JPH02109985A - 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌 - Google Patents
細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野J
本発明は、細菌染色体上への遺伝子の組み込み方法と、
該方法によって得られる細菌に関する。
該方法によって得られる細菌に関する。
E従来の技術1
細菌は、酵素やアミノ酸等有用な物質を得々生産するこ
とが知られている。これらの物質は、多くの遺伝子や代
謝産物に制御を受けている複雑な生合成経路を経て合成
される。これら代謝産物の生産量は比較的少層であり、
生産量増加のために代謝&IJ all解除株の分離な
ど様々な方法が試みられてきた。近年特に環状プラスミ
ドをベクターとして用い、目的とする遺伝子のコピー数
を細菌細胞質内で増幅し、遺伝子産物の増産や酵素活性
の増加による代謝産物の増産を図る方法が数多く報告さ
れている。しかしながら、これらの方法によって得られ
る細菌細胞当りのコピー数は、ベクターの種類、挿入す
る遺伝子の長さ、細胞内の生理学的条件に依り影響を受
は変化し易くまたベクターを菌体内に安定に保持するた
めに培地中に抗生物質を添加しなければならない例が多
く見られる。
とが知られている。これらの物質は、多くの遺伝子や代
謝産物に制御を受けている複雑な生合成経路を経て合成
される。これら代謝産物の生産量は比較的少層であり、
生産量増加のために代謝&IJ all解除株の分離な
ど様々な方法が試みられてきた。近年特に環状プラスミ
ドをベクターとして用い、目的とする遺伝子のコピー数
を細菌細胞質内で増幅し、遺伝子産物の増産や酵素活性
の増加による代謝産物の増産を図る方法が数多く報告さ
れている。しかしながら、これらの方法によって得られ
る細菌細胞当りのコピー数は、ベクターの種類、挿入す
る遺伝子の長さ、細胞内の生理学的条件に依り影響を受
は変化し易くまたベクターを菌体内に安定に保持するた
めに培地中に抗生物質を添加しなければならない例が多
く見られる。
また染色体上に目的遺伝子を組み込み安定化させるため
にインテグレーションベクターが構築され報告されてい
るが、コピー数の選択は困難である。
にインテグレーションベクターが構築され報告されてい
るが、コピー数の選択は困難である。
更に細菌の他の生物においてトランスポゾンをベクター
として用いた例がいくつか見られるが(US−A−46
70388,EP−A−0200708,EP−A−0
091723゜Gene、 42,185(1986)
、 EHBOJ、、 4 (4) 891(1985)
。
として用いた例がいくつか見られるが(US−A−46
70388,EP−A−0200708,EP−A−0
091723゜Gene、 42,185(1986)
、 EHBOJ、、 4 (4) 891(1985)
。
BiotechnoloQV、 4 (5)、 446
(1986)) 、従来報告された方法において目的
遺伝子のコピー数を不必要に増幅することなく、必要と
されるコピー数だけ増幅し、かつ増幅した遺伝子を染色
体−トに安定に維持させる方法については述べられてい
ない。
(1986)) 、従来報告された方法において目的
遺伝子のコピー数を不必要に増幅することなく、必要と
されるコピー数だけ増幅し、かつ増幅した遺伝子を染色
体−トに安定に維持させる方法については述べられてい
ない。
【発明が解決しようとする問題点]
本発明の目的は、目的とする遺伝子を細菌染色体上に組
み込み、必要な数だけ増幅させ、かつこれらの遺伝子の
コピー数を安定に維持する方法を開発すること、及びそ
の方法によって目的物質を効率良く生産する微生物を得
ること、そしてそれによって目的物質の効率の良い生産
方法を見出すことにある。
み込み、必要な数だけ増幅させ、かつこれらの遺伝子の
コピー数を安定に維持する方法を開発すること、及びそ
の方法によって目的物質を効率良く生産する微生物を得
ること、そしてそれによって目的物質の効率の良い生産
方法を見出すことにある。
E問題点を解決するための手段1
本発明者等は、上記問題点を解決するため研究の結果、
トランスポゾンを用いて目的する遺伝子を細菌染色体ま
たはエピソーム上に組み込み、必要とするコピー数だけ
遺伝子を増幅した菌株を選択する方法、及び増幅した遺
伝子を安定に維持する方法を開発することに成功した。
トランスポゾンを用いて目的する遺伝子を細菌染色体ま
たはエピソーム上に組み込み、必要とするコピー数だけ
遺伝子を増幅した菌株を選択する方法、及び増幅した遺
伝子を安定に維持する方法を開発することに成功した。
そして水沫を用いて蛋白質(β−ガラクトシダーゼ)を
コードする遺伝子、またはアミノ酸([−スレオニン)
生合成系遺伝子を染色体上に増幅させた細菌を分離し、
これらの細菌が培地中への抗生物質の添加無しに導入さ
れた遺伝子を安定に保持し、かつ、蛋白質やアミノ酸の
^い生産性を有することを見出した。
コードする遺伝子、またはアミノ酸([−スレオニン)
生合成系遺伝子を染色体上に増幅させた細菌を分離し、
これらの細菌が培地中への抗生物質の添加無しに導入さ
れた遺伝子を安定に保持し、かつ、蛋白質やアミノ酸の
^い生産性を有することを見出した。
本発明にいうトランスポゾンは、細菌DNAの任意の部
位に転移し得るものであればどのようなのでもよい。具
体的には、Tn3 、 Tn5 、 Tn7 、7口1
0、 Th2O3、Tntlollo、 ISI 、
l510. l550. Mu旧ファージ及びH
ud[ファージ等が挙げられる。
位に転移し得るものであればどのようなのでもよい。具
体的には、Tn3 、 Tn5 、 Tn7 、7口1
0、 Th2O3、Tntlollo、 ISI 、
l510. l550. Mu旧ファージ及びH
ud[ファージ等が挙げられる。
このようなトランスポゾンのうち特にMudファージ類
縁体(Nu旧やHudll等)が本発明においてはab
好ましいものである。また目的の遺伝子をより安定にD
NA上に組み込むためには、用いるトランスポゾンが欠
損トランスポゾン、1なわちそれ自身では転移不可能な
トランスポゾンを用いることが好ましい。本発明におい
ては、トランスポゼースを欠くトランスポゾンが最も好
ましいものであるが、トランスアクティングなトランス
ポゼースが通常の条件下で抑制または不活性化されてい
るトランスポゾンも用いることができる。
縁体(Nu旧やHudll等)が本発明においてはab
好ましいものである。また目的の遺伝子をより安定にD
NA上に組み込むためには、用いるトランスポゾンが欠
損トランスポゾン、1なわちそれ自身では転移不可能な
トランスポゾンを用いることが好ましい。本発明におい
ては、トランスポゼースを欠くトランスポゾンが最も好
ましいものであるが、トランスアクティングなトランス
ポゼースが通常の条件下で抑制または不活性化されてい
るトランスポゾンも用いることができる。
本発明にいう細菌は、上述のトランスポゾンが転移可能
なものであればどのようなものでもよく、次のような細
菌が例としてあげられる。
なものであればどのようなものでもよく、次のような細
菌が例としてあげられる。
本発明にいう目的遺伝子とは、通常使用するトランスポ
ゾン内に存在しない遺伝子、または用いる宿主細菌内に
存在しない遺伝子をいう。目的遺伝子には、動物、植物
、細菌由来遺伝子及び合成遺伝子で宿主細菌内で発現可
能なりローン化遺伝子、融合遺伝子及び遺伝子断片が含
まれる。目的遺伝子の具体例としては、ペプチド、蛋白
合成遺伝子や、アミノ酸生合成系遺伝子などがあげられ
る。これらの遺伝子を1個ないし複数個トランスポゾン
内に挿入することが可能である。
ゾン内に存在しない遺伝子、または用いる宿主細菌内に
存在しない遺伝子をいう。目的遺伝子には、動物、植物
、細菌由来遺伝子及び合成遺伝子で宿主細菌内で発現可
能なりローン化遺伝子、融合遺伝子及び遺伝子断片が含
まれる。目的遺伝子の具体例としては、ペプチド、蛋白
合成遺伝子や、アミノ酸生合成系遺伝子などがあげられ
る。これらの遺伝子を1個ないし複数個トランスポゾン
内に挿入することが可能である。
目的遺伝子を1−ランスボゾン内に挿入するためには通
常用いられる遺伝子工学の手法が適用できるが、トラン
スポゾンを含むプラスミドを用いる方法がより容易であ
る。プラスミド上のトランスポゾンは欠失や変異により
欠旧トランスポゾンに変えうる。トランスポゾンを含む
プラスミドはこれを保有する細菌より単離され、トラン
スポゾン内部で転移に必須な領域以外を切断する適当な
制限酵素により切断される。この切断部位に同じ制限酵
素明所末端を持つ目的遺伝子を連結する。
常用いられる遺伝子工学の手法が適用できるが、トラン
スポゾンを含むプラスミドを用いる方法がより容易であ
る。プラスミド上のトランスポゾンは欠失や変異により
欠旧トランスポゾンに変えうる。トランスポゾンを含む
プラスミドはこれを保有する細菌より単離され、トラン
スポゾン内部で転移に必須な領域以外を切断する適当な
制限酵素により切断される。この切断部位に同じ制限酵
素明所末端を持つ目的遺伝子を連結する。
あるいは切断されたプラスミド及び目的遺伝子断片のそ
れぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを接続せしめて、次いで両者のライゲーション反
応を行なう。この際、」虹遺伝子やIaCZ遺伝子のよ
うなレポーター遺伝子を同時に挿入すれば目的遺伝子の
転移の検出がより容易に行える。挿入される遺伝子の個
数はコないし複数個で、1種類ないし複数種の遺伝子の
導入が可能である。
れぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを接続せしめて、次いで両者のライゲーション反
応を行なう。この際、」虹遺伝子やIaCZ遺伝子のよ
うなレポーター遺伝子を同時に挿入すれば目的遺伝子の
転移の検出がより容易に行える。挿入される遺伝子の個
数はコないし複数個で、1種類ないし複数種の遺伝子の
導入が可能である。
トランスポゾンとしてMuファージを用いる場合はMu
dファージを含むプラスミドを用いる方法がより容易で
ある。Mudファージを含むプラスミドを構築する方法
は、Mucts及びMudファージをクロモゾーム上に
保有する菌株を宿主として用い、本菌株を適当なプラス
ミドを用いて形質転換する。形質転換株を適当な培地で
培養侵31℃〜45℃にて熱処理を行い溶菌液を得る。
dファージを含むプラスミドを用いる方法がより容易で
ある。Mudファージを含むプラスミドを構築する方法
は、Mucts及びMudファージをクロモゾーム上に
保有する菌株を宿主として用い、本菌株を適当なプラス
ミドを用いて形質転換する。形質転換株を適当な培地で
培養侵31℃〜45℃にて熱処理を行い溶菌液を得る。
本溶菌液を用いて−rec−株を感染させ(ミニミュー
ダクシコン)、用いたプラスミドの形質及びMudファ
ージの、形質を利用してHudll−ジが転移したプラ
スミドを保有する菌株を選択する。Mucts及びHu
dll−ジを含む菌株の例としては、PO11734(
Castilho et al、、J、Bacte
riol、。
ダクシコン)、用いたプラスミドの形質及びMudファ
ージの、形質を利用してHudll−ジが転移したプラ
スミドを保有する菌株を選択する。Mucts及びHu
dll−ジを含む菌株の例としては、PO11734(
Castilho et al、、J、Bacte
riol、。
158.488 (1984) ) 、 POI 16
81 (同上) 、HC4100(Hucts) (H
udl[POI3)、 HC41GG(Hucts)(
Hudll PR3)(P、 Ratet et a
l、、 Gene、63.41(1988))等があげ
られる。用いるプラスミドは宿主菌内で増幅可能なもの
であればどのようなものでもよい。プラスミドが抗生物
質耐性遺伝子を保有していれば目的プラスミドの選択が
より容易に行える。Hudll−ジを含むプラスミドに
目的遺伝子を挿入する方法は、前述のトランスポゾンを
含むプラスミドの場合と同じ方法が適用される。
81 (同上) 、HC4100(Hucts) (H
udl[POI3)、 HC41GG(Hucts)(
Hudll PR3)(P、 Ratet et a
l、、 Gene、63.41(1988))等があげ
られる。用いるプラスミドは宿主菌内で増幅可能なもの
であればどのようなものでもよい。プラスミドが抗生物
質耐性遺伝子を保有していれば目的プラスミドの選択が
より容易に行える。Hudll−ジを含むプラスミドに
目的遺伝子を挿入する方法は、前述のトランスポゾンを
含むプラスミドの場合と同じ方法が適用される。
構築されたキメラトランスポゾンを宿主菌に導入する方
法は従来用いられているトランスフォーメーション、ト
ランスダクション、コンジュゲーション等の方法が用い
られる。キメラMudファージを用いる場合は、これを
含むプラスミドを用いてMuCtSライソジェンを形質
転換し、形質転換株を適当な培地で培養後31℃〜45
℃の熱処理を行う。得られたWJ菌液を目的の菌株に感
染させれば(ミニミューダクション)、Mudが染色体
に組み込まれた(インチグレートした)菌株(Mudラ
イソジエン)が得られる。本うイソジェンは本発明の目
的のためには、同時にMuCtSファージのライソジエ
ンでないことが好ましい。
法は従来用いられているトランスフォーメーション、ト
ランスダクション、コンジュゲーション等の方法が用い
られる。キメラMudファージを用いる場合は、これを
含むプラスミドを用いてMuCtSライソジェンを形質
転換し、形質転換株を適当な培地で培養後31℃〜45
℃の熱処理を行う。得られたWJ菌液を目的の菌株に感
染させれば(ミニミューダクション)、Mudが染色体
に組み込まれた(インチグレートした)菌株(Mudラ
イソジエン)が得られる。本うイソジェンは本発明の目
的のためには、同時にMuCtSファージのライソジエ
ンでないことが好ましい。
またこのとき得られるMuctsとMudのダブルライ
ソジェンを用いて溶菌液を調製し、ミニミューダクショ
ンに用いればより効率よくMudライソジェンが得られ
る。MuCtSライソジェンの例としテハ、HC410
0(M u c t s )やJM109(M u c
t s ) (P、Ratet et al、、G
ene、42. 185(19863)等があげられる
。以上の方法でキメラMudファージを導入する際にキ
メラMudの増幅が起こり得るが、下記の方法で増幅を
行なう方がより効率よく行える。
ソジェンを用いて溶菌液を調製し、ミニミューダクショ
ンに用いればより効率よくMudライソジェンが得られ
る。MuCtSライソジェンの例としテハ、HC410
0(M u c t s )やJM109(M u c
t s ) (P、Ratet et al、、G
ene、42. 185(19863)等があげられる
。以上の方法でキメラMudファージを導入する際にキ
メラMudの増幅が起こり得るが、下記の方法で増幅を
行なう方がより効率よく行える。
上述のようにして細胞内に導入されたキメラトランスポ
ゾンは、そのトランスポゼースの発現がリプレッサーに
より抑制されているか欠損トランスポゾンである場合、
細胞内で安定に維持される。
ゾンは、そのトランスポゼースの発現がリプレッサーに
より抑制されているか欠損トランスポゾンである場合、
細胞内で安定に維持される。
キメラトランスポゾンは、さらに以下に述べる方法によ
って細胞内のDNA上で転移増幅させ、目的遺伝子の活
性を増幅することができる。すなわもトランスポゼース
の発現がリプレッサーにより抑制されている場合は、リ
プレッサーを不活性化することによりトランスポゼース
の発現を誘導し、i・ランスボゾンを転移増幅させるこ
とができる。リプレッサーの不活性化は例えば温度感受
性のりプレッサーを用いれば培1wA度の変化によって
不活性化を行うことができる。欠損トランスポゾンすな
わちトランスポゼースを持たないトランスポゾンを用い
た場合は、トランスアクティングなトランスポゼース道
伝子を保有するプラスミドやファージを菌体内に導入し
トランスポゼースを発現相補すればよい。
って細胞内のDNA上で転移増幅させ、目的遺伝子の活
性を増幅することができる。すなわもトランスポゼース
の発現がリプレッサーにより抑制されている場合は、リ
プレッサーを不活性化することによりトランスポゼース
の発現を誘導し、i・ランスボゾンを転移増幅させるこ
とができる。リプレッサーの不活性化は例えば温度感受
性のりプレッサーを用いれば培1wA度の変化によって
不活性化を行うことができる。欠損トランスポゾンすな
わちトランスポゼースを持たないトランスポゾンを用い
た場合は、トランスアクティングなトランスポゼース道
伝子を保有するプラスミドやファージを菌体内に導入し
トランスポゼースを発現相補すればよい。
キメラMudファージの場合は、それを保有する菌株を
トランスポゾンA、B遺伝子(Muファージ由来)を保
有するプラスミドで形質転換するかMuファージを感染
させれば、Mudファージが転移増幅した菌株が得られ
る。
トランスポゾンA、B遺伝子(Muファージ由来)を保
有するプラスミドで形質転換するかMuファージを感染
させれば、Mudファージが転移増幅した菌株が得られ
る。
異った発現形質を有する複数種のキメラトランスポゾン
もF述の方法で同時に、または個別に導入、転移増幅さ
せ、同一菌体内のDNA上に同時に存在させることが可
能である。
もF述の方法で同時に、または個別に導入、転移増幅さ
せ、同一菌体内のDNA上に同時に存在させることが可
能である。
これらトランスポゾンが転移増幅するDNAは、染色体
やエピソームなど菌体内で安定に維持されるDNAであ
ればどのようなものでもよい。
やエピソームなど菌体内で安定に維持されるDNAであ
ればどのようなものでもよい。
キメラトランスポゾンの転移増幅後のコピー数は、挿入
した遺伝子の発現の程度によって選択できる。抗生物質
耐性遺伝子や発色反応を利用できる遺伝子(例えば+a
CZ)などが組み込まれていればより容易に選択が行え
る。抗生物質耐性遺伝子の場合は、例えば種々の濃度の
抗生物質を含むプレートに増幅処理後の菌液をスプレッ
ドすることにより種々のコピー数のキメラトランスポゾ
ンが転移増幅した菌株が選択できる。1ace遺伝子の
場合は、X−Ga1 (5−ブロモ−4−クロロ−3
−インドリル−β−D−ガラクトシド)をプレートに添
加しておき処理菌液をスプレッドすれば、コロニーの発
色(青色)の程度により増幅コピー数の多少を知ること
ができる。キメラトランスポゾンの菌体内におけるコピ
ー数は、通常の方法例えばサザンアナリシスにより測定
できる。
した遺伝子の発現の程度によって選択できる。抗生物質
耐性遺伝子や発色反応を利用できる遺伝子(例えば+a
CZ)などが組み込まれていればより容易に選択が行え
る。抗生物質耐性遺伝子の場合は、例えば種々の濃度の
抗生物質を含むプレートに増幅処理後の菌液をスプレッ
ドすることにより種々のコピー数のキメラトランスポゾ
ンが転移増幅した菌株が選択できる。1ace遺伝子の
場合は、X−Ga1 (5−ブロモ−4−クロロ−3
−インドリル−β−D−ガラクトシド)をプレートに添
加しておき処理菌液をスプレッドすれば、コロニーの発
色(青色)の程度により増幅コピー数の多少を知ること
ができる。キメラトランスポゾンの菌体内におけるコピ
ー数は、通常の方法例えばサザンアナリシスにより測定
できる。
増幅したキメラi・ランスボゾンを安定に維持するため
には、トランスポゼース遺伝子の発現を抑えるか、トラ
ンスポゼースを不活性化するかあるいはトランスポゼー
スが菌体内に存在しないようにすればよい。すなわち増
幅処理の際使用したプラスミドやファージを菌体内から
除去、あるいは熱処理を解除すればよい。プラスミドや
ファージの除去された菌株を得るためには特別の処理を
必要としない。このようにして得られた菌株のキメラト
ランスポゾンは安定に保持されるが、より安定に保持づ
−るためには、トランスポゼース遺伝子を持たないトラ
ンスポゾンを用いてキメラトランスポゾンを構築するこ
とが望ましい。キメラMudファージを用いた場合は、
増幅棲宿主菌にDNAポリメラーゼ1.5−3°エキソ
ヌクレアーゼあるいはHU遺伝子欠損などの性質を付与
づればより安定に維持される。
には、トランスポゼース遺伝子の発現を抑えるか、トラ
ンスポゼースを不活性化するかあるいはトランスポゼー
スが菌体内に存在しないようにすればよい。すなわち増
幅処理の際使用したプラスミドやファージを菌体内から
除去、あるいは熱処理を解除すればよい。プラスミドや
ファージの除去された菌株を得るためには特別の処理を
必要としない。このようにして得られた菌株のキメラト
ランスポゾンは安定に保持されるが、より安定に保持づ
−るためには、トランスポゼース遺伝子を持たないトラ
ンスポゾンを用いてキメラトランスポゾンを構築するこ
とが望ましい。キメラMudファージを用いた場合は、
増幅棲宿主菌にDNAポリメラーゼ1.5−3°エキソ
ヌクレアーゼあるいはHU遺伝子欠損などの性質を付与
づればより安定に維持される。
このようにして得られた目的遺伝子産物の生産能を有す
る細菌を培養して目的物質を生成蓄積せしめる方法は、
従来実施されてきた方法で行われるが、従来のように目
的遺伝子の菌体内安定維持のため抗生物質等を培地中に
添加する必要が無い点が大きく異なる。
る細菌を培養して目的物質を生成蓄積せしめる方法は、
従来実施されてきた方法で行われるが、従来のように目
的遺伝子の菌体内安定維持のため抗生物質等を培地中に
添加する必要が無い点が大きく異なる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有
づる通常のものを使用できる。炭素源としては、グルコ
ース、シュークロース、ラクトース等及びこれらを含有
する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒
S源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。培養は好気的条件下で培
地のpHおよび温度を適宜調整しつつ、実質的に目的産
物の生産蓄積が停止するまで行われる。アミノ酸や蛋白
質等の生産には、宿主菌として目的産物の生産性のより
高い株を選べばより高い生産性がIlられる。
に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有
づる通常のものを使用できる。炭素源としては、グルコ
ース、シュークロース、ラクトース等及びこれらを含有
する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒
S源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。培養は好気的条件下で培
地のpHおよび温度を適宜調整しつつ、実質的に目的産
物の生産蓄積が停止するまで行われる。アミノ酸や蛋白
質等の生産には、宿主菌として目的産物の生産性のより
高い株を選べばより高い生産性がIlられる。
実施例1
aC遺伝子の増幅によるβ−ガラクトシダーゼ生産菌の
育種 (1)欠損トランスポゾンにり[]−ン化されたβガラ
クトシダーゼ遺伝子を1コピ一染色体上に有する菌株の
育種 MudI11734(第1図参照)とMuCtS(Ca
stilho et al、、J、Bacteriol
、、 158,488(1984))をクロモゾーム上
に保有するE、col+ P OII 1734株(
同上文献)を2dのLB培地にて30℃で2時間培養し
たのち45℃、15分間の熱処理を行い、更に31℃に
て2時間培養を続は溶菌液を得た。本溶菌液にクロロホ
ルムを数滴加えよく混合侵遠心し、上澄をファージ溶液
として用いた。
育種 (1)欠損トランスポゾンにり[]−ン化されたβガラ
クトシダーゼ遺伝子を1コピ一染色体上に有する菌株の
育種 MudI11734(第1図参照)とMuCtS(Ca
stilho et al、、J、Bacteriol
、、 158,488(1984))をクロモゾーム上
に保有するE、col+ P OII 1734株(
同上文献)を2dのLB培地にて30℃で2時間培養し
たのち45℃、15分間の熱処理を行い、更に31℃に
て2時間培養を続は溶菌液を得た。本溶菌液にクロロホ
ルムを数滴加えよく混合侵遠心し、上澄をファージ溶液
として用いた。
E、coli MC410G株(Casadaban
、H,J、、 J、Ho1Bio1.、104.54
1(1976))をLB培地ニテー晩培養後、最終濃度
がそれぞれ1sH,2,5−HとなるようにCaC1!
2とH(1804を添加した。本溶液200IIIと上
記ファージ溶液5O111を混合し15分間室温に放置
した後2sieのLB培地を加え、30℃で2時間培養
を続けた。培養終了後菌液を20IJ!g/ dのカナ
マイシン(に―)と10sHのX−Ga1を含むLB培
地にスプレッドし、30℃で24時間培養し出現してく
る白色コロニーを釣り上げた。これらのコロニーの中か
らMu感受性菌を指標筒とするレプリカ法でMUcts
を保有しない菌株MC100(M u d II 17
34)を選択した。本菌株より染色体DNAを抽出し、
サザンア′ナリシスにより染色体上に1コピーのMud
I11134が存在することを確認した(データ示さず
)。
、H,J、、 J、Ho1Bio1.、104.54
1(1976))をLB培地ニテー晩培養後、最終濃度
がそれぞれ1sH,2,5−HとなるようにCaC1!
2とH(1804を添加した。本溶液200IIIと上
記ファージ溶液5O111を混合し15分間室温に放置
した後2sieのLB培地を加え、30℃で2時間培養
を続けた。培養終了後菌液を20IJ!g/ dのカナ
マイシン(に―)と10sHのX−Ga1を含むLB培
地にスプレッドし、30℃で24時間培養し出現してく
る白色コロニーを釣り上げた。これらのコロニーの中か
らMu感受性菌を指標筒とするレプリカ法でMUcts
を保有しない菌株MC100(M u d II 17
34)を選択した。本菌株より染色体DNAを抽出し、
サザンア′ナリシスにより染色体上に1コピーのMud
I11134が存在することを確認した(データ示さず
)。
また本菌株はβ−ガラクトシダーゼを生産しないことか
ら、Mudl[1734は染色体上でプロモータ下流に
組み込まれていないと考えられた。
ら、Mudl[1734は染色体上でプロモータ下流に
組み込まれていないと考えられた。
(2)プラスミド上へのMuフ1−ジ由来トランスポゼ
ースA、B遺伝子のり0−ニング pBR322上にMudl[1681(Castilh
o et al、、 J。
ースA、B遺伝子のり0−ニング pBR322上にMudl[1681(Castilh
o et al、、 J。
8aCteriO1,、ユ58.488(1984))
が転移したプラスミドよりEC0RI断片及び1範■断
片を除去したプラスミドpAB81s5を調製後、Ec
oRIとE coR■にて切断しトランスポゼースA、
B遺伝子を含む断片(8,3kb)をアガロースゲル電
気泳動により単離精製した。本DNA断片を5laI及
びE coRIで切断したpUc19にT4 DNAリ
ガーゼを用いて連結しpPR30を得た(W12図参照
)。
が転移したプラスミドよりEC0RI断片及び1範■断
片を除去したプラスミドpAB81s5を調製後、Ec
oRIとE coR■にて切断しトランスポゼースA、
B遺伝子を含む断片(8,3kb)をアガロースゲル電
気泳動により単離精製した。本DNA断片を5laI及
びE coRIで切断したpUc19にT4 DNAリ
ガーゼを用いて連結しpPR30を得た(W12図参照
)。
Caα2処理(Handel and Hioa、 J
、Ho1.Biol、。
、Ho1.Biol、。
53、159(1970))で臀たM C4100(M
udll 1734)のコンピテント細胞をpPR30
を用いて形質転換しトランスフォーマントM C410
0(MudlI 1734) 1oPR30を得た。M
C4100(Mudl[1734) /DPR30を
しB培地にて30℃で2時間給ll後、20埒/−のに
l、25埒/dのアンピシリン(AIIEI)及び10
p3/−のX−Ga1を含むLBプレートにスプレッド
した。30℃で48時間培養し出現してきたコロニーの
うち各種濃淡のブルーコロニーを釣り上げた。各コロニ
ーを20#/dのに−を含むL8プレートでジングルコ
ロニーに分離しpPR30を1l12落させるため同培
地で数回植継いだ侵、それぞれのクローンより染色体1
)NAを調製した。染色体DNAをEcoRIにて切断
した模、ラジオアイソト−プでラベルしたpc[113
4(第4図参照)をプローブとしてサザンアナリシスを
行った。その結果台クローンに数コピーのM ud I
t 1734の転移が認められた。その−例(AMl株
)を第3図のレーンfに示す。4本のバンドが2コピー
のMud111734に相当している。
udll 1734)のコンピテント細胞をpPR30
を用いて形質転換しトランスフォーマントM C410
0(MudlI 1734) 1oPR30を得た。M
C4100(Mudl[1734) /DPR30を
しB培地にて30℃で2時間給ll後、20埒/−のに
l、25埒/dのアンピシリン(AIIEI)及び10
p3/−のX−Ga1を含むLBプレートにスプレッド
した。30℃で48時間培養し出現してきたコロニーの
うち各種濃淡のブルーコロニーを釣り上げた。各コロニ
ーを20#/dのに−を含むL8プレートでジングルコ
ロニーに分離しpPR30を1l12落させるため同培
地で数回植継いだ侵、それぞれのクローンより染色体1
)NAを調製した。染色体DNAをEcoRIにて切断
した模、ラジオアイソト−プでラベルしたpc[113
4(第4図参照)をプローブとしてサザンアナリシスを
行った。その結果台クローンに数コピーのM ud I
t 1734の転移が認められた。その−例(AMl株
)を第3図のレーンfに示す。4本のバンドが2コピー
のMud111734に相当している。
(3)転移したMudl[1734の安定性2コピーの
Mudl[1734を染色体上に持−)AMl株を、に
−を含まないL8培地で170世代培養した後シングル
コロニーに分離した。このうち5コロニーより染色体D
NAを調製し、上記(2)と同様の方法でサザンアナリ
シスを行った。その結果台クローンとも2コピーのMu
d111734を維持し、またパイプリダイゼーシコン
のパターンに変化が見られないことから(第3図、レー
ンa−e@照)転移したMudl[1734の安定性が
示された。
Mudl[1734を染色体上に持−)AMl株を、に
−を含まないL8培地で170世代培養した後シングル
コロニーに分離した。このうち5コロニーより染色体D
NAを調製し、上記(2)と同様の方法でサザンアナリ
シスを行った。その結果台クローンとも2コピーのMu
d111734を維持し、またパイプリダイゼーシコン
のパターンに変化が見られないことから(第3図、レー
ンa−e@照)転移したMudl[1734の安定性が
示された。
(4)β−ガラクトシダーゼの生産
M C410G (M udll 1734)株及びA
Ml株を18培地にて一夜培養し、集菌、洗浄の後細胞
を0.05Mのリン酸バッフ?−に懸濁し超音波破砕機
で細胞を破壊した。細胞破砕液を遠心しく15000r
p園、20分)、上澄を細胞抽出液としてβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定した。その結果MO410G(Mu
dl[1734)及びAMlにそれぞれ7X 1G−’
及び10naole/++in/mg protein
の酵素活性が見出さt’L タ。
Ml株を18培地にて一夜培養し、集菌、洗浄の後細胞
を0.05Mのリン酸バッフ?−に懸濁し超音波破砕機
で細胞を破壊した。細胞破砕液を遠心しく15000r
p園、20分)、上澄を細胞抽出液としてβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定した。その結果MO410G(Mu
dl[1734)及びAMlにそれぞれ7X 1G−’
及び10naole/++in/mg protein
の酵素活性が見出さt’L タ。
実施例2
遺伝子増幅によるL−スレオニン生産菌の育種とL−ス
レオニンの製造 (1) pcE1134の構築 E、col i P OIt 1734株(Cast
ilho et al。
レオニンの製造 (1) pcE1134の構築 E、col i P OIt 1734株(Cast
ilho et al。
J、 Bacteriol、、 158.488 (1
984))をCaCl2法(Handel H,and
Hioa A、、 J、Ho1.Biol、、 53
,159(1970) )にてコンピテント化しpc[
100(2,1kbCI11’ 、第4図参照)を用い
て形質転換した。処理菌液をクロラムフェニコール(C
m) 25n/di含有1Bプレート培地上にスプレッ
ドし、30℃で24時間培養後出現してきたコロニーを
釣り上げトランスフォーマントP OI[1734/1
lcE100を得た。POU 1734/ pcEto
Oを3dのLB培地で30℃にて2時間培養した後、4
5℃、15分間の熱処理を行い更に31℃にて2時間培
養を続けた。得られた溶菌液にクロロホルムを数滴加え
、よく混合した後遠心して(10000rEJ■、10
分)上澄をファージ溶液■とした。
984))をCaCl2法(Handel H,and
Hioa A、、 J、Ho1.Biol、、 53
,159(1970) )にてコンピテント化しpc[
100(2,1kbCI11’ 、第4図参照)を用い
て形質転換した。処理菌液をクロラムフェニコール(C
m) 25n/di含有1Bプレート培地上にスプレッ
ドし、30℃で24時間培養後出現してきたコロニーを
釣り上げトランスフォーマントP OI[1734/1
lcE100を得た。POU 1734/ pcEto
Oを3dのLB培地で30℃にて2時間培養した後、4
5℃、15分間の熱処理を行い更に31℃にて2時間培
養を続けた。得られた溶菌液にクロロホルムを数滴加え
、よく混合した後遠心して(10000rEJ■、10
分)上澄をファージ溶液■とした。
E、coli M8820(Hu)株(Castil
ho et at、、 J。
ho et at、、 J。
Bacteriol、、 158.488(1984
))をLB培地で一晩培養したのち、caa 及びH
QSO4をそれぞれ1 mH及び2.518となるよう
に添加した。本菌液200Ii1にファージ溶液■を5
0庫加え、室温にて15分放置した12dのLB培地を
加えて30℃で2時間培養を行った。培1iv&菌液を
20埒/dの1と25埒/dのC−を含むLBプレート
培地にスプレッドし、30℃で24時間培養後出現して
くるコロニーを釣り上げた。20コロニーよりミニプレ
ツブ法(Birnboimand Doly、 N
ucleic Ac1ds Res、、 7.
1513(1979))にてプラスミドを抽出し、適
当な制限酵素を用いてリストリクシクンサイトを決定し
、すべてのプラスミドにMudff1734が転移して
いることを確認した。この内の1つをpCE 1134
と名付けた(第4図参照)。
))をLB培地で一晩培養したのち、caa 及びH
QSO4をそれぞれ1 mH及び2.518となるよう
に添加した。本菌液200Ii1にファージ溶液■を5
0庫加え、室温にて15分放置した12dのLB培地を
加えて30℃で2時間培養を行った。培1iv&菌液を
20埒/dの1と25埒/dのC−を含むLBプレート
培地にスプレッドし、30℃で24時間培養後出現して
くるコロニーを釣り上げた。20コロニーよりミニプレ
ツブ法(Birnboimand Doly、 N
ucleic Ac1ds Res、、 7.
1513(1979))にてプラスミドを抽出し、適
当な制限酵素を用いてリストリクシクンサイトを決定し
、すべてのプラスミドにMudff1734が転移して
いることを確認した。この内の1つをpCE 1134
と名付けた(第4図参照)。
(2) thrオペロンを含むMudファージ、Hud
AH9の構築 pCE 1134をBa1HI及び1虱■にて切断し、
アガロース電気泳動でMud31!仏子を含むDNAフ
ラグメントを抽出した。一方、pAJ294 (Hiw
a、に、et八へラグメントをアガロースゲル電気泳動
で抽出した。両フラグメントをT4 DNAリガーゼを
用いて10℃で16時開通結反応させた後、l:、co
lithre株を本ライゲーション溶液を用いて形質転
換した。251Nl/ ad! (7) Cm、20/
119 / l11(7) Klヲ含みL−スレオニン
を含まない最小培地でトランスフォーマントを選択し、
ミニブレツブ法でプラスミドを抽出後種々の制限酵素で
制限部位を解析し、npt遭伝子、thrオペロン及び
Mud両末端を含むプラスミドpAH9(第5図)を保
有するトランスフォーマントを選出した。
AH9の構築 pCE 1134をBa1HI及び1虱■にて切断し、
アガロース電気泳動でMud31!仏子を含むDNAフ
ラグメントを抽出した。一方、pAJ294 (Hiw
a、に、et八へラグメントをアガロースゲル電気泳動
で抽出した。両フラグメントをT4 DNAリガーゼを
用いて10℃で16時開通結反応させた後、l:、co
lithre株を本ライゲーション溶液を用いて形質転
換した。251Nl/ ad! (7) Cm、20/
119 / l11(7) Klヲ含みL−スレオニン
を含まない最小培地でトランスフォーマントを選択し、
ミニブレツブ法でプラスミドを抽出後種々の制限酵素で
制限部位を解析し、npt遭伝子、thrオペロン及び
Mud両末端を含むプラスミドpAH9(第5図)を保
有するトランスフォーマントを選出した。
(3) HudAH9の染色体上への転移pAH9を用
いてCaCj!2処理法にて形質転換し、トランスフォ
ーマントをにm及びcmをそれぞれ20p3/ d及び
25IIg/ me含むLBプレートにて選択した。2
0クローンよりプラスミドを抽出し、それぞれpAH9
であることを確認した。トランスフォーマントJH10
9(Mu c t s ) /pAM9をしB培地にて
30℃で2時間培養した後、45℃、15分間の熱処理
を加え更に31℃にて2時間培養を続けた。得られた溶
菌液に数滴のクロロホルムを加えよく混合した後室温に
て15分間放置し、続いて5000rpm、 10分の
遠心で得られた上澄液をファージ溶液■とした。JH1
109(u c t s )をLB培地を用いて30℃
にて一晩培養した。本培養液にCaα2とHgSO4を
最終濃度がそれぞれ1 g+ll及び2.5114とな
るように添加した後、本溶液200fiと50pのファ
ージ溶液■を混合し室温に15分間放置した。2−のし
B培地を加え30℃で2時間培養後、Klを20IIs
/ d含むLB培地にスプレッドした。30℃にて24
8Ifl @ IIの後出現したコロニーより100コ
〇ニーをピックアップし、それ等のCI感受性を調べた
。コロニーの95%がcm感受性であり、JM109(
Mu c t s ) (Mu−dA M 9)であ
ることを認めた。
いてCaCj!2処理法にて形質転換し、トランスフォ
ーマントをにm及びcmをそれぞれ20p3/ d及び
25IIg/ me含むLBプレートにて選択した。2
0クローンよりプラスミドを抽出し、それぞれpAH9
であることを確認した。トランスフォーマントJH10
9(Mu c t s ) /pAM9をしB培地にて
30℃で2時間培養した後、45℃、15分間の熱処理
を加え更に31℃にて2時間培養を続けた。得られた溶
菌液に数滴のクロロホルムを加えよく混合した後室温に
て15分間放置し、続いて5000rpm、 10分の
遠心で得られた上澄液をファージ溶液■とした。JH1
109(u c t s )をLB培地を用いて30℃
にて一晩培養した。本培養液にCaα2とHgSO4を
最終濃度がそれぞれ1 g+ll及び2.5114とな
るように添加した後、本溶液200fiと50pのファ
ージ溶液■を混合し室温に15分間放置した。2−のし
B培地を加え30℃で2時間培養後、Klを20IIs
/ d含むLB培地にスプレッドした。30℃にて24
8Ifl @ IIの後出現したコロニーより100コ
〇ニーをピックアップし、それ等のCI感受性を調べた
。コロニーの95%がcm感受性であり、JM109(
Mu c t s ) (Mu−dA M 9)であ
ることを認めた。
JM109(Mucts)(MudAM9)をLB培地
を用いて30℃にて2時間培養し、45℃、15分間の
熱処理を加えた。その後31℃にて2時間培養を続は臀
られた溶菌液にクロロホルム数滴を加えよく混合した。
を用いて30℃にて2時間培養し、45℃、15分間の
熱処理を加えた。その後31℃にて2時間培養を続は臀
られた溶菌液にクロロホルム数滴を加えよく混合した。
50GOrpm、10分間の遠心にて得られた上澄液を
ファージ溶液■とした。
ファージ溶液■とした。
E、coli A J 11332株(Shilo e
t al、、^gric、 。
t al、、^gric、 。
BjOl、、Ctlel、、33.1152(1969
))をLB培地を用いて一晩培養し、Cacj2とHQ
SO4を最終濃度がそれぞれ1s14及び2.5sNと
なるように添加した。本溶液200バに50成のファー
ジ溶液■を添加し、室温にて15分間放置した。2I1
1のLB培地を添加した1000℃にて2時間培養を続
け、得られた培養液を20747−のに鵬を含むLBプ
レートにスプレッドした。30℃にて24時間培養を続
け、出現してきたコロニーより100コ〇ニーをピック
アップしそれ等のMuファージ感受性及び45℃におけ
る溶菌性を調べた。その結果、85%のコロニーが溶菌
せずかつ1ylu感受性であった。これらのうちの1ク
ローンをE L 1G01株とした。
))をLB培地を用いて一晩培養し、Cacj2とHQ
SO4を最終濃度がそれぞれ1s14及び2.5sNと
なるように添加した。本溶液200バに50成のファー
ジ溶液■を添加し、室温にて15分間放置した。2I1
1のLB培地を添加した1000℃にて2時間培養を続
け、得られた培養液を20747−のに鵬を含むLBプ
レートにスプレッドした。30℃にて24時間培養を続
け、出現してきたコロニーより100コ〇ニーをピック
アップしそれ等のMuファージ感受性及び45℃におけ
る溶菌性を調べた。その結果、85%のコロニーが溶菌
せずかつ1ylu感受性であった。これらのうちの1ク
ローンをE L 1G01株とした。
(4)宿主染色体におけるHudAH9の増幅とコピー
数の決定 (i) DP130によるHudAH9の増幅E L
1G01株をpPR30を用いて形質転換し、トラン
スフォーマントを254/ai!のAID及び20G−
400埒/−のに−またはN−を含む1Bプレートにス
プレッドした。
数の決定 (i) DP130によるHudAH9の増幅E L
1G01株をpPR30を用いて形質転換し、トラン
スフォーマントを254/ai!のAID及び20G−
400埒/−のに−またはN−を含む1Bプレートにス
プレッドした。
(ii) Mu Ct S溶菌液を用いたHudAH9
の増幅JM109(Mu c t s )をLB培地で
30℃にて2時間培養し、45℃、15分間の熱処理を
行った後更に31℃にて2時間培養を続けた。得られた
WII!i液にり00ホルム数滴を加え混合した後、5
0G0 rplで10分間遠心しファージ溶液を得た。
の増幅JM109(Mu c t s )をLB培地で
30℃にて2時間培養し、45℃、15分間の熱処理を
行った後更に31℃にて2時間培養を続けた。得られた
WII!i液にり00ホルム数滴を加え混合した後、5
0G0 rplで10分間遠心しファージ溶液を得た。
LB培地を用いて一晩培養したE L 1G01株の培
養液にCac1!2とHoSO4を最終濃度がそれぞれ
1 aM及び2.51Nとなるように添加しした後、本
溶液200gとSodの上記ファージ溶液を混合し室温
にて15分間放置した。2−のLB培地を加えて30℃
で2時間培養を続けた後20G−4004/−のに−か
つ/または口を含むL8プレートにスプレッドした。3
0℃で48時開通養後出現したコロニーをピックアップ
し、(i)の場合はpP830の脱落したクローンを、
(t+3の場合はMuctsが溶原化していないクロー
ンを更に選択した。染色体上のHudAH9のコピー数
をサザンアナリシス法にて測定した。以下得られたクロ
ーンのうち特にEL1002と1003について詳細に
述べる。^J11332 、E L 1G01、E L
1002及びE l−1003株より通常の方法で染
色体DNAを調製した。
養液にCac1!2とHoSO4を最終濃度がそれぞれ
1 aM及び2.51Nとなるように添加しした後、本
溶液200gとSodの上記ファージ溶液を混合し室温
にて15分間放置した。2−のLB培地を加えて30℃
で2時間培養を続けた後20G−4004/−のに−か
つ/または口を含むL8プレートにスプレッドした。3
0℃で48時開通養後出現したコロニーをピックアップ
し、(i)の場合はpP830の脱落したクローンを、
(t+3の場合はMuctsが溶原化していないクロー
ンを更に選択した。染色体上のHudAH9のコピー数
をサザンアナリシス法にて測定した。以下得られたクロ
ーンのうち特にEL1002と1003について詳細に
述べる。^J11332 、E L 1G01、E L
1002及びE l−1003株より通常の方法で染
色体DNAを調製した。
11J限酵素堕RIでDNAを切断後、0.8%アガロ
ースを用いて電気泳動を行い続いてDNAをニトロセル
ロースフィルター上にプロットした。
ースを用いて電気泳動を行い続いてDNAをニトロセル
ロースフィルター上にプロットした。
pAH9のEcoRIフラグメントのうち4゜3kbの
7ラグメントをラジオアイソトープでラベルしプローブ
として用いハイブリダイゼーションを行った。
7ラグメントをラジオアイソトープでラベルしプローブ
として用いハイブリダイゼーションを行った。
結果を第6図に示した。レーンA、B、C及びDはA
J 11332 、 E L 1G01. E L 1
002及びE L 1G03にそれぞれ相当する。
J 11332 、 E L 1G01. E L 1
002及びE L 1G03にそれぞれ相当する。
小文字raJは元菌株由来のthrオペロンに相当し、
rbJはカラムB、C及びDに見られる非特異的なフラ
グメントに相当する。数字は染色体上に転移増幅したH
udAH9の数に相当する。本結果より、E L 10
01. E L 1002及びE L 1003はそれ
ぞれ少なくとも1,4及び10コピーのHUdAH9を
染色体に保有することが示唆された。HudAH9のコ
ピー数とそれを保有する菌株の薬剤耐性度を表1に示し
た。
rbJはカラムB、C及びDに見られる非特異的なフラ
グメントに相当する。数字は染色体上に転移増幅したH
udAH9の数に相当する。本結果より、E L 10
01. E L 1002及びE L 1003はそれ
ぞれ少なくとも1,4及び10コピーのHUdAH9を
染色体に保有することが示唆された。HudAH9のコ
ピー数とそれを保有する菌株の薬剤耐性度を表1に示し
た。
(5) HUdAH9保有菌株による1−−スレオニン
の生産上記のようにして得られた菌株をしBプレート上
で30℃にて24時間培養した後、20a1の生産培地
を入れたフラスコにシードし、30℃にて72時間振盪
培養を行った。培養ブロス中のL−スレオニン蓄積量は
アミノ酸アナライザーを用いて測定した。
の生産上記のようにして得られた菌株をしBプレート上
で30℃にて24時間培養した後、20a1の生産培地
を入れたフラスコにシードし、30℃にて72時間振盪
培養を行った。培養ブロス中のL−スレオニン蓄積量は
アミノ酸アナライザーを用いて測定した。
結果を表■に、生産培地の組成を以下に示す。
生産培地組成ニゲルコース: 30g/ R、(NH4
)2SO4: IOg/i) 、 KH2PO4:
Ig/ll、 H(IsO471120: 19/1
、 FeSO4−7H20;10ay/R。
)2SO4: IOg/i) 、 KH2PO4:
Ig/ll、 H(IsO471120: 19/1
、 FeSO4−7H20;10ay/R。
HnSO−4−6H20: 101119/ff 、L
−Met: 0.1g/l 。
−Met: 0.1g/l 。
L−11e : 0.1g/l ; L−Pr
o ; 0.45g /1)RNA ; 2g/
fl 、 Thiamine−tlG! : lay
/1CaC03; 40’J/(1、pH=7゜5(6
) HudAH9保有株におけるL−スレオニン生産性
の安定性 少なくとも4コピーのHudAH9を保有づるEL10
02株を抗生物質を含まないLBブレー1・培地上で植
え継ぎ、各植え継ぎの後(5)で述べたのと同様の方法
でL−スレオニン生産性を調べた。結果を表■に示した
。
o ; 0.45g /1)RNA ; 2g/
fl 、 Thiamine−tlG! : lay
/1CaC03; 40’J/(1、pH=7゜5(6
) HudAH9保有株におけるL−スレオニン生産性
の安定性 少なくとも4コピーのHudAH9を保有づるEL10
02株を抗生物質を含まないLBブレー1・培地上で植
え継ぎ、各植え継ぎの後(5)で述べたのと同様の方法
でL−スレオニン生産性を調べた。結果を表■に示した
。
(71HudAH9保有株におけるL−スレオニン生合
成系酵素活性 HudAH9を保有する各種菌株を最小培地で培基し、
P、 r、 Bachi等の方法(Method in
Enzymolozy、 17゜694(1970)
)でアスバルトキナーゼ(AK ! )活性を、同じ(
P、T、Bach等の方法(Biochimt、 。
成系酵素活性 HudAH9を保有する各種菌株を最小培地で培基し、
P、 r、 Bachi等の方法(Method in
Enzymolozy、 17゜694(1970)
)でアスバルトキナーゼ(AK ! )活性を、同じ(
P、T、Bach等の方法(Biochimt、 。
8iophys、、Acta、、 128.450(
19661)でホモセリンデヒドロゲナーゼ(l(Dl
ll)活性を測定した。結果を表■に示した。
19661)でホモセリンデヒドロゲナーゼ(l(Dl
ll)活性を測定した。結果を表■に示した。
表1.HudAH9のコピー数と抗生物質耐性度の関係
HudAH9の薬剤耐性度 薬剤感受性 コピー数 ・0 にII 20埒/Ili にm 200埒/d Nm十に1250 m、/d! 2以上 Nm+Km 250〜/ae 表■、 HudAH9保有株のL−スレオニン生産性菌
株 ^J11332 L100I L1002 L1003 HudAH9の コピー数 し−スレオニン 生産性(g/11 1以上 4以上 10以上 3.0 3.3 8.9 12.0 表■。
HudAH9の薬剤耐性度 薬剤感受性 コピー数 ・0 にII 20埒/Ili にm 200埒/d Nm十に1250 m、/d! 2以上 Nm+Km 250〜/ae 表■、 HudAH9保有株のL−スレオニン生産性菌
株 ^J11332 L100I L1002 L1003 HudAH9の コピー数 し−スレオニン 生産性(g/11 1以上 4以上 10以上 3.0 3.3 8.9 12.0 表■。
El、1002株の植え継ぎ後[−スレオニン生産性植
え継ぎ回数 0 2 4 6 8 10L−ス
レオニン 8.5 8.6 8.5 8.8 8.8
8.9生産性(+II/1) EL1002は抗生物質を含まないLBプレート上で植
え継いだ。
え継ぎ回数 0 2 4 6 8 10L−ス
レオニン 8.5 8.6 8.5 8.8 8.8
8.9生産性(+II/1) EL1002は抗生物質を含まないLBプレート上で植
え継いだ。
表IV、 HudAH9保有株によるL−スレオニン生
合成系酵素生産 比活性(u mole/sin/u protein)
菌 株 AKI
HD旧^J11332 2.5
4.8EL1GG1 4.
0 1G、IEL1002
12.5 25.0EL1GG3
22.5 37.4実施
例3 温度で誘導可能なトランスポゼース遺伝子を有するプラ
スミドを用いたMudファージの増幅(1)温度誘導可
能なトランスポゼース遺伝子を有するプラスミドの構築 P On 1681株(Castilho et al
、、J、Bacteriol、。
合成系酵素生産 比活性(u mole/sin/u protein)
菌 株 AKI
HD旧^J11332 2.5
4.8EL1GG1 4.
0 1G、IEL1002
12.5 25.0EL1GG3
22.5 37.4実施
例3 温度で誘導可能なトランスポゼース遺伝子を有するプラ
スミドを用いたMudファージの増幅(1)温度誘導可
能なトランスポゼース遺伝子を有するプラスミドの構築 P On 1681株(Castilho et al
、、J、Bacteriol、。
158、488(1984))をcaα2処理でコンピ
テント化(Handel and旧Qa、J、Ho1.
、Biol、、 53,159(197G))した後、
プラスミドDE V 11 (第7図)を用いて形質転
換し、204 / dのAIEIと201187−のに
讃を含むLBプレートを用いてトランスフォーマントを
選択した。トランスフォーマント、P OIF 168
1/p[Vll ヲ3d17)LBI地ヲJlイア30
℃r2mlilffi養した後、45℃、15分間の熱
処理を行い続いて31℃で2時間培養を続け、ファージ
溶菌液を得た。
テント化(Handel and旧Qa、J、Ho1.
、Biol、、 53,159(197G))した後、
プラスミドDE V 11 (第7図)を用いて形質転
換し、204 / dのAIEIと201187−のに
讃を含むLBプレートを用いてトランスフォーマントを
選択した。トランスフォーマント、P OIF 168
1/p[Vll ヲ3d17)LBI地ヲJlイア30
℃r2mlilffi養した後、45℃、15分間の熱
処理を行い続いて31℃で2時間培養を続け、ファージ
溶菌液を得た。
クロロホルムを数滴添加した後よく混合し、遠心して上
滑液を得、ファージ溶液とした。
滑液を得、ファージ溶液とした。
E、 coll M8820株(Castilho
et at、、 J。
et at、、 J。
Bacteriol、、 158.488(1984
))をLB培地にて一晩培養し、Caα2とH(IsO
4を最終11がそれぞれ1a+Mおよび2.5mMとな
るように添加した。本溶液200111と上述の77−
ジ溶液5oIJ1を混合し、室温で15分放置した後L
B培地を2m加えて30℃で2時間培養を続けた。この
菌液を20埒/ at!のにmと20R/dのAIDを
含むLBプレートにスプレッドし、30℃で24時間培
養後、出現してきたコロニーのうち20コロニーを釣り
上げ、ミニプレツブ法にてプラスミドを抽出し、制限酵
素を用いて制限部位を解析した。すべてのクローンがM
ud I[1681の転移したpEVllを持つこと
が確認され、このうちの1クローンをpHcl (第7
図)とした。pHclをBulIIと卸1」Iで切断し
、1す1−IIで切断したpRclGG(実施例2参照
)と連結しM C106Gを形質転換した。トランスフ
ォーマントを254 / dのC−と20/l/ae(
F)All)を含むLB7L/−トr選択L、30:1
0ニーよりプラスミドを抽出して解析した。これらのう
らの一つをpHc23としたく第7図)。
))をLB培地にて一晩培養し、Caα2とH(IsO
4を最終11がそれぞれ1a+Mおよび2.5mMとな
るように添加した。本溶液200111と上述の77−
ジ溶液5oIJ1を混合し、室温で15分放置した後L
B培地を2m加えて30℃で2時間培養を続けた。この
菌液を20埒/ at!のにmと20R/dのAIDを
含むLBプレートにスプレッドし、30℃で24時間培
養後、出現してきたコロニーのうち20コロニーを釣り
上げ、ミニプレツブ法にてプラスミドを抽出し、制限酵
素を用いて制限部位を解析した。すべてのクローンがM
ud I[1681の転移したpEVllを持つこと
が確認され、このうちの1クローンをpHcl (第7
図)とした。pHclをBulIIと卸1」Iで切断し
、1す1−IIで切断したpRclGG(実施例2参照
)と連結しM C106Gを形質転換した。トランスフ
ォーマントを254 / dのC−と20/l/ae(
F)All)を含むLB7L/−トr選択L、30:1
0ニーよりプラスミドを抽出して解析した。これらのう
らの一つをpHc23としたく第7図)。
(2) EIHC23を用いたMudファージの増幅H
udAH9が転移増幅した菌株、E L 1001 (
実施例2参照)をCaα2法で処理しコンピテント化し
た後pHC23で形質転換した。トランスフォーマント
は25埒/IiのC−と20埒/alのA11yを含む
LB培地で選択した。トランスフォーマントE L 1
001/pHc23ヲ25IJ!j/ d f) Ca
と204/jd!ノAIDを含むLB培地で30℃にて
2時間培養後、45℃、15分間の熱処理を加えた。本
菌液1dにLB培地を同量加え、30℃で2時間培養を
続けた後、400埒/j11!のにmとN−を含むLB
培地にスプレッドし30℃で培養した。
udAH9が転移増幅した菌株、E L 1001 (
実施例2参照)をCaα2法で処理しコンピテント化し
た後pHC23で形質転換した。トランスフォーマント
は25埒/IiのC−と20埒/alのA11yを含む
LB培地で選択した。トランスフォーマントE L 1
001/pHc23ヲ25IJ!j/ d f) Ca
と204/jd!ノAIDを含むLB培地で30℃にて
2時間培養後、45℃、15分間の熱処理を加えた。本
菌液1dにLB培地を同量加え、30℃で2時間培養を
続けた後、400埒/j11!のにmとN−を含むLB
培地にスプレッドし30℃で培養した。
48時間後出現してきたコロニーのうち50コロニを釣
り上げCgi感受性と1−スレオニンの生産性を調べた
。その結果60%が親株以上の[−スレオニンを生産し
、またそのうちの50%がcm感受性であった。
り上げCgi感受性と1−スレオニンの生産性を調べた
。その結果60%が親株以上の[−スレオニンを生産し
、またそのうちの50%がcm感受性であった。
2クローンを選び染色体EのHudAH9のコピー数を
サザンハイプリダイゼーション法で測定した。
サザンハイプリダイゼーション法で測定した。
すなわち、染色体DNAをHindll[で切断侵アガ
ロースゲルを用いて泳動しナイロンメンブレン上にプロ
ットした。thrオペロンを含むpAH9(実施例2参
照)の5alI −Bag+HI断片をスルフオネーシ
ョンでラベルしくケミプローブキット使用)プローブと
して使用した。HudAH9のコピー数およびL−スレ
オニン蓄積邑の結果を表Vに示す。またサゾンハイブリ
ダイゼーションの結果を第8図に示した。
ロースゲルを用いて泳動しナイロンメンブレン上にプロ
ットした。thrオペロンを含むpAH9(実施例2参
照)の5alI −Bag+HI断片をスルフオネーシ
ョンでラベルしくケミプローブキット使用)プローブと
して使用した。HudAH9のコピー数およびL−スレ
オニン蓄積邑の結果を表Vに示す。またサゾンハイブリ
ダイゼーションの結果を第8図に示した。
実施例4
同一細胞染色体上における2種類のMudの転移増幅
(1) MC4100(tvl(Jc t s)(Mu
dI[PR13)株よりMudI[PR13ライゼート
の調製M C4100(M u c t s )(Mu
dI[P R13)株(PRatet et al、
Gene 63.41(1988))をLB培地にて3
0℃で2時間18!i L’だ後、45℃、15分間の
熱処理を加え更に37℃で2時間培養を続けた。水溶菌
液に数滴のクロロホルムを添加混合し、5000 rp
Illで10分間遠心してその上澄液をファージ溶液■
とした。
dI[PR13)株よりMudI[PR13ライゼート
の調製M C4100(M u c t s )(Mu
dI[P R13)株(PRatet et al、
Gene 63.41(1988))をLB培地にて3
0℃で2時間18!i L’だ後、45℃、15分間の
熱処理を加え更に37℃で2時間培養を続けた。水溶菌
液に数滴のクロロホルムを添加混合し、5000 rp
Illで10分間遠心してその上澄液をファージ溶液■
とした。
(2) MudII P R13のE L 1001お
よびE l−1003株染色体上への転移 E L 1001株を18培地で一晩培養した後、最終
濃度がそれぞれ11Mおよび2.518となるようにc
aa とH(JSO4を添加した。本溶液200pと
50ρのファージ溶液を混合し、15分間室温にて放置
した後2dのLB培地を加えて30℃で2時間培養を続
けた。この菌液を25埒/ rlのCIと20R/dの
Kmを含むLBプレートにスプレッドし、30℃で培養
を続は出現してきたコロニーのうち50を釣り上げ45
℃における溶菌性とMu)7−ジ感受性を調べた。その
結果80%のコロニーが溶菌せずかつMu感受性であっ
た。このうちの1クローンをEL1004とした。E
L 1003株も上述の方法で処理した。
よびE l−1003株染色体上への転移 E L 1001株を18培地で一晩培養した後、最終
濃度がそれぞれ11Mおよび2.518となるようにc
aa とH(JSO4を添加した。本溶液200pと
50ρのファージ溶液を混合し、15分間室温にて放置
した後2dのLB培地を加えて30℃で2時間培養を続
けた。この菌液を25埒/ rlのCIと20R/dの
Kmを含むLBプレートにスプレッドし、30℃で培養
を続は出現してきたコロニーのうち50を釣り上げ45
℃における溶菌性とMu)7−ジ感受性を調べた。その
結果80%のコロニーが溶菌せずかつMu感受性であっ
た。このうちの1クローンをEL1004とした。E
L 1003株も上述の方法で処理した。
その結果90%のコロニーが45℃で溶菌せずかつMu
感受性であった。クローンの一つをE l 1005と
した。
感受性であった。クローンの一つをE l 1005と
した。
(3) E L 1004およびFl 1005株にお
けるMud[P R13の増幅 実施例2で述べたのと同様の方法でE L 1004株
をJM109(Mu c t s )より調製した1y
luctsライゼートを用いて感染させた。得られた菌
液を20埒/at!のにmと400埒/ dのCmを含
むLB培地にスプレッドし、30℃で48時間培養して
出現してくるコロニーのうら50を釣り上げ45℃にお
ける溶菌性とMu感受性を調べた。その結果84%のコ
ロニーが溶菌せずかつMu感受性であった。これらのう
らの1クローンをE l 1006とした。E L 1
005株も同様に処理し、その結果82%のコロニーが
45℃で溶菌ぜずかつMLI感受性であった。クローン
の一つをE L 1007とした。
けるMud[P R13の増幅 実施例2で述べたのと同様の方法でE L 1004株
をJM109(Mu c t s )より調製した1y
luctsライゼートを用いて感染させた。得られた菌
液を20埒/at!のにmと400埒/ dのCmを含
むLB培地にスプレッドし、30℃で48時間培養して
出現してくるコロニーのうら50を釣り上げ45℃にお
ける溶菌性とMu感受性を調べた。その結果84%のコ
ロニーが溶菌せずかつMu感受性であった。これらのう
らの1クローンをE l 1006とした。E L 1
005株も同様に処理し、その結果82%のコロニーが
45℃で溶菌ぜずかつMLI感受性であった。クローン
の一つをE L 1007とした。
染色体DNAをAJ11332 、 E L 1004
. E L 1005゜E l 1006及びE l
1007より調製し、それぞれをL並RIで切断した。
. E L 1005゜E l 1006及びE l
1007より調製し、それぞれをL並RIで切断した。
Hind mで切断したpltclooをプローブとし
てサザンアナリシスを行なった(ケミプローブギット使
用)。ハイブリダイゼーションの結果を第9図に示す。
てサザンアナリシスを行なった(ケミプローブギット使
用)。ハイブリダイゼーションの結果を第9図に示す。
カラムAのすべてのフラグメントはプローブpRc10
0とA J 11332株のDNA間のハイブリダイゼ
ーションによるものである。これらのパターンは他の株
でも同様に見られる。カラムC,D、FおよびGにal
いてそれぞれ1.4.1および3本の1yludI[P
R13に相当するフラグメントが見られる。
0とA J 11332株のDNA間のハイブリダイゼ
ーションによるものである。これらのパターンは他の株
でも同様に見られる。カラムC,D、FおよびGにal
いてそれぞれ1.4.1および3本の1yludI[P
R13に相当するフラグメントが見られる。
実施例5
Erwinia chrysanthemiにおけるM
udの転移と増幅(1) Mudライゼートの調製 MudI[1734やHudAH9のライゼート調製の
ために以下の菌株を用いた。
udの転移と増幅(1) Mudライゼートの調製 MudI[1734やHudAH9のライゼート調製の
ために以下の菌株を用いた。
P OII 1734 (Castilho et a
l、、J、Bacterio1158、488(198
4)) J M 1109(u c t s )(HudAH9
)(実施例2参照)それぞれのMudライゼートを実施
例2で述べたのと同様の方法でta製した。
l、、J、Bacterio1158、488(198
4)) J M 1109(u c t s )(HudAH9
)(実施例2参照)それぞれのMudライゼートを実施
例2で述べたのと同様の方法でta製した。
(2)各Mudのtrwtnta chr 5antt
leli染色体上への転移 Erwinia chr 5antheli
384551 (H,Chippaux。
leli染色体上への転移 Erwinia chr 5antheli
384551 (H,Chippaux。
CNR8Harseille)を受容菌とし、上記2種
のライゼートを用いてMudの導入(ミニミ1−ダクシ
ョン)を実施例2と同様の方法で行った。2G# /
dのにmを含むLB培地上に出現したコロニーを釣り上
げ45℃における溶菌性とMu感受性を調べた。
のライゼートを用いてMudの導入(ミニミ1−ダクシ
ョン)を実施例2と同様の方法で行った。2G# /
dのにmを含むLB培地上に出現したコロニーを釣り上
げ45℃における溶菌性とMu感受性を調べた。
その結果Mud1[1734を用いた場合は70%、H
udAH9を用いた場合は80%のコロニーが45℃で
溶菌せずまたMu感受性であった。 E、chrysa
nthesi384551(HudI[1734)
をE L 3003. E、chrysanthe
a+1384551 (tfudAH9)をE L 3
004とした。
udAH9を用いた場合は80%のコロニーが45℃で
溶菌せずまたMu感受性であった。 E、chrysa
nthesi384551(HudI[1734)
をE L 3003. E、chrysanthe
a+1384551 (tfudAH9)をE L 3
004とした。
(3) MudI[1734およびlyl udAH9
の増幅Muctsライゼートを用いTE L 3003
およびEL3004の藺udの増幅を実施例2と同様の
方法を用いて行った。増幅株の選択にはに―とN−を4
004/m1含むLB培地を用いた。プレート上に現れ
たコロニーよりそれぞれ50コ0ニーを釣り上げ、45
℃で溶菌せず、Mu感受性のコロニーを選択した。
の増幅Muctsライゼートを用いTE L 3003
およびEL3004の藺udの増幅を実施例2と同様の
方法を用いて行った。増幅株の選択にはに―とN−を4
004/m1含むLB培地を用いた。プレート上に現れ
たコロニーよりそれぞれ50コ0ニーを釣り上げ、45
℃で溶菌せず、Mu感受性のコロニーを選択した。
E L 3G03由来の増幅株′をE L 3007.
E L 3G04由来の増幅株をE L 3G08と
した。
E L 3G04由来の増幅株をE L 3G08と
した。
(4)各菌株の染色体DNA上のMljdのコピー数名
菌株より染色体DNAをE、CGl+の場合と同様の方
法(クリアートライゼート調製に用いる5arcost
neをSDSに変更した点だけ責なる)で調製した。各
染色体DNAeEcoRIで切断し、下記のプローブを
用いてサザンアナリシスを行った。サザンアナリシスに
はケミプローブキットを使用した。
菌株より染色体DNAをE、CGl+の場合と同様の方
法(クリアートライゼート調製に用いる5arcost
neをSDSに変更した点だけ責なる)で調製した。各
染色体DNAeEcoRIで切断し、下記のプローブを
用いてサザンアナリシスを行った。サザンアナリシスに
はケミプローブキットを使用した。
Mudl[1734用プ0−プ:Mud左端部分を含む
DNAM udA M Q用プローブ: thrオペa
ンを含むDNA(pAH9の影虹I−8胡HI断片) 結果を表■、第10図および第11図に示した。
DNAM udA M Q用プローブ: thrオペa
ンを含むDNA(pAH9の影虹I−8胡HI断片) 結果を表■、第10図および第11図に示した。
実施例6
複数の遺伝子を保有するMudの増幅
(1)す>r Iペロンとasd遺伝子を有するHud
A旧1の構築 プラスミドpAD2旧11aziza et al、、
EHBOJ、、 3゜379(1982))をBa1l
HIにて切断し、アガロース電気泳動にてasd遺伝子
を含む1.7kbのDNAフラグメントを抽出した。一
方pAH9(実施例2参照)をBa1lHIで切断し、
上記■Lフラグメントと連結反応を行った(T4 DN
Aリガーゼで10℃にて16時間反応)、Asd 株
、J CP 203 (C,Pr1ntz。
A旧1の構築 プラスミドpAD2旧11aziza et al、、
EHBOJ、、 3゜379(1982))をBa1l
HIにて切断し、アガロース電気泳動にてasd遺伝子
を含む1.7kbのDNAフラグメントを抽出した。一
方pAH9(実施例2参照)をBa1lHIで切断し、
上記■Lフラグメントと連結反応を行った(T4 DN
Aリガーゼで10℃にて16時間反応)、Asd 株
、J CP 203 (C,Pr1ntz。
personal comsunication)をコ
ンピテント化し、上記ライゲーション溶液を用いて形質
転換を行った。トランスフォーマントを204!IF
/ dのにmと25147dのCmを含む[8プレート
で選択し、プラスミドを抽出後制限酵素で切断解析し、
asdフラグメントを含むpAN9;pAHll (第
12図)を保有する菌株を選出した。
ンピテント化し、上記ライゲーション溶液を用いて形質
転換を行った。トランスフォーマントを204!IF
/ dのにmと25147dのCmを含む[8プレート
で選択し、プラスミドを抽出後制限酵素で切断解析し、
asdフラグメントを含むpAN9;pAHll (第
12図)を保有する菌株を選出した。
(2J染色体DNA上へのMudAfllの転移プラス
ミドルA旧1を用いてE、 coli JM109(
Mu立ts)(実施例2参照)を形質転換し、J M2
O3(M u c t s ) /pAM11を得た。
ミドルA旧1を用いてE、 coli JM109(
Mu立ts)(実施例2参照)を形質転換し、J M2
O3(M u c t s ) /pAM11を得た。
本菌株をLB培地で30℃で2時間培養し、45℃、1
5分間の熱処理を加えた後、更に37℃で2時間培養を
続は溶菌液を得た。り00ホルム数滴を添加しよく混合
した侵、50G0 rplで10分間遠心しhffi液
をファージ溶液11−AMllとして得た。
5分間の熱処理を加えた後、更に37℃で2時間培養を
続は溶菌液を得た。り00ホルム数滴を添加しよく混合
した侵、50G0 rplで10分間遠心しhffi液
をファージ溶液11−AMllとして得た。
L8培地を用いてJM109(Mu c t s )を
30℃で一晩培養し、本菌液に最終濃度がそれぞれ11
1Mおよび2.5−HとなるようにCaα2とHQSO
4を添加した。本漬200mとファージ溶液II−A旧
150ρを混合し室温に15分間放置した後、2dのL
B培地を添加して30℃で2時間培養した。本菌液を2
0埒/dのにmを含むLBプレートにスプレッドし、3
0℃で24時間培!!侵出現してきたコロニーより 1
00コロニーを釣り上げcm感受性を調べた。85%の
コロニーがCm感受性でありJM109 (MLJ
c t s )(MudAMll)であることを確認し
た。LB培地にてJM109(Mucts)(MudA
Mll)を30℃で2時間培養し、45℃、15分間の
熱処理を加えた模、更に37℃で2時間培養を続は溶菌
液を得た。クロロボルム数滴を添加しよく混合した優、
5000 rpmで10分間遠心し上澄液をファージ溶
液■AMIIとして得た。
30℃で一晩培養し、本菌液に最終濃度がそれぞれ11
1Mおよび2.5−HとなるようにCaα2とHQSO
4を添加した。本漬200mとファージ溶液II−A旧
150ρを混合し室温に15分間放置した後、2dのL
B培地を添加して30℃で2時間培養した。本菌液を2
0埒/dのにmを含むLBプレートにスプレッドし、3
0℃で24時間培!!侵出現してきたコロニーより 1
00コロニーを釣り上げcm感受性を調べた。85%の
コロニーがCm感受性でありJM109 (MLJ
c t s )(MudAMll)であることを確認し
た。LB培地にてJM109(Mucts)(MudA
Mll)を30℃で2時間培養し、45℃、15分間の
熱処理を加えた模、更に37℃で2時間培養を続は溶菌
液を得た。クロロボルム数滴を添加しよく混合した優、
5000 rpmで10分間遠心し上澄液をファージ溶
液■AMIIとして得た。
E、 coli AJ11332 (λ”、Pro
>(実施例2参照)をP1ファージを用いて形質転換し
、A J 11332 (λ+ 、 p 、0+ >
を得た。本枕よりλ非溶原化株を選択しくC,Hore
l、私信)EL1016(λ 、pro)株を得た。本
菌株をLB培地で一晩培養した後最終濃度がそれぞれ1
mNおよび2.5 INとなるようにCaC1! 2
とHIJSO4を添加した。
>(実施例2参照)をP1ファージを用いて形質転換し
、A J 11332 (λ+ 、 p 、0+ >
を得た。本枕よりλ非溶原化株を選択しくC,Hore
l、私信)EL1016(λ 、pro)株を得た。本
菌株をLB培地で一晩培養した後最終濃度がそれぞれ1
mNおよび2.5 INとなるようにCaC1! 2
とHIJSO4を添加した。
本菌液200成とファージ溶液111−A旧150.c
cl!を混合し室温で15分間放置した後、2ai!の
LB培地を添加して30℃で2時間培養を続けた。この
菌液を20119/dのにmを含むLB培地にスプレッ
ドし、30℃で2時間培養した後出現してきたコロニー
からMu感受性を示すコロニーを選択しE l 101
2とした。
cl!を混合し室温で15分間放置した後、2ai!の
LB培地を添加して30℃で2時間培養を続けた。この
菌液を20119/dのにmを含むLB培地にスプレッ
ドし、30℃で2時間培養した後出現してきたコロニー
からMu感受性を示すコロニーを選択しE l 101
2とした。
(3) MudAMllの増幅とコピー数の測定Muc
tsライゼートを用いてE L 1012染色体上のM
udA M 11の増幅を実施例2と同様の方法を用
いて行った。増幅株の選択は250埒/ d −120
0119/1trlのにlとNmを含むLBプレートで
行いこのうちの一株をE L 1013とした。
tsライゼートを用いてE L 1012染色体上のM
udA M 11の増幅を実施例2と同様の方法を用
いて行った。増幅株の選択は250埒/ d −120
0119/1trlのにlとNmを含むLBプレートで
行いこのうちの一株をE L 1013とした。
染色体DNAをE L 1016. E L、 101
2およびEL1013より調製し、旦」口、■またはE
C0RIで明所した。アガロースゲルを用いて電気泳動
を行いサプンブ臼ツティングを行った。2梯類のプロー
ブDNAを用いてハイブリダイゼーションを行った(ケ
ミプローブキット便用) (第13−16図)。各図に
おいてレーンA、BおよびCはそれぞれELlolG、
E L 1012およびE L 1013に相当する
。小文字1’ a Jは菌株由来のthrオペロンに相
当し、数字は転移したMudAMllに対応するフラグ
メントである。第13図は5alIで切断した染色体D
NAフラグメント用いたハイブリダイゼーションパター
ンである。数字を付したフラグメント2木が1MudA
M11に相当する。第14図はEcoRIで切断した染
色体DNAと上記プローブを用いたハイブリダイピージ
ョンパターンである。数字を付したフラグメント1本が
I MudAMllに相当する。第15図は3alIで
切断した染色体DNAとasdを含むDNAプローブ(
pAHllの堕H1−堕H1フラグメント)を用いたハ
イブリダイゼーションパターンである。数字のフラグメ
ント1本が1M IJdA M 11に相当する。第1
6図はEC0RIで切断した染色体DNAと上記asd
フラグメントを用いたハイブリダイゼーションパターン
である。数字のフラグメント1本がIMudAMllに
相当する。
2およびEL1013より調製し、旦」口、■またはE
C0RIで明所した。アガロースゲルを用いて電気泳動
を行いサプンブ臼ツティングを行った。2梯類のプロー
ブDNAを用いてハイブリダイゼーションを行った(ケ
ミプローブキット便用) (第13−16図)。各図に
おいてレーンA、BおよびCはそれぞれELlolG、
E L 1012およびE L 1013に相当する
。小文字1’ a Jは菌株由来のthrオペロンに相
当し、数字は転移したMudAMllに対応するフラグ
メントである。第13図は5alIで切断した染色体D
NAフラグメント用いたハイブリダイゼーションパター
ンである。数字を付したフラグメント2木が1MudA
M11に相当する。第14図はEcoRIで切断した染
色体DNAと上記プローブを用いたハイブリダイピージ
ョンパターンである。数字を付したフラグメント1本が
I MudAMllに相当する。第15図は3alIで
切断した染色体DNAとasdを含むDNAプローブ(
pAHllの堕H1−堕H1フラグメント)を用いたハ
イブリダイゼーションパターンである。数字のフラグメ
ント1本が1M IJdA M 11に相当する。第1
6図はEC0RIで切断した染色体DNAと上記asd
フラグメントを用いたハイブリダイゼーションパターン
である。数字のフラグメント1本がIMudAMllに
相当する。
これらの結果よりE l 1012とE l 1013
はそれぞれ少なくとも1および4コピーのMudAMl
lを有することが示唆された。
はそれぞれ少なくとも1および4コピーのMudAMl
lを有することが示唆された。
(4) E L 1012およびE L 1013株の
薬剤耐性度、[−スレオニン生産性およびM素活性 表v1に各菌株の抗生物質耐性度および感受性度を示す
。表■には実施例2と同様にして測定したE−スレオニ
ン生産性を示した。また表■にはアスパルトカイネース
(AKI)活性およびアスパルテートセミアルデヒドロ
ゲナーゼ(ADD>活性(Hegesan、 G、◎、
et al、、 Methods in Enzyao
logy。
薬剤耐性度、[−スレオニン生産性およびM素活性 表v1に各菌株の抗生物質耐性度および感受性度を示す
。表■には実施例2と同様にして測定したE−スレオニ
ン生産性を示した。また表■にはアスパルトカイネース
(AKI)活性およびアスパルテートセミアルデヒドロ
ゲナーゼ(ADD>活性(Hegesan、 G、◎、
et al、、 Methods in Enzyao
logy。
17、708(197G))を示した。
実施例7
E、coli由来−aspA ’II伝子の増幅と[−
アスパルテートアンモニアリアーゼの生産 (1)幻■−カ、遺伝子を有するM udA B 9の
構築プラスミド1)PH1(P、Ratet et a
l、、Gene、63.41(1988) ) ヲP
St I t”切断したIT4 DNAリガーゼを用い
て再度連結し、cat選伝子がpPR3と逆向きに挿入
されたプラスミドpPC3(第11図)を得た。プラス
ミドDGS94 (Guest et al、、 J、
Gen。
アスパルテートアンモニアリアーゼの生産 (1)幻■−カ、遺伝子を有するM udA B 9の
構築プラスミド1)PH1(P、Ratet et a
l、、Gene、63.41(1988) ) ヲP
St I t”切断したIT4 DNAリガーゼを用い
て再度連結し、cat選伝子がpPR3と逆向きに挿入
されたプラスミドpPC3(第11図)を得た。プラス
ミドDGS94 (Guest et al、、 J、
Gen。
Hicrobiol、、 130.1271(198
4))をC1aIおよび3alIで切断し一1lLへ遺
伝子を含む3.4 kbのDNAフラグメントを得た。
4))をC1aIおよび3alIで切断し一1lLへ遺
伝子を含む3.4 kbのDNAフラグメントを得た。
一方MudPC3を有しMudPC3を含む5.3kb
のDNA断片を得た。
のDNA断片を得た。
上記2フラグメントをT4 DNAリガーゼを用いて2
2℃で1時間連結反応を行った。本ライゲーション溶液
を用いてコンビテン!・化したM C106G(Cas
adaban et al、、Proc、Natl、A
cad、Sci、USA、。
2℃で1時間連結反応を行った。本ライゲーション溶液
を用いてコンビテン!・化したM C106G(Cas
adaban et al、、Proc、Natl、A
cad、Sci、USA、。
76、4530(1979))を形質転換し、20/l
l#/jll!のA11)と25n/−のC−を含むL
Bプレートでトランスフォーマントを選択した。21ク
ローンのトランスフォーマントより更ににI感受性のク
ローンを17選択した。これら11株のアスパルテート
アンモニアリアーゼ(AspA)活性(Spencer
et al、、 J、Gen。
l#/jll!のA11)と25n/−のC−を含むL
Bプレートでトランスフォーマントを選択した。21ク
ローンのトランスフォーマントより更ににI感受性のク
ローンを17選択した。これら11株のアスパルテート
アンモニアリアーゼ(AspA)活性(Spencer
et al、、 J、Gen。
+tcroむiol、、 97.73(1976))を
測定しコントロール株より高いA spA活性を示す株
を1株得た。本菌株よりプラスミドを抽出し各種制限酵
素で制限地図を解析した結果、−計則A遺伝子断片とM
udを含むプラスミド、pAB9であることを確認した
(第17図)。
測定しコントロール株より高いA spA活性を示す株
を1株得た。本菌株よりプラスミドを抽出し各種制限酵
素で制限地図を解析した結果、−計則A遺伝子断片とM
udを含むプラスミド、pAB9であることを確認した
(第17図)。
(2)MudAB9の染色体上への転移JM109(M
u c t s )株(実施例2参照)をpAB9を用
いて形質転換しJH109(M u c t s )/
pAB9を得た。本枕をLB培地にて30℃で2時間培
養した後、45℃、15分間の熱処理を加え更に37℃
で2時間培養を続けた。得られた溶菌液にクロロホルム
数滴を加えよく混合した後、5000 rp−で10分
間遠心し、得られた上[を77−ジ溶液…−AB9とし
た。
u c t s )株(実施例2参照)をpAB9を用
いて形質転換しJH109(M u c t s )/
pAB9を得た。本枕をLB培地にて30℃で2時間培
養した後、45℃、15分間の熱処理を加え更に37℃
で2時間培養を続けた。得られた溶菌液にクロロホルム
数滴を加えよく混合した後、5000 rp−で10分
間遠心し、得られた上[を77−ジ溶液…−AB9とし
た。
しB培地にて30℃で一晩培養したJM109(lyl
ucts)の培養液に最終濃度がそれぞれ1mHおよび
2゜51MとなるようにCaOとHO3O4を添加した
。本渡200pとファージ溶液I−AB950gを混合
し室温に15分間放置した後2dのLB培地を加えて3
0℃で2時間培養を続けた。培養液を25m / al
のCmを含むLBプレートにスプレッドし、30℃で2
4時間培養した侵出用してくるコロニーより100コロ
ニーを釣り上げた。これらのコロニーよりAa+p感受
性感受性根しJM109(M u c t s )
(MudAB9)とした。本枕よりJM109(Mu
Ct S ) /pAB9の場合と同様にしてファージ
溶液を調製しI−AB9とした。
ucts)の培養液に最終濃度がそれぞれ1mHおよび
2゜51MとなるようにCaOとHO3O4を添加した
。本渡200pとファージ溶液I−AB950gを混合
し室温に15分間放置した後2dのLB培地を加えて3
0℃で2時間培養を続けた。培養液を25m / al
のCmを含むLBプレートにスプレッドし、30℃で2
4時間培養した侵出用してくるコロニーより100コロ
ニーを釣り上げた。これらのコロニーよりAa+p感受
性感受性根しJM109(M u c t s )
(MudAB9)とした。本枕よりJM109(Mu
Ct S ) /pAB9の場合と同様にしてファージ
溶液を調製しI−AB9とした。
E、 coli MC410G(Casadaban
et al、、J、Hol。
et al、、J、Hol。
Biol、、 104.541 (1976))を18
培地で一晩培養した模、最終濃度がそれぞれ111Mお
よび2.5+aHとなるようにCaα2とHgSO4を
添加し、本溶液200バとファージ溶液lll−A39
5G屑を混合した。室温で15分間放置した後、2eの
18培地を加えて30℃で2時間培養を続けた。培養液
を25JJg/l111!のCa+を含むLBプレート
にスプレッドし、30℃で24時間培養して出現したコ
ロニーよりMu感受性株を選びE 11010とした。
培地で一晩培養した模、最終濃度がそれぞれ111Mお
よび2.5+aHとなるようにCaα2とHgSO4を
添加し、本溶液200バとファージ溶液lll−A39
5G屑を混合した。室温で15分間放置した後、2eの
18培地を加えて30℃で2時間培養を続けた。培養液
を25JJg/l111!のCa+を含むLBプレート
にスプレッドし、30℃で24時間培養して出現したコ
ロニーよりMu感受性株を選びE 11010とした。
(3) M udA B 9の増幅とコピー数Muct
sライゼートを用いてELIOIO株のM udA B
9を実施例2と同様の方法で増幅させた。増幅株の選
択には5004/−のCmを含むLBプレートを用いE
L 1011を選出した。M C4100゜E L
1010およびE L 1011より染色体DNAを調
製し1旦1で切断後アガロースゲルを用いて電気泳動を
行い、続いてナイロンメンブレンフィルターヘブOット
しサザンアナリシスを行った。pGs94をプローブD
NAとしケミプローブキットを用いてハイブリダイゼー
ションを行った(第18図)。
sライゼートを用いてELIOIO株のM udA B
9を実施例2と同様の方法で増幅させた。増幅株の選
択には5004/−のCmを含むLBプレートを用いE
L 1011を選出した。M C4100゜E L
1010およびE L 1011より染色体DNAを調
製し1旦1で切断後アガロースゲルを用いて電気泳動を
行い、続いてナイロンメンブレンフィルターヘブOット
しサザンアナリシスを行った。pGs94をプローブD
NAとしケミプローブキットを用いてハイブリダイゼー
ションを行った(第18図)。
第18図においてレーンA、BおよびCはそれぞれM
C4100,E L 1010およびE L 1011
に相当する。
C4100,E L 1010およびE L 1011
に相当する。
小文字raJは菌株由来のasp△フラグメントに相当
し、数字を付したフラグメントは転移したMudAB9
に相当する。1フラグメントが1MudA89に相当す
る。この結果E l 1010およびE L 1011
にはそれぞれ少なくとも1および4コピーのM udA
B 9が存在することが示唆された。
し、数字を付したフラグメントは転移したMudAB9
に相当する。1フラグメントが1MudA89に相当す
る。この結果E l 1010およびE L 1011
にはそれぞれ少なくとも1および4コピーのM udA
B 9が存在することが示唆された。
表Xに各菌株のMudAB9のコピー数、CIWt4性
度、Cm感受性度およびAsd活性を示した。
度、Cm感受性度およびAsd活性を示した。
実施例8
1回の溶原化操作によるMudの複数転移(1)MuC
tSおよびMudライゼートによるAJ 11332株
の感染 E、 coli J旧09 (M u c t s )
(MudAM9)株より実施例2と同様の方法で溶菌液
をvA製しファージ溶液■を得た。LB培地を用いてA
J 11332(実施例2参照)を−晩培養しこの培
養液に最終濃度がそれぞれ11IIHおよび2.5iM
となるようにcaa とHO8O4を添加した。本渡
200IJ1とファージ溶液1II50111を混合し
変温で15分間放置した模、2Il!i!のLB培地を
添加して30℃で2時間培養を続けた。本溶液を250
#/II!のに膿とNIlを含むLB培地にスプレッド
し、30℃で24時間培養した後出現してきたコロニー
2個を釣り上げた。両コロニとも45℃で溶菌せず、M
tj@受注であった。これらのコロニーをE L 10
14およびE L 1015とした。
tSおよびMudライゼートによるAJ 11332株
の感染 E、 coli J旧09 (M u c t s )
(MudAM9)株より実施例2と同様の方法で溶菌液
をvA製しファージ溶液■を得た。LB培地を用いてA
J 11332(実施例2参照)を−晩培養しこの培
養液に最終濃度がそれぞれ11IIHおよび2.5iM
となるようにcaa とHO8O4を添加した。本渡
200IJ1とファージ溶液1II50111を混合し
変温で15分間放置した模、2Il!i!のLB培地を
添加して30℃で2時間培養を続けた。本溶液を250
#/II!のに膿とNIlを含むLB培地にスプレッド
し、30℃で24時間培養した後出現してきたコロニー
2個を釣り上げた。両コロニとも45℃で溶菌せず、M
tj@受注であった。これらのコロニーをE L 10
14およびE L 1015とした。
(21HudAH9のコピー数と[−スレオニンの生産
性各菌株に含まれるM udA M 9のコピー数をサ
ザンアナリシス法で測定した。両株より染色体DNAを
調製しHind [[で切断した後ナイロンメンブレン
フィルターヘブロットした。thrオペロンを含むDN
A断片(pAH9の影旦I−堕HI断片)をプローブと
しケミプローブキットを用いてサザンハイプリダイゼー
ションを行った。結果を第19図に示ず。図においてレ
ーンA、BおよびCはそれぞれA J 11332 、
E L 1014およびE L 1015に相当する
。小文字f’OJは菌株由来のthrオペロンに相当し
、数字はM udA M 9に相当するフラグメントで
ある。1フラグメントがIMudAM9に相当する。L
−スレオニンの生産性を実施例2と同様の方法で測定し
た。結果を表XIに示()た。この結果E L 101
4およびE L 1015にはそれぞれ3および2コピ
ーのlyl udAM 9が含まれることが示唆された
。
性各菌株に含まれるM udA M 9のコピー数をサ
ザンアナリシス法で測定した。両株より染色体DNAを
調製しHind [[で切断した後ナイロンメンブレン
フィルターヘブロットした。thrオペロンを含むDN
A断片(pAH9の影旦I−堕HI断片)をプローブと
しケミプローブキットを用いてサザンハイプリダイゼー
ションを行った。結果を第19図に示ず。図においてレ
ーンA、BおよびCはそれぞれA J 11332 、
E L 1014およびE L 1015に相当する
。小文字f’OJは菌株由来のthrオペロンに相当し
、数字はM udA M 9に相当するフラグメントで
ある。1フラグメントがIMudAM9に相当する。L
−スレオニンの生産性を実施例2と同様の方法で測定し
た。結果を表XIに示()た。この結果E L 101
4およびE L 1015にはそれぞれ3および2コピ
ーのlyl udAM 9が含まれることが示唆された
。
実施例9
Mudファージの醗酵過程における位置安定性とコピー
数の安定性 E L 1003株(λ”、Pro)をP1ファージを
用いた形質転換によりPro+とじ、続いてλファージ
の非溶原化株を選択した(C,HOrel、P8rSO
nalcommun tcat ion > 本菌株
をEL1017(λPro)とした。E L1017(
E L1003a 由来(7)M udAM 9を少な
くとも10コピー含む)を用いて醗酵前と終了後の菌株
におけるMudファージの安定性を調べた。全容21の
ミニジャーファーメンタ−に1.51の生産培地(実施
例2参照)を張り込み30℃で48時間醗酵を続けた。
数の安定性 E L 1003株(λ”、Pro)をP1ファージを
用いた形質転換によりPro+とじ、続いてλファージ
の非溶原化株を選択した(C,HOrel、P8rSO
nalcommun tcat ion > 本菌株
をEL1017(λPro)とした。E L1017(
E L1003a 由来(7)M udAM 9を少な
くとも10コピー含む)を用いて醗酵前と終了後の菌株
におけるMudファージの安定性を調べた。全容21の
ミニジャーファーメンタ−に1.51の生産培地(実施
例2参照)を張り込み30℃で48時間醗酵を続けた。
S酵終了後ブロスよりコロニーを単離しE L 101
7−a、 −b、 −cおよび−dとした。E L 1
016 (実施例6参照)、EL1017および4クロ
ーンより染色体DNAを調製し、@ ind Iで明所
後アガロースを用いて泳動しナイロンメンブレンフィル
ターにプロットした。−Jul、 仇LA、thrBお
よびthrc ’を含むDNAフラグメント(pAH9
のEcoRI −Hind Iフラグメント)を70−
プとじケミプローブキットを用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った(第20図)。
7−a、 −b、 −cおよび−dとした。E L 1
016 (実施例6参照)、EL1017および4クロ
ーンより染色体DNAを調製し、@ ind Iで明所
後アガロースを用いて泳動しナイロンメンブレンフィル
ターにプロットした。−Jul、 仇LA、thrBお
よびthrc ’を含むDNAフラグメント(pAH9
のEcoRI −Hind Iフラグメント)を70−
プとじケミプローブキットを用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った(第20図)。
レーンA、B、C,D、EおよびFはそれぞれE L1
016. E L1017. E L1017−a、
E L1017−b。
016. E L1017. E L1017−a、
E L1017−b。
E L 1017−cおよびE l 1017−dに相
当する。小文字raJは菌株由来の(hrオペロンに相
当し、数字はM udA M 9に相当する。1フラグ
メントが1M udA M 9に相当する。この結果よ
りE L 1017およびそれから単離されたクローン
は同一のハイブリダイゼーシコンパターンを有し転移増
幅したM udA M 9の位置およびコピー数の安定
性が示された。
当する。小文字raJは菌株由来の(hrオペロンに相
当し、数字はM udA M 9に相当する。1フラグ
メントが1M udA M 9に相当する。この結果よ
りE L 1017およびそれから単離されたクローン
は同一のハイブリダイゼーシコンパターンを有し転移増
幅したM udA M 9の位置およびコピー数の安定
性が示された。
表V 、 EL1008オJ: U EL1009に、
13 Lt ルHudAH97)コピー数とE−スレ
オニン生産性 菌株 L1008 L1009 HudAH9のコピー数 L−Thr(SF II ) 表V1. Erwinia chrysanthca+
i染色体OH^上のHudコピー数 菌 株 Mudコピー数 EL3G03 1 EL3004 1 EL3007 3以上 El、3008 4以上 表■、各菌株におけるHudAHl 1のコピー数と抗
生物質耐性度および感受性度L1016 L1012 L1013 に−20#/ad! N1m+にm 200/7#/d Nal+K
l 2504/me5以上 1十に−2SOx/me N−+Ks 1200II
I/d表IX 。
13 Lt ルHudAH97)コピー数とE−スレ
オニン生産性 菌株 L1008 L1009 HudAH9のコピー数 L−Thr(SF II ) 表V1. Erwinia chrysanthca+
i染色体OH^上のHudコピー数 菌 株 Mudコピー数 EL3G03 1 EL3004 1 EL3007 3以上 El、3008 4以上 表■、各菌株におけるHudAHl 1のコピー数と抗
生物質耐性度および感受性度L1016 L1012 L1013 に−20#/ad! N1m+にm 200/7#/d Nal+K
l 2504/me5以上 1十に−2SOx/me N−+Ks 1200II
I/d表IX 。
菌 株
L1016
L1012
L1G13
各菌株におけるL−スレオニン
生合成系ill活性
比活性(μmole/Sin/1(I
AKl ASD
4.9 G、32
4.0 G、54
21.1 1.14
protein)
表■。
各菌株におけるHudAHllのコピー数とE−スレオ
ニン生産性 菌 株 L1016 L1012 L1013 のコピー数 以上 L−Thr(9/ II ) 3.0 5.3 10.2 表X。
ニン生産性 菌 株 L1016 L1012 L1013 のコピー数 以上 L−Thr(9/ II ) 3.0 5.3 10.2 表X。
菌株
C4100
EL、1010
L1011
各菌株におけるHudAB9のコピー数とのAspA比
活性HudAB9:+ビー数 4以上 比活性(Δ00/sin/sg protetn)0.
33 0.60 2.04 表Xi E 11014およびEL1015の HudAH9コ
ピー数と[−スレオニン生産性 菌 株 HudAH9=+ビー数 L−Thr(g/l
)EL1014 3以上 6.2EL
1015 2以上 5.3
活性HudAB9:+ビー数 4以上 比活性(Δ00/sin/sg protetn)0.
33 0.60 2.04 表Xi E 11014およびEL1015の HudAH9コ
ピー数と[−スレオニン生産性 菌 株 HudAH9=+ビー数 L−Thr(g/l
)EL1014 3以上 6.2EL
1015 2以上 5.3
添付の図面はそれぞれ下記を示す図または写真である。
第1図: Hud1734の制限酵素地図第2図: p
BR322(Mud II 1681 )とpPR30
の構築と制限酵素地図 第3図: M ud II 1734転移増幅株のハイ
ブリダイゼーションパターンのX線写真 レーンa−e:AHI株を170世代植え継ぎ後単離し
たクローン レーンr:^旧株 2本の7ラグメン1〜がI MudII 1734に相
当する。 第4図: pcF1134の構築と制限酵素地図第5図
: pAH9の構築と制限酵素地図第6図:AJ113
32. ELlool EL1002およびEL10
03のハイブリダイゼーションパターンのX線写真 レーンA:^J11322 、レーンB : [:Ll
ool。 レーンC: EL1002.レーンD : EL100
3a:菌株由来のthrオペロン b:非特異的フラグメント 数字: HudAH9に相当するフラグメント:1本の
7ラグメントがI HudAH9に相当する。 第7図: pEVll、 pHcl オよiCF pH
C23の構築第8図:^J11332. EL1008
およびEL1009のサザンハイプリダイゼーションパ
ターンを示すX線写真 レーンA : AJ11332 、レーンB: EL1
008゜レーンC: EL1009 0:菌株由来thrオペロン 数字: HudAH9に相当するフラグメント;1本の
7ラグメントがl HudAH9に相当する。 第9図: M udII PR13転移株のサザンハイ
プリダイゼーションパターンを示すX線写真 レーンA、B C,D、E、rおよびGはそれぞれAJ
11322. [11001,EL1004. EL1
006. E11003 EL1005およびEl、
1007に相当する。 0:転移したM ud II PH10のE coRI
断片のうち共通のフラグメント 数字: MudII P1113に相当づるフラグメン
ト;1フラグメントが1HudlIPR13に相当する レーン八におけるずべてのフラグメントはAJ1133
2とプローブ: pRclooのハイブリダイゼーショ
ンによる。レーンC−Dにおいても同様のパターンが見
られる。 第10図: M ucfI[1734転移株のハイブリ
ダイゼーションパターンを示すX線写真 レーンA、BおよびCはそれぞれE。 chrysanthemi 384551.EL300
3およびEL3007に相当する。 数字はM ud ’fl 1734に相当するフラグメ
ントで1フラグメントがI HudlI 1734に相
当する。 第11図: HudA89転移株のハイブリダイゼーシ
ョンパターンを示すX線写真 レーン^、BおよびCはそれぞれE O工ひ1射1リュ384551. EL3004および
EL3008に相当する。 b:非特異的なフラグメント 数字: HudAH9に相当するフラグメント:1フラ
グメントがI HudAH9に相当する。 第12図:pAAl1構築 第13図−第16図: Mud^旧1転移株のサザンハイプリダイゼーションパ
ターンを示すxI!写真 レーしA、BおよびCはそれぞれELIOIG。 EL1012およびEL1013に相当する。 a:菌株由来thrオペロン(第13図、第14図)お
よびaSd遺伝子(第15図、第16図)。 p:部分消化DNA由来の7ラグメント数字: Hud
AHllに相当するフラグメント;1フラグメントがI
Hud^旧1に相当(第14.15.16図)または
2フラグメントがI HLldAHllに相当する(第
13図)。 第11図: 1)AB9の構築 第18図: Hud’AB9転移株のパイプリダイゼー
ションパターンを示すxm写真 レーンA、BおよびCはそれぞれHC4100゜ELI
OIGおよびELlollに相当する。 a:@株由来且堕遺伝子 数字: HudAB9に相当するフラグメント:17ラ
グメントがI HudAB9に相当する。 第19図: HudA89転移株のサザンハイプリダイ
ゼーョンパターンを示すxI写真 レーンA、BおよびCはそれぞれ^J11322゜EL
1014およびEL1015に相当する。 O:菌株由来thrオペロン 数字: HudAH9に相当するフラグメント;1フラ
グメントがI HudAH9に相当する。 第20図: HudA89転移株のサザンハイプリダイ
ゼーシミンパターンを示すX線写真 a:菌株由来thrオペロン 数字: HudAH9に相当するフラグメント;1フラ
グメントがI HudAH9に相当する。 IG−3 FIG、5 図面の1”p・す;力〜容に変更’2iz)FIGj4 ビし IG−17 IGj9 A 日 口 目 IG−20
BR322(Mud II 1681 )とpPR30
の構築と制限酵素地図 第3図: M ud II 1734転移増幅株のハイ
ブリダイゼーションパターンのX線写真 レーンa−e:AHI株を170世代植え継ぎ後単離し
たクローン レーンr:^旧株 2本の7ラグメン1〜がI MudII 1734に相
当する。 第4図: pcF1134の構築と制限酵素地図第5図
: pAH9の構築と制限酵素地図第6図:AJ113
32. ELlool EL1002およびEL10
03のハイブリダイゼーションパターンのX線写真 レーンA:^J11322 、レーンB : [:Ll
ool。 レーンC: EL1002.レーンD : EL100
3a:菌株由来のthrオペロン b:非特異的フラグメント 数字: HudAH9に相当するフラグメント:1本の
7ラグメントがI HudAH9に相当する。 第7図: pEVll、 pHcl オよiCF pH
C23の構築第8図:^J11332. EL1008
およびEL1009のサザンハイプリダイゼーションパ
ターンを示すX線写真 レーンA : AJ11332 、レーンB: EL1
008゜レーンC: EL1009 0:菌株由来thrオペロン 数字: HudAH9に相当するフラグメント;1本の
7ラグメントがl HudAH9に相当する。 第9図: M udII PR13転移株のサザンハイ
プリダイゼーションパターンを示すX線写真 レーンA、B C,D、E、rおよびGはそれぞれAJ
11322. [11001,EL1004. EL1
006. E11003 EL1005およびEl、
1007に相当する。 0:転移したM ud II PH10のE coRI
断片のうち共通のフラグメント 数字: MudII P1113に相当づるフラグメン
ト;1フラグメントが1HudlIPR13に相当する レーン八におけるずべてのフラグメントはAJ1133
2とプローブ: pRclooのハイブリダイゼーショ
ンによる。レーンC−Dにおいても同様のパターンが見
られる。 第10図: M ucfI[1734転移株のハイブリ
ダイゼーションパターンを示すX線写真 レーンA、BおよびCはそれぞれE。 chrysanthemi 384551.EL300
3およびEL3007に相当する。 数字はM ud ’fl 1734に相当するフラグメ
ントで1フラグメントがI HudlI 1734に相
当する。 第11図: HudA89転移株のハイブリダイゼーシ
ョンパターンを示すX線写真 レーン^、BおよびCはそれぞれE O工ひ1射1リュ384551. EL3004および
EL3008に相当する。 b:非特異的なフラグメント 数字: HudAH9に相当するフラグメント:1フラ
グメントがI HudAH9に相当する。 第12図:pAAl1構築 第13図−第16図: Mud^旧1転移株のサザンハイプリダイゼーションパ
ターンを示すxI!写真 レーしA、BおよびCはそれぞれELIOIG。 EL1012およびEL1013に相当する。 a:菌株由来thrオペロン(第13図、第14図)お
よびaSd遺伝子(第15図、第16図)。 p:部分消化DNA由来の7ラグメント数字: Hud
AHllに相当するフラグメント;1フラグメントがI
Hud^旧1に相当(第14.15.16図)または
2フラグメントがI HLldAHllに相当する(第
13図)。 第11図: 1)AB9の構築 第18図: Hud’AB9転移株のパイプリダイゼー
ションパターンを示すxm写真 レーンA、BおよびCはそれぞれHC4100゜ELI
OIGおよびELlollに相当する。 a:@株由来且堕遺伝子 数字: HudAB9に相当するフラグメント:17ラ
グメントがI HudAB9に相当する。 第19図: HudA89転移株のサザンハイプリダイ
ゼーョンパターンを示すxI写真 レーンA、BおよびCはそれぞれ^J11322゜EL
1014およびEL1015に相当する。 O:菌株由来thrオペロン 数字: HudAH9に相当するフラグメント;1フラ
グメントがI HudAH9に相当する。 第20図: HudA89転移株のサザンハイプリダイ
ゼーシミンパターンを示すX線写真 a:菌株由来thrオペロン 数字: HudAH9に相当するフラグメント;1フラ
グメントがI HudAH9に相当する。 IG−3 FIG、5 図面の1”p・す;力〜容に変更’2iz)FIGj4 ビし IG−17 IGj9 A 日 口 目 IG−20
Claims (32)
- (1)トランスポゾンの内部かつ必須領域外に目的遺伝
子がクローン化されたトランスポゾンを、細菌染色体上
またはエピソーム上へ組み込む方法。 - (2)トランスポゾンが欠損トランスポゾンである特許
請求の範囲第1項記載の方法。 - (3)トランスポゾンが転移不可能なトランスポゾンで
ある特許請求の範囲第2項記載の方法。 - (4)トランスポゾンがトランスポゼース(転移酵素)
を欠損するトランスポゾンである特許請求の範囲第2項
または第3項記載の方法。 - (5)トランスポゾンがトランスポゼースをコードする
遺伝子を欠失するトランスポゾンである特許請求の範囲
第4項記載の方法。 - (6)トランスポゾンにおいて、トランスポゼースの発
現が抑制されているトランスポゾンである特許請求の範
囲第2項または第3項記載の方法。 - (7)トランスポゾンがプラスミド上に挿入され、トラ
ンスフォーメーションによって細菌内にプラスミドと共
に導入されるトランスポゾンである特許請求の範囲第1
項から第6項のいずれかに記載の方法。 - (8)トランスポゾンがバクテリオファージ中に挿入さ
れ、トランスダクションによって細菌内にバクテリオフ
ァージと共に導入されるトランスポゾンである特許請求
の範囲第1項から第6項のいずれかに記載の方法。 - (9)特許請求の範囲第3項から第8項のいずれかに記
載の方法において、転移不可能なトランスポゾンを転移
増幅するためにトランスポゼースを相補し、決められた
コピー数増幅の後相補を停止する、遺伝子を決められた
コピー数安定に組み込む方法。 - (10)トランスポゾンがトランスポゼースを発現する
プラスミドによるトランスフォーメーションで相補され
る特許請求の範囲第9項記載の方法。 - (11)トランスポゾンがリプレッサーの不活化により
発現したトランスポゼースにより相補される特許請求の
範囲第9項記載の方法。 - (12)目的遺伝子がトランスポゾン内に存在するプロ
モーターの制御下にあり、細胞内で発現可能な遺伝子で
ある特許請求の範囲第1項から第11項のいずれかに記
載の方法。 - (13)トランスポゾンがTn3、Tn5、Tn7、T
n10、Tn903、TnHoHo、IS1、IS10
、IS50、MudファージまたはMudIIファージの
いずれかである特許請求の範囲第1項から第12項のい
ずれかに記載の方法。 - (14)宿主細菌が腸内細菌科、リゾビウム属またはシ
ュードモナス属細菌のいずれかに属する細菌である特許
請求の範囲の第1項から第13項のいずれかに記載の方
法。 - (15)宿主細菌が¥Escherichiacoli
¥、¥Citrobacter¥¥freundi¥、
¥Erwiniaherbicola¥、¥Erwin
ia¥¥chrysanthemi¥、¥Salmon
ellatyphimurium¥、Shigella
sonnei¥、¥Enterobactercloa
cae¥、¥Serratiamarcescens¥
、¥Agrobacteriumtumefa¥¥ci
ens¥または¥Pseudomonasputida
¥のいずれかに属する細菌である特許請求の範囲第14
項記載の方法。 - (16)トランスポゾンがマーカー遺伝子を有するトラ
ンスポゾンである特許請求の範囲第1項からから第15
項のいずれかに記載の方法。 - (17)マーカー遺伝子が細菌内で発現する抗生物質耐
性遺伝子である特許請求の範囲第16項記載の方法。 - (18)トランスポゾンの増複数がマーカー遺伝子の発
現の程度に応じて評価される特許請求の範囲第9項から
第17項のいずれかに記載の方法。 - (19)マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、
その発現が抗生物質への耐性度で評価できる遺伝子であ
る特許請求の範囲第18項記載の方法。 - (20)マーカー遺伝子がラクトースオペロンのような
発色マーカー遺伝子であり、その発現が発色の程度によ
つて評価できる遺伝子である特許請求の範囲第18項記
載の方法。 - (21)特許請求の範囲第1項から第20項までのいず
れかに記載の方法において、既にトランスポゾンが転移
増幅した菌株に更に別種のトランスポゾンを転移増幅さ
せる方法。 - (22)トランスポゾンがMudファージである特許請
求の範囲第1項から第21項のいずれかに記載の方法。 - (23)Mudファージがヘルパーファージと共に宿主
細菌に感染しクロモゾーム上に1ないし複数コピー組み
込まれるMudファージである特許請求の範囲第22項
記載の方法。 - (24)Mudファージがトランスポゼースを発現する
プラスミドによる宿主の形質転換またはMuファージの
感染によりトランスポゼースが相補され転移増幅するM
udファージである特許請求の範囲第22項または第2
3項記載の方法。 - (25)Mudファージの増幅後、用いたプラスミドま
たはMuファージを菌体内に保有しない菌株を選択する
特許請求の範囲第22項から第24項のいずれかに記載
の方法。 - (26)特許請求の範囲第1項から第25項のいずれか
に記載の方法で得られた菌株。 - (27)目的遺伝子がL−スレオニン生合成経路の1な
いしそれ以上の遺伝子である特許請求の範囲第1項から
第25項のいずれかに記載の方法。 - (28)1ないしすべてのL−スレオニン生合成遺伝子
を含むトランスポゾンを1ないし複数個クロモゾーム上
に有し、L−スレオニンを著量生産する特許請求の範囲
第26項記載の菌株。 - (29)菌株が¥E.coli¥である特許請求の範囲
第28項記載の菌株。 - (30)目的遺伝子がペプチドまたは蛋白質をコードす
る遺伝子である特許請求の範囲第1項から第25項のい
ずれかに記載の方法。 - (31)特許請求の範囲第26項、第28項および第2
9項のいずれかに記載の細菌を培養し、培地中に生成蓄
積された目的生産物を採取することを特徴とする醗酵法
による目的物質の製造方法。 - (32)特許請求の範囲第26項または第30項記載の
細菌を培養し、培地中または菌体内に生成蓄積されたペ
プチドまたは蛋白を採取することを特徴とする醗酵法に
よるペプチドまたは蛋白の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8802078 | 1988-02-22 | ||
FR8802078A FR2627508B1 (fr) | 1988-02-22 | 1988-02-22 | Procede pour l'integration d'un gene choisi sur le chromosome d'une bacterie et bacterie obtenue par ledit procede |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02109985A true JPH02109985A (ja) | 1990-04-23 |
JP2944094B2 JP2944094B2 (ja) | 1999-08-30 |
Family
ID=9363469
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1042913A Expired - Lifetime JP2944094B2 (ja) | 1988-02-22 | 1989-02-22 | 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5595889A (ja) |
EP (1) | EP0332488B1 (ja) |
JP (1) | JP2944094B2 (ja) |
KR (1) | KR930007579B1 (ja) |
AT (1) | ATE145668T1 (ja) |
AU (1) | AU624353B2 (ja) |
CA (1) | CA1341190C (ja) |
DE (1) | DE68927486T2 (ja) |
DK (1) | DK175477B1 (ja) |
ES (1) | ES2097115T3 (ja) |
FR (1) | FR2627508B1 (ja) |
Cited By (86)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994011517A1 (en) | 1992-11-10 | 1994-05-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-threonine by fermentation |
US5547864A (en) * | 1993-01-13 | 1996-08-20 | Ajinomoto Co., Inc. | Coryneform bacteria deficient in a cell surface protein |
JP2002522043A (ja) * | 1998-08-04 | 2002-07-23 | メタボリックス,インコーポレイテッド | ポリオールからのポリヒドロキシアルカノエートの産生 |
JP2002523050A (ja) * | 1998-08-18 | 2002-07-30 | メタボリックス,インコーポレイテッド | トランスジェニック微生物のポリヒドロキシアルカノエート産生 |
EP1266966A2 (en) | 2001-06-12 | 2002-12-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-lysine or L-arginine by using methanol assimilating bacterium |
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