JPH02113887A - プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えdna及び該組換えdnaを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 - Google Patents
プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えdna及び該組換えdnaを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法Info
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- JPH02113887A JPH02113887A JP26556988A JP26556988A JPH02113887A JP H02113887 A JPH02113887 A JP H02113887A JP 26556988 A JP26556988 A JP 26556988A JP 26556988 A JP26556988 A JP 26556988A JP H02113887 A JPH02113887 A JP H02113887A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
この発明は遺伝子組換え法による7’ a リンイミノ
−efグチダーゼ衾遣法に″関するものである。
−efグチダーゼ衾遣法に″関するものである。
(従来技術)
デロリンイミノペデチグーゼについてはこれまでにエシ
ェリヒア属、バチルス嘴およびブタ腎臓にその存在が認
められている( 5arld、8. 、B@rgnr。
ェリヒア属、バチルス嘴およびブタ腎臓にその存在が認
められている( 5arld、8. 、B@rgnr。
A、& Katahalskl、1:、、 J、Blo
l、Chem、、 237 、22 U 7(1962
) 、 YomhlmoLo 、 T、 &Tguru
、 D、、 J、BIoahem、。
l、Chem、、 237 、22 U 7(1962
) 、 YomhlmoLo 、 T、 &Tguru
、 D、、 J、BIoahem、。
97.1477(19d5) 、Nordwing、A
、&Mayor+H,。
、&Mayor+H,。
Hopp*−8eyle r’s Z、Phymlal
、 Chem、 354 、380[973))。
、 Chem、 354 、380[973))。
しかしながら、これらの従来より知られている微生物又
は動物細)泡はプロリンイミノペグチダーゼの生産能が
極めて低いために、経済的なグOIJンイばノペデチダ
ーゼの製造法としては不適である。
は動物細)泡はプロリンイミノペグチダーゼの生産能が
極めて低いために、経済的なグOIJンイばノペデチダ
ーゼの製造法としては不適である。
(本発明が解決しようとする課M)
本発明が解決しようとする課題は遺伝子工学の手法を用
いてエシェリヒア属に属する政生物により経済的な!ロ
リンイばノ(グチダーゼの製造法全提供することにある
。
いてエシェリヒア属に属する政生物により経済的な!ロ
リンイばノ(グチダーゼの製造法全提供することにある
。
(課題を解決するための手段)
上述のa題を解決するために、本発明者らはrオキシリ
ボ核#(以下DNAと記す)供与菌としてエシェリヒア
・コリHBIOI菌t−用い、これよりグロリンイiノ
ペゾチl−ゼ生成に関与する遺伝情it有するDNA
’i油抽出、ついでこのプロリンイミノ(グチダーゼ生
成に関与する遺伝情報を有するDNAを組み込んだプラ
スばドを得て、このプラスばドをエシェリヒア属の微生
物に尋人し、これらの中よりグロリンイミノペグチグー
ゼ活住の増強し九岨良え体微生物を選択し比。
ボ核#(以下DNAと記す)供与菌としてエシェリヒア
・コリHBIOI菌t−用い、これよりグロリンイiノ
ペゾチl−ゼ生成に関与する遺伝情it有するDNA
’i油抽出、ついでこのプロリンイミノ(グチダーゼ生
成に関与する遺伝情報を有するDNAを組み込んだプラ
スばドを得て、このプラスばドをエシェリヒア属の微生
物に尋人し、これらの中よりグロリンイミノペグチグー
ゼ活住の増強し九岨良え体微生物を選択し比。
本発明の微生物を用いることによって、従来の天然法を
用いる方法に比べて極めて高い収率でグロリンイミノペ
!チグーゼを生産できることを見出した。すなわち、グ
ロリンイtノペ!テダーゼ活性合有する微生物はいくつ
か知られて3シ(芳本忠・鶴大典、蛋白質核戯酵素29
、317(1984))これより染色体DNA 全常
法により抽出しく 1(、5aik。
用いる方法に比べて極めて高い収率でグロリンイミノペ
!チグーゼを生産できることを見出した。すなわち、グ
ロリンイtノペ!テダーゼ活性合有する微生物はいくつ
か知られて3シ(芳本忠・鶴大典、蛋白質核戯酵素29
、317(1984))これより染色体DNA 全常
法により抽出しく 1(、5aik。
and K、 Mlura 、 Blochlm、 B
iophys、 AcLa+ 72 + 619(19
63))常法1cよ)l!lII限エンドヌクレアーゼ
で処理する。
iophys、 AcLa+ 72 + 619(19
63))常法1cよ)l!lII限エンドヌクレアーゼ
で処理する。
我々の実験では制限エンドヌクレアーゼとしてPat)
’ii用いてプロリンイミノ(グチダーゼ生成に関与す
る遺伝t’sを担うDNAフラグメントを得たが、他の
制限エンドヌクレアーゼ例えばEl mmF(I *S
*11 、 Hknd ill 、 Xho Iなどを
用いてもPsLJと同様の結果が得られる可能性がある
。
’ii用いてプロリンイミノ(グチダーゼ生成に関与す
る遺伝t’sを担うDNAフラグメントを得たが、他の
制限エンドヌクレアーゼ例えばEl mmF(I *S
*11 、 Hknd ill 、 Xho Iなどを
用いてもPsLJと同様の結果が得られる可能性がある
。
ベクターDNAとしてはpBR322、pUc19など
のエシェリヒア・コリーのリラックスタイググラスミド
より得られたものならばどのようなものでもよい、この
ベクターにプロリンイミノ−4fチダーゼ生成に関与す
る遺伝情報を担うDNAフラグメントを岨み込む方法は
特定の方法を要しない。
のエシェリヒア・コリーのリラックスタイググラスミド
より得られたものならばどのようなものでもよい、この
ベクターにプロリンイミノ−4fチダーゼ生成に関与す
る遺伝情報を担うDNAフラグメントを岨み込む方法は
特定の方法を要しない。
かくして得られたfelリンイミノペ!チグーゼ生成に
関与する遺伝情it担うDNAフラグメントを組み込ん
だプラスミド″全工/エリヒア属の微生物に富有せしめ
る方法もまた、従来知られているすべての形質転換方法
が可能である。
関与する遺伝情it担うDNAフラグメントを組み込ん
だプラスミド″全工/エリヒア属の微生物に富有せしめ
る方法もまた、従来知られているすべての形質転換方法
が可能である。
組換えプラスばドの受容菌としては、エシェリヒア属の
中でデロリンイば〕(ブチグーぜ活性をもたないものあ
るいは弱いものを用いる方が、グロリンイミノペグチダ
ーゼ生成に関与する遺伝情報を担うDNAフラグメント
を組み込んだプラスミドを保有する形質転換株全選別、
分離するのく都合よい。
中でデロリンイば〕(ブチグーぜ活性をもたないものあ
るいは弱いものを用いる方が、グロリンイミノペグチダ
ーゼ生成に関与する遺伝情報を担うDNAフラグメント
を組み込んだプラスミドを保有する形質転換株全選別、
分離するのく都合よい。
かくして得られ九グoリフイミノペグチダーゼ生産M’
ft−培養する方法は、従来のエシェリヒア属のj@養
方法と特に変らない。すなわち培地としては炭素源、窒
素源、無機イオン、さらに必要に応じアi)酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養Aを社有する通常のものである。
ft−培養する方法は、従来のエシェリヒア属のj@養
方法と特に変らない。すなわち培地としては炭素源、窒
素源、無機イオン、さらに必要に応じアi)酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養Aを社有する通常のものである。
ffl、11としてはグルコース、シュクロース等及び
これらを含有する澱粉加水分解、m嬢等が用^1、?L
る。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、ア
ンモニウム塩、その他が便用できる。
これらを含有する澱粉加水分解、m嬢等が用^1、?L
る。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、ア
ンモニウム塩、その他が便用できる。
より好ましくはペプトン、トリプトン、肉エキス。
酵母エキス等の天然素材なども使われる。
培jlFは好気的条件下で培地の−及び温度を適宜81
4節しつつ、実質的にグロリンイミノベグチダーゼの生
成S積が最高になるところまで行われる。
4節しつつ、実質的にグロリンイミノベグチダーゼの生
成S積が最高になるところまで行われる。
培養画体よりグロリンイミノペデチグーゼヲ採取するK
は通常以下のような方法が用いられる。
は通常以下のような方法が用いられる。
培養菌体を冷却遠心機等で集菌した後、適当なバッファ
ーVc4濁し1.ffl音波あるいはグイノビルなどで
酸体全破砕して抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安沈
澱分画法(好ましくは、塩析分画として硫安40−80
%飽和画1缶)、DEAlirToyopearl(東
ソー社製)などの高速液体りσマドグラフィーなどを行
い、さらにハイドロキシアノ卆タイトなどのイオン交換
クロマトグラフィーなどを行ってゾロリンイミノ4デチ
グーゼの槽製傾品乞得る。
ーVc4濁し1.ffl音波あるいはグイノビルなどで
酸体全破砕して抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安沈
澱分画法(好ましくは、塩析分画として硫安40−80
%飽和画1缶)、DEAlirToyopearl(東
ソー社製)などの高速液体りσマドグラフィーなどを行
い、さらにハイドロキシアノ卆タイトなどのイオン交換
クロマトグラフィーなどを行ってゾロリンイミノ4デチ
グーゼの槽製傾品乞得る。
以上1本発明の微生物を用いることにょシ、従来知られ
ているエシェリヒア・コリーのデロリンイミノペ!チグ
ーゼ生産菌を用いる場合に比べ、単位蛋白質あたりの生
産量が極めて高いことにより、プロリンイミノ(グチダ
ーゼの分離・精製)際に有利である。
ているエシェリヒア・コリーのデロリンイミノペ!チグ
ーゼ生産菌を用いる場合に比べ、単位蛋白質あたりの生
産量が極めて高いことにより、プロリンイミノ(グチダ
ーゼの分離・精製)際に有利である。
tたグロリンイミノペデチグーゼの用途としては、本#
累の基質%異性がPro−X−・・・のProの慢を特
異的に切断しX−・・・なる4グテドt−遊離するとこ
ろから、リコンビナント法で先導蛋白質と目的蛋白質を
連結した融合蛋白質を蓄積せしめる場合に、先導蛋白質
と目的蛋白質との間にProを配オした融合蛋白質とし
て蓄積せしめ、先4蛋白質部分ヲアミノペデチダーゼ−
Mなどおよびアばノにブチダーゼ−Pによ#)にrl所
し、N末端1cProが付加した目的蛋白質を取得し、
しかる後にプロリンイミノ(デチダーゼを作用式せるこ
とによりN末端の揃り之目的蛋白質金取得することなど
に用いられる。!’TtH昭63−6284 )。
累の基質%異性がPro−X−・・・のProの慢を特
異的に切断しX−・・・なる4グテドt−遊離するとこ
ろから、リコンビナント法で先導蛋白質と目的蛋白質を
連結した融合蛋白質を蓄積せしめる場合に、先導蛋白質
と目的蛋白質との間にProを配オした融合蛋白質とし
て蓄積せしめ、先4蛋白質部分ヲアミノペデチダーゼ−
Mなどおよびアばノにブチダーゼ−Pによ#)にrl所
し、N末端1cProが付加した目的蛋白質を取得し、
しかる後にプロリンイミノ(デチダーゼを作用式せるこ
とによりN末端の揃り之目的蛋白質金取得することなど
に用いられる。!’TtH昭63−6284 )。
実施例1゜
エシェリヒア・コリ)H3101(Boy@r 、 H
,W、 etal、、Mo1.Blol、41,459
(1969))kプロリンイミノ−Z fチダーゼを生
抜する原塊として、次のような方法でデロリンイミノペ
デチダーゼ生成に関与する遺伝情報を担うDNAフラグ
メント金分離し、!fr規に著量のグロリンイミノベ!
チダーゼ全生産する菌を造成し比。
,W、 etal、、Mo1.Blol、41,459
(1969))kプロリンイミノ−Z fチダーゼを生
抜する原塊として、次のような方法でデロリンイミノペ
デチダーゼ生成に関与する遺伝情報を担うDNAフラグ
メント金分離し、!fr規に著量のグロリンイミノベ!
チダーゼ全生産する菌を造成し比。
(1)染色体DNAの調製
エシェリヒア・コリ)(BIOIを4QQa7のL培地
(トリプトン1チ、酵母エキス0.5%、NaCto、
5係、グルコース0.1憾、pH7,2に祠4)中3
70で約3時間振盪培養金行い、対数増殖期の菌体を嗅
菌凌フェノール法による通常のDNA抽出法(II。
(トリプトン1チ、酵母エキス0.5%、NaCto、
5係、グルコース0.1憾、pH7,2に祠4)中3
70で約3時間振盪培養金行い、対数増殖期の菌体を嗅
菌凌フェノール法による通常のDNA抽出法(II。
5aiko and K、Mlura 、Bioe
hlrn、Blophym、Aeta。
hlrn、Blophym、Aeta。
72.019(1963))によって染色体DNAを抽
出イぎ製し、f&終20ηを得之。
出イぎ製し、f&終20ηを得之。
(2) 染色体DNA断片のベクターへの挿入(1)
で得た染色体DNAおよびベクターpBR322(タカ
ラ市販品)の各10 Allをとり、各々に制限エンド
ヌクレアーゼの1種、Pstlt−370,i時間作用
させてDNA鎖を切断した。次に各々t−フェノール処
理、クロロホルム処理(&、エタノール1lin収し1
両DNA切断物を1mMATP、及び10−ジチオスレ
イトール、 6.6 mM MgCl2 ’に含む6
6 rnM Trl 5−HCt%−7,5中でT4D
NAすf−ゼ(タカラ)100ユニツトと共に混合し、
混合物を4℃、−昼夜原石させ丸。
で得た染色体DNAおよびベクターpBR322(タカ
ラ市販品)の各10 Allをとり、各々に制限エンド
ヌクレアーゼの1種、Pstlt−370,i時間作用
させてDNA鎖を切断した。次に各々t−フェノール処
理、クロロホルム処理(&、エタノール1lin収し1
両DNA切断物を1mMATP、及び10−ジチオスレ
イトール、 6.6 mM MgCl2 ’に含む6
6 rnM Trl 5−HCt%−7,5中でT4D
NAすf−ゼ(タカラ)100ユニツトと共に混合し、
混合物を4℃、−昼夜原石させ丸。
(3) コンピテント細胞の調製
エシェリヒア・コリD)il (Low、B、 Pro
a、Natl。
a、Natl。
人cad、 8el、、 60.160(1968)
) t 50 atのL培地に接種し、培養液の650
mμにおける吸光反がおよそ0.4〜0.5 Kなるま
で30℃で振盪培養した。
) t 50 atのL培地に接種し、培養液の650
mμにおける吸光反がおよそ0.4〜0.5 Kなるま
で30℃で振盪培養した。
培養終了後、培養液をOCにて20分間放置し。
次に菌体を遠心分離により集め、50 mM CaC6
2溶液25mK懸濁し、0℃に1時間放置後、遠心分離
により菌体を集め、50 m)/L CaCZ2と20
チグリセロール溶液5dに菌体f:再び悟濁し、得られ
た菌体懸濁液を0.5 #L/ずつエツペンドルフチ、
−グに入れ、−70℃にて凍結保存した7 (4) 形質転換と形質転換株の取得(3ンで調製し
九コンピテント細胞憑濁液200μ2YC<2) テv
4mし7’j DNA溶fg、1−加え、0℃、30分
間放(lf俵、420で2分間のヒートショックを与え
皮袋、再び0℃に30分間放置してDNA t−細胞内
に取込ませた。
2溶液25mK懸濁し、0℃に1時間放置後、遠心分離
により菌体を集め、50 m)/L CaCZ2と20
チグリセロール溶液5dに菌体f:再び悟濁し、得られ
た菌体懸濁液を0.5 #L/ずつエツペンドルフチ、
−グに入れ、−70℃にて凍結保存した7 (4) 形質転換と形質転換株の取得(3ンで調製し
九コンピテント細胞憑濁液200μ2YC<2) テv
4mし7’j DNA溶fg、1−加え、0℃、30分
間放(lf俵、420で2分間のヒートショックを与え
皮袋、再び0℃に30分間放置してDNA t−細胞内
に取込ませた。
次に、この#i濁液KL培地を1d加え、37℃で1時
間培養を行りた後、テトラサイクリン20μllAlを
含有するL培地寒天プレートに塗床し37℃で1晩メン
キ、ベートした。出現したコロニーを今度はアンピアリ
ン25μb電を富有するL培地寒天プレートにそれぞれ
塗床し、37℃で一晩インキ、ベートし生育のWit検
定し、テトラサイクリンを含む培地では生育するがアン
ピシリンを倉む培咄では生育しないコロニーをデロリ/
イξノイデチダーゼ生産を検定する候補法としてpla
kupした。
間培養を行りた後、テトラサイクリン20μllAlを
含有するL培地寒天プレートに塗床し37℃で1晩メン
キ、ベートした。出現したコロニーを今度はアンピアリ
ン25μb電を富有するL培地寒天プレートにそれぞれ
塗床し、37℃で一晩インキ、ベートし生育のWit検
定し、テトラサイクリンを含む培地では生育するがアン
ピシリンを倉む培咄では生育しないコロニーをデロリ/
イξノイデチダーゼ生産を検定する候補法としてpla
kupした。
(5) プロリンイはノペグチダーゼ生産の検定(4
)でpiak up した約1000コロニーの検定候
補法をそれぞれテトラサイクリン20μI/Witを含
むL−培地3oopt Vc*Wi (96穴グレート
使用)シ。
)でpiak up した約1000コロニーの検定候
補法をそれぞれテトラサイクリン20μI/Witを含
むL−培地3oopt Vc*Wi (96穴グレート
使用)シ。
30℃で24時間培養した。
この培養液の菌体懸濁/[0,l rnlに、20 m
MTrfs−HCl (pH8,5)を0.8 ILt
加え、さらに基質であろ5 mMPro−β−Naph
tylamld* f?、0.1 tLl加えて、37
℃で10分間反応させ几1反応後この反応液に0、5
馴−イの Fagt Garnet GBC(10
% ト リ ト ン X −100ft含む1M酢酸緩
衝液(メ14,0沫」かして0.1チとしたもの)を加
え、不d物と遠心する$により除いた後、上清のアゾ色
素(赤色)の生成量t−550nmの吸収で測定した。
MTrfs−HCl (pH8,5)を0.8 ILt
加え、さらに基質であろ5 mMPro−β−Naph
tylamld* f?、0.1 tLl加えて、37
℃で10分間反応させ几1反応後この反応液に0、5
馴−イの Fagt Garnet GBC(10
% ト リ ト ン X −100ft含む1M酢酸緩
衝液(メ14,0沫」かして0.1チとしたもの)を加
え、不d物と遠心する$により除いた後、上清のアゾ色
素(赤色)の生成量t−550nmの吸収で測定した。
その結果、原塊のHBlolの対filc比べ約10倍
程活性の強い候補法が得られた。
程活性の強い候補法が得られた。
この候補法について、さらに無細胞抽出物レペルでの#
:Jg活性を検討するために以下の実験を行りた・ 20/Jわ41のテトラサイクリンを含むL−培地の1
001ntの入った坂ロフラスコに植菌し300で一晩
振!i培養し、培養終了後集画し20mMTr1m−H
Cl 、 48.5溶Fg、に懸濁し、OCで超音波破
砕し4心により抽出液を得几。この細胞抽出液を用いて
次のようにグロリンイiノペデチダーゼの活性を測定し
九。
:Jg活性を検討するために以下の実験を行りた・ 20/Jわ41のテトラサイクリンを含むL−培地の1
001ntの入った坂ロフラスコに植菌し300で一晩
振!i培養し、培養終了後集画し20mMTr1m−H
Cl 、 48.5溶Fg、に懸濁し、OCで超音波破
砕し4心により抽出液を得几。この細胞抽出液を用いて
次のようにグロリンイiノペデチダーゼの活性を測定し
九。
20 mM Tr is −HCl t p)18.5
のl mlと細胞抽baの0、25 atと1mJdの
Pro−βNaphthylarnideの0.251
とk rA合し、30Cで10分間反応し友、そして1
00℃で2分間の熱処理により反応全停止した後、1M
酢酸バッファー、pH4,0と10声のTrt ton
X−100からなる溶液中1η〜の濃度でFist
GarnaL GBCf含む試薬to、sig加えて発
色させ友、この赤色度を550 runの吸収で測定し
た。
のl mlと細胞抽baの0、25 atと1mJdの
Pro−βNaphthylarnideの0.251
とk rA合し、30Cで10分間反応し友、そして1
00℃で2分間の熱処理により反応全停止した後、1M
酢酸バッファー、pH4,0と10声のTrt ton
X−100からなる溶液中1η〜の濃度でFist
GarnaL GBCf含む試薬to、sig加えて発
色させ友、この赤色度を550 runの吸収で測定し
た。
そノ&lj来、filK示スヨうに泳法HBIOI 9
Lび宿主株DI(l ic比し約8倍の比活性の上昇
が認められた。tた、このffl換え菌株をpIP O
f/DH1と命名した6なお、本菌株はFERM−P
1033/として存託されている。
Lび宿主株DI(l ic比し約8倍の比活性の上昇
が認められた。tた、このffl換え菌株をpIP O
f/DH1と命名した6なお、本菌株はFERM−P
1033/として存託されている。
またユニットは
として表わした。
表 1
(6) pIPOlの挿入DNA部分の割飼m素地図
プロリ/イイノペグチダーゼ生成に関与する遺伝情報を
担うDN人フラグメ/トを富むプラスミドpIPO1は
常法により調製された( T、Manlattsat
@t、、Mo1ecular Cloning
、 p93(1982)、ColdSpring H
arbor LaboraLory )。
プロリ/イイノペグチダーゼ生成に関与する遺伝情報を
担うDN人フラグメ/トを富むプラスミドpIPO1は
常法により調製された( T、Manlattsat
@t、、Mo1ecular Cloning
、 p93(1982)、ColdSpring H
arbor LaboraLory )。
そして主として61基配列全認識する制限酵素での切断
により制限酵A地囚全作製したところ図IK示すような
切断部位を有することが分った。
により制限酵A地囚全作製したところ図IK示すような
切断部位を有することが分った。
ま次Pstlで切す出した挿入部分はほぼ7kbの大き
さであった。
さであった。
′)A施例2゜
次にpIPOlの71cbの挿入フラグメント全Ei4
4A化するためtC以下のような検討を行った・先ずp
lPOlより7 kbのPat lフラグメントを切り
出し、プラスミドpUc19のPmtlサイトに挿入し
たprP02ft構築した(図2)。すなわち、plP
O120μgを制限酵素PlIで切断し、この反応液を
エチノウムブロマイドを含む0.9チアがロースグル電
気泳動により4.4kbと7 kbの2つのフラグメン
トを分離し、7kbフラグメントのグルt−切り出した
。この)f A/ Ie透析チューブに入れ4気的に透
析チューブ中の90raMTr1g−ホウ酸バッファー
−7,5に浴出させ、フェノール処刑、クロロホルム6
厘を行い、エタノール沈澱として7 kbのフラグメン
トを5μm回収した。そしてこの7 kb 7ラグメン
トとPstlで切断したグラスミドpUc19と連結反
応を行い因2に示したpIP02を選択した。
4A化するためtC以下のような検討を行った・先ずp
lPOlより7 kbのPat lフラグメントを切り
出し、プラスミドpUc19のPmtlサイトに挿入し
たprP02ft構築した(図2)。すなわち、plP
O120μgを制限酵素PlIで切断し、この反応液を
エチノウムブロマイドを含む0.9チアがロースグル電
気泳動により4.4kbと7 kbの2つのフラグメン
トを分離し、7kbフラグメントのグルt−切り出した
。この)f A/ Ie透析チューブに入れ4気的に透
析チューブ中の90raMTr1g−ホウ酸バッファー
−7,5に浴出させ、フェノール処刑、クロロホルム6
厘を行い、エタノール沈澱として7 kbのフラグメン
トを5μm回収した。そしてこの7 kb 7ラグメン
トとPstlで切断したグラスミドpUc19と連結反
応を行い因2に示したpIP02を選択した。
次にp lPO2をBamHlで切断し、そのまま再び
連結反応を行い、デロリンイiノベデチダーゼ遺伝F部
分が若干小さくなったplPO3を得た(図2)。
連結反応を行い、デロリンイiノベデチダーゼ遺伝F部
分が若干小さくなったplPO3を得た(図2)。
同じようにplPO2を5ail 6るいは3tulと
5rna、lで切断して再連結反応を行いゾロリンイミ
ノイデチダーゼ遺伝子f、短R6化したpIP(J4
、 plPO5をそルぞれ得た(図2)。
5rna、lで切断して再連結反応を行いゾロリンイミ
ノイデチダーゼ遺伝子f、短R6化したpIP(J4
、 plPO5をそルぞれ得た(図2)。
また、先に得た7kbのPsL)フラグメンh2gao
RIと8allで切断し、プラスばドPIJC18fc
&oR[とSl、11で切断し几ものと連結反応を行
ってデaリンイiノイプチダーゼ遺伝子のEcoRJ
、 Sal II析片の挿入されたpIPO8t−得た
6さらに、pIPO4をEcoRlで切断し、自己連結
することによりp lPO7を得た。(図2) これらのprPO2、pIPO3、plPO4、pIP
O5。
RIと8allで切断し、プラスばドPIJC18fc
&oR[とSl、11で切断し几ものと連結反応を行
ってデaリンイiノイプチダーゼ遺伝子のEcoRJ
、 Sal II析片の挿入されたpIPO8t−得た
6さらに、pIPO4をEcoRlで切断し、自己連結
することによりp lPO7を得た。(図2) これらのprPO2、pIPO3、plPO4、pIP
O5。
p lPO7およびpIPO8でそれぞれエシェリヒア
・コIJ JMRB味を形質転換し念珠を実施例1によ
って述べた方法でグロリンイばノペデテダーゼ活性検定
し九ところp I P 04/JM83株、!: PI
PL)5/JM83株#i rtnの)IBIOIある
いri宿主株JM83に比べ約25倍の比活性を示した
(表2)、またpXPO7/JM83とpIPO8/J
M83の両法は製法と同じ活性であるところからプロリ
/イイノベデチダーゼ生成九関与する遺伝情報を担うD
NAフラグメントは7 kb中のPmtl−Ballあ
るいはPsLI−8tul 4〜4.5kbのフラグメ
ント中に存在することが明らかとなりた。ここに高いコ
ピー数にまでエクエリヒア・コリ内でrim製・】1能
なpUCベクターを用いることによって着清のデaリン
イミノペデチグーぜを生産するplPO5/JM83菌
沫を造成することに成功した0本I株はFεRM−P
to332として詳託されている。
・コIJ JMRB味を形質転換し念珠を実施例1によ
って述べた方法でグロリンイばノペデテダーゼ活性検定
し九ところp I P 04/JM83株、!: PI
PL)5/JM83株#i rtnの)IBIOIある
いri宿主株JM83に比べ約25倍の比活性を示した
(表2)、またpXPO7/JM83とpIPO8/J
M83の両法は製法と同じ活性であるところからプロリ
/イイノベデチダーゼ生成九関与する遺伝情報を担うD
NAフラグメントは7 kb中のPmtl−Ballあ
るいはPsLI−8tul 4〜4.5kbのフラグメ
ント中に存在することが明らかとなりた。ここに高いコ
ピー数にまでエクエリヒア・コリ内でrim製・】1能
なpUCベクターを用いることによって着清のデaリン
イミノペデチグーぜを生産するplPO5/JM83菌
沫を造成することに成功した0本I株はFεRM−P
to332として詳託されている。
第1図はpIPOlのプロリンイミノ(ブチr−ゼの遺
伝子の制限酵素池図 第2図はplPOlより各種プロリンイミノペデチダー
ゼ発現プラス°ミドの構築図。 特許出題人 味の素株式余社 stI \ \ \
伝子の制限酵素池図 第2図はplPOlより各種プロリンイミノペデチダー
ゼ発現プラス°ミドの構築図。 特許出題人 味の素株式余社 stI \ \ \
Claims (1)
- エシェリヒア属の有するプロリンイミノペプチダーゼを
コードする遺伝子を組み込んだプラスミドを含有するエ
シェリヒア属細胞を培養し、プロリンイミノペプチダー
ゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダ
ーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26556988A JPH02113887A (ja) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えdna及び該組換えdnaを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26556988A JPH02113887A (ja) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えdna及び該組換えdnaを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02113887A true JPH02113887A (ja) | 1990-04-26 |
Family
ID=17418935
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26556988A Pending JPH02113887A (ja) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えdna及び該組換えdnaを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02113887A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994026882A1 (en) * | 1993-05-18 | 1994-11-24 | Quest International B.V. | Proline iminopeptidase, process for its preparation and its use in the flavouring of food compositions |
EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
WO2008126783A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | ジペプチドの製造法 |
-
1988
- 1988-10-21 JP JP26556988A patent/JPH02113887A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994026882A1 (en) * | 1993-05-18 | 1994-11-24 | Quest International B.V. | Proline iminopeptidase, process for its preparation and its use in the flavouring of food compositions |
EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
WO2008126783A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | ジペプチドの製造法 |
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