JPH01503707A - 動物成長促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物成長促進剤 この発明は、動物におけるインビボ成長の促進に関するものであり、さらに具体 的には成長促進剤、その製造方法および動物成長増進方法に関するものである。

従来、動物、特に家畜動物における成長促進は、飼料に異化ステロイド性物質、 例えばエストロゲンを添加することにより達成されてきた。最近では、動物組織 に許容し得ないほど大量のステロイドが蓄積されることから、この実践方法は不 評を招いている。その結果、例えば大量のエストロゲンを摂取した鶏を食した男 児の***が膨らむなど望ましくない作用が生じている。

別の実践策として、動物飼料への抗生物質の混入が広く普及している。この方法 は機会に乗じた細菌感染の制御を助けるものであり、家畜の健康を全体的に改良 し、その結果体重を増加させる。この実践策は保健当局による綿密な調査を受け た結果、抗生物質耐性株の微生物の生成を助長するものとして非難された。飼料 添加物とじて使用された抗生物質が一般に処方されるヒト治療薬である場合、こ れは特に懸念される問題になる。

さらに、飼料添加物として様々な消化酵素を用いた動物成長促進方法がこれまで に提案されている。これらの酵素は腸における未消化飼料材料の分解を助けるた め、所定の食物割当に対する吸収作用によって利用可能な栄養分の量が通常の消 化条件下の場合よりも多くなる。

飼料中への酵素混入は、酵素が極端なｐＨ値に遭遇する胃またはこぶ胃通過時に 変性および不活化されることが多いという不利点を有する。酵素は、ｐＨ，温度 、コファクター等、生物学的活性の維持に関して特定必要条件を有するため、最 適値から逸脱すると、不可逆性であり得る酵素活性の低下または酵素不活化が誘 発され得る。

動物飼料への消化酵素の添加は、一般に動物成長促進に効果の無いことが判った 。さらに、投与された酵素のうち、こぶ胃または胃を通って生き残る酵素はごく 僅かの比率に過ぎないため、大量の酵素を必要とすることからこの処置は費用が 高くついてしまう。

オー７トラリア国特許第５１６０７２号は、結合系、安定剤および崩壊剤と酵素 を混合し、次いでこの混合物を腸溶性コーティングで被覆することにより胃の不 活化から消化酵素を防御することを提案している。この腸溶コーティングにより （混合物は）胃を通過し得、その後十二指腸のアルカリ性環境内で分解する。結 合剤および崩壊剤は、十二指腸への酵素の急速な放出を助長する。この提案は、 消化酵素が、有機溶媒、例えばイソプロパツールおよびメチレンクロリドの存在 下結合剤および崩壊剤と混合されたとき、部分的に不活化されるという不利点を 有する。さらにまた、消化酵素は、腸溶性コーティングの適用時に有機溶媒によ り部分的に不活化される。特許第５１６０７２号に従い製造された粒子のか拉サ イズは、飼料への均一分布の妨げとなる大きなサイズであるが故に総じて不満足 なものである。

従って、上述の不利点の１つま１こはそれ以上を克服する酵素性動物成長促進剤 に対する必要性が存在する。

この発明は、飼料成分を有効に利用するための成長促進剤の提供を目的としてい る。

この発明によると、固定化された形聾を呈する（ｉ）　蛋白質消化酵素、 （ｉ　ｉ）炭水化物消化酵素、 （ｉｉｉ）脂肪消化酵素、または （ｉｖ）繊維消化酵素 から選ばれる１種またはそれ以上の酵素から成るコアを有する微粒を含む成長促 進剤であって、前記コアが水溶性薄膜により封入され、アルカリ可溶性酸不溶性 ポリマー、またはその構造が腸液により可溶化され得る脂肪酸または他の材料の ウィンドーで置換されているか、またはそれらを含んでいる高分子量ポリマーを 含む腸溶性コーティングで被覆された成長促進剤が提供される。

「固定化された形態」なる語は、酵素がゲル様材料内に固定されているか、半透 膜内に収納されているか、吸着剤に吸着されているか、またはキレート剤に結合 されている場合を包含する。

酵素は、例えば下記方法、 （ａ）包括方法−ゲル様材料のコアへの酵素の取り込みまたは半透膜内収納、 （ｂ）架橋方法−架橋試薬を用いた酵素の分子間架橋、または（ｃ）担体結合方 法−イオンおよび／または共有結合による水不溶性物質と酵素の物理的または化 学的結合 のいずれか一法により固定され得る。固定化した結果、酵素はそれらの生物学的 活性を保持し得る。

コア内での酵素の包括は、ある種の条件下でゲルを形成し得る成分と酵素を混合 することにより行なわれ得、その結果、酵素は形成されたゲル・マトリックス内 に包括される。

ゲル形成剤の例としては、ｋ−カラゲーニン、ゼラチン、アルギネート、セルロ ースもしくはその誘導体、または様々なゲル形成合成ポリマー、例えばポリアミ ドもしくはキトサンが含まれる。吸収剤が使用される場合、それは好ましくは微 粉化された活性炭である。

酵素の固定に有用なキレート剤には、ＥＤＴＡ、その塩もしくは誘導体、および 高分子量親水性ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたは水溶液もしくは水性 ／親水性溶媒中でそれらのイオン結合を解離し得る高分子量塩類が含まれる。

微粒の粒子サイズは、好ましくは２５ないし５００μ１１さらに好ましくは５０ ないし３５０μｌである。

この発明において使用され得る酵素の例には、（１）蛋白質消化酵素（蛋白質分 解酵素）カテプシンａ、　ｂおよびｃ１腺カリクレイン類、プロテアーゼに１ス ブチリシン、フィシン、ストレプトドルナーゼ、パパイン、レニン、トリプシン 、プロメリンおよび細菌、真菌、植物または動物由来の任意のプロテアーゼ、（ ２）炭水化物消化酵素 アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルターゼ、ラクターゼ、β−グルカナーゼ、 グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、インベルターゼおよび細菌 、真菌、植物または動物由来の任意の炭水化物消化酵素、 （３）脂肪消化酵素 すい臓リパーゼ、細菌および真菌リパーゼ、（４）繊維消化酵素 セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼがある。

封入する場合、コアに薄いフィルムまたは機械的バリアを波山ることにより各微 粒のコアおよびその環境を物理的に分離させ得る。

このバリアまたはフィルムは水溶液に溶は得る。適当な機械的バリアを形成する 化合物の例としては、ゼラチンがある。

腸溶性コーティングは、好ましくは酢酸セルロースフタレートである。しかしな がら、他の酸耐性−アルカリ可溶性ポリマーも使用され得る。

ブチルメタクリレートまたは他の高分子量ポリマーは、腸液により可溶化され得 るステアリン酸もしくは他の脂肪酸誘導体、例えばＣＨ＋ｔ−ｘ、脂肪酸のウィ ンドーで置換され得るか、またはそれらを含み得る。

消化酵素のゲル内固定は、非常に有益な特色を有する方法である。

特にゲル・マトリックスは、変性成分、例えｌｆ腸溶性コーティング（酸不溶性 、塩基可溶性コーティング、例えば酢酸セルロースフタレート）の酵素への適用 におＬ）て使用さ２する有機溶媒の接近を匍１限する・すなわち・ゲル°マトリ ックス内に固定された消化酵素の力λなりの部分は、最終的には触媒作用に利用 され得る。これは、腸溶性コーティングの適用時に酵素活性のかなりの喪失が生 じる先行技術で得られた結果とは対照的である。

消化酵素が固定され得るゲル・マトリックスは多孔質で透過性である。従って、 ゲルが水性条件、例えば十二指腸の環境に曝された場合、ゲル・マトリックス中 へ腸液が入ってくるため、ゲルは膨潤し、消化酵素は放出され、ゲルから出てい って触媒作用を行う。

この発明の実施方法によると、消化酵素の生物学的活性を喪失せずに５０μｍ１ 〜５００μ肩程度の非常に小さい粒子サイズを有する微粒が製造され得る。特に 、ゲル内またはゲルを形成し得る溶液中に固定された消化酵素は、操作および処 理が容易であり、緩和な手順例えば消化酵素含有ゲルは、非常に小さな孔サイズ のふるいから押し出され得るか、または凍結乾燥することにより所望のサイズの 粒子を製造し得る。別法として、ゲルを形成し得る溶液中の消化酵呆を適当なノ ズルにより噴霧して微小飛沫を形成させ、飛沫をゲル化させる溶液に導入するこ とにより、形成されたゲル・マトリックス内に消化酵素を固定し得る。この方法 で形成されたか粒のサイズは、ノズルにおける孔サイズおよび溶液が霧化される 圧力により決定される。対照的に、先行技術の方法ではこのような結果は得られ ない。

先行技術の場合、単に酵素を常用の結合剤と混合するだけであり、それらは上記 処置に付されても所望の粒子サイズを有する微粒を製造し得ない。

小さな粒子サイズを有する微粒は、飼料全体に均一に分配され得るため最も望ま しく、微粒の表面積が増加するためそれらは酵素を急速に放出させ得る。

酵素含有コアを水溶性バリアで覆うと、腸溶コーティングの適用中に使用される 有機溶媒による変性から酵素が保護される。先に述べたゲル・マトリックスは保 護性を有するため、消化酵素の生物学的活性は顕著に維持される。すなわち、こ れは、成長促進に使用される消化酵素の量がかなり節約され得ることを意味する 。

この発明の成長促進剤により、Ｉ）Ｈ感受性消化酵素は胃またはこぶ胃における 不活化から保護され、さらに腸管、特に十二指腸での作用に関して有効に利用さ れ得る。成長促進剤が単胃動物の腸のアルカリ性領域に達すると、外部コーティ ングが溶けるか、または脂肪酸ウィンドーが消化される。次いで、腸液は水溶性 コーティングを通過し、それを分解させ得る。その結果剥き出しになったコアを 膨張させ、消化酵素を放出させる。

こぶ胃動物において、高分子量ポリマー、例えば脂肪酸ウィンドー、好ましくは Ｃ＋ｔ−ｔａを有するブチルメタクリレートを用いることにより、成長促進剤は こぶ胃および胃を通過することができる。

腸領域、特に十二指腸において、脂肪酸ウィンドーがリパーゼによって消化され ることにより、水溶性コーティングは分解され、コアは剥き出しになり、その結 果コアは膨張し、消化酵素は放出される。

この点において注意すべきことは、この発明の実施方法に従い達成され得る微粒 の粒子サイズが小さいため、微粒のこぶ胃通過が容易になることである。

この発明のさらに別の態様によると、前述の成長促進剤の有効量を投与すること による動物の成長増進方法が提供される。

上記方法に従い処置された動物は、体重増加の向上および飼料利この発明により 処置され得る動物には、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、アヒルおよび他 の家畜が含まれる。

この発明の成長促進剤は動物に経口投与され得る。

この発明の別の態様によると、前述の動物成長促進剤を医薬的または獣医学的に 許容し得る担体または賦形剤と共に含有する動物の成長増進用組成物が提供され る。例えば、成長促進剤は、水、カオリン、タルク、炭酸カルシウム、ラクトー ス、塩化ナトリウム、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸鉄、硫酸マンガン、ヨウ化カリウ ム、硫黄、塩化カリウム、セレニウム並びに／またはビタミン類、例えばビオチ ン、コリン、塩化物、ニコチンアミド、葉酸およびビタミンＡ、Ｂ３、Ｅ、に、 Ｂ、、Ｂ１、Ｂ６およびＢｌ、と共に投与され得る。

この発明のさらに別の態様によると、前述の成長促進剤および適当な動物飼料原 料を含有する動物の成長促進用食物組成物が提供される。

適当な動物飼料原料の例としては、メイズ、小麦、シャープス（ミドリング）、 大豆ミール（粉餌）、フィツシュミール、グラスミール、脱脂乳、燐酸三カルシ ウム、麦芽、コーン、イネ、マイロ、ホエー、アルファルファミール等のうちの １種またはそれ以上が含まれる。

成長促進剤に混入される酵素（複数も可）の様々な量（Ｗ／ｗ）は厳密ではない 。成長促進剤に混入されるべき酵素の最適量は、大した実験を行わずに容易に決 定され得る。

好ましくは、この発明の実施方法によると、成長促進剤１キログラム当たり、 プロテアーゼ：２Ｘ１０’〜２ＸＩＯ’ビタフアーム・プロテアーゼ単位 アミラーゼ　：ｌＸ１０’〜４．３Ｘ１０”ビタファーム・アミラーゼ単位 リパーゼ　：０．５〜５Ｘ１０３ビタフアーム・リパーゼ単位セルラーゼ　：２ ＸｌＯ’〜２Ｘ１０Ｂビタフアーム・セルラーゼ単位 が含まれる。

さらに好ましくは、この発明の成長促進剤１にｇ当たり、プロテアーゼ：２Ｘ１ ０５プロテア一ゼ単位アミラーゼ　＋４．３ＸｌＯａアミラ一ゼ単位リパーゼ　 ：５Ｘ１０’リパ一ゼ単位 セルラーゼ　：２ＸＩＯ’セルラ一ゼ単位が含まれる。

上記酵素は各々フード・ケミカル・インデックス１１１版に記載された通り食品 用である。

上記酵素単位はビタファーム標準単位であり、実施例３記載の方法に従い計算さ れる。

この発明のさらに別の態様によると、下記段階、すなわち（ａ）（ｉ）　蛋白質 消化酵素、 （ｉｉ）脂肪消化酵素、 （ｉｉｉ）繊維消化酵素、 （ｉｖ）炭水化物消化酵素 から成る群から選ばれる１種またはそれ以上の酵素をコア内に固定し、 （ｂ）固定された酵素を微粒状に造粒し、（Ｃ）上記微粒を水溶性機械的バリア によりカプセル封入し、そして （ｄ）アルカリ可溶性酸不溶性ポリマー、またはその構造が脂肪酸の隙間および ウィンドーにより中断されている高分子量ポリマーにより段階（ｃ）の微粒をコ ーティングする段階で構成される動物成長促進剤の製造方法が提供される。

好ましくはこれらの微粒は、段階（ｃ）の水溶性機械的バリアおよび段階（ｄ） のコーティングによりスプレー・コーティングされてい好ましくは、コア内にお ける固定は、酵素がゲル様材料内に固定されていることを指す。

この発明の動物成長促進剤は、動物の体重を増加させ、飼料利用状況を改善する 。さらに、この動物成長促進剤は屠体の背部脂肪を減少させる。この結果商業上 望ましい赤身肉が得られる。

以下、非限定的実施例によりこの発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 動物成長促進剤の製造方法 （ａ）２％−５％Ｗ／Ｖのに一カラゲーニンを６５°Ｃの温度で精製水と混合し 、カラゲーニンを溶解させる。次いてこの溶液を５０℃に冷却する。

（ｂ）１％ｗ／ｖの等酵素活性（等酵素活性は、その等重量の特定基質を消化し 得る酵素の量として定義される）のアミラーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼおよ びリパーゼを等張性燐酸緩衝液（４０％０．０６７モルＮ　ａＨｙ　Ｐ　Ｏ−＋ 　６０％の０．６７モルＮ　ａ、Ｈｐ　Ｏ４）にｐＨ６および５０℃で溶かす。

この溶液を溶液（ａ）に加え、１５分間５００　ｒｐｍでホモジナイズする。次 いで２−５％Ｗ／　Ｖのイオン化カルシウム（水中）をこの溶液に加え、生成し た溶液をさらに１時間５０ｒｐｍでホモジナイズし、次いで２０℃に冷却するこ とにより、ゲルおよび水相が形成される。

（ｅ）生成したゲルおよび水相を５℃に冷却し、傾しゃし、ろ過し、凍結乾燥す る。凍結乾燥材料を粉砕すると、２５−１００ミクロンのか粒サイズが得られる 。次いでか粒を硬化剤、例えば２．５％Ｗ／Ｗグルタルアルデヒドまたはホルム アルデヒドにより洗浄する。

別法として、段階（ｂ）のゲル相を押し出し、３ｋＰ／ａｍ”で５０μｌサイズ の孔より噴霧し、２．５％ｗ／ｗグルタルアルデヒドまたはホルマリン溶液中に １−５メートル滴下することによりか粒が形成される。

（ｄ）次いでか粒をろ過し、軟化剤、例えばグリセリンで洗浄する。

フィルム軟化剤であれば全て使用され得る。

（ｅ）生成したか粒をろ過し、流動化し、４０℃で加熱乾燥する。

ＣＤ前記段階のか粒を、４０℃で１−２％ｗ／ｖのゼラチン（水溶液中）により スプレー・コーティングする。

（ｇ）次いで酸耐性、アルカリ可溶性コーティングをか粒土にスプレー・コーテ ィングして最終重量を１２０％Ｗ／Ｖとする。このコーティングは、６％Ｗ／ｌ Ｖ酢酸セルロースフタレート、３０％Ｖ／Ｗイソプロパツール、０．５％ｖ／ｗ ひまし油およびアセトン（適量加えて１００％Ｗ／Ｗとする）を含む。

（ｈ）段階（ｇ）の別法として、その構造が脂肪酸の隙間またはウィンドーによ り中断されている高分子量ポリマーをか粒土にスプレー。

コーティングして最終重量を１０５％ｗ／ｗとする。このコーティングは、３％ ブチルメタクリレート、０．１５％ジブチルフタレート、０．０５％ステアリン 酸および酢酸エチル（適量加えて１００％Ｗ／Ｖとする）を含む。

段階（ａ）において、ｋ−カラゲーニンの代わりに、ゲル形成剤、例えばアルギ ニン酸、ゼラチンまたはセルロースおよびその誘導体が使用され得る。

段階（ｂ）において、カルシウムは、他のアルカリ金属イオン、例えばに、Ｒｈ ！＋、Ｃｓ＋またはアルカリ　金属イオン、例えばＭ　ｇ　’　”、Ｓｒ　また は２価もしくは３価金属イオン、例えばＡ１３＋、Ｍｎ”、！＋ ！十　鵞＋　！十　宜＋　鵞十 Ｂａ　、Ｃｏ　、Ｎｉ　、Ｚｎ　、Ｐｂ　等またはＮＨ，＋イオンまたは脂肪族 アミンもしくは芳香族ジアミン、例えばトリエチルアミン、メチレンジアミン、 エチルアミン、ヘキサメチレンジアミン等と置き換えられ得る。

実施例２ ブタにおける成長促進 「成長段階」（生体重２２−５０キログラム）および「成長完了段階」（生体重 ５０−８０キログラム）のブタに、様々な量の実施例１による本発明成長促進剤 を与える。成長促進剤１キログラム当たり、２Ｘ１０’プロテア一ゼ単位、４． ３Ｘ１０”アミラーゼ単位、５ｘ１０１ノパ一ゼ単位および２ＸｌＯ’セルラ一 ゼ単位が含まれる。成長促進剤を小麦、大麦、スィート・ルピナスの種子および ミートミールの標準的飼料原料に加えた。この飼料原料は、１キログラム当たリ １３．４ＭＪの消化性エネルギー、推奨されたレベルのミネラルおよびビタミン と一緒に０．９５％のリジン、０．５４％のメチオニンおよび０．５６％のトレ オニンを含む１８．３％の粗蛋白質を含んでいた。

調査された６種の食餌療法処置では、成長促進剤を飼料１トン当たりＯ−１，０ ，２，０，４，０，８，０および１６キログラムの割合で加えた。各処置を、各 々成長段階（２２−５０キログラム）および成長完了段階（５０−８０キログラ ム）中における充分な食欲の８４％および８７％に達する３倍推持レベルに飼育 された成長中のブタに割り当てた。

この実験の結果を第１表に示す。

第　１　表 基本的飼料原料と混合した成長促進剤を与えられたブタの状況成長促進剤（ｋｇ ／　トン）０１２４８１６軽度の重量増加− ２２−５０に９．９／日　５７０　５７８　５７５　５６９　５８８　５７７５ ０−８０に９．９／日　７３２　７５９　８１２　７９１　７９４　８００飼料 変換割合− ２２−５０ｋｇ　２．７５　２．６９　２．７９　２．７０　２．６６　２．７ １５０−８０に９３，１０　２．９９　２．７２　２．８４　２．８３　２．８ １背中の脂肪、Ｐｘｘ：Ａ１４．１　１３．４　１２．９　１２．８　１３．１ 　１２．１層体ドレッシング％　６８　６８　６８　６８　６８　６８第１表に 示した結果から、この発明の成長促進剤により試験動物の成長および飼料変換が 共に改善されることは明らかである。成長段階におけるブタの生体重増加は、成 長完了段階におけるブタの場合はど顕著ではない。成長完了段階では、成長促進 剤を与えられなかったブタは、１日当たり７３２９という軽度の重量増加を示し た。

１トン当たり２キログラムの成長促進剤を与えられたブタは、１日当たり８１２ ９の生体重増加を示した。このことは、この処置の効果を強調している。

対、照動物および成長促進剤を与えられた動物間に屠体ドレッシング・パーセン テージの顕著な差異は無いが、成長促進剤のレベルが増加すると、屠体の背部脂 肪（標準カリパスを用いて測定）は減少すると思われる。

実施例３ 酵素活性に関するビタファーム標準単位の測定。

Ａ、プロテアーゼ単位 ３０分の比色ヘモグロビン検定法において０．０４４７ミリグラムの非蛋白質窒 素を遊離させる酵素の量を、ｌビタファーム・プロテアーゼ単位として定義する 。この検定法は、変性ヘモグロビンを用いてｐＨ４，７，４０℃で行なわれる。

検定法： に！＝ ２、粉末状軽石 ３、ヘモグロビン基質 １６．０グラムのディフコ・ブランド・バクト・ヘモグロビン（湿気を含まない 主成分）を秤量して１リツトル・ビーカーに入れる。

３さじの粉末状軽石を加え、乾燥成分を充分混合する。連続撹はんシナ力ら、約 ４００ｍＱの蒸留水およびｌまたは２滴のダウ−コーニング・アンティフオーム を加える。ヘモグロビン溶液中にｐＨ／を極を浸し、連続して撹はんしながら２ Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨをｌ０１０に調節する。溶液の体積を５００３１ ｇに調節する。溶液を１５分間３０００　ｒｐｍでの遠心分離にかけ、基質の上 清を取っておく。

４、ストック酢酸ナトリウム緩衝液、２モル１６４グラムの無水酢酸ナトリウム を約７ｏｏＲＱの蒸留水に溶かす。標準ｐＨ計を用い、緩衝液がｐＨ４，７０± ０．０５になるまで氷酢酸を加える。溶液の体積を蒸留水により１リツトルに調 節する。

５．酢酸ナトリウム緩衝液、０．２モル５０１Ｑのストック酢酸ナトリウム緩衝 液をピペットで５００ｘｆ２の容積測定フラスコに移し、蒸留水でその体積に希 釈する。

６、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、蒸留水中７０％７、水酸化ナトリウム、２Ｎ ８、水酸化ナトリウム０．５Ｎ ９、フォリン試薬 ！容積のフォリンーシオカルトー・フェノール試薬を２容積の蒸留水で希釈する 。希釈フェノール試薬は１週間安定している。

手順： １．２５＋Ｑのヘモグロビン基質および２５ｘＱの０．２モル酢酸ナトリウム緩 衝液をピペットで１５０ｚＱビーカーに移し入れる。標準ｐＨ計により基質緩衝 液のＰＨを測定する。基質がｐＨ４，７０±０゜０５でない場合、２５１Ｑのヘ モグロビン基質および２５ＲＱの０．２モル酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨが４． ７０±０．０５となるように、０．２モル酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨを調節し なければならない。

２．２５１１１２のヘモグロビン基質および２５ｘＱの０．２モル酢酸ナトリウ ム緩衝液をピペットで１２５＋Ｑエルレンマイヤー・フラスコに移し入れる。４ ０±０．１℃水浴中で１５分間フラスコを平衡状態におく。

３．０時点で、５ｘＱの適当な酵素希釈液を平衡基質中にピペットで迅速に移し 入れる。ストップウォッチを０時点で始動させる。

４６正確に３０分後、５ｚＱのＴＣＡを各フラスコに加える。安全のため、ビユ レットまたはピペット装置を用いる。各フラスコを激しく渦状にする。

５．２５ｘＱのヘモグロビン基質、２５ｘＩ２の酢酸ナトリウム緩衝液、５ｊＩ Ｑの蒸留水および５１１ＱのＴＣＡ溶液を含むブランクを調製する。

６、フラスコを３０分間室温で放置することにより、蛋白質を完全に縦面させる 。各溶液をワットマン・ナンバー４２ろ紙によりろ過する。ろ液の初めの半分を 同じろ紙により再ろ過することが望ましい。ろ液は絶対的に透明でなくてはなら ない。

７．１ｚＱの各ろ液、４ｚＱの０，５Ｎ水酸化ナトリウムおよび１ｊＩＱの希釈 フェノール試薬をピペットで試験管に移し、よく混ぜる。

８．１０分後、および２０分以内にブランクに対して６６０ｎｍでの各ろ液の吸 光度を測定する。

計算法： ■ヘモグロビン単位（ＨＵ）は、検定条件下で６７，０８３＋９（５’／”ｘ６ ＝６７．０８）の非蛋白質窒素を遊離させる酵素の量である。

Ｆ−フェノール試薬による顕色およびプロテアーゼ加水分解間の固定関係。この 説明については標準化方法を参照。

ＩｗＶ＝５ｘＱアリコートにおける消化のため加えられた酵素のＨ０標準化方法 ニ プロテアーゼが相異すると、開裂されるペプチド結合も相異する。

フェノール試薬による顕色および加水分解の程度の間には普遍的な関係は存在し ない。しかしながら、各タイプのプロテアーゼについては固定関係が存在する。

固定関係、すなわちＦ係数は、ヘモグロビン基質と既知ヘモグロビン活性試料と のインキュベーションにより測定され得る。インキュベーションの後、ケルダー ル墾索測定が１２ホウ酸溶液、２％ ２、硫酸カリウム ３、濃硫酸 ４、フェノールフタレイン溶液（１％、９５％エタノール中）５、窒素測定用ヘ ンガーか粒 ６、メチルパープル措示薬 酵素調製： 最終希釈液の５＋１２アリコートが１０−１２のΔＮ’−’を示すように、既知 ヘモグロビン活性試料により酵素溶液を調製する。酵素希釈物の概算に役立つ計 算法を適用する。

１、比色方法における上記段階１−６により検定を行う。デュプリケイトのブラ ンクおよびトリプリケイトの酵素消化物を実験に付す。

２．４．０９の硫酸カリウムおよび１個のセレン化か粒を含む１００ｘＱのケル ダール・フラスコにピペットを用いてＬＯｍＱのブランクろ液を移し入れる。４ 峠のろ液を用いて同様に各酵素消化試料についてフラスコを準備する。

３．４＋Ｑのａｔ酸をピペットで各フラスコに移し入れ、透明になった後３０分 間消化させる。加熱を止め、フラスコを冷却する。４０ｘＱの蒸留水および１滴 のフェノールフタレイン溶液を加える。フラスコを１０〜３０分間水浴中に置く 。

４、一連の蒸留の直前に２％ホウ酸溶液のｐＨをチェックする。ホウ酸溶液のｐ Ｈは４．３〜４．７であるべきである。蒸留冷却器の配管を適当に配置し、１５ ０ｉＱビーカーに入れられた４０ｘＱのホウ酸溶液中に浸らせる。

５．７．０９の水酸化ナトリウムを冷却しｎケルダール・フラスコに加える。混 合什ず、直ちにフラスコをゴム・スリーブにより蒸留装置に連結する。激しく混 合する。３０分間蒸留し、ホウ酸のビーカーを下げ、１分間蒸留を続ける。パン ピングが発生した場合・蒸留が完了した場合と同様に直ちに続行する。ホウ酸溶 液への配管を蒸留水でリンスする。フラスコの下からフレームを除去する。

定して各留出液のｐＨを４．５にする。ブランクおよび酵素消化物に関して平均 力価を測定する。ＨＵ／９計算法の平均力価を使用する。

止見失ニ ブロチアーゼ加水分解によるろ液１０ｘＱ中の窒素のＲ９を下記要領で計算する 。

Ｒ９，窒素（ΔＮ）＝（試料力価ｘ　１０／４−ブランク力価）（０，０２ＮＸ ｌ　４） Ｒ９，窒素（ΔＮ）＝（試料力価×２．５−ブランク力価）（０，２８） １０／４＝４２Ｑ試料ろ液のＬＯ＋Ｑベースへの換算０．０２Ｎ＝塩酸の規定度 １４　＝窒素の分子量 ΔＮ量を１．５乗、すなわちΔＮ３／２とする。ΔＮ３７１対１ｌＩ９、酵素を プロットすると、直線が得られる。この直線プロット力１ら、正確に５Ｒ９のＮ を遊離させるのに必要な酵素の重量を測定する。

（ΔＮ）ｌ・５＝真数（１，５Ｘ１ｏｇΔＮ）１グラム当たりのヘモグロビン単 位（ＨＵ／９）を下記の要領で計算する。

（ΔＮ）１・’＝ｌＯｉＱのる液において遊離した５仄？の窒素１０００＝１巧 酵素の１９酵素への換算６０／１ｏ＝１０ｉ１２アリコートの総容積ベース６０ ｒｙ、Ｑへの換算Ｅ＝５ｙ９のＮを与える酵素の１９ 下記の要領で基型プロテアーゼに関するＦ係数を計算する。

ΔＡ＝６６０ｍμでの酵素消化ろ液の吸光度ＨＵ／９−ケルダール標準化方法に より測定されたプロテアーゼ１ｇ当たりのヘモグロビン単位 ｌビタファーム・プロテアーゼ単位（Ｉ　ＶＰＰＶ）＝　ｌ　ＨＵｏＢ、アミラ ーゼ単位 下記のビタフアーム・アミラーゼ検定条件下において３０分でＩＩｌ！９の還元 糖をマルトースとして遊離させる活性量を１ビタフアーム・アミラーゼ単位とし て定義する。

澱粉基質４％ｗ／ｖ可溶性澱粉溶液 ２０．００９（Ｍ気を含まない主成分）の可溶性澱粉（ヨード滴定に適した、メ ルク・リエイジェント・ソルブル・スターチ、メルク・アンド・カンパニー、ラ ーウエイ、ニューシャーシー）を７５ＲＱの蒸留水でスラリーにする。振り混ぜ ながらスラリーを３００ＲＱの強沸蒸留水に加える。澱粉溶液を再び沸、＠さけ 、３分間穏やかに煮沸する。熱源から離し、５００ｚ１２のパイレックス容積測 定フラスコに定量的に移す。水道水下室温に冷却し、容積を補う。

１５０９の分析用塩化ナトリウム（Ｎ　ａ　Ｃ１２）を４８０πＱの蒸留水に溶 かし、熱して沸騰させる。電動スターラーにより激しく撹はんする。５．７９（ 約５．０９の乾燥重量）の可溶性澱粉および２ｏＩＩＩＱの水から成る均一なｐ ３Ｈ液をゆっくりと加える。少なくとも５分間沸騰さ仕、冷却する。

炭酸ナトリウム溶液、１０，６％ 炭酸ナトリウム溶液、１．０６％ ストック・ヨウ素溶液、０．ＩＮ １２．７９のヨウ素（■、）および４８ｇのヨウ化カリウム（Ｋｌ）を約９００ Ｊ＋７！の蒸留水に溶かす。１リツトルの容積、スリ定フラスコに定量的に移し 、蒸留水により容積を補う。

ヨウ素溶液、０．０２Ｎ 硫酸、０．５Ｎ チオ硫酸ナトリウム、０．００５Ｎ ・酵素溶液 酵素溶液は、インキュベーション期間中ＬｘＱで約２０％の理論上のマルトース を生成させる濃度を有するべきである。アミラーゼは希釈溶液中では不安定であ る。従って、使用直前に適当な酵素溶液を調製すべきである。不活化の危険があ るため４０℃で酵素溶液を平衡状性にしてはならない。

ｆ旦： １．２５ＪＩ（！の４％澱粉基質をピペットで５０ｘｉ２の容積測定フラスコに 移し入れる。５ＲＱの適当な緩衝液および１８１１１１２の水を加える。フラス コを１５分間４０°Ｃ±０．５℃の水浴中で平衡状態にする。

２．０時点で、ＩｔｔＱの適当な酵素溶液を平衡状態の澱粉混合物にピペットで 迅速に移し入れる。容積を（蒸留水を捕って）埋め合わせ、転置混合する。基質 ブランクについては、酵素溶液の代わりに１ｘＱの蒸留水を加える。

３、各反応フラスコを正確に３０分インキュベーションした後、ピペットで１０ ，６％炭酸ナトリウム１ｍＱを含む１ｏＪＬＱの容積測定フラスコに５村の澱粉 消化物を移し入れる。蒸留水により容積を補い、転置混合する。

４、以下の要領で消化物の還元値を測定する。すなわち、炭酸ナトリウム酵素消 化物の２ｍＱアリコートを５０ｚ（のガラス・ストッパー・フラスコにピペット で移し入れる。測定は全て２回反復する。３ｘＱの０．０２Ｎヨウ素溶液をガラ スフラスコにピペットで移し入れ、３ｘＱの蒸留水によりフラスコの側面をリン スする。ヨウ素混合物を２０℃±０．５°Ｃの水浴中で３０分間平衡状態にする 。１ｌｌＩｉ２の０．５Ｎ硫酸を加え、０．００５Ｎの標準化チオ硫酸ナトリウ ムにより滴定する。溶液が淡黄色になると、３滴の澱粉溶液指示薬を加える。

澱粉−ヨウ素複合体が消失するまで滴定を続ける。

５、ヨウ素ブランクについては、３ｚＱの０．０２Ｎヨウ素溶液、２１１Ｑの１ ．０６％炭酸ナトリウムおよび３ｘＱの水を滴定する。

計算法： 以下の要領で消化物の還元値を計算する。

１、ヨウ素ブランク力価から澱粉溶液力価を減することにより、澱粉ブランクを 計算する。

２、下式を用いてｘｇ、マルトースを計算する。

Ｒ９マルトース＝（■、ブランクー澱粉ブランクーＭａｔＳ＊０３力価）ｘ５０ ｘｏ、８５５ 滴定試料の還元値は、ヨウ素ブランクから澱粉ブランクを減じ、さらに消化物の チオ硫酸ナトリウム力価を減じ、０．８５５倍した値に等しい。１吋の０．００ ５Ｎチオ硫酸ナトリウムは０．８８５３Ｉ９のマルトースに相当する。滴定試料 は元の消化物ＩＩ！ｇに等しい。滴定試料の還元値を５０倍すると、１ｇの澱粉 から得られたマルトースとして計算された還元糖の実際のｅｒｇが得られる。

３、第２表に記した補正係数を用いて加水分解値を２０％加水分解に補正する。

下記等式を用いてアミラーゼ効力を計算する。

ｍ９／仄Ｑ醇素 細菌性アミラーゼ Ｃ，リパーゼ単位 下記ビタファーム・アミラーゼ検定法を用いて２時間で１ミリ当量の脂肪酸を遊 離させる活性単位として１ビタフアーム・リパーゼ単位を定義する。

！、援支所液０．１モル燐酸、ｐＨ７，３２，７８（ｉ９のＮａＨ，ＰＯ，−Ｈ ｔＯを水に溶かし、１００４１２１：希釈する。２．８３９９の無水Ｎａ、ＨＰ Ｏａを水に溶かし、１００ｉＱに希釈する。２３．、ＯｚＱのＮ　ａＨｔ　Ｐ　 Ｏ４溶液および７７、ｆ）＋ｆ２のＮａｔＨＰ０４溶液を測定して２００村の容 積測定フラスコに入れ、蒸留水により容積を補う。

２、基質、オリーブ油エマルジョン 低速で（２５〜３０でのパワースタット装置の使用による）作動しているウォリ ング・ブレングー中９３ｘＱの０．１モル燐酸緩衝液に２００ｘ９の安息香酸ナ トリウムおよび７．０ｇのＵＳＰアラビアゴムをゆっくりと加える。これらの試 薬が完全に溶けると、ゆっくりと９３ＲＩ２のＵＳＰオリーブ油を加える。油を 全て加えた後、この速度で３分間、次いで高速で５分間混合する。

３、緩衝基質 タラ式１００ｘＱ容積測定フラスコ中に、５４．４０９のオリーブ油エマルジョ ンを加え、０．１モル燐酸緩衝溶液により容積を補う。

この緩衝基質は７．３のｌ）Ｈを有するべきである。

４、エチルアルコール、９５％ ５、チモールフタレイン、９５％エチルアルコール中１％（、／Ｖ）６、水酸化 ナトリウム、０．０５Ｎ 手順： １．５．Ｏ＋Ｑアリコートの緩衝基質をピペットで５０＋Ｑエルレンマイヤー・ フラスコに移し入れる。各検定試料に対してｌフラスコが必要とされる。これら を特殊ホールディング・クランプに取り付け、３７°Ｃ水浴中に設置する。

活性により異なる。

３、基質を含む１つのフラスコに５　、　ＯｘＱの蒸留水を加える。これは酵素 ブランクを構成する。次いで５．０λＱの各酵素試料を他の基質フラスコに加え る。充分混合し、３７°Ｃで正確に２時間インキュベーションする。フラスコを 時折渦状にする。

４．３．Ｏｉ（のエチルアルコールをフラスコに加えることにより反応を止め、 ４滴のチモールフタレインを加え、徹底的に混合する。

５．０．０５ＮのＮａＯＨにより各フラスコを淡青色終点に達するまで滴定する 。ブランクを滴定し、次いで試料をそれと合わせるのが量を減する。

計算法： 様々なレベルの酵素による基質の加水分解程度は直線状ではない。

良好な再現性を得るためには、０．０５ＮのＮａＯＨ４ｚＱの滴定量差（試料力 価−ブランク力価）を得るのに必要な酵素の量が、酵素の正確な量である。この 酵素量の測定に使用され得る２つの方法が存在する。

（Ａ）３試料方法 酵素調製物の３試料を正確に上記手順に従い試験する。試料の重量は、第１試料 では大体４　、　ＯｘＱ未満、第２試料では大体４　、　ＯｘＱより大および第 ３試料では大体４ｘＱに等しい滴定量差が得られるように選択される。グラフ用 紙の座標を調整後、滴定量差に対する酵素の１９をプロットし、点と点の間に直 線を引く。このプロットから正確に４　、０　ｙ（ｌの滴定量差に対する酵素の Ｒ９を読み取り、この値を用いて下式からリパーゼ単位を計算する。

（Ｂ）標準曲線方法 標準試料として既に正確に測定された活性を有する調製物を用いることにより、 数種の試料重量の標準試料を用いて上記方法に正確に従い検定を実施する。標準 試料の１９に対して得られた滴定量差をプロットし、点を結んで滑らかな曲線を 描く。この標準曲線を確立した後、未知試料のリパーゼ活性を測定するために、 この方法に従い好都合な試料重量による検定を実施する。この標準曲線から未知 検定試料と同じ滴定量差を与える標準試料の重量を測定し、下記関係式によりリ パーゼ単位を計算する。

Ｄ、セルラーゼ単位 検定条件下規定のカルボキシメチルセルロース基質において５分で１の相対液性 変化を生じさせる活性の単位としてｌビタファーム・セルラーゼ単位を定義する 。この検定は、ｐＨ４，５および４０°Ｃにおける規定のカルボキシメチルセル ロース基質の内部ベーター１゜４−ゲルコンド結合の酵素加水分解に基づくもの である。

試薬および溶液： ！、酢酸溶液、２Ｎ ２、酢酸ナトリウム溶液、２Ｎ ３、酢酸溶液、０．４Ｎ ４、酢酸ナトリウム溶液、０．４Ｎ ５、酢酸緩衝液（ｐＨ４、５） 標準化ｐ）（計を用いて、ｐＨが４．５±０．０５になるまで連続して振り混ぜ ながら酢酸ナトリウム溶液（０，４Ｎ）を４００ｘＱの酢酸溶液（０，４Ｎ）に 加える。

６、カルボキシメチルセルロースナトリウムＣＭＣタイプ７ＨＰ（ヘラクレス、 ９１０マーケツト・ストリート、ウィルミントン、プラウエア１９８９９）とい う名称のカルボキシメチルセルロースナトリウムを用いる。

７、カルボキシメチルセルロースナトリウム基質、０．２％Ｗ／Ｖ２Ｏ０１１Ｑ の蒸留水をウォリング・ブレンダーのボウルに移し入れる。ブレンダーを低速で 作動させながら、液体が一切飛び散らないように注意して１．０９（湿気を含ま ない主成分）のＣＭｏ　７ＨＰをボウル中にゆっくりと分散させる。ゴム製ポリ スマンを用いてガラス・ボウルの側面を蒸留水で洗浄する。ボウル上にトップを 置き、１分間高速で混合する。定量的に５００酎容積測定フラスコに移し入れ、 蒸留水で希釈して容積を埋め合わせる。使用前に基質をガーゼによりろ過する。

酵素調製物 検定条件下で１ｘＱの最終希釈液が５分で０．１８ないし０．２２間の相対液性 変化を生じるように酵素溶液を調製する。酵素を秤量し、ガラスすり鉢に定量的 に移す。蒸留水を用いて磨砕し、適当な容積測定フラスコに定量的に移す。蒸留 水で希釈して容積を補い、使用前にワットマン・ナンバーｌろ紙により酵素溶液 をろ過する。

検定方法 １、目盛りを定めた粘度計を厳密に垂直な位置で４０°±０．ピＣ水浴中に置く 。細部にわたり清潔な粘度計のみを使用する。大量の洗浄剤溶液、次いで蒸留水 を粘度計全体に通すことにより容易に清浄できる。これは、粘度計の狭いアーム に連結したゴム管の付いた吸引装置を用いることにより行なわれ得る。

２．２０ｘＱのろ過されたＣＭＣ７ＨＰ基質および４＊Ｑの酢酸緩衝液（ｐＨ４ ，ｓ）を５０ｙＱのエルレンマイヤー・フラスコ中にピペットで移し入れる。各 酵素試料につき少なくとも２つのフラスコおよび基質ブランクにつき１つのフラ スコを割り当てる。フラスコに栓をし、１５分間水浴中でそれらを平衡状態にお く。

３．０時点で、ＩＲＱの酵素溶液を平衡基質中にピペットで移し入れる。ストッ プウォッチのナンバー１を始動させ、溶液を徹底的に混合する。直ちに１０５Ｑ の反応混合物を粘度計の広いアーム中にピペットで移し入れる。

４、約２分後、粘度計の狭いアームと連結したゴム管の付いた吸引装置を適用し 、上部マークの上の反応混合物を駆動流体ヘッドに引き込む。反応混合物が上部 マークを通り過ぎて自由に流れ落ちるのを静観することにより、流出時間を測定 する。反応混合物のメニスカスが上部マークを通り過ぎると、ストップウォッチ のナンバー２間（分ＸＴｒ）を記録する。反応混合物のメニスカスが下部マーク ラ通り過ぎると、ストップウォッチのナンバー２による時間（秒ＸＴｔ）を５２ 録する。

５、直ちに上部マークの上の反応混合物を駆動流体ヘッドに再び引き込む。反応 混合物のメニスカスが自由な状態で上部マークを通り過ぎると、再びストップウ ォッチのナンバー２を始動させる。同時にストップウォッチのナンバー１による 反応時間（分ＸＴｒ）を記録する。反応混合物のメニスカスが下部マークを通り 過ぎると、ストップウォッチのナンバー２による時間（秒）（Ｔ　ｔ）を記録す る。

６．１５分以内の反応時間（Ｔｒ）にわたって４つの測定値の合計が得られるま で工程５を反復する。

７、ピペットで１ｘＱの蒸留水を２４ｒｓＱの緩衝基質中に移し入れることによ り基質ブランクを調製する。１ＯｘＱの反応混合物を粘度計の広いアームにピペ ットで移し入れる。メニスカスが２つのマークの間を下がるのに必要な時間（秒 ＸＴｓ）を測定する。（Ｔ　ｓ）については５つの測定値の平均を用いる。

’８．１ＯｘＱの平衡蒸留水を粘度計の広いアームにピペットで移し入れること により水ブランクを調製する。メニスカスが２つのマークの間を下がるのに必要 な時間（秒ＸＴＷ）を測定する。（Ｔｗ）については５つの測定値の平均を用い る。

計算法： ｌセルラーゼ単位（ＣＯ）とは、検定条件下で規定のカルボキシメチルセルロー ス基質において５分で１の相対液性変化を生じさ仕る活性の単位である。

４つの流出時間（Ｔ　ｔ）および反応時間（Ｔｒ）の各々について相対液性（Ｆ ｒ）および（ＴＭ）値を下記の要領で計算する。

Ｆｒ−（Ｔｓ−ＴｖＸＴｔ−Ｔｖ） Ｔｍ＝　１／２（Ｔｔ／６０秒／分）＋Ｔｒ＝（’ｌ／１２０）＋Ｔｒ式中、 Ｆｒ＝各反応時間における相対液性 Ｔｓ＝基質ブランクに関する平均流出時間（秒）Ｔｗ−水ブランクに関する平均 流出時間（秒）Ｔｔ＝反応混合物の流出時間（秒） Ｔｒ＝Ｏ時点からの経過時間（分）、すなわち、流出時間（Ｔｔ）の測定開始時 までの緩衝基質に酵素溶液を加えていた時間ＴＭ＝反応時間（分ＸＴｒ）に、分 に換算した流出時間（Ｔ　ｔ）の２分の１を加えた時間。

横軸としての４つの反応時間（ＴＮ）に対して縦軸としての４つの相対液性（Ｆ ｒ）をプロットする。直線が得られる筈である。この線の勾配は１公告たりの相 対液性変化に対応し、酵素濃度に比例している。一連の実験点を通る最良の線の 勾配は、単−相対液性値の場合よりも優れた酵素活性基準である。このグラフか ら１０および５分におけるＦｒ値を測定する。それらは、０．２２以内で０．１ ８以上の液性差を有するべきである。下記の要領で未知の酵素活性を計Ｆｒ５＝ 反応時間５分における相対液性Ｆｒ＋ｏ＝反応時間１０分における相対液性１０ ００＝１グラムに対するミリグラム数Ｗ＝１ｘＱアリコートの酵素溶液において 反応混合物に加えられた酵素の重量（ミリグラム）。

請求の範囲 補正書の写しくｖＡ訳文）提出書 （特許法第１８４条の７第１項） １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＡＵ８７１００２６９ ２、発明の名称 動物成長促進剤 ３、特許出願人 住所　オーストラリア連邦３１７８、ビクトリア州、ロウビル、ブリッジウォー ター・ウェイ′２番 氏名　インク、トーマス・コ・サイ 住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号ツイン２１ＭＩＤタ ワー内　電話（０６）９４９−１２６１１９８８年２月３日 ６、添付書類の目録 マーを構成成分としている、請求項２記載の成長促進剤。

（Ｉ　Ｘｉ）　蛋白質消化酵素 （ｉｉ）炭水化物消化酵素 （ｉｉｉ）脂肪消化酵素、および （ｉｖ）繊維消化酵素 から選ばれる１種またはそれ以上の固定化酵素を構成成分とするコアを有する微 粒から成る成長促進剤であって、前記コアが水溶性フィルム内に封入され、アル カリ可溶性酸不溶性ポリマー、またはその構造が腸液により可溶化され得る脂肪 酸もしくは他の材料のウィンドーにより置換されているか、もしくはそれらを含 んでいる高分子量ポリマーを含む腸溶性コーティングにより被覆されている成長 促進剤。

（２）コアがゲル様マトリックス内に固定された酵素（複数も可）を特徴する請 求項！記載の成長促進剤。

（３）ゲル・マトリックスが、ｋ−カラゲーニン、ゼラチン、アルギネート、セ ルロースもしくはその誘導体、またはゲル形成合成ポリ（４）微粒が、２５ない し５００μｌのサイズを有している、請求項１〜３のいずれか１項記載の成長促 進剤。

（５）か粒が５０ないし３５０μＲのサイズを有している、請求項４記載の成長 促進剤。

（６）脂肪酸のフィルムがＣＩｔ−１４脂肪酸を含む、請求項！記載の成長促進 剤。

（７）水溶性フィルムがゼラチンである請求項１記載の成長促進剤。

（８）アルカリ可溶性酸不溶性ポリマーがセルロースアセテートフタレートであ る、請求項１記載の成長促進剤。

（９）高分子量ポリマーがブチルメタクリレートである請求項１記載の成長促進 剤。

（ｌＯ）成長促進剤１キログラム当たり、２Ｘ１０３〜２Ｘ１０７プロテア一ゼ 単位４、ｌＸｌ０’　〜４．３ｘｌＯ’７ミーｙ−ゼ単位０．５〜５ＸＩＯ３リ パーゼ単位 ２ＸＩＯ”〜２ＸＩＱ’セルラーゼ単位を特徴する請求項１〜９のいずれが１項 記載の成長促進剤。

（１１）請求項１−１０のいずれか１項記載の成長促進剤の成長促進量の投与を 含む動物の成長増進方法。

（１２）成長促進剤が動物飼料と混合した形で動物に投与される、請求項１１記 載の方法。

（１３）医薬的または獣医学的に許容し得る担体まには賦形剤と組み合わせた請 求項１−１０のいずれが１項記載の成長促進剤。

（１４）請求項１３記載の成長促進組成物の投与を含む動物の成長増進方法。

（Ｉ５）請求項１〜１０のいずれか１項記載の成長促進剤を混入させた動物飼料 。

（１６）請求項Ｉ３記載の成長促進組成物を混入させた動物飼料。

（１７Ｘａ）コア内に （ｉ）　蛋白質消化醇索、 （ｉ　ｉ）脂肪消化酵素、 （ｉｉｉ）繊維消化酵素、 （ｉｖ）炭水化物消化酵素 【　から選ばれる１種またはそれ以上の酵素を固定化し、（ｂ）固定された酵素 を微粒状にし、 （Ｃ）水溶性機緘的バリアにより微粒を封入し、（ｄ）工程（ｃ）の微粒をアル カリ可溶性酸不溶性ポリマー、またはその構造が腸液により可溶化され得る脂肪 酸もしくは他の材料のウィンドー７こより置換されているか、もしくはそれらを 含んでいる高分子量ポリマーを含む腸溶性コーティングにより被覆する工程から 成る動物成長促進剤の製造方法。

（１８）酵素がゲル様材料内に固定されている請求項１７記載の方法。

（１９）微粒が、工程（ｃ）の水溶性機緘的バリアおよび工程（ｄ）のコーティ ングによりスプレー・コーティングされている、請求項１７記載の方法。

組成物、動物の成長促進方法または動物成長促進剤の製造方法。

国際調査報告 ｔ’ｓ　３Ｂ０３３０４　Ｆ’Ｒ２０８７９３０ＦＲ２４１９７２２ＥＳ　４フ ７３５４　ｒｒ　１１１５５９６ｕｓ　４４４７４１２　ＣＡ　１２１３５４３ ２３＝１９５７２

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ｉ） 蛋白質消化酵素 （ｉｉ）炭水化物消化酵素 （ｉｉｉ）脂肪消化酵素、および （ｉｖ）繊維消化酵素 から選ばれる１種またはそれ以上の酵素の固定形態を構成成分とするコアを有す る微粒から成る成長促進剤であって、前記コアが水溶性フィルム内に封入され、 アルカリ可溶性酸不溶性ポリマー、またはその構造が腸液により可溶化され得る 脂肪酸もしくは他の材料のウインドーにより置換されているか、もしくはそれら を含んでいる高分子量ポリマーを含む腸溶性コーティングにより被覆されている 成長促進剤。
2. （２）コアがゲル様マトリックス内に固定された酵素（複数も可）を包含する、 請求項１記載の成長促進剤。
3. （３）ゲル・マトリックスが、ｋ−カラゲーニン、ゼラチン、アルギネート、セ ルロースもしくはその誘導体、またはゲル形成合成ポリマーを構成成分としてい る、請求項２記載の成長促進剤。
4. （４）微粒が、２５ないし５００μｍのサイズを有している、請求項１〜３のい ずれか１項記載の成長促進剤。
5. （５）か粒が５０ないし３５０μｍのサイズを有している、請求項４記載の成長 促進剤。
6. （６）脂肪酸のフィルムがＣ１２−２４脂肪酸を含む、請求項１記載の成長促進 剤。
7. （７）水溶性フィルムがゼラチンである請求項１記載の成長促進剤。
8. （８）アルカリ可溶性酸不溶性ポリマーがセルロースアセテートフタレートであ る、請求項１記載の成長促進剤。
9. （９）高分子量ポリマーがブチルメタクリレートである請求項１記載の成長促進 剤。
10. （１０）成長促進剤１キログラム当たり、２×１０３〜２×１０７プロテアーゼ 単位４．１×１０４〜４．３×１０６アミラーゼ単位０．５〜５×１０３リパー ゼ単位 ２×１０２〜２×１０６セルラーゼ単位を含有する、請求項１〜９のいずれか１ 項記載の成長促進剤。
11. （１１）請求項１〜１０のいずれか１項記載の成長促進剤の成長促進量の投与を 含む動物の成長増進方法。
12. （１２）成長促進剤が動物飼料と混合した形で動物に投与される、請求項１１記 載の方法。
13. （１３）医薬的または獣医学的に許容し得る担体または賦形剤と組み合わせた請 求項１〜１０のいずれか１項記載の成長促進剤。
14. （１４）請求項１３記載の成長促進組成物の投与を含む動物の成長増進方法。
15. （１５）請求項１〜１０のいずれか１項記載の成長促進剤を混入させた動物飼料 。
16. （１６）請求項１３記載の成長促進組成物を混入させた動物飼料。
17. （１７）（ａ）コア内に （ｉ）蛋白質消化酵素、 （ｉｉ）脂肪消化酵素、 （ｉｉｉ）繊維消化酵素、 （ｉｖ）炭水化物消化酵素 から選ばれる１種またはそれ以上の酵素を固定化し、（ｂ）固定された酵素を徴 粒状にし、 （ｃ）水溶性機械的バリアにより微粒を封入し、（ｄ）工程（ｃ）の微粒をアル カリ可溶性酸不溶性ポリマー、またはその構造が腸液により可溶化され得る脂肪 酸もしくは他の材料のウインドーにより置換されているか、もしくはそれらを含 んでいる高分子量ポリマーを含む腸溶性コーティングにより被覆する工程から成 る動物成長促進剤の製造方法。
18. （１８）酵素がゲル様材料内に固定されている請求項１７記載の方法。
19. （１９）微粒が、工程（ｃ）の水溶性機械的バリアおよび工程（ｄ）のコーティ ングによりスプレー・コーティングされている、請求項１７記載の方法。
20. （２０）実質的にこの明細書において前述された成長促進剤、成長促進組成物、 動物の成長促進方法または動物成長促進剤の製造方法。