JP2009514506A - E.コリ株dsm6601のプラスミド不含のクローン - Google Patents
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Abstract
Description
図1は、概略の形式で菌株DSM6601のプラスミド不含のクローンの製造方法の経路を示しており;
図2はプラスミドpMut1−Tcの物理地図を示しており;
図3はプラスミドpMut2−Knの物理地図を示している。
pMut1の改変
野生型のDSM6601に本来から存在する両者のプラスミドpMut1及びpMut2をキアゲン(QIAGEN)のプラスミド−ミディプレップ(Midiprep)プロトコール(キアゲンプラスミド調製ハンドブック12/2002、第16〜20頁)に従って単離した。
pMut2の改変
プラスミドpMut2の標識のために、ベクターpACYC177から誘導されたカナマイシン耐性カセットを選択した。このために前記ベクターから制限酵素StuIにより耐性カセット(サイズ1.34kb)を切り出し、そしてBglII制限切断部位を介してプラスミドpMut2に組み込んだ。相応の酵素によるプラスミドの制限消化により制限バッチをカラム(キアゲン、PCR分別キット(PCR Fraktion Kit))を介して精製し、そしてプラスミドpMut2に、クローニングのための“ブラントエンド”を形成するためにクレノウ処理を行った。プラスミドpMut2の再ライゲーションを回避するために、制限酵素BglIIで直鎖化され、かつクレノウ酵素で処理されたプラスミドの脱リン酸化を実施した。引き続きベクターpMut2及びカナマイシンカセットをライゲーションし、そしてそれによりE.コリK−12株DH5αを実施例1に記載のように形質転換した。形質転換体をKn含有のLB寒天培地上にプレーティングした。クローニングの成果を幾つかの細菌クローンのプラスミドの微量調製によって検査した。カナマイシンカセットで標識されたプラスミドpMut2をpMut2−Knと呼称する。
sacB遺伝子の導入
sacB遺伝子(レバンサッカラーゼをコードする)を耐性カセットで標識されたプラスミドpMut1−TcとpMut2−Kn中に導入するために、両方のプラスミドにおいてそれぞれ単一のEcoRI制限切断部位を選択した。sacB遺伝子(サイズ2.6kb)をプラスミドpCVD442から制限酵素PstIで単離した。ベクターpMut1−TcとpMut2−Knを準備するために、前記のプラスミドをEcoRIで直鎖化し、そして引き続き“ブラントエンド”の形成のためにクレノウ処理を行い、そして脱リン酸化させた。インサートのsacBをPstIによる制限消化後に精製し、そしてクレノウ酵素で処理した。直鎖化されたベクター及びインサートをライゲーションし、そしてそれによりE.コリK−12株DH5αを実施例1に記載のようにコンピテントにして、形質転換した。クローニングの成果を幾つかの細菌クローンのプラスミドDNAの微量調製及び引き続いての制限分析によって検査した。sacB遺伝子で標識されたプラスミドpMut1−TcとpMut2−KnをpMut1−TcSac及びpMut2−KnSacと呼称する。
E.コリ株DSM6601のプラスミド不含のクローンの製造
まずプラスミドpMut1−TcSacをエレクトロポレーションによって前記の菌株に、実施例1に記載のように形質転換した。プラスミドpMut1−TcSacを菌株DSM6601に移入させるためのエレクトロポレーションの後に、該バッチをTc含有(50μg/ml)のLBプレート上にプレーティングした。得られたテトラサイクリン耐性の細菌クローンを、プラスミドpMut1−TcSacの保有に関して、そしてそれと結びつく本来存在するプラスミドpMut1の損失に関して検査した。プラスミドpMut1の損失は、プラスミドDNAを調製し、そしてそのDNAを酵素EcoRIにより制限消化し、引き続き直鎖化されたプラスミドを電気泳動により分離し、pMut1を示すDNAバンドの欠損により検出された。
Claims (8)
- エシェリキア・コリ株DSM6601のプラスミド不含のクローン。
- 請求項1記載のプラスミド不含のクローンの製造方法であって、以下の工程:
a)プラスミドpMut1及びpMut2中に耐性遺伝子を組み込む工程、
b)工程a)で得られたプラスミド中にsacB遺伝子を組み込む工程、
c)工程b)で得られたプラスミドをE.コリ株DSM6601に導入し、そして該菌株を、本来存在するプラスミドpMut1及びpMut2が工程b)で得られたプラスミドによって排除される条件下に培養する工程、及び
d)工程c)で得られたクローンを、実質的にsacB遺伝子を欠失した細菌の増殖のみを可能にする条件下に培養する工程
を特徴とする方法。 - 耐性遺伝子が発現カセット中に存在する、請求項2記載の方法。
- 耐性遺伝子がテトラサイクリン耐性又はカナマイシン耐性から選択される、請求項2又は3記載の方法。
- プラスミドpMut1をテトラサイクリン耐性カセット及びsacB遺伝子で標識し、そして本来のプラスミドpMut2をカナマイシン耐性カセット及びsacB遺伝子で標識する、請求項2から4までのいずれか1項記載の方法。
- テトラサイクリン耐性カセットとsacB遺伝子で標識されているプラスミドpMut1で形質転換された細菌をテトラサイクリンを含有するプレート上で培養し、引き続きサッカロースを含有するプレート上で培養し、そして第一工程でのプラスミドpMut1の排除の後に、プラスミドpMut2の排除をカナマイシンプレート上での培養及びサッカロースプレート上での更なる培養によって実施する、請求項2から5までのいずれか1項記載の方法。
- クローニング菌株としての、請求項1記載のプラスミド不含のクローンの使用。
- 動物における胃腸障害の治療のための薬剤の製造のための、請求項1記載のプラスミド不含のクローンの使用。
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