JPH02138291A - 新規オリゴグルコシド誘導体、α‐アミラーゼの測定方法および測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規オリゴグルコ７ド誘導体、α−アミラー
ゼを測定する方法および試薬に関する。

従来の技術 血清お工び尿中のα−アミラーゼの測定は、膵臓機能の
検査のためのｉｌ？な臨床的パラメータである。α−ア
ミラーゼ測定のための慣用方法の場合には１．２１！質
として、３〜８個の１，４−α−結合グルコース単位か
ら成り、還元性末端の１位では測定可能の基で誘導され
かつ他の末端の６位および場合によって４位では保護基
によって誘導されているオリゴグルコ７ドが使用される
。

ＥＰ第１３５７５８号明細書にはこのような基質が記載
されており、還元性末端の１位では例えばエトロフエニ
ル基のような測定可能の基で誘導されて′Ｊ？シ、他の
末端の４および６位では保護基によって誘導されている
。保帥基としては、例えば０！鑓また社枝分れアルΦル
基またはアルコイル基、フェニル基またはエチリデン架
橋が過当である。

このような基質を用いてα−アミラーゼ測定を酵素的呈
色試験として実施することは、４゜６−エチリデン−ｐ
−エトロフエニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド（ｇｔ
　−Ｃ）、　−ＰＮＰ　）なる基質に関しては、Ｆｒｅ
ｓｅｎｉｕｓ　Ｚ、　Ａｎａｌ　Ｃｈａｍ。

３２４（１９８６）、３０３〜３０５に記載されている
。この場合には測定は次のｌ！Ｉｔ験原理（単純化しで
ある）に従って行われる：５　Ｅｔ　−Ｇ、、−Ｐ’Ｍ
Ｐ　＋　５　ＨｚＯ互ゴ１辷イ→２　（）２−　ＰＮＰ
　＋　２０ｉ　−ＰＮＰ　＋　０４−　ＰＮＰ　＋２　
ｇｔ　−Ｇ、　＋　２　Ｅｔ　−Ｇ、　＋　Ｉｔ　−Ｇ
３２　Ｇ２−　ＰＮＰ　＋　２　Ｃ）、　−ＰＮＰ　＋
　１０　）１２０ａ−””’−４ＰＮＰ　＋　１Ｑ　Ｇ （ｇｔ＝エチリデ／、Ｇ＝ニブルコースＰＮＰ　＝ｐ−
ニトロフェノール） 前記基質の利点は特に、測定可能の基を遊離するために
使用される補酵素、例えばα−グルコシダーゼまたはβ
−グルコ７ダーゼが、すてにα−アミラーゼによって分
解された基質のみに作用するが、未分解基質には作用し
ないことである。

従って保診された基質を用いると、末保霞基駕と比べて
試薬混合物の貯ｉ１！訃力が改善される。

しかし、特にα−アばラーゼの小さい活性を測定する場
＆に精度を高めるためには、測光的拭験で公知基質を用
いて得られる感度よりもさらに高い感度を有するα−ア
ミラーゼ基質を伜るのが望ましい。ここで感度とは、単
位時間轟りの吸光度の増分（ΔＦｉ　／　ｍｉｎ　）に
対するα−アミラーゼ活性の割合の謂である。つまり感
度の増大は、試料のα−アミラーゼ活性が同じでもΔＷ
　／　ｍｉｎがより大きくなることを意味する。

発明が解決しようとする問題点 ることである。

問題点を解決するための手段 前記課題は、本発明により一般式！： 〔式中Ｒ１は水素原子、メチル基、エチル基、ゾロぎル
基、イソプロピル基、エチル基、１−エチル基、１−ア
ルコ午シアル中ル基または場合によシ親水的Ｋｆ！Ｍ換
されたシクロプロピル本りクロプチル基、シクロペンチ
ル基、フクロへ中シル基、フェニル基、テトラヒドロピ
ラニル基、キヘリジニル基（場合によりＮ−メチルまた
はエチル置換されている）、ピリジニル基、チオフェニ
ル基、１．１−ジオ争ソーテトラヒドロチオｅラニル基
または場合によりメチル基、エチル基、プロぜル基また
はイソゾロビル基からの同じまたは異なる置換基を有す
るアミノ基を表わし；Ｒ２は２．３または４個のグルコ
ース単位を有するオリヅグルコシド基を表わし；Ｘは水
素原子または光学的に測定可能の基を表わす〕で示され
る化合物によって解決される。

意外にも、末端の０６−ヒドロキシ基に対する上記の保
神基を有する本発明による基質が、公知基ｌｌｉよりも
明らかにより感受性があり、従ってα−アミラーゼ測定
の精度が著しく改善されうることか判明し、た。

Ｒ１としては、メチル基、イソプロピル基または場合に
より親水的に置換されたフクロプロビル基が有利である
。特にイソゾロビル基およびシクロゾロぎル基が有利で
ある。Ｒ２としては４個のグルコース単位を有するオリ
ヒグルコ／ド基が■利である。

親水性置換基としては、例えばカルボキシ基、ヒドロキ
シ基、スルホン−基、ジメチルアミノ基、燐酸基、へロ
２７基および／またはニトロ基が適当である。

該基質の遣元性末端の１位における光学的測定可能基は
、α−結合またはβ−結合に結合されていてもよい。

Ｘが光学的に測定可能の基である場合には、これは可視
範囲または紫外範囲でも呈色する基、または別の化合物
との反応後に、例えば着色物質に変化するかまたは着色
物質と結合して初めて光学的に測定可能になる基であっ
てもよい。

この工うな光学的に測定可能な基は当業者にはたフェニ
ル基、すなわちエトロフエニル基、６゜４１２−エトロ
フエニル基ｔたは２−クロロ−４−エトロフエニル基お
よびレゾルフィン基オよびそれらの誘導基である。

本発明による化合物および対照化合物の製造は例えばＥ
ｐ＠１３５７５８号明＆ＩＢｌＢに記載された方法と同
様にして行われる。また未保静基質中に、活性化カルボ
ン酸基により、例えば相応のオルトエステル、酸塩化物
、無水物により、活性化エステルから酵素的に（ＪＡＣ
８１１０（１９８８）、５８４〜５８９）、アセタール
からまたは直接カルボン酸から脱水剤により、例えばミ
ツノブ（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ　）反応（Ｐｏ５ｔｅｒｖ
Ｏｎ　　８．Ｃｚａｒｎｓｃｋｉ　　Ｐ３ｕｆ　　ｒｏ
ａｍ　ＸＩＶｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｒ
ｂｏｈｙｄｒａｔｅ　８３ｍｐｏｓｉｕｍ（１９８Ｂ）
、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ　：　５ｙｎｔｈｓｓｉｓ１９８
１．８．１−２８　）によって所望の保饅基を導入して
もよい。特に中間生成物として相応のオルトエステルを
介する製造およびミツノブ反応による＊造が有利である
。オルトエステルは有利には相応のニトリルから製造さ
れる〔例えばＨｏｕｂｅｎ　−Ｗｅｙｌ、ＢａｎｄＶｌ
　／　３　（１９６５）３００−３１り”１＝ｌＪルは
例えば相応のカルボン酸から製造することができる。保
捗された基質の精製は例えばクロマトグラフィーやイオ
ン交換体またはＭＰＬＣにより行うことができる。

一般式ｉの化合物は、一般式ｆｆ： ０Ｈ 〔式中Ｒは２．３または４個のグルコース単位を有する
オリイグルコクドを表わし、Ｙは水素原子または光学的
測定可能の基を表わす〕で示される化合物を、一般式薯
： 〔式中でＲ，Ｉは水素原子、メチル基、エチル基、プロ
ピル基、イソプロピル基、エチル基、ｔ−ブチル基、１
−アルコ午シアル中ル基または場合によっては親水的に
置換されたフクロプロビル基、／クロブチル基、フクロ
ベンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基、テトラヒ
ドロピラニル基、ピペリジニル基（場合によりＮ−メチ
ルまたはエチル置換されている）、ピリジニル基、チオ
フェニル基、１，１−ジオ午ソーテトラヒドロチオビラ
二ル基または場合によりメチル基、エチル基、プロピル
基またはイソプロピル基からの同じかま六は異なる基で
置換されているアミノ基を表わし、 Ｒ，ｔｉ、ヒドロキ７基、アルコキク基、ジメチルまた
はジエチル置換アミノ基を表わし、Ｒ５およびＲａ　（
同じがまたは異なっていてもよい）は炭素原子１〜４個
を有するアルコキン基または一緒に酸素原子を表わす〕
で示されるカルボン酸、そのエステル（場合によりさら
に活性化されていてもよい）、オルトエステル、アセタ
ールまたはケタールと、水分排除下の無水溶剤および酸
咄媒中でまたは脱水剤の存在で反応させ、場合により加
水分解させ、生成混合物を次に例えばクロマトグラフィ
ー法にょシ分離することによって製造されつる。反応は
有利には２０〜５０℃で実施する。

このようにして例えば、Ｒ１がメチル基、イソプロピル
基または親木的に置換されたシクロプロピル基を表わ１
−２、 Ｒ２が４個のグルコース単位を有するオリ♂グルコクド
を表わし、Ｘがし１戸ルフィン基またはｐ−エトロフエ
ニル基を表わす一般式■の化合物は、一般式■において
Ｒお工びＹがＲ２およびＸと同様のものを表わす化合物
を、一般式厘においてＲ３がメチル基、イソプロピル基
または親水的に置換されたフクロプロビル基を表わし、
Ｒ４はメト中７基ま九はエトキク基を表わし、Ｒ５およ
びＲ６は両方ともメトギシ基かまたはエトキク基を表わ
す一般式璽のオルトエステルの少なくとも４倍の当量と
一緒に無水溶剤中で溶かし、水分排除下にｐ−）ルオー
ルスルホ７　酸１ｍｏｂを導入攪拌する場合に祷られる
。

同様にし°Ｃまた、アセクールの相応の量および一般式
■の化合物を用いて、相応の４，６−エチリテンーレ・
ｌルフイニルーβ−ｒｌ−もＬ＜ｔｉ４，６−エチリデ
ン−ｐ−エトロフエニル−α−Ｄ−マルチペンタオシド
も得られる。またｐ−）ルオールスルホン酸の代りに酸
触媒として他の有機酸お工び鉱酸お工び／またはり／イ
ス酸を便用してもよい。

ｌ１ｆｆｌ　機にして本発明による化合物を、一般式Ｉ
において例えばＲ３がメチル基、イソプロピル基または
親水的に置換された７クロプロビルを表わし、Ｒ４はヒ
ドロ午７基またはアルコキク基を表わし％ＲＩ５および
馬が一緒に酸素原子を表わす一般式Ｉのカルボン酸およ
び一般式■の化合物から製造するのが有利であり、これ
らの化合物を水分排除下に１種以上の脱水剤の存在で反
応させる。脱水剤としては例えばトリフェニルホスフィ
ンおよび／またはジェチルアゾジカルボキクレートおよ
び／または同様に使用可能の化合物をデ用することがで
きる。

Ｒ１お工びＲ３の定義における”アルコ苧７アル中ル”
とは、アルキル基に結合されたアルコ中７基を意味し、
それぞれ炭素原子１〜６個、有利には１〜４個を有する
。

Ｒ４の定義における”アルコ午７基”は、炭素原子１〜
１０個、有利には１〜６個および場合によっては１個以
上のへテロ原子、特に窒素および塩素を有しかつ直鎖、
枝分れまたは環として存在していてもよい。

また本発明による化合物の製造は、それぞれのグルコ７
ド（マルトトリオクト、マルトテトラオクト、マルトペ
ンタオクト）を無水酢酸または塩化アセチルで過アセチ
ル化しく　ＣｈｅＩＸＩ。

Ｂａｒ、　−Ｌ」−（１８８０）　）、１位のアセト午
シ基を加水分解して［Ｃｈａｍ、　Ｂｅｒ、旦ｊ　（１
９５３）６０４〕水酸化物または臭化物を形成させるこ
とによって行ってもよい。

次に遊１１１１Ｉ５ｗ色物質がクロルアセトイミダート
（Ｃｈｌｏｒｈａｓｔｉｍｉｄａｔ　）法（８ｙｎｔｈ
ａｓｉａ（１９８１）　　８８５〜８８７〕またはケー
ニックスークノル（Ｋｏａｎｌｇｓ　−Ｋｎｏｒｒ　）
法（Ｊ、　Ａｍ、　ＣＭｍ、　８ｏｃ、　５１　（１９
２９）１８６０、Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍｉｅ　９４　
（１９８２）１８４〕によりグルコ７ドに結合される。

この結合は、それぞれの過アセチル化化合物をリュイス
＃Ｉ触媒下にフェノール性色素原と反応させて直接行う
こともできる（特開昭６２−２８９５９５号公報）。Ｎ
色物質の結合後に脱アセチル化され、保靜基が相応のオ
ルトエステルに工り酵素的にまたは活性化カルボン酸誘
導体、すなわち活性エステル、酸塩化物ま九は無水物に
より末端の６位に結合される（Ｔｅｔｒａｈａｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔｅｒ８２旦（１９８７）　　３８０９〜３８１
２、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｂｏａ、　１０８　（
１９Ｂ　６　）５（５３８）。対照化合物も同様に製造
することができる。

本発明の他の対象は、試料をオリビサツカリド基貴、α
−グルコ７ダーゼおよび／またはβ−グルコシダーゼと
反応させて分解生成物を測定することによって試料中の
α−アミラーゼを測定する方法であって、その特徴とす
るところはオリプグルコシド基質として一般式■：Ｈ で示される化合物を使用することである。

Ｘ＝Ｈである限り、分解生成物の測定は当業者に周知の
方法（例えばＤＥ第２７４１１９２号明細書に記載）で
行うことができる。Ｘが光学的に測定可能の基である場
合の分解生成物の測定も同様に当業者にとって周知であ
り、例えばＥｐ第１　、り５７５８号明細書に記載され
ている。他の実施態様ではさらにグルコアミラーゼも加
える。

また本発明の他の対象は、 本発明による一般式■の化合物　０．５〜２ｍ　ｍｏ”
Ｌ　／　１ ＮａＣｊ　　３０〜１００　ｍ　ｍｏ１／１α−グルコ
シダーゼ　２０〜５０Ｕ／／および／ｌたはβ−グルコ
シダーゼ　０．５〜２Ｕ／７３から成るα−アミラーゼ
測定用試薬である。

測定は通常、ＰＨ６〜８、有利には６．５〜７．５で、
濃１１’　２０〜２００　ｍ　ｍｏｌ／ｌ、有利には５
０〜１５０ｔｎｍｏｌ／６の緩衝剤、有利にはボード（
ＧＯＯｒ）　）緩衝剤中で行う。場合によってはグルコ
アミラーゼ５〜２０Ｌｌ／ａ７！を加えてもよい。有利
には測定はＭｇ　Ｃ２０５〜’ｌ　Ｏｍ　ｍｏｂ／ｌの
存在で行う。

本発明を次の実施例により詳述する。

例　　１ ベルアセチル−β−マルトペンタオクトマルトペンタオ
ース１００　ｇ　（０，１２ｍｏｌ）および無水酢酸ナ
トリウム８１．８９　（１，０ｍｏｌ）を、無水節＃！
１１．１１　（１１，７ｍｏｂ　）中Ｔ懸Ｍし、水分排
除下に反応開始（約１１０’Ｃ）ｔで徐々に加熱する。

次に氷水を用いて、反応が低下すす るまで冷却し、次にさらピー間還流煮沸して反応を完結
させる。反応混合物を約７０℃に冷却して、氷水４１に
注ぐ。６０分の攪拌後に上澄みを注出し、残留物をＣＨ
ｌｌＣｌ　２５０　ＱｍＡ中に溶かす。Ｉ（、Ｏ１飽和
ＮａＨＣＯ３溶液およびＨ２０を用に いて順々にＣＨ，Ｃｊ、相／振出を施し、Ｎａ２８０４
を介して脱水する。真空で溶剤を留去した後、残留物を
活性炭冷加下にエタノール−イソゾロパノール（１：１
）１．５７から再結晶させる。

収量；無色結晶１６６．２９　（理論値の８９．８悌）
−点：１２０〜１２５℃：α。ヨ＋１２５．５゜ｒ）Ｃ
Ｃ薄層クロマトグラフィー）：珪酸ゲル６０−プレート
Ｆｉｓ４（Ｍｅｒｖ社）ドルオール／アセトｙ（７／４
） ｒｆ　＝　０．５２ ＩＨ−鹿Ｒ（ｎｕｓｏ−ａ、）　：　１．８−２．２　
（ｇ、５１Ｈ５ＣＨ（ＢＣＯ）　： ５．８−５．５　（＋！１　％　３５１（。

Ｉ（−１／　Ｈ−６） 次のベルアセチル−β−〇−マルトオリイサツカリドを
王妃の工うにして合成する。この際マルトペントースの
代りに同量のマルトース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトへ中サオースお工びマルトヘプタオ
ースを便用した。

文　　献； Ｈ８ｒ　Ｍ　ｆ　ａ　”Ｌ　６　ｓ　　Ｃｈ８ｉｌｌ　
ａ　Ｂｏｒ、上！１（１８８０）、例　　２ ヒドロ午シーα−Ｄ−ベルアセチルマルト槓ンタオ／ド ペルアセチル−β−ローマルトペンタオシド１５０１１
　（０，０９６ｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラフ２０
０Ｒ１中に溶かす。このものに攪拌下にべ／ジルアミン
３３ｍＡ　（０，３ｍｏｘ　）を加え、室温で２時間水
分排除下に情件する。次に真空で乾固するまで蒸発し、
残留物ｔ−ｃＨ２ｃ１２４ＱＱｍ７！に溶かし、ＣＨ２
Ｃｊ２相を５　ｍｏｌ　／　ＩＨＣＪ、　Ｉ（、Ｏ，飽
和Ｎａａｃｏ５溶液およびＨｌｌＯのそれぞれ４００ｍ
Ａで順々に洗浄する。次に有機相をＮａ２８０４を介し
て脱水し、活性炭と共に還流下に加熱煮沸する。活性炭
を濾取した後、濾液を真空で蒸発乾固する。生成物は、
さらに精製することなく次の段階のために使用すること
ができる。

収量：１４０．９（理論値の９７９６）ｐＣ：珪酸ゲル
６０　Ｆ２５４　（Ｍｅｒａｋ社）ドルオール／アセト
ン（７／４） ｒｆ　＝＝　０．４２ １Ｈ−ＮＭＲ（ｒ）ＭＳＯ−１６）　：１．８−２．２
　（ＩＩ、４８　Ｈ ＣＨ，Ｃｏ　） ５．８−５．５　（ｔｏ　、　　５５　Ｈ。

Ｈ−１、ｐ　Ｈ−６） ５．７　（ａ　、　１）！　、　０）Ｉ）文献： Ｈｓｓｌｆｓｒｉｃｈ　、　　Ｂ、　　：　Ｐｏｒｔｍ
　、　　Ｗ、　　：　Ｃｈ＠ｗ、　Ｂａｒ。

１泣、（１９５３）、６０４゜ この規定によシ次のマルトオリフサツカリドを合成した
： ｒｆ（珪１！ｌｒル６０、 マルトース　　　　９６　％　　　　　　　　０．４５
マルトトリオース　　９６憾　　　　　　　　０．４０
例　　３ ベルアセチル−マルトペンタオクルーα−Ｄ−トリクロ
ルアセチＺデート ヒドロ命り−α−Ｄ−ベルアセチル−マルトペンタオク
ト７５　ｇ　（０，０５ｍｏｘ　）およびトリクロルア
セトニトリル２５ｍ／　（０，２５ｍｏｂ　）を、無水
Ｃ’Ｈ２（Ｊ　２１５　Ｏａｘ中に溶かす。溶液を０°
Ｃに冷却し、攪拌下に水素化す）　ＩＪつ４１．５１１
（０−０５５ｍｏｌ）を少しづつ加え、次に室温で２時
間水分排除下に攪拌する。過剰の水素化ナトリウムをガ
ラスフリットを介して分離し、濾液を珪＃デルカラム（
６０Ｍａｒｋ約２００１１１７！。

φ６α）により濾過し、次いで酢酸エステル２１で洗浄
する。ｍ腋を活性炭と共に還流下に加熱煮沸し、活性炭
を濾取し、濾液を真空で蒸発乾固する。

収量２発泡状の無色生成物７２ｙ（理論値の８７．５４
　）、 ｒ）Ｃ：珪ａｔ　ｌ’　ル６０　Ｆ２５４　（Ｍｅｒａ
ｋ社）ドルオール／アセトン（７／４　’） ｒｆ　＝　０．５８ １Ｈ−ＮＭＲ（ｎＭ８０−４．）　： １．８−２．２（ｓ　、　４８Ｈ、ｃ′Ｈ，ｃｏ）３．
８−５．５　（ｍ　、　　３５Ｈ。

Ｈ−１−Ｈ−６） ６．３　（ＩＩ、ＩＨ，ＮＨ） 文献： ５ｃｂａ＋ｉｄｔ　、　Ｒ，、Ｓ　ｔｕ　ｍｒ　９９％
　Ｍ　＊　、Ｌ　ｉ　１１　ｂ　ｉ　ｇ　８　ｓ　Ａ　
ｎｎ　−ｃｈｅｍ、　　１　９８３．１２４９〜１２５
６゜この規定によりペルアセチルーマルトトリオースト
リクロルアセチミデートもａ造した。

収率：９３４ ｒｆ　：　０．４５ 例　　４ しｔｌルフィニル−β−〇−マルトペンタオクトペルア
セチルマルトペンタオシル−α−Ｄ−トリクロルアセチ
ミデート７２１１　（０，０４４ｍｏｌ）およびレゾル
フィン４．４　、ｌｉ＋　（０，０２ｍｏｌ）を無水ｎ
ＭＦ　１１中テ＠濁する。ＢＦ３−０Ｆｉｔ　＠媒下に
水分を排除して６０℃で８時間攪拌する。室温に冷却後
にＡｔ２０３　（約５００ｄ）Ｋ！Ｄ濾ｉＬ、次に酢酸
エステル５１で洗浄する。濾液を真空で蒸発乾固し、残
留物を無水Ｍ・ｏＨ１ｏｏＩＩ＋／中に皺かし、水分排
除下に室温で３時間、ＮａＯＣＨ３２ｇで脱アセチル化
する。懸濁液を真空で蒸発乾固し、残留物を）１．ｏ　
１００ｍＡ中ニ取シ、２　ｍｏ１／　ｌ　　ＨＣｊで−
＝６ＫＡ廟節し、ダイヤイオン（Ｄｉａｌｏｎ　）カラ
ム（約５００ＩＩＬｔ／　０８ｃｒｎ）上に施す。先づ
Ｈ２Ｏ４１″′ｃ＃離し、次に２０１イソゾロパノ一ル
ｍ液３１で溶離する。溶離液を蒸発して約４０ｙｎｌと
なし、ＲＰ−１８−フランク二カラム（φ＝４σ、ｈ＝
３９ｃｍ）に工り溶離剤としての１５係イソゾロパノー
ルを５０−づつ用いてクロマトグラフィーを施す。

し１１ルフイニルーマルトペンタオシドを含有スるフラ
クシヨ／を一緒にし、真空で約’１ＱｔｎＡに蒸発濃縮
し、ＲＰ−１８−ＭＰＬＣカラムにより溶離剤としての
１５係インゾロパノールをＩＱｍＡづつ用いてクロマト
グラフィーを施す。生成物を含有するフラククヨンを一
緒にし、真空蒸発し、次に凍結乾燥する。

収量：凍結乾燥物２．８９　（理論値の１４係）ＨＰＬ
Ｃ：　ＲＰ　−１８−カラム、１ｍｔ／ｍｉｎ、１７４
インゾロパノール、ｒｔ＝　２−９５　ｗｉｎレゾルフ
ィン−０６の含分：９７％ ”Ｈ−ＮＭＲ（０Ｍ８０−１．）　： ３．０−６．０　（ｍ　、　５１Ｈ１０Ｈ。

Ｈ−１−Ｈ−６）　： ６．２−８−０　（＋！ｌ　、　６Ｈ、ＡｒＨ）文献： ８ｃｈｍｉｄｔ　、　Ｒ−＠　Ｇｒｕｎｄｌｅｒ　ＳＧ
４　；　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ１９８１．８８５〜８８７ 例　　５ ケーニツクスークノル（Ｋｏｅｎｉｇｓ　−Ｋｎｏｒｒ
　）法瓢によるレゾルフィニル−β−Ｄ−マルトオリゴ
サツカリドの製造 １、　アセトデロムーα−Ｄ−マルトオリビサツカリド
： 過アセチル化糖２５　ｍ　ｍｏｌを氷酢酸５ＱｍＪ中に
溶かす。これに氷酢酸中のＨＢｒ　（３０４）５０ｍ／
を加え、室温で水分排除下に攪拌する。

次にＣＨ２σ２３００！ｌ／を加え、氷水１１に注ぐ。

有機相を分離し、次にＨ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯｉ溶液お
よび！（２０を用いて振出を施す。有機相をＮａ２ＳＯ
４にエリ脱水し、次に真空で蒸発乾固する。生成物をさ
らに精製することなく次の反応で開用することができる
。

ｒｆ（珪酸ｒル６０／ マルトース マルトトリオース マルトテトラオース マルトペンタオース マルトヘキサオース マルトへブトオース ８８俤 ８ｓ ９１　俤 ９３チ ９５俤 ０．７２ ０．６５ ０．６１ ０．５７ ０．５３ ０．５０ 文献： Ｂｒａｕｎａ　、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈａｔｏ、　８ｏｃ
、　５１、（１９２９）、２、　　レゾルフィニル−β
−Ｄ−マルトオリデサツカリド レプルフイン５０　ｍ　ｔｏｏｌお工びＡｇ２Ｏ２５ｍ
ｍｏｌｔ−１無水ＣＨ，ＣＮ　８Ｑ　Ｑ　ｍＡ中でモレ
キュラー７−プ（３Ａ）と共に懸濁し、水分排除下に４
時間還流煮沸する。無水ＣＨ３ＣＮ　２００１１１Ａ中
のアセトブロム−α−Ｄ−マルトオリゴサツカリド６２
．５　ｍ　ｍｏｌを加え、６時間還流煮沸する。さらに
１８時間室潟で攪拌し、活性炭１０ｆＩを加え、短時間
還流煮沸する。この混合物をＡ１２０３（活性段階１７
Ｎ）ＩＯＣＩにより濾過し、次に酢酸エステル５ｅで洗
浄する。α液を真空で蒸発乾固し、残留物を無水エタノ
ール１１中に俗かし、水分排除下に室温で１８時間Ｎａ
ＯＣＨ３５１と一緒に攪拌する。この＠濁液を真空で蒸
発乾固し、残留物をＨ２Ｏ２００１ｄに溶かし、−７に
調節し、ダイヤイオｙ−ＨＰ　−２０５１］０ｒｎｔを
充填したカラム上に施す。Ｉ（２０１５，Ｊで洗浄し、
１５係イソゾロパノール溶液１０１を用いて溶離する。

溶離液を真空で蒸発して１０〇−とし、イミダート法に
工りＭＰＬＣカラム（ＲＰ−１８）でインゾロパノール
溶啼を用いてクロマトグラフィーにかけ、凍結乾燥する
。

ａ）２５％イソプロパツールを用いてダイヤイオンカラ
ムからレゾルフィニル−β−〇−マルトトリオースを浴
離し、２５憾インプロパツールを用いてＲＰ　−１８−
カラムでクロマトグラフィーを施す場合。

ｋｌ）４０％インプロパツールを用いてダイヤイオンカ
ラムからレゾルフィニル−！−マルトクドを溶離する場
合。

生成物を真空で蒸発乾固し、次にｎＭＦに溶かし、Ｈ２
Ｏで沈殿させる。沈殿物を吸引し、真空で乾燥する。

ＩＨ−ＮＭＲ（ｒ）ＭＳＯ−ｄ６）　：マルトース：　
３．１−３−９　（ｍ　、　１１Ｈ、ＯＨ、Ｈ−６）　
：４．４−５．７　（ｍ　、　１０Ｈ、Ｈ−１−Ｈ−５
）　；６．２−８−０　（＋！Ｉ　、　６Ｈ、ＡｒＨ）
マルトトリオース：　３−０−５−９　（ｍ　、　３２
Ｈ、ＯＨ。

Ｈ−１−）！−６）　； ６−２−８−０　（ｒｎ　、　６Ｈ、ＡｒＨ）例　　６ 保しされたレゾルフィニル−β−〇−およびｐ−二トロ
フェニルーα−Ｄ−マルトオリプサツカリドの合成 レゾルフィニルーモＬ　＜　ハル−エトロフエニル−マ
ルトオリゴサツカリド１ｍ　ｍｏｂおよびオルトエステ
ルもしくはアセタール４　ｍ　ｍｏｌ　ヲ、無水ｒ）Ｍ
Ｆ　１Ｑ　ａｔ中でモｖキュラーーｉ−フ（３Ａｓ新鮮
、活性化）と−緒に水分排除下に溶かす。

これにｐ−）ルオールスルホン＃１ｍｍｏ１を攪拌下に
加え、室温で４時間攪拌する。次にＨ，０２０ｍ１を加
え、１０分攪拌し、ｒ）ＥＡＥ−セフ　７セｐｖ　（５
ａｐｈａａｅｌ　）　（Ｃｏ　　）により濾過する。

次に２０憾イソグロパノールで洗浄し、濾液を真空で蒸
発させて２０ｒｎＪとなし、ＲＰ　−１８−ＭＰＬＣ−
カラムにより１８〜６０憾インプロパツールを用いて画
分的にクロマトグラフィーを施す。生成物のフラクショ
ンを一緒にし、真空で蒸発させ、凍結乾燥する。レゾル
フィニル−β−〇−マルトシドの保霞された化合物の場
合には、ｒ）ＭＰ　／　Ｈ２Ｏから生じる。その都度便
用された化合物および生成物の物理的データは表■から
判明する。

例　　７ ミツノブ反応による末端基の保誇されたマルトオリコ９
サツカリドの合成 レゾルフィニル−マルトペンタオシド１ｍｍｏｂに、無
水ｒ１ＭＦ中でその都度のカルボン酸２ｍｍｏｌ、）リ
フェニルホスフィンお工びジェチルアゾジカルボ中クレ
ートを加え、室温で１６時間水分排除下に攪拌する。次
にＨ２゜２０＋！１７！を加え、生じる沈殿物をザイッ
フィルタ−（８ａｉｔｇ　−Ｆｉｌｔｅｒ　）により濾
取する。濾液を真空で蒸発させて約８−にし、ＲＰ−１
８−ＭＰＬＣ−カラムにより１８憾インプロパツールを
用いてクロマトグラフィーにかける。生成物のフラクシ
ョンを集めて、真空で蒸発させ、凍結乾燥する。その都
度の生成物はオルトエステル法（例６）にニジ製造され
た生成物と同一であり、同じ物理的データ（表■）を示
す。

例 α−アミラーゼの測定 試薬（試験における最終Ｓ度）； 基＊（表ｎ参照）　　　　１ｍｍｏｌ／Ｊ１（１ｉＪ’
Ｅ８緩伽剤（ｐＪ１７．１）　　　１００　ｍ　ｍｏｂ
　／　ＩＮａＣｊ　　　　　　　　　　　　　５Ｑ　ｍ
　ｍｏｌ　／　ｊＭｇｃｊ　ｘ　　　　　　　　　　　
１０　ｍ　ｍｏｌ　／　１α−グルコシダーゼ　　　　
　３０　　υ／ｌβ−グルコシダーゼ　　　　　１　０
７１試薬１幅およびヒトの病的血清たる試料０．２５１
ＩＩＡを混合し、混合物を２５℃に調節すム４分のＡｉ
ｌ恒温保持時１ｌＩｌ′ｌ（遅延期）後に５７８ｎｍで
の吸光度の増分を光度計で記録し、毎分の吸光度の変化
（ΔＢ　／　ｗｉｎ　）を測定する。本発明による基質
（１）、Ｃ２１、（４）および（６）と対照化合物の結
果が表■から判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中Ｒ＿１は水素原子、メチル基、エチル基、プロピ
   ル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、１−
   アルコキシアルキル基または場合により親水的に置換さ
   れたシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチ
   ル基、シクロヘキシル基、フェニル基、テトラヒドロピ
   ラニル基、ピペリジニル基（場合によりＮ−メチルまた
   はエチル置換）、ピリジニル基、チオフェニル基、１，
   １−ジオキソ−テトラヒドロチオピラニル基または場合
   によりメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロ
   ピル基からの同じかまたは異なる置換基を有するアミノ
   基を表わし；Ｒ＿２は２，３または４個のグルコース単
   位を有するオリゴグルコシド基を表わし；Ｘは水素原子
   または光学的に測定可能の基を表わす〕で示される化合
   物。 ２、Ｘが場合により置換されたエトロフエニル基または
   レゾルフイン基を表わす請求項１から請求項３までのい
   づれか１項記載の化合物。 ３、試料を、請求項１記載の一般式 I で示される化合
   物およびα−グルコシダーゼおよび／またはβ−グルコ
   シダーゼと反応させかつ分解生成物を測定することを特
   徴とするα−アミラーゼの測定方法。 ４、グルコアミラーゼを加える請求項５記載の方法。 ５、請求項１記載の一般式 I で示される化合物０．５
   〜２ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ３０〜１００ｍｍｏｌ／ｌ α−グルコシダーゼ２０〜５０Ｕ／ｌお よび／または β−グルコシダーゼ０．５〜２Ｕ／ｌ 緩衝剤（ｐＨ６〜８）２０〜２００ｍｍｏｌ／ｌから成
   ることを特徴とするα−アミラーゼ測定用試薬。 ６、グルコアミラーゼ５〜２０Ｕ／ｍｌを含有する請求
   項７記載の試薬。 ７、ＭｇＣｌ＿２５〜２０ｍｍｏｌ／ｌを含有する請求
   項７また８記載の試薬。