JPH02109985A - 細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌 - Google Patents

細菌染色体上ヘの目的遺伝子の組み込み方法及び該方法によって得られた細菌

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JPH02109985A
JPH02109985A JP1042913A JP4291389A JPH02109985A JP H02109985 A JPH02109985 A JP H02109985A JP 1042913 A JP1042913 A JP 1042913A JP 4291389 A JP4291389 A JP 4291389A JP H02109985 A JPH02109985 A JP H02109985A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野Ｊ 本発明は、細菌染色体上への遺伝子の組み込み方法と、
該方法によって得られる細菌に関する。
Ｅ従来の技術１ 細菌は、酵素やアミノ酸等有用な物質を得々生産するこ
とが知られている。これらの物質は、多くの遺伝子や代
謝産物に制御を受けている複雑な生合成経路を経て合成
される。これら代謝産物の生産量は比較的少層であり、
生産量増加のために代謝＆ＩＪ　ａｌｌ解除株の分離な
ど様々な方法が試みられてきた。近年特に環状プラスミ
ドをベクターとして用い、目的とする遺伝子のコピー数
を細菌細胞質内で増幅し、遺伝子産物の増産や酵素活性
の増加による代謝産物の増産を図る方法が数多く報告さ
れている。しかしながら、これらの方法によって得られ
る細菌細胞当りのコピー数は、ベクターの種類、挿入す
る遺伝子の長さ、細胞内の生理学的条件に依り影響を受
は変化し易くまたベクターを菌体内に安定に保持するた
めに培地中に抗生物質を添加しなければならない例が多
く見られる。
また染色体上に目的遺伝子を組み込み安定化させるため
にインテグレーションベクターが構築され報告されてい
るが、コピー数の選択は困難である。
更に細菌の他の生物においてトランスポゾンをベクター
として用いた例がいくつか見られるが（ＵＳ−Ａ−４６
７０３８８，ＥＰ−Ａ−０２００７０８，ＥＰ−Ａ−０
０９１７２３゜Ｇｅｎｅ、　４２，１８５（１９８６）
、　ＥＨＢＯＪ、、　４　（４）　８９１（１９８５）
。
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏＱＶ、　４　（５）、　４４６
　（１９８６））　、従来報告された方法において目的
遺伝子のコピー数を不必要に増幅することなく、必要と
されるコピー数だけ増幅し、かつ増幅した遺伝子を染色
体−トに安定に維持させる方法については述べられてい
ない。
【発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、目的とする遺伝子を細菌染色体上に組
み込み、必要な数だけ増幅させ、かつこれらの遺伝子の
コピー数を安定に維持する方法を開発すること、及びそ
の方法によって目的物質を効率良く生産する微生物を得
ること、そしてそれによって目的物質の効率の良い生産
方法を見出すことにある。
Ｅ問題点を解決するための手段１ 本発明者等は、上記問題点を解決するため研究の結果、
トランスポゾンを用いて目的する遺伝子を細菌染色体ま
たはエピソーム上に組み込み、必要とするコピー数だけ
遺伝子を増幅した菌株を選択する方法、及び増幅した遺
伝子を安定に維持する方法を開発することに成功した。
そして水沫を用いて蛋白質（β−ガラクトシダーゼ）を
コードする遺伝子、またはアミノ酸（［−スレオニン）
生合成系遺伝子を染色体上に増幅させた細菌を分離し、
これらの細菌が培地中への抗生物質の添加無しに導入さ
れた遺伝子を安定に保持し、かつ、蛋白質やアミノ酸の
＾い生産性を有することを見出した。
本発明にいうトランスポゾンは、細菌ＤＮＡの任意の部
位に転移し得るものであればどのようなのでもよい。具
体的には、Ｔｎ３　、　Ｔｎ５　、　Ｔｎ７　、７口１
０、　Ｔｈ２Ｏ３、Ｔｎｔｌｏｌｌｏ、　　ＩＳＩ　、
　　ｌ５１０．　　ｌ５５０．　Ｍｕ旧ファージ及びＨ
ｕｄ［ファージ等が挙げられる。
このようなトランスポゾンのうち特にＭｕｄファージ類
縁体（Ｎｕ旧やＨｕｄｌｌ等）が本発明においてはａｂ
好ましいものである。また目的の遺伝子をより安定にＤ
ＮＡ上に組み込むためには、用いるトランスポゾンが欠
損トランスポゾン、１なわちそれ自身では転移不可能な
トランスポゾンを用いることが好ましい。本発明におい
ては、トランスポゼースを欠くトランスポゾンが最も好
ましいものであるが、トランスアクティングなトランス
ポゼースが通常の条件下で抑制または不活性化されてい
るトランスポゾンも用いることができる。
本発明にいう細菌は、上述のトランスポゾンが転移可能
なものであればどのようなものでもよく、次のような細
菌が例としてあげられる。
本発明にいう目的遺伝子とは、通常使用するトランスポ
ゾン内に存在しない遺伝子、または用いる宿主細菌内に
存在しない遺伝子をいう。目的遺伝子には、動物、植物
、細菌由来遺伝子及び合成遺伝子で宿主細菌内で発現可
能なりローン化遺伝子、融合遺伝子及び遺伝子断片が含
まれる。目的遺伝子の具体例としては、ペプチド、蛋白
合成遺伝子や、アミノ酸生合成系遺伝子などがあげられ
る。これらの遺伝子を１個ないし複数個トランスポゾン
内に挿入することが可能である。
目的遺伝子を１−ランスボゾン内に挿入するためには通
常用いられる遺伝子工学の手法が適用できるが、トラン
スポゾンを含むプラスミドを用いる方法がより容易であ
る。プラスミド上のトランスポゾンは欠失や変異により
欠旧トランスポゾンに変えうる。トランスポゾンを含む
プラスミドはこれを保有する細菌より単離され、トラン
スポゾン内部で転移に必須な領域以外を切断する適当な
制限酵素により切断される。この切断部位に同じ制限酵
素明所末端を持つ目的遺伝子を連結する。
あるいは切断されたプラスミド及び目的遺伝子断片のそ
れぞれの両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを接続せしめて、次いで両者のライゲーション反
応を行なう。この際、」虹遺伝子やＩａＣＺ遺伝子のよ
うなレポーター遺伝子を同時に挿入すれば目的遺伝子の
転移の検出がより容易に行える。挿入される遺伝子の個
数はコないし複数個で、１種類ないし複数種の遺伝子の
導入が可能である。
トランスポゾンとしてＭｕファージを用いる場合はＭｕ
ｄファージを含むプラスミドを用いる方法がより容易で
ある。Ｍｕｄファージを含むプラスミドを構築する方法
は、Ｍｕｃｔｓ及びＭｕｄファージをクロモゾーム上に
保有する菌株を宿主として用い、本菌株を適当なプラス
ミドを用いて形質転換する。形質転換株を適当な培地で
培養侵３１℃〜４５℃にて熱処理を行い溶菌液を得る。
本溶菌液を用いて−ｒｅｃ−株を感染させ（ミニミュー
ダクシコン）、用いたプラスミドの形質及びＭｕｄファ
ージの、形質を利用してＨｕｄｌｌ−ジが転移したプラ
スミドを保有する菌株を選択する。Ｍｕｃｔｓ及びＨｕ
ｄｌｌ−ジを含む菌株の例としては、ＰＯ１１７３４（
Ｃａｓｔｉｌｈｏ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、。
１５８．４８８　（１９８４）　）　、　ＰＯＩ　１６
８１　（同上）　、ＨＣ４１００（Ｈｕｃｔｓ）　（Ｈ
ｕｄｌ［ＰＯＩ３）、　ＨＣ４１ＧＧ（Ｈｕｃｔｓ）（
Ｈｕｄｌｌ　ＰＲ３）（Ｐ、　Ｒａｔｅｔ　ｅｔ　　ａ
ｌ、、　Ｇｅｎｅ、６３．４１（１９８８））等があげ
られる。用いるプラスミドは宿主菌内で増幅可能なもの
であればどのようなものでもよい。プラスミドが抗生物
質耐性遺伝子を保有していれば目的プラスミドの選択が
より容易に行える。Ｈｕｄｌｌ−ジを含むプラスミドに
目的遺伝子を挿入する方法は、前述のトランスポゾンを
含むプラスミドの場合と同じ方法が適用される。
構築されたキメラトランスポゾンを宿主菌に導入する方
法は従来用いられているトランスフォーメーション、ト
ランスダクション、コンジュゲーション等の方法が用い
られる。キメラＭｕｄファージを用いる場合は、これを
含むプラスミドを用いてＭｕＣｔＳライソジェンを形質
転換し、形質転換株を適当な培地で培養後３１℃〜４５
℃の熱処理を行う。得られたＷＪ菌液を目的の菌株に感
染させれば（ミニミューダクション）、Ｍｕｄが染色体
に組み込まれた（インチグレートした）菌株（Ｍｕｄラ
イソジエン）が得られる。本うイソジェンは本発明の目
的のためには、同時にＭｕＣｔＳファージのライソジエ
ンでないことが好ましい。
またこのとき得られるＭｕｃｔｓとＭｕｄのダブルライ
ソジェンを用いて溶菌液を調製し、ミニミューダクショ
ンに用いればより効率よくＭｕｄライソジェンが得られ
る。ＭｕＣｔＳライソジェンの例としテハ、ＨＣ４１０
０（Ｍ　ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）やＪＭ１０９（Ｍ　ｕ　ｃ
　ｔ　ｓ　）　　（Ｐ、Ｒａｔｅｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇ
ｅｎｅ、４２．　１８５（１９８６３）等があげられる
。以上の方法でキメラＭｕｄファージを導入する際にキ
メラＭｕｄの増幅が起こり得るが、下記の方法で増幅を
行なう方がより効率よく行える。
上述のようにして細胞内に導入されたキメラトランスポ
ゾンは、そのトランスポゼースの発現がリプレッサーに
より抑制されているか欠損トランスポゾンである場合、
細胞内で安定に維持される。
キメラトランスポゾンは、さらに以下に述べる方法によ
って細胞内のＤＮＡ上で転移増幅させ、目的遺伝子の活
性を増幅することができる。すなわもトランスポゼース
の発現がリプレッサーにより抑制されている場合は、リ
プレッサーを不活性化することによりトランスポゼース
の発現を誘導し、ｉ・ランスボゾンを転移増幅させるこ
とができる。リプレッサーの不活性化は例えば温度感受
性のりプレッサーを用いれば培１ｗＡ度の変化によって
不活性化を行うことができる。欠損トランスポゾンすな
わちトランスポゼースを持たないトランスポゾンを用い
た場合は、トランスアクティングなトランスポゼース道
伝子を保有するプラスミドやファージを菌体内に導入し
トランスポゼースを発現相補すればよい。
キメラＭｕｄファージの場合は、それを保有する菌株を
トランスポゾンＡ、Ｂ遺伝子（Ｍｕファージ由来）を保
有するプラスミドで形質転換するかＭｕファージを感染
させれば、Ｍｕｄファージが転移増幅した菌株が得られ
る。
異った発現形質を有する複数種のキメラトランスポゾン
もＦ述の方法で同時に、または個別に導入、転移増幅さ
せ、同一菌体内のＤＮＡ上に同時に存在させることが可
能である。
これらトランスポゾンが転移増幅するＤＮＡは、染色体
やエピソームなど菌体内で安定に維持されるＤＮＡであ
ればどのようなものでもよい。
キメラトランスポゾンの転移増幅後のコピー数は、挿入
した遺伝子の発現の程度によって選択できる。抗生物質
耐性遺伝子や発色反応を利用できる遺伝子（例えば＋ａ
ＣＺ）などが組み込まれていればより容易に選択が行え
る。抗生物質耐性遺伝子の場合は、例えば種々の濃度の
抗生物質を含むプレートに増幅処理後の菌液をスプレッ
ドすることにより種々のコピー数のキメラトランスポゾ
ンが転移増幅した菌株が選択できる。１ａｃｅ遺伝子の
場合は、Ｘ−Ｇａ１　　（５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）をプレートに添
加しておき処理菌液をスプレッドすれば、コロニーの発
色（青色）の程度により増幅コピー数の多少を知ること
ができる。キメラトランスポゾンの菌体内におけるコピ
ー数は、通常の方法例えばサザンアナリシスにより測定
できる。
増幅したキメラｉ・ランスボゾンを安定に維持するため
には、トランスポゼース遺伝子の発現を抑えるか、トラ
ンスポゼースを不活性化するかあるいはトランスポゼー
スが菌体内に存在しないようにすればよい。すなわち増
幅処理の際使用したプラスミドやファージを菌体内から
除去、あるいは熱処理を解除すればよい。プラスミドや
ファージの除去された菌株を得るためには特別の処理を
必要としない。このようにして得られた菌株のキメラト
ランスポゾンは安定に保持されるが、より安定に保持づ
−るためには、トランスポゼース遺伝子を持たないトラ
ンスポゾンを用いてキメラトランスポゾンを構築するこ
とが望ましい。キメラＭｕｄファージを用いた場合は、
増幅棲宿主菌にＤＮＡポリメラーゼ１．５−３°エキソ
ヌクレアーゼあるいはＨＵ遺伝子欠損などの性質を付与
づればより安定に維持される。
このようにして得られた目的遺伝子産物の生産能を有す
る細菌を培養して目的物質を生成蓄積せしめる方法は、
従来実施されてきた方法で行われるが、従来のように目
的遺伝子の菌体内安定維持のため抗生物質等を培地中に
添加する必要が無い点が大きく異なる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有
づる通常のものを使用できる。炭素源としては、グルコ
ース、シュークロース、ラクトース等及びこれらを含有
する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒
Ｓ源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモ
ニウム塩その他が使用できる。培養は好気的条件下で培
地のｐＨおよび温度を適宜調整しつつ、実質的に目的産
物の生産蓄積が停止するまで行われる。アミノ酸や蛋白
質等の生産には、宿主菌として目的産物の生産性のより
高い株を選べばより高い生産性がＩｌられる。
実施例１ ａＣ遺伝子の増幅によるβ−ガラクトシダーゼ生産菌の
育種 （１）欠損トランスポゾンにり［］−ン化されたβガラ
クトシダーゼ遺伝子を１コピ一染色体上に有する菌株の
育種 ＭｕｄＩ１１７３４（第１図参照）とＭｕＣｔＳ（Ｃａ
ｓｔｉｌｈｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
、、　１５８，４８８（１９８４））をクロモゾーム上
に保有するＥ、ｃｏｌ＋　　Ｐ　ＯＩＩ　１７３４株（
同上文献）を２ｄのＬＢ培地にて３０℃で２時間培養し
たのち４５℃、１５分間の熱処理を行い、更に３１℃に
て２時間培養を続は溶菌液を得た。本溶菌液にクロロホ
ルムを数滴加えよく混合侵遠心し、上澄をファージ溶液
として用いた。
Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＣ４１０Ｇ株（Ｃａｓａｄａｂａｎ
、Ｈ，Ｊ、、　　Ｊ、Ｈｏ１Ｂｉｏ１．、１０４．５４
１（１９７６））をＬＢ培地ニテー晩培養後、最終濃度
がそれぞれ１ｓＨ，２，５−ＨとなるようにＣａＣ１！
２とＨ（１８０４を添加した。本溶液２００ＩＩＩと上
記ファージ溶液５Ｏ１１１を混合し１５分間室温に放置
した後２ｓｉｅのＬＢ培地を加え、３０℃で２時間培養
を続けた。培養終了後菌液を２０ＩＪ！ｇ／　ｄのカナ
マイシン（に―）と１０ｓＨのＸ−Ｇａ１を含むＬＢ培
地にスプレッドし、３０℃で２４時間培養し出現してく
る白色コロニーを釣り上げた。これらのコロニーの中か
らＭｕ感受性菌を指標筒とするレプリカ法でＭＵｃｔｓ
を保有しない菌株ＭＣ１００（Ｍ　ｕ　ｄ　ＩＩ　１７
３４）を選択した。本菌株より染色体ＤＮＡを抽出し、
サザンア′ナリシスにより染色体上に１コピーのＭｕｄ
Ｉ１１１３４が存在することを確認した（データ示さず
）。
また本菌株はβ−ガラクトシダーゼを生産しないことか
ら、Ｍｕｄｌ［１７３４は染色体上でプロモータ下流に
組み込まれていないと考えられた。
（２）プラスミド上へのＭｕフ１−ジ由来トランスポゼ
ースＡ、Ｂ遺伝子のり０−ニング ｐＢＲ３２２上にＭｕｄｌ［１６８１（Ｃａｓｔｉｌｈ
ｏ　　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｊ。
８ａＣｔｅｒｉＯ１，、ユ５８．４８８（１９８４））
が転移したプラスミドよりＥＣ０ＲＩ断片及び１範■断
片を除去したプラスミドｐＡＢ８１ｓ５を調製後、Ｅｃ
ｏＲＩとＥ　ｃｏＲ■にて切断しトランスポゼースＡ、
Ｂ遺伝子を含む断片（８，３ｋｂ）をアガロースゲル電
気泳動により単離精製した。本ＤＮＡ断片を５ｌａＩ及
びＥ　ｃｏＲＩで切断したｐＵｃ１９にＴ４　ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結しｐＰＲ３０を得た（Ｗ１２図参照
）。
Ｃａα２処理（Ｈａｎｄｅｌ　ａｎｄ　Ｈｉｏａ、　Ｊ
、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、。
５３、１５９（１９７０））で臀たＭ　Ｃ４１００（Ｍ
ｕｄｌｌ　１７３４）のコンピテント細胞をｐＰＲ３０
を用いて形質転換しトランスフォーマントＭ　Ｃ４１０
０（ＭｕｄｌＩ　１７３４）　１ｏＰＲ３０を得た。Ｍ
　Ｃ４１００（Ｍｕｄｌ［１７３４）　／ＤＰＲ３０を
しＢ培地にて３０℃で２時間給ｌｌ後、２０埒／−のに
ｌ、２５埒／ｄのアンピシリン（ＡＩＩＥＩ）及び１０
ｐ３／−のＸ−Ｇａ１を含むＬＢプレートにスプレッド
した。３０℃で４８時間培養し出現してきたコロニーの
うち各種濃淡のブルーコロニーを釣り上げた。各コロニ
ーを２０＃／ｄのに−を含むＬ８プレートでジングルコ
ロニーに分離しｐＰＲ３０を１ｌ１２落させるため同培
地で数回植継いだ侵、それぞれのクローンより染色体１
）ＮＡを調製した。染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩにて切断
した模、ラジオアイソト−プでラベルしたｐｃ［１１３
４（第４図参照）をプローブとしてサザンアナリシスを
行った。その結果台クローンに数コピーのＭ　ｕｄ　Ｉ
ｔ　１７３４の転移が認められた。その−例（ＡＭｌ株
）を第３図のレーンｆに示す。４本のバンドが２コピー
のＭｕｄ１１１７３４に相当している。
（３）転移したＭｕｄｌ［１７３４の安定性２コピーの
Ｍｕｄｌ［１７３４を染色体上に持−）ＡＭｌ株を、に
−を含まないＬ８培地で１７０世代培養した後シングル
コロニーに分離した。このうち５コロニーより染色体Ｄ
ＮＡを調製し、上記（２）と同様の方法でサザンアナリ
シスを行った。その結果台クローンとも２コピーのＭｕ
ｄ１１１７３４を維持し、またパイプリダイゼーシコン
のパターンに変化が見られないことから（第３図、レー
ンａ−ｅ＠照）転移したＭｕｄｌ［１７３４の安定性が
示された。
（４）β−ガラクトシダーゼの生産 Ｍ　Ｃ４１０Ｇ　（Ｍ　ｕｄｌｌ　１７３４）株及びＡ
Ｍｌ株を１８培地にて一夜培養し、集菌、洗浄の後細胞
を０．０５Ｍのリン酸バッフ？−に懸濁し超音波破砕機
で細胞を破壊した。細胞破砕液を遠心しく１５０００ｒ
ｐ園、２０分）、上澄を細胞抽出液としてβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定した。その結果ＭＯ４１０Ｇ（Ｍｕ
ｄｌ［１７３４）及びＡＭｌにそれぞれ７Ｘ　１Ｇ−’
及び１０ｎａｏｌｅ／＋＋ｉｎ／ｍｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ
の酵素活性が見出さｔ’Ｌ　タ。
実施例２ 遺伝子増幅によるＬ−スレオニン生産菌の育種とＬ−ス
レオニンの製造 （１）　ｐｃＥ１１３４の構築 Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　　Ｐ　ＯＩｔ　１７３４株（Ｃａｓｔ
ｉｌｈｏ　　ｅｔ　ａｌ。
Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１５８．４８８　（１
９８４））をＣａＣｌ２法（Ｈａｎｄｅｌ　Ｈ，ａｎｄ
　Ｈｉｏａ　Ａ、、　Ｊ、Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、、　５３
，１５９（１９７０）　）にてコンピテント化しｐｃ［
１００（２，１ｋｂＣＩ１１’　、第４図参照）を用い
て形質転換した。処理菌液をクロラムフェニコール（Ｃ
ｍ）　２５ｎ／ｄｉ含有１Ｂプレート培地上にスプレッ
ドし、３０℃で２４時間培養後出現してきたコロニーを
釣り上げトランスフォーマントＰ　ＯＩ［１７３４／１
ｌｃＥ１００を得た。ＰＯＵ　１７３４／　ｐｃＥｔｏ
Ｏを３ｄのＬＢ培地で３０℃にて２時間培養した後、４
５℃、１５分間の熱処理を行い更に３１℃にて２時間培
養を続けた。得られた溶菌液にクロロホルムを数滴加え
、よく混合した後遠心して（１００００ｒＥＪ■、１０
分）上澄をファージ溶液■とした。
Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｍ８８２０（Ｈｕ）株（Ｃａｓｔｉｌ
ｈｏ　　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１５８．４８８（１９８４
））をＬＢ培地で一晩培養したのち、ｃａａ　　及びＨ
ＱＳＯ４をそれぞれ１　ｍＨ及び２．５１８となるよう
に添加した。本菌液２００Ｉｉ１にファージ溶液■を５
０庫加え、室温にて１５分放置した１２ｄのＬＢ培地を
加えて３０℃で２時間培養を行った。培１ｉｖ＆菌液を
２０埒／ｄの１と２５埒／ｄのＣ−を含むＬＢプレート
培地にスプレッドし、３０℃で２４時間培養後出現して
くるコロニーを釣り上げた。２０コロニーよりミニプレ
ツブ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍａｎｄ　　Ｄｏｌｙ、　　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　　　７．
　１５１３（１９７９））にてプラスミドを抽出し、適
当な制限酵素を用いてリストリクシクンサイトを決定し
、すべてのプラスミドにＭｕｄｆｆ１７３４が転移して
いることを確認した。この内の１つをｐＣＥ　１１３４
と名付けた（第４図参照）。
（２）　ｔｈｒオペロンを含むＭｕｄファージ、Ｈｕｄ
ＡＨ９の構築 ｐＣＥ　１１３４をＢａ１ＨＩ及び１虱■にて切断し、
アガロース電気泳動でＭｕｄ３１！仏子を含むＤＮＡフ
ラグメントを抽出した。一方、ｐＡＪ２９４　（Ｈｉｗ
ａ、に、ｅｔ八へラグメントをアガロースゲル電気泳動
で抽出した。両フラグメントをＴ４　ＤＮＡリガーゼを
用いて１０℃で１６時開通結反応させた後、ｌ：、ｃｏ
ｌｉｔｈｒｅ株を本ライゲーション溶液を用いて形質転
換した。２５１Ｎｌ／　ａｄ！　（７）　Ｃｍ、２０／
１１９　／　ｌ１１（７）　Ｋｌヲ含みＬ−スレオニン
を含まない最小培地でトランスフォーマントを選択し、
ミニブレツブ法でプラスミドを抽出後種々の制限酵素で
制限部位を解析し、ｎｐｔ遭伝子、ｔｈｒオペロン及び
Ｍｕｄ両末端を含むプラスミドｐＡＨ９（第５図）を保
有するトランスフォーマントを選出した。
（３）　ＨｕｄＡＨ９の染色体上への転移ｐＡＨ９を用
いてＣａＣｊ！２処理法にて形質転換し、トランスフォ
ーマントをにｍ及びｃｍをそれぞれ２０ｐ３／　ｄ及び
２５ＩＩｇ／　ｍｅ含むＬＢプレートにて選択した。２
０クローンよりプラスミドを抽出し、それぞれｐＡＨ９
であることを確認した。トランスフォーマントＪＨ１０
９（Ｍｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）　／ｐＡＭ９をしＢ培地にて
３０℃で２時間培養した後、４５℃、１５分間の熱処理
を加え更に３１℃にて２時間培養を続けた。得られた溶
菌液に数滴のクロロホルムを加えよく混合した後室温に
て１５分間放置し、続いて５０００ｒｐｍ、　１０分の
遠心で得られた上澄液をファージ溶液■とした。ＪＨ１
１０９（ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）をＬＢ培地を用いて３０℃
にて一晩培養した。本培養液にＣａα２とＨｇＳＯ４を
最終濃度がそれぞれ１　ｇ＋ｌｌ及び２．５１１４とな
るように添加した後、本溶液２００ｆｉと５０ｐのファ
ージ溶液■を混合し室温に１５分間放置した。２−のし
Ｂ培地を加え３０℃で２時間培養後、Ｋｌを２０ＩＩｓ
／　ｄ含むＬＢ培地にスプレッドした。３０℃にて２４
８Ｉｆｌ　＠　ＩＩの後出現したコロニーより１００コ
〇ニーをピックアップし、それ等のＣＩ感受性を調べた
。コロニーの９５％がｃｍ感受性であり、ＪＭ１０９（
Ｍｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）　　（Ｍｕ−ｄＡ　Ｍ　９）であ
ることを認めた。
ＪＭ１０９（Ｍｕｃｔｓ）（ＭｕｄＡＭ９）をＬＢ培地
を用いて３０℃にて２時間培養し、４５℃、１５分間の
熱処理を加えた。その後３１℃にて２時間培養を続は臀
られた溶菌液にクロロホルム数滴を加えよく混合した。
５０ＧＯｒｐｍ、１０分間の遠心にて得られた上澄液を
ファージ溶液■とした。
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ａ　Ｊ　１１３３２株（Ｓｈｉｌｏ　ｅ
ｔ　ａｌ、、＾ｇｒｉｃ、　。
ＢｊＯｌ、、Ｃｔｌｅｌ、、３３．１１５２（１９６９
））をＬＢ培地を用いて一晩培養し、Ｃａｃｊ２とＨＱ
ＳＯ４を最終濃度がそれぞれ１ｓ１４及び２．５ｓＮと
なるように添加した。本溶液２００バに５０成のファー
ジ溶液■を添加し、室温にて１５分間放置した。２Ｉ１
１のＬＢ培地を添加した１０００℃にて２時間培養を続
け、得られた培養液を２０７４７−のに鵬を含むＬＢプ
レートにスプレッドした。３０℃にて２４時間培養を続
け、出現してきたコロニーより１００コ〇ニーをピック
アップしそれ等のＭｕファージ感受性及び４５℃におけ
る溶菌性を調べた。その結果、８５％のコロニーが溶菌
せずかつ１ｙｌｕ感受性であった。これらのうちの１ク
ローンをＥ　Ｌ　１Ｇ０１株とした。
（４）宿主染色体におけるＨｕｄＡＨ９の増幅とコピー
数の決定 （ｉ）　　ＤＰ１３０によるＨｕｄＡＨ９の増幅Ｅ　Ｌ
　１Ｇ０１株をｐＰＲ３０を用いて形質転換し、トラン
スフォーマントを２５４／ａｉ！のＡＩＤ及び２０Ｇ−
４００埒／−のに−またはＮ−を含む１Ｂプレートにス
プレッドした。
（ｉｉ）　Ｍｕ　Ｃｔ　Ｓ溶菌液を用いたＨｕｄＡＨ９
の増幅ＪＭ１０９（Ｍｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）をＬＢ培地で
３０℃にて２時間培養し、４５℃、１５分間の熱処理を
行った後更に３１℃にて２時間培養を続けた。得られた
ＷＩＩ！ｉ液にり００ホルム数滴を加え混合した後、５
０Ｇ０　ｒｐｌで１０分間遠心しファージ溶液を得た。
ＬＢ培地を用いて一晩培養したＥ　Ｌ　１Ｇ０１株の培
養液にＣａｃ１！２とＨｏＳＯ４を最終濃度がそれぞれ
１　ａＭ及び２．５１Ｎとなるように添加しした後、本
溶液２００ｇとＳｏｄの上記ファージ溶液を混合し室温
にて１５分間放置した。２−のＬＢ培地を加えて３０℃
で２時間培養を続けた後２０Ｇ−４００４／−のに−か
つ／または口を含むＬ８プレートにスプレッドした。３
０℃で４８時開通養後出現したコロニーをピックアップ
し、（ｉ）の場合はｐＰ８３０の脱落したクローンを、
（ｔ＋３の場合はＭｕｃｔｓが溶原化していないクロー
ンを更に選択した。染色体上のＨｕｄＡＨ９のコピー数
をサザンアナリシス法にて測定した。以下得られたクロ
ーンのうち特にＥＬ１００２と１００３について詳細に
述べる。＾Ｊ１１３３２　、Ｅ　Ｌ　１Ｇ０１、Ｅ　Ｌ
　１００２及びＥ　ｌ−１００３株より通常の方法で染
色体ＤＮＡを調製した。
１１Ｊ限酵素堕ＲＩでＤＮＡを切断後、０．８％アガロ
ースを用いて電気泳動を行い続いてＤＮＡをニトロセル
ロースフィルター上にプロットした。
ｐＡＨ９のＥｃｏＲＩフラグメントのうち４゜３ｋｂの
７ラグメントをラジオアイソトープでラベルしプローブ
として用いハイブリダイゼーションを行った。
結果を第６図に示した。レーンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤはＡ　
Ｊ　１１３３２　、　Ｅ　Ｌ　１Ｇ０１．　Ｅ　Ｌ　１
００２及びＥ　Ｌ　１Ｇ０３にそれぞれ相当する。
小文字ｒａＪは元菌株由来のｔｈｒオペロンに相当し、
ｒｂＪはカラムＢ、Ｃ及びＤに見られる非特異的なフラ
グメントに相当する。数字は染色体上に転移増幅したＨ
ｕｄＡＨ９の数に相当する。本結果より、Ｅ　Ｌ　１０
０１．　Ｅ　Ｌ　１００２及びＥ　Ｌ　１００３はそれ
ぞれ少なくとも１，４及び１０コピーのＨＵｄＡＨ９を
染色体に保有することが示唆された。ＨｕｄＡＨ９のコ
ピー数とそれを保有する菌株の薬剤耐性度を表１に示し
た。
（５）　ＨＵｄＡＨ９保有菌株による１−−スレオニン
の生産上記のようにして得られた菌株をしＢプレート上
で３０℃にて２４時間培養した後、２０ａ１の生産培地
を入れたフラスコにシードし、３０℃にて７２時間振盪
培養を行った。培養ブロス中のＬ−スレオニン蓄積量は
アミノ酸アナライザーを用いて測定した。
結果を表■に、生産培地の組成を以下に示す。
生産培地組成ニゲルコース：　３０ｇ／　Ｒ、（ＮＨ４
）２ＳＯ４：　ＩＯｇ／ｉ）　、　ＫＨ２ＰＯ４：　　
Ｉｇ／ｌｌ、　Ｈ（ＩｓＯ４７１１２０：　　１９／１
　、　ＦｅＳＯ４−７Ｈ２０；１０ａｙ／Ｒ。
ＨｎＳＯ−４−６Ｈ２０：　１０１１１９／ｆｆ　、Ｌ
−Ｍｅｔ：　　０．１ｇ／ｌ　。
Ｌ−１１ｅ　　：　　０．１ｇ／ｌ　　；　　Ｌ−Ｐｒ
ｏ　　；　０．４５ｇ　／１）ＲＮＡ　　；　　２ｇ／
ｆｌ　、　Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ｔｌＧ！　：　　ｌａｙ
／１ＣａＣ０３；　４０’Ｊ／（１、ｐＨ＝７゜５（６
）　ＨｕｄＡＨ９保有株におけるＬ−スレオニン生産性
の安定性 少なくとも４コピーのＨｕｄＡＨ９を保有づるＥＬ１０
０２株を抗生物質を含まないＬＢブレー１・培地上で植
え継ぎ、各植え継ぎの後（５）で述べたのと同様の方法
でＬ−スレオニン生産性を調べた。結果を表■に示した
。
（７１ＨｕｄＡＨ９保有株におけるＬ−スレオニン生合
成系酵素活性 ＨｕｄＡＨ９を保有する各種菌株を最小培地で培基し、
Ｐ、　ｒ、　Ｂａｃｈｉ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ、　１７゜６９４（１９７０）
）でアスバルトキナーゼ（ＡＫ　！　）活性を、同じ（
Ｐ、Ｔ、Ｂａｃｈ等の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍｔ、　。
８ｉｏｐｈｙｓ、、Ａｃｔａ、、　　１２８．４５０（
１９６６１）でホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｌ（Ｄｌ
ｌｌ）活性を測定した。結果を表■に示した。
表１．ＨｕｄＡＨ９のコピー数と抗生物質耐性度の関係
ＨｕｄＡＨ９の薬剤耐性度 薬剤感受性 コピー数 ・０ にＩＩ　　２０埒／Ｉｌｉ にｍ　２００埒／ｄ Ｎｍ十に１２５０　　ｍ、／ｄ！ ２以上 Ｎｍ＋Ｋｍ　　２５０〜／ａｅ 表■、　ＨｕｄＡＨ９保有株のＬ−スレオニン生産性菌
　　株 ＾Ｊ１１３３２ Ｌ１００Ｉ Ｌ１００２ Ｌ１００３ ＨｕｄＡＨ９の コピー数 し−スレオニン 生産性（ｇ／１１ １以上 ４以上 １０以上 ３．０ ３．３ ８．９ １２．０ 表■。
Ｅｌ、１００２株の植え継ぎ後［−スレオニン生産性植
え継ぎ回数　０　　２　　４　　６　　８　１０Ｌ−ス
レオニン　８．５　８．６　８．５　８．８　８．８　
８．９生産性（＋ＩＩ／１） ＥＬ１００２は抗生物質を含まないＬＢプレート上で植
え継いだ。
表ＩＶ、　ＨｕｄＡＨ９保有株によるＬ−スレオニン生
合成系酵素生産 比活性（ｕ　ｍｏｌｅ／ｓｉｎ／ｕ　ｐｒｏｔｅｉｎ）
菌　　株　　　　　　　　ＡＫＩ　　　　　　　　　　
ＨＤ旧＾Ｊ１１３３２　　　　　　　　２．５　　　　
　　　　　４．８ＥＬ１ＧＧ１　　　　　　　　　４．
０　　　　　　　　１Ｇ、ＩＥＬ１００２　　　　　　
　　１２．５　　　　　　　　２５．０ＥＬ１ＧＧ３　
　　　　　　　２２．５　　　　　　　　３７．４実施
例３ 温度で誘導可能なトランスポゼース遺伝子を有するプラ
スミドを用いたＭｕｄファージの増幅（１）温度誘導可
能なトランスポゼース遺伝子を有するプラスミドの構築 Ｐ　Ｏｎ　１６８１株（Ｃａｓｔｉｌｈｏ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
１５８、４８８（１９８４））をｃａα２処理でコンピ
テント化（Ｈａｎｄｅｌ　ａｎｄ旧Ｑａ、Ｊ、Ｈｏ１．
、Ｂｉｏｌ、、　５３，１５９（１９７Ｇ））した後、
プラスミドＤＥ　Ｖ　１１　（第７図）を用いて形質転
換し、２０４　／　ｄのＡＩＥＩと２０１１８７−のに
讃を含むＬＢプレートを用いてトランスフォーマントを
選択した。トランスフォーマント、Ｐ　ＯＩＦ　１６８
１／ｐ［Ｖｌｌ　ヲ３ｄ１７）ＬＢＩ地ヲＪｌイア３０
℃ｒ２ｍｌｉｌｆｆｉ養した後、４５℃、１５分間の熱
処理を行い続いて３１℃で２時間培養を続け、ファージ
溶菌液を得た。
クロロホルムを数滴添加した後よく混合し、遠心して上
滑液を得、ファージ溶液とした。
Ｅ、　ｃｏｌｌ　　Ｍ８８２０株（Ｃａｓｔｉｌｈｏ　
ｅｔ　ａｔ、、　　Ｊ。
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１５８．４８８（１９８４
））をＬＢ培地にて一晩培養し、Ｃａα２とＨ（ＩｓＯ
４を最終１１がそれぞれ１ａ＋Ｍおよび２．５ｍＭとな
るように添加した。本溶液２００１１１と上述の７７−
ジ溶液５ｏＩＪ１を混合し、室温で１５分放置した後Ｌ
Ｂ培地を２ｍ加えて３０℃で２時間培養を続けた。この
菌液を２０埒／　ａｔ！のにｍと２０Ｒ／ｄのＡＩＤを
含むＬＢプレートにスプレッドし、３０℃で２４時間培
養後、出現してきたコロニーのうち２０コロニーを釣り
上げ、ミニプレツブ法にてプラスミドを抽出し、制限酵
素を用いて制限部位を解析した。すべてのクローンがＭ
　ｕｄ　Ｉ［１６８１の転移したｐＥＶｌｌを持つこと
が確認され、このうちの１クローンをｐＨｃｌ　（第７
図）とした。ｐＨｃｌをＢｕｌＩＩと卸１」Ｉで切断し
、１す１−ＩＩで切断したｐＲｃｌＧＧ（実施例２参照
）と連結しＭ　Ｃ１０６Ｇを形質転換した。トランスフ
ォーマントを２５４　／　ｄのＣ−と２０／ｌ／ａｅ（
Ｆ）Ａｌｌ）を含むＬＢ７Ｌ／−トｒ選択Ｌ、３０：１
０ニーよりプラスミドを抽出して解析した。これらのう
らの一つをｐＨｃ２３としたく第７図）。
（２）　ＥＩＨＣ２３を用いたＭｕｄファージの増幅Ｈ
ｕｄＡＨ９が転移増幅した菌株、Ｅ　Ｌ　１００１　（
実施例２参照）をＣａα２法で処理しコンピテント化し
た後ｐＨＣ２３で形質転換した。トランスフォーマント
は２５埒／ＩｉのＣ−と２０埒／ａｌのＡ１１ｙを含む
ＬＢ培地で選択した。トランスフォーマントＥ　Ｌ　１
００１／ｐＨｃ２３ヲ２５ＩＪ！ｊ／　ｄ　ｆ）　Ｃａ
と２０４／ｊｄ！ノＡＩＤを含むＬＢ培地で３０℃にて
２時間培養後、４５℃、１５分間の熱処理を加えた。本
菌液１ｄにＬＢ培地を同量加え、３０℃で２時間培養を
続けた後、４００埒／ｊ１１！のにｍとＮ−を含むＬＢ
培地にスプレッドし３０℃で培養した。
４８時間後出現してきたコロニーのうち５０コロニを釣
り上げＣｇｉ感受性と１−スレオニンの生産性を調べた
。その結果６０％が親株以上の［−スレオニンを生産し
、またそのうちの５０％がｃｍ感受性であった。
２クローンを選び染色体ＥのＨｕｄＡＨ９のコピー数を
サザンハイプリダイゼーション法で測定した。
すなわち、染色体ＤＮＡをＨｉｎｄｌｌ［で切断侵アガ
ロースゲルを用いて泳動しナイロンメンブレン上にプロ
ットした。ｔｈｒオペロンを含むｐＡＨ９（実施例２参
照）の５ａｌＩ　−Ｂａｇ＋ＨＩ断片をスルフオネーシ
ョンでラベルしくケミプローブキット使用）プローブと
して使用した。ＨｕｄＡＨ９のコピー数およびＬ−スレ
オニン蓄積邑の結果を表Ｖに示す。またサゾンハイブリ
ダイゼーションの結果を第８図に示した。
実施例４ 同一細胞染色体上における２種類のＭｕｄの転移増幅 （１）　ＭＣ４１００（ｔｖｌ（Ｊｃ　ｔ　ｓ）（Ｍｕ
ｄＩ［ＰＲ１３）株よりＭｕｄＩ［ＰＲ１３ライゼート
の調製Ｍ　Ｃ４１００（Ｍ　ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）（Ｍｕ
ｄＩ［Ｐ　Ｒ１３）株（ＰＲａｔｅｔ　ｅｔ　ａｌ、　
Ｇｅｎｅ　６３．４１（１９８８））をＬＢ培地にて３
０℃で２時間１８！ｉ　Ｌ’だ後、４５℃、１５分間の
熱処理を加え更に３７℃で２時間培養を続けた。水溶菌
液に数滴のクロロホルムを添加混合し、５０００　ｒｐ
Ｉｌｌで１０分間遠心してその上澄液をファージ溶液■
とした。
（２）　ＭｕｄＩＩ　Ｐ　Ｒ１３のＥ　Ｌ　１００１お
よびＥ　ｌ−１００３株染色体上への転移 Ｅ　Ｌ　１００１株を１８培地で一晩培養した後、最終
濃度がそれぞれ１１Ｍおよび２．５１８となるようにｃ
ａａ　　とＨ（ＪＳＯ４を添加した。本溶液２００ｐと
５０ρのファージ溶液を混合し、１５分間室温にて放置
した後２ｄのＬＢ培地を加えて３０℃で２時間培養を続
けた。この菌液を２５埒／　ｒｌのＣＩと２０Ｒ／ｄの
Ｋｍを含むＬＢプレートにスプレッドし、３０℃で培養
を続は出現してきたコロニーのうち５０を釣り上げ４５
℃における溶菌性とＭｕ）７−ジ感受性を調べた。その
結果８０％のコロニーが溶菌せずかつＭｕ感受性であっ
た。このうちの１クローンをＥＬ１００４とした。Ｅ　
Ｌ　１００３株も上述の方法で処理した。
その結果９０％のコロニーが４５℃で溶菌せずかつＭｕ
感受性であった。クローンの一つをＥ　ｌ　１００５と
した。
（３）　Ｅ　Ｌ　１００４およびＦｌ　１００５株にお
けるＭｕｄ［Ｐ　Ｒ１３の増幅 実施例２で述べたのと同様の方法でＥ　Ｌ　１００４株
をＪＭ１０９（Ｍｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）より調製した１ｙ
ｌｕｃｔｓライゼートを用いて感染させた。得られた菌
液を２０埒／ａｔ！のにｍと４００埒／　ｄのＣｍを含
むＬＢ培地にスプレッドし、３０℃で４８時間培養して
出現してくるコロニーのうら５０を釣り上げ４５℃にお
ける溶菌性とＭｕ感受性を調べた。その結果８４％のコ
ロニーが溶菌せずかつＭｕ感受性であった。これらのう
らの１クローンをＥ　ｌ　１００６とした。Ｅ　Ｌ　１
００５株も同様に処理し、その結果８２％のコロニーが
４５℃で溶菌ぜずかつＭＬＩ感受性であった。クローン
の一つをＥ　Ｌ　１００７とした。
染色体ＤＮＡをＡＪ１１３３２　、　Ｅ　Ｌ　１００４
．　Ｅ　Ｌ　１００５゜Ｅ　ｌ　１００６及びＥ　ｌ　
１００７より調製し、それぞれをＬ並ＲＩで切断した。
Ｈｉｎｄ　ｍで切断したｐｌｔｃｌｏｏをプローブとし
てサザンアナリシスを行なった（ケミプローブギット使
用）。ハイブリダイゼーションの結果を第９図に示す。
カラムＡのすべてのフラグメントはプローブｐＲｃ１０
０とＡ　Ｊ　１１３３２株のＤＮＡ間のハイブリダイゼ
ーションによるものである。これらのパターンは他の株
でも同様に見られる。カラムＣ，Ｄ、ＦおよびＧにａｌ
いてそれぞれ１．４．１および３本の１ｙｌｕｄＩ［Ｐ
　Ｒ１３に相当するフラグメントが見られる。
実施例５ Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉにおけるＭ
ｕｄの転移と増幅（１）　Ｍｕｄライゼートの調製 ＭｕｄＩ［１７３４やＨｕｄＡＨ９のライゼート調製の
ために以下の菌株を用いた。
Ｐ　ＯＩＩ　１７３４　（Ｃａｓｔｉｌｈｏ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１１５８、４８８（１９８
４）） Ｊ　Ｍ　１１０９（ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）（ＨｕｄＡＨ９
）（実施例２参照）それぞれのＭｕｄライゼートを実施
例２で述べたのと同様の方法でｔａ製した。
（２）各Ｍｕｄのｔｒｗｔｎｔａ　ｃｈｒ　５ａｎｔｔ
ｌｅｌｉ染色体上への転移 Ｅｒｗｉｎｉａ　　ｃｈｒ　　５ａｎｔｈｅｌｉ　　　
３８４５５１　　（Ｈ，Ｃｈｉｐｐａｕｘ。
ＣＮＲ８Ｈａｒｓｅｉｌｌｅ）を受容菌とし、上記２種
のライゼートを用いてＭｕｄの導入（ミニミ１−ダクシ
ョン）を実施例２と同様の方法で行った。２Ｇ＃　／　
ｄのにｍを含むＬＢ培地上に出現したコロニーを釣り上
げ４５℃における溶菌性とＭｕ感受性を調べた。
その結果Ｍｕｄ１［１７３４を用いた場合は７０％、Ｈ
ｕｄＡＨ９を用いた場合は８０％のコロニーが４５℃で
溶菌せずまたＭｕ感受性であった。　Ｅ、ｃｈｒｙｓａ
ｎｔｈｅｓｉ３８４５５１（ＨｕｄＩ［１７３４）　　
をＥ　　Ｌ　３００３．　　Ｅ、ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅ
ａ＋１３８４５５１　（ｔｆｕｄＡＨ９）をＥ　Ｌ　３
００４とした。
（３）　ＭｕｄＩ［１７３４およびｌｙｌ　ｕｄＡＨ９
の増幅Ｍｕｃｔｓライゼートを用いＴＥ　Ｌ　３００３
およびＥＬ３００４の藺ｕｄの増幅を実施例２と同様の
方法を用いて行った。増幅株の選択にはに―とＮ−を４
００４／ｍ１含むＬＢ培地を用いた。プレート上に現れ
たコロニーよりそれぞれ５０コ０ニーを釣り上げ、４５
℃で溶菌せず、Ｍｕ感受性のコロニーを選択した。
Ｅ　Ｌ　３Ｇ０３由来の増幅株′をＥ　Ｌ　３００７．
　Ｅ　Ｌ　３Ｇ０４由来の増幅株をＥ　Ｌ　３Ｇ０８と
した。
（４）各菌株の染色体ＤＮＡ上のＭｌｊｄのコピー数名
菌株より染色体ＤＮＡをＥ、ＣＧｌ＋の場合と同様の方
法（クリアートライゼート調製に用いる５ａｒｃｏｓｔ
ｎｅをＳＤＳに変更した点だけ責なる）で調製した。各
染色体ＤＮＡｅＥｃｏＲＩで切断し、下記のプローブを
用いてサザンアナリシスを行った。サザンアナリシスに
はケミプローブキットを使用した。
Ｍｕｄｌ［１７３４用プ０−プ：Ｍｕｄ左端部分を含む
ＤＮＡＭ　ｕｄＡ　Ｍ　Ｑ用プローブ：　ｔｈｒオペａ
ンを含むＤＮＡ（ｐＡＨ９の影虹Ｉ−８胡ＨＩ断片） 結果を表■、第１０図および第１１図に示した。
実施例６ 複数の遺伝子を保有するＭｕｄの増幅 （１）す＞ｒ　Ｉペロンとａｓｄ遺伝子を有するＨｕｄ
Ａ旧１の構築 プラスミドｐＡＤ２旧１１ａｚｉｚａ　ｅｔ　ａｌ、、
ＥＨＢＯＪ、、　３゜３７９（１９８２））をＢａ１ｌ
ＨＩにて切断し、アガロース電気泳動にてａｓｄ遺伝子
を含む１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントを抽出した。一
方ｐＡＨ９（実施例２参照）をＢａ１ｌＨＩで切断し、
上記■Ｌフラグメントと連結反応を行った（Ｔ４　ＤＮ
Ａリガーゼで１０℃にて１６時間反応）、Ａｓｄ　　株
、Ｊ　ＣＰ　２０３　（Ｃ，Ｐｒ１ｎｔｚ。
ｐｅｒｓｏｎａｌ　ｃｏｍｓｕｎｉｃａｔｉｏｎ）をコ
ンピテント化し、上記ライゲーション溶液を用いて形質
転換を行った。トランスフォーマントを２０４！ＩＦ　
／　ｄのにｍと２５１４７ｄのＣｍを含む［８プレート
で選択し、プラスミドを抽出後制限酵素で切断解析し、
ａｓｄフラグメントを含むｐＡＮ９；ｐＡＨｌｌ　（第
１２図）を保有する菌株を選出した。
（２Ｊ染色体ＤＮＡ上へのＭｕｄＡｆｌｌの転移プラス
ミドルＡ旧１を用いてＥ、　ｃｏｌｉ　　ＪＭ１０９（
Ｍｕ立ｔｓ）（実施例２参照）を形質転換し、Ｊ　Ｍ２
Ｏ３（Ｍ　ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）　／ｐＡＭ１１を得た。
本菌株をＬＢ培地で３０℃で２時間培養し、４５℃、１
５分間の熱処理を加えた後、更に３７℃で２時間培養を
続は溶菌液を得た。り００ホルム数滴を添加しよく混合
した侵、５０Ｇ０　ｒｐｌで１０分間遠心しｈｆｆｉ液
をファージ溶液１１−ＡＭｌｌとして得た。
Ｌ８培地を用いてＪＭ１０９（Ｍｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）を
３０℃で一晩培養し、本菌液に最終濃度がそれぞれ１１
１Ｍおよび２．５−ＨとなるようにＣａα２とＨＱＳＯ
４を添加した。本漬２００ｍとファージ溶液ＩＩ−Ａ旧
１５０ρを混合し室温に１５分間放置した後、２ｄのＬ
Ｂ培地を添加して３０℃で２時間培養した。本菌液を２
０埒／ｄのにｍを含むＬＢプレートにスプレッドし、３
０℃で２４時間培！！侵出現してきたコロニーより　１
００コロニーを釣り上げｃｍ感受性を調べた。８５％の
コロニーがＣｍ感受性でありＪＭ１０９　　（ＭＬＪ　
ｃ　ｔ　ｓ　）（ＭｕｄＡＭｌｌ）であることを確認し
た。ＬＢ培地にてＪＭ１０９（Ｍｕｃｔｓ）（ＭｕｄＡ
Ｍｌｌ）を３０℃で２時間培養し、４５℃、１５分間の
熱処理を加えた模、更に３７℃で２時間培養を続は溶菌
液を得た。クロロボルム数滴を添加しよく混合した優、
５０００　ｒｐｍで１０分間遠心し上澄液をファージ溶
液■ＡＭＩＩとして得た。
Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＡＪ１１３３２　　（λ”、Ｐｒｏ
＞（実施例２参照）をＰ１ファージを用いて形質転換し
、Ａ　Ｊ　１１３３２　　（λ＋　、　ｐ　、０＋　＞
を得た。本枕よりλ非溶原化株を選択しくＣ，Ｈｏｒｅ
ｌ、私信）ＥＬ１０１６（λ　、ｐｒｏ）株を得た。本
菌株をＬＢ培地で一晩培養した後最終濃度がそれぞれ１
　ｍＮおよび２．５　ＩＮとなるようにＣａＣ１！　２
とＨＩＪＳＯ４を添加した。
本菌液２００成とファージ溶液１１１−Ａ旧１５０．ｃ
ｃｌ！を混合し室温で１５分間放置した後、２ａｉ！の
ＬＢ培地を添加して３０℃で２時間培養を続けた。この
菌液を２０１１９／ｄのにｍを含むＬＢ培地にスプレッ
ドし、３０℃で２時間培養した後出現してきたコロニー
からＭｕ感受性を示すコロニーを選択しＥ　ｌ　１０１
２とした。
（３）　ＭｕｄＡＭｌｌの増幅とコピー数の測定Ｍｕｃ
ｔｓライゼートを用いてＥ　Ｌ　１０１２染色体上のＭ
　ｕｄＡ　Ｍ　１１の増幅を実施例２と同様の方法を用
いて行った。増幅株の選択は２５０埒／　ｄ　−１２０
０１１９／１ｔｒｌのにｌとＮｍを含むＬＢプレートで
行いこのうちの一株をＥ　Ｌ　１０１３とした。
染色体ＤＮＡをＥ　Ｌ　１０１６．　Ｅ　Ｌ、　１０１
２およびＥＬ１０１３より調製し、旦」口、■またはＥ
Ｃ０ＲＩで明所した。アガロースゲルを用いて電気泳動
を行いサプンブ臼ツティングを行った。２梯類のプロー
ブＤＮＡを用いてハイブリダイゼーションを行った（ケ
ミプローブキット便用）　（第１３−１６図）。各図に
おいてレーンＡ、ＢおよびＣはそれぞれＥＬｌｏｌＧ、
　Ｅ　Ｌ　１０１２およびＥ　Ｌ　１０１３に相当する
。小文字１’　ａ　Ｊは菌株由来のｔｈｒオペロンに相
当し、数字は転移したＭｕｄＡＭｌｌに対応するフラグ
メントである。第１３図は５ａｌＩで切断した染色体Ｄ
ＮＡフラグメント用いたハイブリダイゼーションパター
ンである。数字を付したフラグメント２木が１ＭｕｄＡ
Ｍ１１に相当する。第１４図はＥｃｏＲＩで切断した染
色体ＤＮＡと上記プローブを用いたハイブリダイピージ
ョンパターンである。数字を付したフラグメント１本が
Ｉ　ＭｕｄＡＭｌｌに相当する。第１５図は３ａｌＩで
切断した染色体ＤＮＡとａｓｄを含むＤＮＡプローブ（
ｐＡＨｌｌの堕Ｈ１−堕Ｈ１フラグメント）を用いたハ
イブリダイゼーションパターンである。数字のフラグメ
ント１本が１Ｍ　ＩＪｄＡ　Ｍ　１１に相当する。第１
６図はＥＣ０ＲＩで切断した染色体ＤＮＡと上記ａｓｄ
フラグメントを用いたハイブリダイゼーションパターン
である。数字のフラグメント１本がＩＭｕｄＡＭｌｌに
相当する。
これらの結果よりＥ　ｌ　１０１２とＥ　ｌ　１０１３
はそれぞれ少なくとも１および４コピーのＭｕｄＡＭｌ
ｌを有することが示唆された。
（４）　Ｅ　Ｌ　１０１２およびＥ　Ｌ　１０１３株の
薬剤耐性度、［−スレオニン生産性およびＭ素活性 表ｖ１に各菌株の抗生物質耐性度および感受性度を示す
。表■には実施例２と同様にして測定したＥ−スレオニ
ン生産性を示した。また表■にはアスパルトカイネース
（ＡＫＩ）活性およびアスパルテートセミアルデヒドロ
ゲナーゼ（ＡＤＤ＞活性（Ｈｅｇｅｓａｎ、　Ｇ、◎、
ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙａｏ
ｌｏｇｙ。
１７、７０８（１９７Ｇ））を示した。
実施例７ Ｅ、ｃｏｌｉ由来−ａｓｐＡ　’ＩＩ伝子の増幅と［−
アスパルテートアンモニアリアーゼの生産 （１）幻■−カ、遺伝子を有するＭ　ｕｄＡ　Ｂ　９の
構築プラスミド１）ＰＨ１（Ｐ、Ｒａｔｅｔ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｇｅｎｅ、６３．４１（１９８８）　）　ヲＰ　
Ｓｔ　Ｉ　ｔ”切断したＩＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い
て再度連結し、ｃａｔ選伝子がｐＰＲ３と逆向きに挿入
されたプラスミドｐＰＣ３（第１１図）を得た。プラス
ミドＤＧＳ９４　（Ｇｕｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、
　Ｇｅｎ。
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１３０．１２７１（１９８
４））をＣ１ａＩおよび３ａｌＩで切断し一１ｌＬへ遺
伝子を含む３．４　ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。
一方ＭｕｄＰＣ３を有しＭｕｄＰＣ３を含む５．３ｋｂ
のＤＮＡ断片を得た。
上記２フラグメントをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて２
２℃で１時間連結反応を行った。本ライゲーション溶液
を用いてコンビテン！・化したＭ　Ｃ１０６Ｇ（Ｃａｓ
ａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、。
７６、４５３０（１９７９））を形質転換し、２０／ｌ
ｌ＃／ｊｌｌ！のＡ１１）と２５ｎ／−のＣ−を含むＬ
Ｂプレートでトランスフォーマントを選択した。２１ク
ローンのトランスフォーマントより更ににＩ感受性のク
ローンを１７選択した。これら１１株のアスパルテート
アンモニアリアーゼ（ＡｓｐＡ）活性（Ｓｐｅｎｃｅｒ
　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ。
＋ｔｃｒｏむｉｏｌ、、　９７．７３（１９７６））を
測定しコントロール株より高いＡ　ｓｐＡ活性を示す株
を１株得た。本菌株よりプラスミドを抽出し各種制限酵
素で制限地図を解析した結果、−計則Ａ遺伝子断片とＭ
ｕｄを含むプラスミド、ｐＡＢ９であることを確認した
（第１７図）。
（２）ＭｕｄＡＢ９の染色体上への転移ＪＭ１０９（Ｍ
ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）株（実施例２参照）をｐＡＢ９を用
いて形質転換しＪＨ１０９（Ｍ　ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）／
ｐＡＢ９を得た。本枕をＬＢ培地にて３０℃で２時間培
養した後、４５℃、１５分間の熱処理を加え更に３７℃
で２時間培養を続けた。得られた溶菌液にクロロホルム
数滴を加えよく混合した後、５０００　ｒｐ−で１０分
間遠心し、得られた上［を７７−ジ溶液…−ＡＢ９とし
た。
しＢ培地にて３０℃で一晩培養したＪＭ１０９（ｌｙｌ
ｕｃｔｓ）の培養液に最終濃度がそれぞれ１ｍＨおよび
２゜５１ＭとなるようにＣａＯとＨＯ３Ｏ４を添加した
。本渡２００ｐとファージ溶液Ｉ−ＡＢ９５０ｇを混合
し室温に１５分間放置した後２ｄのＬＢ培地を加えて３
０℃で２時間培養を続けた。培養液を２５ｍ　／　ａｌ
のＣｍを含むＬＢプレートにスプレッドし、３０℃で２
４時間培養した侵出用してくるコロニーより１００コロ
ニーを釣り上げた。これらのコロニーよりＡａ＋ｐ感受
性感受性根しＪＭ１０９（Ｍ　ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）　　
（ＭｕｄＡＢ９）とした。本枕よりＪＭ１０９（Ｍｕ　
Ｃｔ　Ｓ　）　／ｐＡＢ９の場合と同様にしてファージ
溶液を調製しＩ−ＡＢ９とした。
Ｅ、　ｃｏｌｉ　　ＭＣ４１０Ｇ（Ｃａｓａｄａｂａｎ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｈｏｌ。
Ｂｉｏｌ、、　１０４．５４１　（１９７６））を１８
培地で一晩培養した模、最終濃度がそれぞれ１１１Ｍお
よび２．５＋ａＨとなるようにＣａα２とＨｇＳＯ４を
添加し、本溶液２００バとファージ溶液ｌｌｌ−Ａ３９
５Ｇ屑を混合した。室温で１５分間放置した後、２ｅの
１８培地を加えて３０℃で２時間培養を続けた。培養液
を２５ＪＪｇ／ｌ１１１！のＣａ＋を含むＬＢプレート
にスプレッドし、３０℃で２４時間培養して出現したコ
ロニーよりＭｕ感受性株を選びＥ　１１０１０とした。
（３）　Ｍ　ｕｄＡ　Ｂ　９の増幅とコピー数Ｍｕｃｔ
ｓライゼートを用いてＥＬＩＯＩＯ株のＭ　ｕｄＡ　Ｂ
　９を実施例２と同様の方法で増幅させた。増幅株の選
択には５００４／−のＣｍを含むＬＢプレートを用いＥ
　Ｌ　１０１１を選出した。Ｍ　Ｃ４１００゜Ｅ　Ｌ　
１０１０およびＥ　Ｌ　１０１１より染色体ＤＮＡを調
製し１旦１で切断後アガロースゲルを用いて電気泳動を
行い、続いてナイロンメンブレンフィルターヘブＯット
しサザンアナリシスを行った。ｐＧｓ９４をプローブＤ
ＮＡとしケミプローブキットを用いてハイブリダイゼー
ションを行った（第１８図）。
第１８図においてレーンＡ、ＢおよびＣはそれぞれＭ　
Ｃ４１００，Ｅ　Ｌ　１０１０およびＥ　Ｌ　１０１１
に相当する。
小文字ｒａＪは菌株由来のａｓｐ△フラグメントに相当
し、数字を付したフラグメントは転移したＭｕｄＡＢ９
に相当する。１フラグメントが１ＭｕｄＡ８９に相当す
る。この結果Ｅ　ｌ　１０１０およびＥ　Ｌ　１０１１
にはそれぞれ少なくとも１および４コピーのＭ　ｕｄＡ
　Ｂ　９が存在することが示唆された。
表Ｘに各菌株のＭｕｄＡＢ９のコピー数、ＣＩＷｔ４性
度、Ｃｍ感受性度およびＡｓｄ活性を示した。
実施例８ １回の溶原化操作によるＭｕｄの複数転移（１）ＭｕＣ
ｔＳおよびＭｕｄライゼートによるＡＪ　１１３３２株
の感染 Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｊ旧０９　（Ｍ　ｕ　ｃ　ｔ　ｓ　）
（ＭｕｄＡＭ９）株より実施例２と同様の方法で溶菌液
をｖＡ製しファージ溶液■を得た。ＬＢ培地を用いてＡ
　Ｊ　１１３３２（実施例２参照）を−晩培養しこの培
養液に最終濃度がそれぞれ１１ＩＩＨおよび２．５ｉＭ
となるようにｃａａ　　とＨＯ８Ｏ４を添加した。本渡
２００ＩＪ１とファージ溶液１ＩＩ５０１１１を混合し
変温で１５分間放置した模、２Ｉｌ！ｉ！のＬＢ培地を
添加して３０℃で２時間培養を続けた。本溶液を２５０
＃／ＩＩ！のに膿とＮＩｌを含むＬＢ培地にスプレッド
し、３０℃で２４時間培養した後出現してきたコロニー
２個を釣り上げた。両コロニとも４５℃で溶菌せず、Ｍ
ｔｊ＠受注であった。これらのコロニーをＥ　Ｌ　１０
１４およびＥ　Ｌ　１０１５とした。
（２１ＨｕｄＡＨ９のコピー数と［−スレオニンの生産
性各菌株に含まれるＭ　ｕｄＡ　Ｍ　９のコピー数をサ
ザンアナリシス法で測定した。両株より染色体ＤＮＡを
調製しＨｉｎｄ　［［で切断した後ナイロンメンブレン
フィルターヘブロットした。ｔｈｒオペロンを含むＤＮ
Ａ断片（ｐＡＨ９の影旦Ｉ−堕ＨＩ断片）をプローブと
しケミプローブキットを用いてサザンハイプリダイゼー
ションを行った。結果を第１９図に示ず。図においてレ
ーンＡ、ＢおよびＣはそれぞれＡ　Ｊ　１１３３２　、
　Ｅ　Ｌ　１０１４およびＥ　Ｌ　１０１５に相当する
。小文字ｆ’ＯＪは菌株由来のｔｈｒオペロンに相当し
、数字はＭ　ｕｄＡ　Ｍ　９に相当するフラグメントで
ある。１フラグメントがＩＭｕｄＡＭ９に相当する。Ｌ
−スレオニンの生産性を実施例２と同様の方法で測定し
た。結果を表ＸＩに示（）た。この結果Ｅ　Ｌ　１０１
４およびＥ　Ｌ　１０１５にはそれぞれ３および２コピ
ーのｌｙｌ　ｕｄＡＭ　９が含まれることが示唆された
。
実施例９ Ｍｕｄファージの醗酵過程における位置安定性とコピー
数の安定性 Ｅ　Ｌ　１００３株（λ”、Ｐｒｏ）をＰ１ファージを
用いた形質転換によりＰｒｏ＋とじ、続いてλファージ
の非溶原化株を選択した（Ｃ，ＨＯｒｅｌ、Ｐ８ｒＳＯ
ｎａｌｃｏｍｍｕｎ　ｔｃａｔ　ｉｏｎ　＞　　本菌株
をＥＬ１０１７（λＰｒｏ）とした。Ｅ　Ｌ１０１７（
Ｅ　Ｌ１００３ａ　由来（７）Ｍ　ｕｄＡＭ　９を少な
くとも１０コピー含む）を用いて醗酵前と終了後の菌株
におけるＭｕｄファージの安定性を調べた。全容２１の
ミニジャーファーメンタ−に１．５１の生産培地（実施
例２参照）を張り込み３０℃で４８時間醗酵を続けた。
Ｓ酵終了後ブロスよりコロニーを単離しＥ　Ｌ　１０１
７−ａ、　−ｂ、　−ｃおよび−ｄとした。Ｅ　Ｌ　１
０１６　（実施例６参照）、ＥＬ１０１７および４クロ
ーンより染色体ＤＮＡを調製し、＠　ｉｎｄ　Ｉで明所
後アガロースを用いて泳動しナイロンメンブレンフィル
ターにプロットした。−Ｊｕｌ、　仇ＬＡ、ｔｈｒＢお
よびｔｈｒｃ　’を含むＤＮＡフラグメント（ｐＡＨ９
のＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　Ｉフラグメント）を７０−
プとじケミプローブキットを用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行った（第２０図）。
レーンＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、ＥおよびＦはそれぞれＥ　Ｌ１
０１６．　Ｅ　Ｌ１０１７．　Ｅ　Ｌ１０１７−ａ、　
Ｅ　Ｌ１０１７−ｂ。
Ｅ　Ｌ　１０１７−ｃおよびＥ　ｌ　１０１７−ｄに相
当する。小文字ｒａＪは菌株由来の（ｈｒオペロンに相
当し、数字はＭ　ｕｄＡ　Ｍ　９に相当する。１フラグ
メントが１Ｍ　ｕｄＡ　Ｍ　９に相当する。この結果よ
りＥ　Ｌ　１０１７およびそれから単離されたクローン
は同一のハイブリダイゼーシコンパターンを有し転移増
幅したＭ　ｕｄＡ　Ｍ　９の位置およびコピー数の安定
性が示された。
表Ｖ　、　ＥＬ１００８オＪ：　Ｕ　ＥＬ１００９に、
　１３　Ｌｔ　ルＨｕｄＡＨ９７）コピー数とＥ−スレ
オニン生産性 菌株 Ｌ１００８ Ｌ１００９ ＨｕｄＡＨ９のコピー数 Ｌ−Ｔｈｒ（ＳＦ　ＩＩ　　） 表Ｖ１．　Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｈｃａ＋
ｉ染色体ＯＨ＾上のＨｕｄコピー数 菌　株　　　Ｍｕｄコピー数 ＥＬ３Ｇ０３　　　　１ ＥＬ３００４　　　　１ ＥＬ３００７　　　　　３以上 Ｅｌ、３００８　　　　　４以上 表■、各菌株におけるＨｕｄＡＨｌ　１のコピー数と抗
生物質耐性度および感受性度Ｌ１０１６ Ｌ１０１２ Ｌ１０１３ に−２０＃／ａｄ！ Ｎ１ｍ＋にｍ　　　２００／７＃／ｄ　　　Ｎａｌ＋Ｋ
ｌ　　　２５０４／ｍｅ５以上 １十に−２ＳＯｘ／ｍｅ　　Ｎ−＋Ｋｓ　１２００ＩＩ
Ｉ／ｄ表ＩＸ　。
菌　　株 Ｌ１０１６ Ｌ１０１２ Ｌ１Ｇ１３ 各菌株におけるＬ−スレオニン 生合成系ｉｌｌ活性 比活性（μｍｏｌｅ／Ｓｉｎ／１（Ｉ ＡＫｌ　　　　　　　　　ＡＳＤ ４．９　　　　　　　　Ｇ、３２ ４．０　　　　　　　　Ｇ、５４ ２１．１　　　　　　　１．１４ ｐｒｏｔｅｉｎ） 表■。
各菌株におけるＨｕｄＡＨｌｌのコピー数とＥ−スレオ
ニン生産性 菌　　株 Ｌ１０１６ Ｌ１０１２ Ｌ１０１３ のコピー数 以上 Ｌ−Ｔｈｒ（９／　ＩＩ　　） ３．０ ５．３ １０．２ 表Ｘ。
菌株 Ｃ４１００ ＥＬ、１０１０ Ｌ１０１１ 各菌株におけるＨｕｄＡＢ９のコピー数とのＡｓｐＡ比
活性ＨｕｄＡＢ９：＋ビー数 ４以上 比活性（Δ００／ｓｉｎ／ｓｇ　ｐｒｏｔｅｔｎ）０．
３３ ０．６０ ２．０４ 表Ｘｉ Ｅ　１１０１４およびＥＬ１０１５の　ＨｕｄＡＨ９コ
ピー数と［−スレオニン生産性 菌　株　ＨｕｄＡＨ９＝＋ビー数　Ｌ−Ｔｈｒ（ｇ／ｌ
　　）ＥＬ１０１４　　　３以上　　　　　６．２ＥＬ
１０１５　　　２以上　　　　　５．３
【図面の簡単な説明】
添付の図面はそれぞれ下記を示す図または写真である。 第１図：　Ｈｕｄ１７３４の制限酵素地図第２図：　ｐ
ＢＲ３２２（Ｍｕｄ　ＩＩ　１６８１　）とｐＰＲ３０
の構築と制限酵素地図 第３図：　Ｍ　ｕｄ　ＩＩ　１７３４転移増幅株のハイ
ブリダイゼーションパターンのＸ線写真 レーンａ−ｅ：ＡＨＩ株を１７０世代植え継ぎ後単離し
たクローン レーンｒ：＾旧株 ２本の７ラグメン１〜がＩ　ＭｕｄＩＩ　１７３４に相
当する。 第４図：　ｐｃＦ１１３４の構築と制限酵素地図第５図
：　ｐＡＨ９の構築と制限酵素地図第６図：ＡＪ１１３
３２．　ＥＬｌｏｏｌ　　ＥＬ１００２およびＥＬ１０
０３のハイブリダイゼーションパターンのＸ線写真 レーンＡ：＾Ｊ１１３２２　、レーンＢ　：　［：Ｌｌ
ｏｏｌ。 レーンＣ：　ＥＬ１００２．レーンＤ　：　ＥＬ１００
３ａ：菌株由来のｔｈｒオペロン ｂ：非特異的フラグメント 数字：　ＨｕｄＡＨ９に相当するフラグメント：１本の
７ラグメントがＩ　ＨｕｄＡＨ９に相当する。 第７図：　ｐＥＶｌｌ、　ｐＨｃｌ　オよｉＣＦ　ｐＨ
Ｃ２３の構築第８図：＾Ｊ１１３３２．　ＥＬ１００８
およびＥＬ１００９のサザンハイプリダイゼーションパ
ターンを示すＸ線写真 レーンＡ　：　ＡＪ１１３３２　、レーンＢ：　ＥＬ１
００８゜レーンＣ：　ＥＬ１００９ ０：菌株由来ｔｈｒオペロン 数字：　ＨｕｄＡＨ９に相当するフラグメント；１本の
７ラグメントがｌ　ＨｕｄＡＨ９に相当する。 第９図：　Ｍ　ｕｄＩＩ　ＰＲ１３転移株のサザンハイ
プリダイゼーションパターンを示すＸ線写真 レーンＡ、Ｂ　Ｃ，Ｄ、Ｅ、ｒおよびＧはそれぞれＡＪ
１１３２２．　［１１００１，ＥＬ１００４．　ＥＬ１
００６．　Ｅ１１００３　　ＥＬ１００５およびＥｌ、
１００７に相当する。 ０：転移したＭ　ｕｄ　ＩＩ　ＰＨ１０のＥ　ｃｏＲＩ
断片のうち共通のフラグメント 数字：　ＭｕｄＩＩ　Ｐ１１１３に相当づるフラグメン
ト；１フラグメントが１ＨｕｄｌＩＰＲ１３に相当する レーン八におけるずべてのフラグメントはＡＪ１１３３
２とプローブ：　ｐＲｃｌｏｏのハイブリダイゼーショ
ンによる。レーンＣ−Ｄにおいても同様のパターンが見
られる。 第１０図：　Ｍ　ｕｃｆＩ［１７３４転移株のハイブリ
ダイゼーションパターンを示すＸ線写真 レーンＡ、ＢおよびＣはそれぞれＥ。 ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ　３８４５５１．ＥＬ３００
３およびＥＬ３００７に相当する。 数字はＭ　ｕｄ　’ｆｌ　１７３４に相当するフラグメ
ントで１フラグメントがＩ　ＨｕｄｌＩ　１７３４に相
当する。 第１１図：　ＨｕｄＡ８９転移株のハイブリダイゼーシ
ョンパターンを示すＸ線写真 レーン＾、ＢおよびＣはそれぞれＥ Ｏ工ひ１射１リュ３８４５５１．　ＥＬ３００４および
ＥＬ３００８に相当する。 ｂ：非特異的なフラグメント 数字：　ＨｕｄＡＨ９に相当するフラグメント：１フラ
グメントがＩ　ＨｕｄＡＨ９に相当する。 第１２図：ｐＡＡｌ１構築 第１３図−第１６図： Ｍｕｄ＾旧１転移株のサザンハイプリダイゼーションパ
ターンを示すｘＩ！写真 レーしＡ、ＢおよびＣはそれぞれＥＬＩＯＩＧ。 ＥＬ１０１２およびＥＬ１０１３に相当する。 ａ：菌株由来ｔｈｒオペロン（第１３図、第１４図）お
よびａＳｄ遺伝子（第１５図、第１６図）。 ｐ：部分消化ＤＮＡ由来の７ラグメント数字：　Ｈｕｄ
ＡＨｌｌに相当するフラグメント；１フラグメントがＩ
　Ｈｕｄ＾旧１に相当（第１４．１５．１６図）または
２フラグメントがＩ　ＨＬｌｄＡＨｌｌに相当する（第
１３図）。 第１１図：　１）ＡＢ９の構築 第１８図：　Ｈｕｄ’ＡＢ９転移株のパイプリダイゼー
ションパターンを示すｘｍ写真 レーンＡ、ＢおよびＣはそれぞれＨＣ４１００゜ＥＬＩ
ＯＩＧおよびＥＬｌｏｌｌに相当する。 ａ：＠株由来且堕遺伝子 数字：　ＨｕｄＡＢ９に相当するフラグメント：１７ラ
グメントがＩ　ＨｕｄＡＢ９に相当する。 第１９図：　ＨｕｄＡ８９転移株のサザンハイプリダイ
ゼーョンパターンを示すｘＩ写真 レーンＡ、ＢおよびＣはそれぞれ＾Ｊ１１３２２゜ＥＬ
１０１４およびＥＬ１０１５に相当する。 Ｏ：菌株由来ｔｈｒオペロン 数字：　ＨｕｄＡＨ９に相当するフラグメント；１フラ
グメントがＩ　ＨｕｄＡＨ９に相当する。 第２０図：　ＨｕｄＡ８９転移株のサザンハイプリダイ
ゼーシミンパターンを示すＸ線写真 ａ：菌株由来ｔｈｒオペロン 数字：　ＨｕｄＡＨ９に相当するフラグメント；１フラ
グメントがＩ　ＨｕｄＡＨ９に相当する。 ＩＧ−３ ＦＩＧ、５ 図面の１”ｐ・す；力〜容に変更’２ｉｚ）ＦＩＧｊ４ ビし ＩＧ−１７ ＩＧｊ９ Ａ 日 口 目 ＩＧ−２０

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）トランスポゾンの内部かつ必須領域外に目的遺伝
    子がクローン化されたトランスポゾンを、細菌染色体上
    またはエピソーム上へ組み込む方法。
  2. （２）トランスポゾンが欠損トランスポゾンである特許
    請求の範囲第１項記載の方法。
  3. （３）トランスポゾンが転移不可能なトランスポゾンで
    ある特許請求の範囲第２項記載の方法。
  4. （４）トランスポゾンがトランスポゼース（転移酵素）
    を欠損するトランスポゾンである特許請求の範囲第２項
    または第３項記載の方法。
  5. （５）トランスポゾンがトランスポゼースをコードする
    遺伝子を欠失するトランスポゾンである特許請求の範囲
    第４項記載の方法。
  6. （６）トランスポゾンにおいて、トランスポゼースの発
    現が抑制されているトランスポゾンである特許請求の範
    囲第２項または第３項記載の方法。
  7. （７）トランスポゾンがプラスミド上に挿入され、トラ
    ンスフォーメーションによって細菌内にプラスミドと共
    に導入されるトランスポゾンである特許請求の範囲第１
    項から第６項のいずれかに記載の方法。
  8. （８）トランスポゾンがバクテリオファージ中に挿入さ
    れ、トランスダクションによって細菌内にバクテリオフ
    ァージと共に導入されるトランスポゾンである特許請求
    の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の方法。
  9. （９）特許請求の範囲第３項から第８項のいずれかに記
    載の方法において、転移不可能なトランスポゾンを転移
    増幅するためにトランスポゼースを相補し、決められた
    コピー数増幅の後相補を停止する、遺伝子を決められた
    コピー数安定に組み込む方法。
  10. （１０）トランスポゾンがトランスポゼースを発現する
    プラスミドによるトランスフォーメーションで相補され
    る特許請求の範囲第９項記載の方法。
  11. （１１）トランスポゾンがリプレッサーの不活化により
    発現したトランスポゼースにより相補される特許請求の
    範囲第９項記載の方法。
  12. （１２）目的遺伝子がトランスポゾン内に存在するプロ
    モーターの制御下にあり、細胞内で発現可能な遺伝子で
    ある特許請求の範囲第１項から第１１項のいずれかに記
    載の方法。
  13. （１３）トランスポゾンがＴｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔ
    ｎ１０、Ｔｎ９０３、ＴｎＨｏＨｏ、ＩＳ１、ＩＳ１０
    、ＩＳ５０、ＭｕｄファージまたはＭｕｄIIファージの
    いずれかである特許請求の範囲第１項から第１２項のい
    ずれかに記載の方法。
  14. （１４）宿主細菌が腸内細菌科、リゾビウム属またはシ
    ュードモナス属細菌のいずれかに属する細菌である特許
    請求の範囲の第１項から第１３項のいずれかに記載の方
    法。
  15. （１５）宿主細菌が￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
    ￥、￥Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ￥￥ｆｒｅｕｎｄｉ￥、
    ￥Ｅｒｗｉｎｉａｈｅｒｂｉｃｏｌａ￥、￥Ｅｒｗｉｎ
    ｉａ￥￥ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ￥、￥Ｓａｌｍｏｎ
    ｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ￥、Ｓｈｉｇｅｌｌａ
    ｓｏｎｎｅｉ￥、￥Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａ
    ｃａｅ￥、￥Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ￥
    、￥Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａ￥￥ｃｉ
    ｅｎｓ￥または￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ
    ￥のいずれかに属する細菌である特許請求の範囲第１４
    項記載の方法。
  16. （１６）トランスポゾンがマーカー遺伝子を有するトラ
    ンスポゾンである特許請求の範囲第１項からから第１５
    項のいずれかに記載の方法。
  17. （１７）マーカー遺伝子が細菌内で発現する抗生物質耐
    性遺伝子である特許請求の範囲第１６項記載の方法。
  18. （１８）トランスポゾンの増複数がマーカー遺伝子の発
    現の程度に応じて評価される特許請求の範囲第９項から
    第１７項のいずれかに記載の方法。
  19. （１９）マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、
    その発現が抗生物質への耐性度で評価できる遺伝子であ
    る特許請求の範囲第１８項記載の方法。
  20. （２０）マーカー遺伝子がラクトースオペロンのような
    発色マーカー遺伝子であり、その発現が発色の程度によ
    つて評価できる遺伝子である特許請求の範囲第１８項記
    載の方法。
  21. （２１）特許請求の範囲第１項から第２０項までのいず
    れかに記載の方法において、既にトランスポゾンが転移
    増幅した菌株に更に別種のトランスポゾンを転移増幅さ
    せる方法。
  22. （２２）トランスポゾンがＭｕｄファージである特許請
    求の範囲第１項から第２１項のいずれかに記載の方法。
  23. （２３）Ｍｕｄファージがヘルパーファージと共に宿主
    細菌に感染しクロモゾーム上に１ないし複数コピー組み
    込まれるＭｕｄファージである特許請求の範囲第２２項
    記載の方法。
  24. （２４）Ｍｕｄファージがトランスポゼースを発現する
    プラスミドによる宿主の形質転換またはＭｕファージの
    感染によりトランスポゼースが相補され転移増幅するＭ
    ｕｄファージである特許請求の範囲第２２項または第２
    ３項記載の方法。
  25. （２５）Ｍｕｄファージの増幅後、用いたプラスミドま
    たはＭｕファージを菌体内に保有しない菌株を選択する
    特許請求の範囲第２２項から第２４項のいずれかに記載
    の方法。
  26. （２６）特許請求の範囲第１項から第２５項のいずれか
    に記載の方法で得られた菌株。
  27. （２７）目的遺伝子がＬ−スレオニン生合成経路の１な
    いしそれ以上の遺伝子である特許請求の範囲第１項から
    第２５項のいずれかに記載の方法。
  28. （２８）１ないしすべてのＬ−スレオニン生合成遺伝子
    を含むトランスポゾンを１ないし複数個クロモゾーム上
    に有し、Ｌ−スレオニンを著量生産する特許請求の範囲
    第２６項記載の菌株。
  29. （２９）菌株が￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥である特許請求の範囲
    第２８項記載の菌株。
  30. （３０）目的遺伝子がペプチドまたは蛋白質をコードす
    る遺伝子である特許請求の範囲第１項から第２５項のい
    ずれかに記載の方法。
  31. （３１）特許請求の範囲第２６項、第２８項および第２
    ９項のいずれかに記載の細菌を培養し、培地中に生成蓄
    積された目的生産物を採取することを特徴とする醗酵法
    による目的物質の製造方法。
  32. （３２）特許請求の範囲第２６項または第３０項記載の
    細菌を培養し、培地中または菌体内に生成蓄積されたペ
    プチドまたは蛋白を採取することを特徴とする醗酵法に
    よるペプチドまたは蛋白の製造方法。
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