JPH02111731A - 薬物−単クローン性抗体結合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クロスリファレンス この出願は、この出願の譲受人により所有され、この出
願と同日に提出されたピータ−・Ｄ・センター（Ｐｅｔ
ｅｒ　Ｄ、　５ｅｎｔｅｒ）の「抗腫瘍プロドラッグ」
と題する出願に関連する。

発明の背景 本発明は腫瘍細胞の細胞毒性物質を供給する方法に関す
る。

細胞毒性物質に対する担体として、腫瘍間連単クローン
性抗体を使用することは過去数年内に著しくン主目され
た〔モラー（Ｍｏｌｌｅｒ）　、１９８２　）。

この研究の多くの目的は抗癌薬物の効力を改良し、同時
に好ましくなく、しばしば有害な副作用を減少させるこ
とであった。研究は抗体が腫瘍に対して抗癌薬物を供給
する働きをする抗体−薬物供給体の使用によりこの目的
を達成するために試みられ、または提案された。

この方法が有効であるためには抗体が非常に腫瘍選択性
であること、および薬物が活性な細胞毒性形態で供給さ
れることが必要である。メトトレキサート〔エンド（［
Ｅｎｄｏ）　、１９８　’ｔ〕、ダウノマイシン〔ガレ
ゴ（ＧａｉｌｅｇＯ）ほか、１９８４’］、マイトマイ
シンＣ（ＭＭＣ＞　　［：オーカ’７　（Ｏｈｋａｗａ
）ほか、１９８６）およびビンカアルカロイド〔ローラ
ンド（Ｒｏｗｌａｎｄ）ほか、１９８６：］のような薬
物が抗体に結合され、その誘導された結合体について抗
腫瘍活性が研究された。多くの場合に、そのような結合
体のスポラチック（ｓｐｏｒａｔ　ｉｃ　）活性は抗体
に共有的に結合したとき（ピ薬物の減少した活性に帰着
できる。遅い非特異的遊離、例えば加水分解をうける比
較的安定な化学結による薬物に対する抗体の結合を示す
多くの例がある。

薬物が抗体から、しかし化学的に変性された形態で遊離
されるときに他の問題が生ずることができる。薬物が次
にその活性の部位に接近できるけれども、化学的に変性
された薬物が有意に低い効力であることができる。

これらの考察のために、薬物がその最大水準の活性を及
ぼすことができるように化学的に変性されない薬物を抗
体から遊離できる新結合方策、すなわち、新規薬物−抗
体結合体の開発に対する要求がある。研究は、マイトマ
イシンＣ（ＭＭＣ）、マイトマイシンＡ　（ＭＭＡ）お
よびダウノマイシンのベンジルカルバメートジスルフィ
ド誘専体であるプロドラッグ化合物が、ジスルフィド結
合が還元されると化学的に変性されていない薬物を遊離
することを示した〔センタ（Ｓｅｎｔｅｒ）　、クロス
リファレンス特許出願；第１図参照〕。

発明者は、多くの固形腫瘍が酸素不足環境中に存在し、
高水準の還元性物質例えばグルタチオン、ＮＡＤＨおよ
びＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを有することが示された〔サート
レリ　（Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ）　、１９８６　）ので
、薬物遊離をジスルフィド結合の還元にたよるプロドラ
ッグ方策が腫瘍関連抗体による腫瘍に対する薬物の供給
に理想的に適することができると考えた。これらの還元
性物質はヘンシルカルバメートジスルフィド薬物結合体
からジスルフィド結合の還元により′ＴＩ離薬物のａ離
を行なうことができる。

薬物−抗体結合体に対するベンジルカルバメートジスル
フィドリンカ−の使用はまた、抗体が細胞の内側に受容
体仲介エンドサイト−シスにより取込まれる場合に薬物
の細胞内遊離に対する使用であることができる。従って
、細胞内チオール例えばグルタチオンがジスルフィド結
合結合体を還元できよう。

発明の概要 本発明は抗体と薬物とが、ジスルフィドベンジルカルバ
メート、例えばＭＭＣ−抗体結合体、またはジスルフィ
ドベンジルカーボネート、例えばエトポシド−抗体結合
体、を用いて連結される薬物−抗体結合体である。

他の観点において本発明は、本発明による薬物−単クロ
ーン性抗体を、哺乳動物に投与することにより活性抗腫
瘍薬物を哺乳動物中の腫瘍細胞の部位に供給する方法で
ある。

ジスルフィド結合還元が薬物断片形成プロセスを開始し
、それにより親、すなわち非変性薬物が活性な細胞毒性
形態で遊離されることはクロスリフアレした出願中に示
された。さらに、薬物遊離の速度はジスルフィドの立体
障害により制ｉｌｌできる。クロスリファレンス出願に
記載される化学の使用が薬物活性の有意な低下がなかっ
た。実質的に同様の方法が、部位特異的免疫療法のため
の抗体に対するアミン基含有薬物並びに等価のヒドロキ
シル基含有薬物およびタンパク質毒素の結合に有用であ
ると認められた。

発明の詳細な説明 本発明は一般構造式、 を有する抗腫瘍薬物−単クローン性抗体結合体である。

た−゛し式中、 Ｄはその幹に対するペンダント、式Ｒ’　Ｎ　Ｈ−によ
り表わされる第一級アミノ基、式Ｒ’Ｒ”Ｎ−により表
わされる第二級アミノ基、および式Ｒ’Ｏ−により表わ
されるアルコール基からなる群から誘導された化学的反
応性官能基（それにより薬物幹がジスルフィドベンジル
オキシカルボニル基に結合される）を有する抗腫瘍薬物
部分であり； Ｒ１はＤが第一級アミノ基、第二級アミノ基、およびア
ルコール基からなる群から誘導されるときの前記薬物部
分の幹であり、たソし第二級アミノ基の場合にＲ１およ
びＲ２は独立である；Ｒ２、Ｒ１およびＲ２が独立であ
るとき、は１〜１０個の炭素原子を有する非置換および
置換、並びに枝分れおよび直鎖アルキル基（た−゛し置
換基は１〜３個の炭素原子を有する１〜３個のアルコキ
シ基および１〜３個のハロ基から選ばれる）；非置換お
よび置換フェニル（た〜°し置換基は１〜３個の炭素原
子を有する１〜３個のアルキル基、１〜３個の炭素原子
を有する１〜３個のアルコキシ基および１〜３個のハロ
基から選ばれる）；並びに非置換および置換フェニルア
ルキル（たりしフェニル部分は置換されているとき置換
フェニルの場合に示したように置換され、アルキル部分
は１〜３個の炭素原子を有するポリアルキレン基である
）から選ばれ； Ｒ１およびＲ２は第二級アミンから誘導された官能基中
で一緒になったとき、前記第二級アミン基を構成する窒
素原子に化学的に結合した二価基を有する薬物部分りの
幹を表わし； Ｒ３およびＲ４は独立に、Ｈ並びに１−１０個の炭素原
子を有する非置換および置換、並びに枝分れおよび直鎖
のアルキル基（たソし置換基は１〜３個の炭素原子を有
する１〜３個のアルコキシ基および１〜３個のハロ基か
ら選ばれる）；非置換および置換フェニル（た＼“し置
換基は１〜３個の炭素原子を有する１〜３個のアルキル
基、１〜３個の炭素原子を有する１〜３個のアルコキシ
基および１〜３個のハロ基から選ばれる）；並びに非置
換および置換フェニルアルキル（たゾしフェニル部分は
置換されているとき置換フェニルの場合に示したように
置換され、アルキル部分は１〜３個の炭素原子を有する
ポリアルキレン基である）から選ばれ； ｍは１〜１０から選ばれる整数であり；Ａｂはペンダン
トアミノ基を有する単クローン性抗体を表わし： ベンジルカルバメート部分のフェニル環上の基Ｓ　　Ｓ
　　（ＣＲ’　Ｒ’）−ＣＮ　ＨＡｂの置換位置はオル
ト−およびバラ−位から選ばれる。

代表的、な前記アミノ基含有薬物はマイトマイシン−Ｃ
１マイトマイシン−Ａ１ダウノマイシン、アドリアマイ
シン、アミノプテリン、アドリアマイシン、ブレオマイ
シン、およびそれらの誘導体であり、代表的な前記アル
コール基含有薬物はエトポシドである。

用いた略号は次のとおりである：ＭＭＣ，マイトマイシ
ンＣＯＭＭＡ、マイトマイシンＡ１ＤＡＵ、ダウノマイ
シン；ＰＢＳ、リン酸塩ＨＩｉ食塩水：ＨＰＬＣ１高速
液体高速液体クロラフトグラフィー、ジチオトレイトー
ル；お、上びＡｂ、単クローン性抗体。

他の観点において、本発明はＮＡＤＨ。

ＮＡＤＰＨおよびグルタチオンの群の少くとも一員を含
む内因性還元性物質の高水準を有する哺乳動物中の腫瘍
細胞の部位に、幹に対するペンダント、弐Ｒ１ＮＨ−に
より表わされる第一級アミノ基、式Ｒ’Ｒ”Ｎ−により
表わされる第二級アミノ基、および式Ｒ’Ｏにより表わ
されるアルコール基（たゾしＲ１およびＲ２は前記のと
おりである）からなる群から選ばれる化学的反応性官能
基を有する活性抗腫瘍薬物を供給する方法であって、（
ａ）哺乳動物に式■を有する抗腫瘍薬物−単クローン性
抗体結合体の抗腫瘍有効量を投与する段階、 （ｂ）　　抗腫瘍薬物−単クローン性抗体を内因性還元
条件に接触させる段階、および （Ｃ）　　抗腫瘍薬物−単クローン性抗体結合体を還元
的に切断させて結合体から遊離薬物を遊離させる段階、 を含む方法である。

本発明による結合体は、薬学的組成物として、腫瘍に冒
された宿主、殊に哺乳動物宿主、例えば実験動物宿主の
治療に対し本発明の方法による使用を提供することがで
きる。薬学的組成物は本発明による結合体の抗腫瘍有効
量、すなわち腫瘍増殖抑制量および薬学的に許容される
担体、および場合により普通の薬学的に許容される賦形
剤および補助剤を含む。

本発明の免疫結合体の抗体成分には、腫瘍関連抗原に特
異的に結合する任意の抗体が含まれる。

そのような抗体の例には癌腫、黒色腫、リンパ腫並びに
骨および軟組織肉腫、並びに他の腫瘍上に見出される抗
原に特異的に結合するものが含まれ、しかしそれらに限
定されない。細胞表面に長時間結合して保たれるか、ま
たは取込まれる抗体が好ましい。これらの抗体は多クロ
ーン性、好ましくは単クローン性であることができ、よ
く確立された技術を用いて製造することができる〔例え
ばドベガー（Ｒ，＾、ＤｅＷｅｇｅｒ）ほか、「クロラ
ムブシルー抗体複合体によるマウスリンパ腫および黒色
腫細胞の根絶」、イムノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅｖ、）　　、６２、ｐｐ
、　　２９〜４５（１９８２）　　（腫瘍特異的多クロ
ーン性抗体が製造され、結合体に使用される）、および
イエ−（Ｍ、Ｙｅｈ　）ほか、「単クローン性抗体によ
り確認されたヒト黒色腫の細胞表面抗原」、プロシーデ
イングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オプ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、）、７６、ｐ、２９２７　（１９７９）　、並び
にブラウン（Ｊ、Ｐ、Ｂｒｏｗｎ）ほか、「ヒト黒色腫
関連抗原ｐ９７の単クローン性抗体による構造確認」、
ジャーナル・オン・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、）、１２７（隘２）ｐｐ、５３９〜５４６　（１９
８１）（腫瘍特異的単クローン性抗体が製造された）参
照）。

薬学的担体は通常液体組成物を与えるため液体であるが
、しかし固体組成物が胃腸管からの低い吸収を有すると
予想されるので、液体組成物が一層好ましいと予想され
る。本発明による結合体は、無菌水または他の液体媒質
中に溶解または懸濁して経口投与または非経口投与に対
する溶液および懸濁液並びに乳濁液を与えることができ
る無菌可溶性結合体または組成物として提供することが
できる。経口投与に適する液体担体の例には水、アルコ
ール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ールおよび前記の２つまたはそれ以上の混合物が含まれ
る。非経口使用に適する液体担体の例には注射用水、生
理食塩水、および他の適当な無菌注射媒質が含まれる。

一般に、適当に緩衝した等張液の提供に液体担体ととも
に使用するのに適する緩衝剤には、若干の代表的な緩衝
剤をあげるとオルトリン酸三ナトリウム、炭酸水素ナト
リウム、クエン酸ナトリウム、Ｎ−メチルグルカミン、
Ｌ（＋）−リシン、およびＬ（＋）−アルギニンが含ま
れる。

薬学的組成物は式Ｉの少くとも１つの結合体あるいは前
記化合物の１つまたはそれ以上の混合物あるいはその他
の抗腫瘍剤との混合物を含む。式■の化合物の抗腫瘍有
効量は個々の適用、形態、用いる結合体の力価、および
組成物中の結合体の所望濃度により広く変動または調整
することができる。一般に、活性成分の量は組成物の全
重量を基にして約０．５〜９０重量％の範囲内にある。

悪性または良性の腫瘍に冒された哺乳動物宿主例えば実
験動物宿主を処置する治療使用において、本発明の結合
体は腫瘍の増殖の抑制に有効な量投与され、すなわち、
腫瘍増殖抑制量は約０．１〜約１５■／ｋｇ動物体重／
日の範囲内にあろう。結合体の実際の好ましい用量は治
療される動物の要求、使用される組成物および投与の経
路により広く変動する。抗新生物物質の作用を改変する
多くの因子は、例えば動物宿主の年令、体重および性；
食事；投与の時間；排出の速度；宿主の状態；疾患の重
さなどを含めて本発明が関連する当業者により考慮され
よう。投与は最大許容量内で同時または定期的に行なう
ことができる。所与組の条件に対する最適投与（または
適用）速度は、普通の投薬量決定試験を用いて当業者に
より容易に確認されることができる。

以下の実施例は本発明の範囲および有用性の例示であり
、本発明の範囲を限定すると解すべきではない。特に示
さなければ、部および百分率はすベて重量であり、温度
はセルシラス度である。化合物および結合体は第１およ
び２図に関連した番号が付けられる。

実験の部 Ｌ６と称されるヒト肺癌上の糖脂質抗原に反応するプロ
ティンＡ精製単りローン性抗体〔ヘルストロム（ｌｌｅ
ｌ　Ｉｓ　ｔｒｏｍ）ほか、１９８６）は叶５Ｋ。

Ｅ、および１．ヘルストロム（叶、　Ｋ、　Ｅ、および
■。

１１ｅｌｌｓｔｒｏａｉ、　Ｏｎｃｏｇｅｎ、　５ｅａ
ｔｔｌｅ）により提供された。

ヒト腫瘍細胞系Ａ３４９は叶、カチノ　（叶、Ｊ。

Ｃａｔｉｎｏ、　Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｃｏ、
、　Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ）により提供された。

結論（１１１丸定 免疫結合体を増殖培地中へ系列希釈し、１００μ１分割
量を１００μｌ増殖培地中で１×１０ｈ細胞とともに４
℃でインキュベートした。１時間後、細胞を、１：４０
希釈ヤギ抗マウスＴｇＧＦＩＴＣ（ベーリンガー・マン
ハイム （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）製〕を含
む１００μ＃培地中で２回、４℃で２０分間洗浄し再懸
濁した。

細胞を洗浄し、コールタ−（Ｃｏｕｌｔｅｒ）エピック
ス（Ｅｐｉｃｓ）　Ｖ螢光細胞アナライザーを用いて分
析した。各試験のため、同様に希釈したＭＡｂを非結合
陽性結合対照として用いた。

抜狭青Ａ凪兇奇止枚定 マコイス（ＭｃＣｏｙｓ）完全培地０．４＋／！中のＡ
３４９細胞を１２ウ工ル組織培養プレート中にｔ、ｏｏ
ｏ細胞／ウェルに塗布し、次いで３７℃で一夜インキユ
ベートした。細胞をＲＰＭＴ培地で洗浄し、マコイス培
地０．４ｍｌ！中の結合体を加えた。定期的間隔で（１
，３，６および２４時間）、細胞をＲＰＭＩで洗浄して
非結合結合体または薬物を除去し、新マコイス培地を加
え、インキュベーションを３７℃で合計２４時間続けた
。コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、オプテ
ィマックス（Ｏｐｔｉｍａｘ）　４０．１０イメージア
ナライザーで計数した。

−操　−１および２の澗 それぞれパラ−またはオルト−メルカプトベンジルアル
コール１３７［（０，５５ミリモル）およびピリジン０
．０４４ｍｆ　（０，５５ミリモル）の乾燥ジオキサン
１ｍｌ中の溶液をクロロギ酸トリクロロメチルＣ、０３
２艶（０，２７５ミリモル）のジオキサン０．５ｍｌ中
のかくはん溶液に３分間にわたって加えた。１５分間か
くはんした後、ＭＭＣ（９２ｍｇ、０．２７５　ミリモ
ル）およびトリエチルアミン（０，１５３ｄ、１．１ミ
リモル）のジオキサ２イ 蒸発させ、残留物のＣＨ２Ｃβ２中の溶液を飽和ＮａＨ
ＣＯ３、ＮａＣ　ｆ２で抽出し、乾燥した（Ｍｇ　Ｓ　
Ｏ　４）。

生成物を２　Ｘ　２　０ｃｍ５ｉ０２カラム上のフラッ
シュクロマトグラフィーにより、初めに非極性物質を石
油エーテル中の２０％酢酸エチル（３００ｍｊ２）で分
離し、次いでクロロホルム中の５％メタノールでカルバ
メートを溶出することにより精製した。

生成物、それぞれ化合物１および２、が無定形青色固体
として得られ、それを　ＣＨ２Ｃβ２　　３＋＋＋１に
溶解し、石油エーテル３０ｍｊ！に消却した。各化合物
１および２それぞれの場合に次の性質を有する固体生成
物が得られた： ＭＭＣベンジルカルバメートジスルフィド上：収率９２
％青色粉末；融点９９°　（分解）；’　Ｈ　　Ｎ　Ｍ
　Ｒ　（ｐｙｒ−ｄｓ）δ１．９５　（Ｓ，３Ｈ。

ＣＨｉ　）　、３．１　５　（ｓ，３Ｈ，ＯＣＲ，）　
、３．４〜４．２　（ｍ，　　６１ｆ）　、４．６〜５
．０　（ｍ，　　２Ｈ）、５、２０　（ｓ．　　２Ｈ，
　ＡｒＣＨｚ　）　、５．６　（ｄｄ，　　ＩＨ）　、
　６．９〜７．８　（ｍ，　　７　Ｈ，　ＡｒＨ）　、
８．３　５〜８、５　（ｍ，　　ＬＨ，　Ａｒ１（）　
　；　ＴＲ　（ＫＢｒ）　ｖ３４０、２９２０、１８９
０、１６００、１　５　５　２ｃｍ−’　；ｕｖ／ｖｉ
ｓ　（Ｃ　ＨｓＯ　Ｈ）λ１１ａｘ　３　５　６ｎｍ　
（Ｎａｇｅ　＝４、３１）。

ＭＭＣベンジルカルバメートジスルフィド２：収率６３
％青色粉末；融点９６〜９８°Ｃｉ’ＨＮ　Ｍ　Ｒ　（
ｐｙｒ−ｄｓ）δ１．９　０　（ｓ，　　３　Ｈ．　Ｃ
Ｈ：＋）、３、０　７　（ｓ，　　３　Ｈ．　０ＣＨ３
）、３．　４　〜３．　５　５　（ｍ。

２Ｈ）　、３．８　〜４．０　５　（ｍ．　　３　Ｈ）
　、４．６　〜５．０（ｍ，　　３Ｈ）　、４．８　５
　（ｓ，　　３Ｈ）　、５、３５〜５、７０　（ｍ，３
Ｈ）　、６．８〜７．７　（ｍ，７Ｈ。

＾ｒＨ）　、８．３５　（ｄ，ＩＨ，ＡｒＨ）；　ＩＲ
　（ＫＢｒ）ν　３４００，　　１６９２　、　１　６
　０　０　、　１５５２ｃｍ　−電　；ｕｖ／ｖｉｓ　
　（ＣＨｓＯＨ）　　λｍｍｘ　　３６５Ｈｍ　　（ｌ
ｏｇｓ　＝４．３２）　　。

化合物１１２５ｍｇ（０，２０５ミリモル）のアセトン
５　ｍｌｌ中の溶液に３−メルカプトプロピオン酸１８
μｍ　（０，２０５ミリモル）を加えた。１時間後さら
に１８μｌの３−メルカプトプロピオン酸を加え、合計
１％時間後に反応を終えた。溶媒を減圧下すこ除去し、
残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｓｉ　Ｏ□）
により塩化メチレン中の１０％メタノールを溶離剤とし
て用いて精製した。酸（５）をさらに精製することなく
次の段階に用いた。

酸（５）、０．１８６ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（４３曙、０．３７２ミリモル）およびジシ
クロへキシルカルボジイミド（７７■、０、３７２ミリ
モル）の乾燥ＤＭＦ２ｍｌ中の溶液を３時間かくはんし
た。沈殿を濾過し、酢酸エチルで洗浄した。溶媒を減圧
で除去し、た後、残留物を調製用Ｔ　Ｌ　Ｃ（Ｓｉ　Ｏ
ｚ）により塩化メチレン中の１０％インプロパツールを
用いて精製した。ヒドロキシスクシンイミドエステル（
６）が微小青色固体（２６ｍｇ）として得られた。’　
Ｈ−Ｎ　Ｍ　Ｒ（３６０ＭＨｚ、　ＣＤＣβ３）δ１．
７５　　（ｓ、　　３Ｈ，ＣＨ３）、２．８５　　（ｓ
、４Ｈ，スクシンイミドＣＨ２）、２．８〜３．１　　
（ｍ、　４Ｈ）　、３．８１　　（ｓ、　３Ｈ，○ＣＨ
，）、３．２０　　（ｍ、　　ＩＨ）、３．２７〜３．
５５　　（ｍ、　　３Ｈ）、３．７０　　（Ｑ、　　Ｉ
Ｈ）　、４．０　　（ｂｒ、　　ｓ、　　ＬＨ）、４．
３３　　（ｔ、　　ＩＨ）　、４．４０　（ｄ、　　Ｌ
Ｈ）、４．６〜５．４　　（ｍ、６Ｈ）　、７．４　　
（Ｑ、４Ｈ，ＡｒＨ）。

ヒドロキシスクシンイミドエステル８をピリジルジスル
フィド１および２−メルカプト−２−メチルプロピオン
酸から、化合物６の合成に対して記載したように製造し
た。微小青色固体（５５ｍｇ）が化合物１１００ｍｇで
出発して得られた。１ＨＮＭＲ（２２０ＭＨｚ、ＣＤＣ
ｎ３）　δ１．６８（ｓ。

６　Ｈ，２ＣＨ３）、１．７７　　（ｓ　、　　３　Ｈ
，ＣＨ３）、２．８３　　（ｓ、　４Ｈ，スクシンイミ
ドＣＨ２）、３．２０（ｓ　、　　３　Ｈ，ＯＣＨｓ）
、３．２５〜３．　’？　５　（ｍ、　　６Ｈ）　　、
４．２〜５．３　　（ｍ、　　６Ｈ）　　、７．４０　
　（ｑ、　　４Ｈ２＾ｒＨ）　　。

ヒドロキシスクシンイミドエステル１０はピリジルジス
ルフィド２および２−メルカプト−２−メチルプロピオ
ン酸から、化合物工の合成に対して記載したように製造
した。生成物■は化合物２７１ｍｇで出発して青色固体
（１０■）として得られた。　”ＨＮＭＲ（２２０ＭＨ
ｚ、　　ＣＤＣｊ！　２）６１．５３　（ｓ、　　３　
Ｈ，ＣＨｓ）、１．６１　　（ｓ、３Ｈ。

ＣＨ３＞、１．７８　（ｓ、　　３　Ｈ，ＣＨ３）、２
．９０（ｓ。

４Ｉ（、スクシンイミドＣＨ，）、３．２０　　（ｓ、
　　３Ｈ。

０ＣＨ３）、３．４〜３．８　（ｍ、６　Ｈ）　、４．
２１　（ｔ。

ＩＨ）　、４．４０　（ｄ、ＩＨ）　、４．５０　（ｂ
ｒｓ、２Ｈ）　、４．９０　　（Ｑ、　　Ｉ　Ｈ）　、
５．２〜５．４　（ｍ、　　４Ｈ）　、７．２〜７．４
　（ｍ、　　２　Ｈ，ＡｒＨ）　、７．８０（ｄ、２Ｈ
，＾ｒＨ）。

ヒドロキシスクシンイミドエステル、６．８．１０（２
，９〜３．７ｍＭ）のアセトニトリル中の溶液を、１０
０ｍＭ−ＮａＣ１ｌを含む５０ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）　１．５　ｍｅ中のＬ６抗体（２，６１ｏｗ
／ｍｌ）に３０℃で加えた。ヒドロキシスクシンイミド
エステル基および■（２０倍全モル過刺）を４等部分で
１０分間隔で、一方エステル６　（１０倍全モル過剰）
は２等部分でＯおよび１ｏ分に加えた。４０分後に沈殿
を遠心分離により除去し、上澄みをＰＢＳに対して４℃
で一夜透析した。透析物を約０．５ｇの５Ｍ−２ポリス
チレンビーズ（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）製〕ととも
に１ｏ分間４℃で穏やかに回転し、次いで無菌濾過して
抗体に共有結合しなかった薬物を除去した。結合体のＨ
ＰＬＣ分析（下記）は″ｔｉ離薬物または遊離薬物誘導
体が存在しないことを示した。得られた結合体の組成を
３６５Ｈｍ（ε−２１０８６）における薬物吸光度およ
び２８０Ｈｍにおける抗体吸光度（Ａｂｓ　２８０Ｈｍ
、１ｍｇ／ｍｊ！＝１．４）により測定し、次のとおり
であった：土工、０−８６　ｍｇ／　ｍ１Ａｂ（１，２
９■合計）、薬物７ｐ、ｂ＝４．３８／１　：ユ、０．
７０ｍｇ／　ｍＪＡｂ　（１，０５ｍｇ合計）、薬物／
抗体＝５．１４／１；１３い１．０７■／ｍｊ！Ａｂ（
１，６５■合計）、薬物／Ａｂ＝５．２５／１゜薬物成
分がアルコール基を含む薬物エトポシドであり、それに
よりエトポシドがカルバメート結合よりはむしろカルボ
ナート結合によりジスルフィドベンジル部分に結合する
抗腫瘍薬物−抗体結合体は実質的に前記操作に従うこと
により、初めにＭＭＣの代りにエトポシド（１６２■、
０．２７５ミリモル）゛を用いることによりエトポシド
ヘンシルカルボナートジスルフィドを与え、次いで生じ
たエトポシドベンジルカルボナートジスルフィドを結合
体調製の残余段階においてＭＭＣベンジルカルバメート
ジスルフィドの代りに用いることにより製造される。

もちろん、ＭＭＡ、ダウノマイシン、アドリアマイシン
および他のアミノ基含有薬物を前記実施例におけるＭＭ
Ｃの代りに使用できる。

植光生■支定立 結合体上上〜上１をＲＰＭＩおよび１０％ウシ胎児血清
を含む増殖培地等容積で希釈した。溶液を３７℃でイン
キュベートした。一部（０，２５ｍｊ’）を定期的間隔
でプロティンＡカラム（０，２５ｍｆりに適用し、カラ
ムをＰＢＳで洗浄して非結合物質を除去した。結合した
結合体を、１５ｍＭ−ＮａＣｌ２（０，５−）を含有す
る１００ｍＭ酢酸で溶出させ、速やかに中和した。分光
光度計分析を結合体の組成の決定に用いた。

結合体とジチオトレイトールとの反応 薬物−抗体結合体１１〜１３のＰＢＳ中の溶液にジチオ
トレイトール（最終濃度０．２ｍＭ）を加えた。室温で
１９時間後、分割量を１０ｃｍワットマン（Ｗｈａｔｍ
ａｎ）パータシル（Ｐａｒｔａｓｉｌ）　５０　Ｄ　Ｓ
　−３逆相（Ｃ−１８）カラムおよび次の勾配系を用い
てＨＰＬＣにより分析した二０．１％酢酸塩（ｐＨ６）
中の３０％ＣＨ３０Ｈ〜９５％ＣＨ３０Ｈ，６分；８分
間継続；流量２ｍｆ／分；３４０ｎｍでモニター。

結果および論議 結合体の製造 ヒドロキシスクシンイミドエステル６．８および■をマ
イトマイシンＣベンジルカルバメートピリジルジスルフ
ィド上およ碧１から、チオール置換酸によるジスルフィ
ド変換、次に酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドによる
エステル化を含む２段階法で製造した（第２図）。ヒド
ロキシスクシンイミドエステルと抗体Ｌ６とのｐＨ８，
５における反応は抗体−ＭＭＣ結合体上１〜■の形成を
生じた。結合体は非共有結合ＭＭＣを含まず、ＨＰＬＣ
およびＵν／ｖｉｓ分光法によ分離法された。

６ＭＭＣ分子程度が前記の化学を用いてＬ６に結合する
ことができた。おそらく、抗体上のアミノ基が活性薬物
上のヒドロキシスクシンイミドエステルを置換し、アミ
ド結合が抗体および薬物誘導体間に形成される。

結人体からのマイトマイシンＣの遊離 ジスルフィド結合還元で薬物脱離するベンジルカルバメ
ートジスルフィド薬物誘導体の能力は若干詳細に研究さ
れた〔センター（Ｓｅｎｔｅｒ）前掲）。

結合体上１〜土ユ中のジスルフィド結合の切断反応に対
する推定機構がＭＭＣの遊離を生ずる。

Ｌ６−ＭＭＣ結合体上土を過剰のジチオトレイトールで
還元し、反応をＨＰＬＣによりモニターした。真正試料
に比較することにより実証されるように（第３図）　、
ＭＭＣＪ離が生じたことが認められた。還元剤が存在し
ないとＰＢＳ中の結合体は反応条件のもとて全く安定で
あった。

ジスルフィド結合の立体障害が薬物抗体結合体の安定性
に効果を有するかどうかを決定することは関心であった
。障害ジスルフィドを有するリシンＡｔｊ￥免疫毒素が
類似の非障害免疫毒素より試験管内で一層安定であった
ことが前に報告された〔ウオレル（Ｗｏｒｒｅｌｌ）ほ
か、１９８６）。

結合体を、ＰＢＳ並びにＲＰＭＩおよび１０％ウシ胎児
血清を含む増殖培地の１：１溶液中で３７℃でインキュ
ベートした。結合体をプロティン−Ａアフィニティーカ
ラムで再分離した後、抗体結合を保持する薬物の量を測
定した。２４時間後、土工、■およびユはそれぞれ結合
薬物の４０％、２１％および９％を遊離した。従って、
高い結合体安定性を、ジスルフィド結合が障害される程
度の増加により達成できる。

人　の　Ａおよび゛　　　　　毒性 結合体をＡ３４９肺癌細胞系上の受容体に結合するそれ
らの能力について試験した。螢光活性化細胞選別は３結
合体がすべて非修飾抗体と全く同様に細胞に結合したこ
とを示した。薬物結合に用いた化学は抗体の結合力に明
らかに影響を与えなかった。

Ａ３４９細胞系に対する結合体の細胞毒性活性をある範
囲の暴露時間にわたり測定したく表１）。

最小障害結合体１１は単に３時間暴露後に有意な増殖抑
制を示し、より障害された結合体ユおよび■は細胞毒性
効果が認められる前にかなり長時間を要した。２４時間
後に３結合体はすべて高度に細胞毒性であった。２４時
間暴露後、結合体上上、■およびＨに対して得られたＩ
Ｃ−５０値はそれぞれ５５ｎＭ、６４ｎＭ、および５９
ｎＭであった。２４時間暴露後の遊離ＭＭＣに対するＩ
Ｃ５０値は５０ｎＭであった。従って、結合化学が薬物
の活性を保存する。

参照文献 エンドはか（Ｅｎｄｏ、　Ｎ、＋　Ｋａｔｏ、　Ｙ、、
　Ｔａｋｅｄａ、Ｙ、。

５ａｉｔｏ＋　Ｍ、＋　Ｕｍｅｍｏｔｏ、　Ｎ、＋　Ｋ
１５ｈｉｄａ、　Ｋ、および１１ａｒａ＋　Ｔ、）メト
トレキサートと抗ＭＭ４６単りローン性抗体とのヒト血
清アルブミン仲介結合体の試験管内細胞毒性。カンサー
・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ）　、４７
．１０７６〜１０８０　（１９８７）。

ガレゴほか（Ｇａｌｌｅｇｏ、　Ｊ、ｌ　Ｐｒ１ｃｅ、
　Ｍ、Ｒ，＋　およびＢａｌｄｗｉｎ、　Ｒ，Ｗ、抗腫
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ーナル・オプ・カンサー（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅ
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Ｔ、）ヒト血清アルブミンを経由するマイトマイシンＣ
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によるヒト卵黄嚢腫瘍細胞系に対する試験管内および生
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Ｒ，Ｇ、、らｏｒｅ、　Ｖ、Ａ、、　Ｍａｒｓｄｅｎ、
Ｃ０Ｈ，およびＳｍ１ｔｈ。

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性抗ＣＥＡ結合体の薬物局在化および増殖抑制研究。カ
ンサー・イムノロジー・イムノセラピー　（Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、）　、
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サートレリ　（Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ、　Ａ、Ｃ，）固
形腫瘍の化学療法におけるマイトマイシン抗生物質の役
割。

バイオケミカル・ファルマコロジ−（Ｂ　１ｏｃｈｅ＋
＋＋。

Ｐｈａｒｍ、）　　、３５−１６７〜６９　　（１９８
６）　　。

ワレルほか（Ｗｏｒｒｅｌｌ、　Ｎ、Ｒ，、Ｃｕｍｂｅ
ｒ、　Ａ、Ｊ、。

Ｐａｒｎｅｌｌ、Ｇ、Ｄ、、Ｍｉｒｚａ＋　　Ａ、、Ｆ
ｏｒｒｅｓｔｅｒ＋Ｊ、Ａ、ａｎｄＲｏｓｓ、　Ｗ、Ｃ
，Ｊ、）正常ラット中のりシンＡｔＪ抗体結合体の薬物
動態学に対する結合変化の効果。アンチカンサー・ドラ
グ・デザイン（Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒＤｒｕｇ　Ｄｅ
ｓｉｇｎ）、上、１７９〜１８８　（１９８６）。

蟇　　ｌ 結合体１１〜１３に１０ｐｇ／　ｍ１Ｌ６で暴露後Ａ３
４９コロニー形成の抑制パーセント。暴露時間の効果 結　合　体　　　　　コロニー形成の抑制％（１０μｇ
７ｍｌ抗体）　　１時間　３時間　６時間　２４時間１
５％　　４５％　　７０％　　９５％１２％　　２５％
　　　０％　　９５％１０％　　１０％　　　０％　　
９５％

【図面の簡単な説明】

第１図は相当するプロドラッグからＭＭＣが脱離する経
路を示す図であり、 第２図は本発明による代表的薬物−単クローン性抗体結
合体の合成を示す図であり、 第３図は本発明によるプロドラッグとしての誘導体のＨ
Ｐ　Ｌ　Ｃ比較分析結果を示す図である。 ？ ８、ＲＩＩＮ口 δ １２゜ コＵ■し↑、訃甜内各、二二２旺；シ）ＦＩＧ工１ ＦＩＧ田に３ 手 続 補 正 書く方式） ■、事件の表示 昭和６３年特許願第２９５８９０号 ２、発明の名称 薬物−単クローン性抗体結合体 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 名 称 ブリストル マイアーズ コムノ望ニ ４、代 理 人

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する抗腫瘍薬物−単クローン性抗体結合体、たゞし
   式中、 Ｄはその幹に対するベンダント、式Ｒ＾１ＮＨ−により
   表わされる第一級アミノ基、式Ｒ＾１Ｒ＾２Ｎ−により
   表わされる第二級アミノ基、および式Ｒ＾１Ｏ−により
   表わされるアルコール基からなる群から誘導された化学
   的反応性官能基（それにより薬物幹がジスルフィドベン
   ジルオキシカルボニル基に結合される）を有する抗腫瘍
   薬物部分であり； Ｒ＾１はＤが第一級アミノ基、第二級アミノ基、および
   アルコール基からなる群から誘導されるときの前記薬物
   部分の幹であり、たゞし第二級アミノ基の場合にＲ＾１
   およびＲ＾２は独立である；Ｒ＾２は、Ｒ＾１およびＲ
   ＾２が独立であるとき、は１〜１０個の炭素原子を有す
   る非置換および置換、並びに枝分れおよび直鎖アルキル
   基（たゞし置換基は１〜３個の炭素原子を有する１〜３
   個のアルコキシ基および１〜３個のハロ基から選ばれる
   ）；非置換および置換フェニル（たゞし置換基は１〜３
   個の炭素原子を有する１〜３個のアルキル基、１〜３個
   の炭素原子を有する１〜３個のアルコキシ基および１〜
   ３個のハロ基から選ばれる）；並びに非置換および置換
   フェニルアルキル（たゞしフェニル部分は置換されてい
   るとき置換フェニルの場合に示したように置換され、ア
   ルキル部分は１〜３個の炭素原子を有するポリアルキレ
   ン基である）から選ばれ； Ｒ＾１およびＲ＾２は第二級アミンから誘導された官能
   基中で一緒になったとき、前記第二級アミノ基を構成す
   る窒素原子に化学的に結合した二価基を有する薬物部分
   Ｄの幹を表わし； Ｒ＾３およびＲ＾４は独立に、Ｈ並びに１〜１０個の炭
   素原子を有する非置換および置換、並びに枝分れおよび
   直鎖のアルキル基（たゞし置換基は１〜３個の炭素原子
   を有する１〜３個のアルコキシ基および１〜３個のハロ
   基から選ばれる）；非置換および置換フェニル（たゞし
   置換基は１〜３個の炭素原子を有する１〜３個のアルキ
   ル基、１〜３個の炭素原子を有する１〜３個のアルキル
   基および１〜３個のハロ基から選ばれる）；並びに非置
   換および置換フェニルアルキル（たゞしフェニル部分は
   置換されているとき置換フェニルの場合に示したように
   置換され、アルキル部分は１〜３個の炭素原子を有する
   ポリアルキレン基である）から選ばれ； ｍは１〜１０から選ばれる整数であり； Ａｂはペンダントアミノ基を有する単クローン性抗体を
   表わし； ベンジルカルバメート部分のフェニル環上の基▲数式、
   化学式、表等があります▼の配向は オルト−およびパラ位から選ばれる。
2. （２）薬物部分、Ｄ、が第一級アミン含有および第二級
   アミン含有薬物からなる群から選ばれる一員である、請
   求項（１）記載の化合物。
3. （３）薬物部分、Ｄ、がマイトマイシン−Ｃ、マイトマ
   イシン−Ａ、ダウノマイシン、アドリアマイシン、アミ
   ノプリテン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、およ
   びそれらの誘導体から選ばれる一員である、請求項（２
   ）記載の化合物。
4. （４）薬物部分、Ｄ、がアルコール基含有薬物である、
   請求項（１）記載の化合物。
5. （５）薬物部分、Ｄ、がエトポシドである、請求項（４
   ）記載の化合物。
6. （６）ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨおよびグルタチオンの群の
   少くとも一員を含む高水準の内因性還元性物質を有する
   哺乳動物中の腫瘍細胞の部位に、幹に対するペンダント
   、式Ｒ＾１ＮＨ−により表わされる第一級アミノ基、式
   Ｒ＾１Ｒ＾２Ｎ−により表わされる第二級アミノ基、お
   よび式Ｒ＾１Ｏにより表わされるアルコール基からなる
   群から選ばれる化学的反応性官能基（たゞしＲ＾１およ
   びＲ＾２は請求項（１）に記載のとおりである）を有す
   る活性抗腫瘍薬物を供給する方法であって、（ａ）哺乳
   動物に抗腫瘍有効量の、請求項（１）記載の抗腫瘍プロ
   ドラッグ化合物を投与する段階、（ｂ）段階（ａ）の抗
   腫瘍薬物−単クローン性抗体結合体と内因性還元条件に
   接触させる段階、および （ｃ）抗腫瘍薬物−単クローン性抗体を還元的に切断さ
   せて、結合体から遊離薬物を遊離させる段階、 を含む方法。