌクレオ
チド類の分解反応を抑制するために、中度好塩菌ミクロ
コッカス バリアンス サブスピーシーズ ハロフィラ
ス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓ ｓｕｂ
ｓｐ．ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）（ＡＴＣＣ２１９７１）
の生産する好塩性酵素系を０．０５ｍＭ以上のＺｎ＾２
＾＋イオンの存在下で、５′−ヌクレオチダーゼの活性
を抑制して前記分解反応を行なうことを特徴とする５′
−ヌクレオチド類の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP169987A JPS63169992A (ja) | 1987-01-09 | 1987-01-09 | 好塩菌による５′−ヌクレオチド類の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP169987A JPS63169992A (ja) | 1987-01-09 | 1987-01-09 | 好塩菌による５′−ヌクレオチド類の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63169992A true JPS63169992A (ja) | 1988-07-13 |
Family
ID=11508784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP169987A Pending JPS63169992A (ja) | 1987-01-09 | 1987-01-09 | 好塩菌による５′−ヌクレオチド類の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63169992A (ja) |
-
1987
- 1987-01-09 JP JP169987A patent/JPS63169992A/ja active Pending
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