NL7908326A - Geimmobiliseerd enzym, werkwijzen ter bereiding daarvan en een werkwijze voor het uitvoeren van een enzymatische reactie. - Google Patents

Description

é N.0.28.483

Geïmmobiliseerd enzym, werkwijzen ter bereiding daarvan en een werkwijze voor het uitvoeren van een enzymatische reactie.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een geïmmobiliseerd enzym, op werkwijzen ter bereiding daarvan en op een werkwijze voor het uitvoeren van een enzymatische reactie onder toepassing van het geïmmobiliseerde enzym volgens de uitvinding.

5 Er is reeds voorgesteld enzymen met een drager te combineren, welke drager in het milieu, waarin het enzym moet worden toegepast, onoplosbaar is. Het doel van het immobiliseren van enzymen is een enzymprodukt te verkrijgen, dat gemakkelijk uit het reactiemedium kan worden afgescheiden en opnieuw als biochemische katalysator 10 kan worden gebruikt. Er zijn verschillende zowel chemische als fysische methoden bekend voor het binden van een enzym aan een onoplosbare drager. Zo kan men het enzym door middel van covalente chemische bindingen aan een drager binden. De drager bevat dan actieve groepen, die eventueel afzonderlijk worden ingevoerd, welke 15 actieve groepen met een of meer actieve groepen van het enzym reageren. Als actieve dragermaterialen zijn geactiveerde polysaccha-riden, synthetische polymeren en geactiveerde anorganische dragers voorgesteld. Ook is bekend, dat men een enzym via een bifunctioneel verknopingsmiddel met een drager kan koppelen. Als bifunctioneel 20 verknopingsmiddel is bijvoorbeeld glutaaraldehyde bekend. Tan de fysische methoden voor het binden van een enzym aan een drager kunnen het binden aan een ionen-uitwisselende hars, het insluiten in microcapsules, het insluiten in vezels van synthetische polymeren en het insluiten in natuurlijke of synthetische gelen worden 25 genoemd.

Wanneer de geïmmobiliseerde enzymen moeten worden toegepast voor de bereiding van een eetbaar produkt, zijn immobiliserings-methoden, waarbij een chemisch verknopingsmiddel en/of synthetische polymeren worden toegepast, meestal minder gewenst, omdat chemische 30 verknopingsmiddelen, alsmede de chemicaliën, die bij de bereiding van de synthetische polymeren worden gebruikt, niet geheel onschadelijk kunnen zijn. De uitvinding voorziet nu in een geïmmobiliseerd enzym, waarvan de bestanddelen geen enkel gevaar voor mens of dier opleveren.

35 Men heeft reeds voorgesteld een enzym te immobiliseren door het in een zetmeelgel in te sluiten. Dit voorstel is beschreven 7908326 κ 2 ν in het Amerikaanse octrooischrift 3*223.593· Hiertoe "bereidt men uit 3>25 g van een bepaalde zetmeelsoort (connaught starch) en 25 ml gedestilleerd water door verwarmen een helder, viskeus sol. Het afgekoelde sol wordt gemengd met een oplossing van paardeserum-5 cholinesterase, waarna men het geheel laat geleren. Blijkens een .publicatie in Anal. Chem. 22. (1965), blz. 1378-1381 heeft het gel slechts een geringe mechanische sterkte, waarom in dit artikel wordt voorgesteld het gel op te nemen in een spons van polyurethan-schuim met open poriën. Ook blijkt de binding van het enzym aan het 10 gel te wensen over te laten, want ongeveer 15 % van het enzym wordt gemakkelijk uitgewassen.

In het Amerikaanse octrooischrift 4*106.987 is voorgesteld aan microbiële cellen gebonden glucose-isomerase te immobiliseren in een natuurlijke, in water onoplosbare, gel-vormende stof. Onder 15 de toepasbare gelvormende stoffen is ook zetmeel genoemd.

Yerrassenderwijze is gebleken, dat ook celvrije enzymen uitstekend in een zetmeelgel geïmmobiliseerd kunnen worden. De uitvinding betreft daarom een geïmmobiliseerd enzym bestaande uit vorm-stukken van een gedroogd zetmeelgel waarin één of meer celvrije 20 enzymen zijn ingesloten.

Bij voorkeur bevindt het geïmmobiliseerde enzym volgens de uitvinding zich in de vorm van korrels. Het produkt heeft een verrassend goede mechanische sterkte. Het enzymgehalte kan op iedere gewenste waarde worden ingesteld, mits het zetmeelgel het enzym kan 25 vasthouden. In het algemeen bedraagt de hoeveelheid enzym, die in het zetmeelgel kan worden opgenomen en door het gel kan worden vastgehouden ten hoogste 15 %, berekend op het gewicht van het zetmeel.

De uitvinding betreft ook een werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzym, waarbij men een of meer enzymen opneemt in 30 een zetmeelgel. De werkwijze is hierdoor gekenmerkt, dat men een ten hoogste gedeeltelijk gegeleerd zetmeelsol met een zetmeelgehalte van 20-60 gew.% met het enzym vermengt, het mengsel laat geleren en in de vorm van gedroogde vormstukken brengt.

In de praktijk wordt eerst een zetmeelsol bereid door het zet-35 meel met het water bij verhoogde temperatuur te kneden. Het sol wordt daarna afgekoeld tot een temperatuur, waarbij het (de) toe te voegen enzym(en) niet ontleden, waarna het sol, dat ten hoogste gedeeltelijk gegeleerd mag zijn, onmiddellijk met het enzym wordt gemengd. Het verkregen mengsel laat men dan geleren. Het is gewenst, 40 het mengen met het enzym bij een zo hoog mogelijke temperatuur uit 790 83 26 * 3 4 te voeren om een voortijdige geleding van het mengsel te voorkomen.

Een bijzonder gunstige methode, waarmee het gegeleerde, enzym bevattende mengsel in de vorm van gedroogde vormstukken kan worden gebracht, bestaat hieruit, dat men het mengsel tot strengen extru-5 deert, de strengen droogt en daarna verkleint. Hierdoor ontstaat een korrelvormig produkt, dat een grote mechanische sterkte bezit.

Deze eigenschap blijft behouden, wanneer het produkt in aanraking wordt gebracht met een waterige vloeistof.

Het drogen kan aan de lucht of onder verlaagde druk plaats-10 vinden. Men kan bij verhoogde temperatuur werken, maar de temperatuur mag niet zo hoog zijn, dat desactivering van het enzym optreedt. In het algemeen kan men het drogen bij temperaturen beneden 30°C veilig uitvoeren.

Hoewel als zetmeel, dat in de onderhavige geïmmobiliseerde 15 enzymprodukten wordt verwerkt, elke natuurlijke zetmeelsoort geschikt is, zoals mais-, tarwe-, rogge-, tapioca-, cassave-, rijst-, aardappel- of boekweit-zetmeel, of uit peulvruchten te verkrijgen zetmeelsoorten, kunnen ook uit die zetmeelsoorten af te scheiden zuivere zetmeelfracties, zoals amylopectine (de vertakte zetmeel-20 fractie) worden toegepast. Ook kunnen zetmeelderivaten worden toegepast, waarvan een sol met een gehalte van 20-60 gev.% kan worden bereid, dat bij de hoogste temperatuur, waarbij het met een enzym kan worden gemengd (de ontledingstemperatuur van het enzym), niet in korte tijd volledig geleert. Bij voorkeur is het zetmeel aard-25 appelzetmeel of daaruit verkregen amylopectine, of ook maïszetmeel.

De uitvinding kan worden toegepast voor het immobiliseren van allerlei enzymen, zoals lactase, invertase, catalase, glucose- oxydase, fosfoglucose-isomerase, aminoacylase, orthofosforzuur mono- esterfosfohydrolase en dergelijke. Bijzonder goede resultaten zijn invertase 30 verkregen met lactase, catalase,*glucose-oxydase en een combinatie van catalase en glucose-oxydase.

Yoorts werd verrassenderwijs gevonden, dat het volgens de uitvinding in een zetmeelgel ingesloten enzym zeer gemakkelijk kan worden gezuiverd, wanneer men het geïmmobiliseerde enzym extraheert 35 met water of een zoutoplossing, bijvoorbeeld een bufferoplossing.

Daartoe kan men de granules van het geïmmobiliseerde enzym in de extractievloeistof suspenderen en de suspensie door matig roeren in beweging houden. Het geïmmobiliseerde enzym kan dan worden afgezogen en de bewerking kan zonodig nog enige malen worden herhaald.

40 Als extractievloeistof is een 0,02 M kaliumfosfaatbuffer van pH J,0 790 83 26

V

* 4 bijzonder geschikt. Het is gebleken, dat door deze extractiebewer-king een groot deel, in het geval van lactase wel 75 van het oorspronkelijke stikstofgehalte, dat in het geïmmobiliseerde enzym aanwezig was, kan worden verwijderd, zonder dat de enzymactiviteit 5 achteruitgaat. Bit was bijvoorbeeld het geval met een in de handel zijnd enzympreparaat, dat uit Saccharomyces lactis is verkregen.

; Beze mogelijkheid, het enzympreparaat' op eenvoudige wijze te zuiveren, is uitermate belangrijk, daar men volgens de uitvinding kan uitgaan van betrekkelijk onzuivere enzymen, waarvan de kostprijs 10 zeer veel lager is dan van gezuiverde enzymen.

Be geïmmobiliseerde enzymen volgens de uitvinding zijn uitermate goed geschikt voor het uitvoeren van enzymatische omzettingen en de toepassing van de geïmmobiliseerde enzymen volgens de uitvinding respectievelijk van een volgens de uitvinding bereid geïmmobi-15 liseerd enzym behoort derhalve eveneens tot de uitvinding.

Een belangrijke toepassing van één der geïmmobiliseerde enzymen volgens de uitvinding, namelijk van geïmmobiliseerde lactase, ligt in het behandelen van melk met een normaal of verlaagd vetgehalte en van melkwei teneinde de daarin aanwezige lactose om te 20 zetten in een mengsel van glucose en galactose. Yooral voor door de mens of dier te consumeren produkten is het ongewenst het enzym · in oplosbare vorm toe te voegen, daar het enzym dan in het produkt achterblijft. Zoals boven reeds is aangeduid, zijn bij de veelal toegepaste enzymimmobilisatietechnieken chemische, in het algemeen 25 toxische hulpstoffen, bijvoorbeeld bifunctionele reagentia, zoals dialdehyden, carbodiïmide, epoxyverbindingen en dergelijke noodzakelijk (Amerikaans octrooischrift 5*858.007). Anderzijds blijven in het geval van de door polymerisatie in situ fysisch-mechanisch in gelen, bijvoorbeeld polyacrylamidegel (Biotechnical and Bio-50 Engineering IJ), 595-402 (1975)) ingesloten enzympreparaten verontreinigd door resten van de bij de polymerisatie noodzakelijke chemische katalysatoren, zoals radicaal-inititatoren en anderen laag-moleculaire en eveneens toxische reactieversnellers. Bergelijke nadelen bezitten de geïmmobiliseerde lactaseprodukten volgens de uit-55 vinding niet, want deze zijn slechts uit onschadelijke produkten opgebouwd.

Een ander voordeel van de geïmmobiliseerde lactase volgens de uitvinding is, dat de effectiviteit ervan bij gebruik nauwelijks achteruitgaat. Met alle®is het enzym zeer sterk aan het zetmeel 40 gebonden, doch men kan de hydrolyse van lactose ook zodanig uit- 790 3 3 26

V

5 voeren, dat het geïmmobiliseerde enzym niet wordt verontreinigd door verstopping van de poriën door afzetting van melkproteïnen en andere melkbestanddelen op de dragerdeeltjes. Dit nadeel treedt bij de bekende geïmmobiliserde enzymen wel op (Chemical Week, 5 14 november 1977» blz. 37 - 38). Er is namelijk gebleken, dat men de deeltjes uiterst geleidelijk kan laten afslijten, zonder dat de deeltjes desintegreren. Hierdoor wordt het oppervlak van de deeltjes verschoond, waardoor een mogelijk door vervuiling optredende extra diffusieweerstand wordt vermeden. Een dergelijk, zeer lang-10 zaam slijtageproces kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd door de inhoud van een reactor, waarin zich het mengsel van enzymkatalysata?-deeltjes en substraat (lactose bevattende vloeistof) bevindt, te roeren of door de enzymkatalysatordeeltjes door een opwaartse vloeistof stroom in gefluïdiseerde toestand te houden. Door regeling van 15 de ingebrachte roer- respectievelijk fluïdisatie-energie kan de gewenste mate van slijtage gemakkelijk worden verkregen en de afzetting van melkeiwitten of andere vervuilende neerslagen op efficiënte wijze worden voorkomen.

Invertase of β-fructosidase is een enzym dat door bepaalde 20 stammen van Saccharomyces cerevisiae kan worden geproduceerd.

Het enzym kan' worden toegepast voor de bereiding van fructose uit saccharose en/of maltose. In de geïmmobiliseerde vorm volgens de uitvinding blijkt ook invertase zeer sterk aan het zetmeelgel te zijn gebonden. Na bewaren gedurende 40 dagen in de koelkast in een 25 buffer pH 5»2 is de invertase-activiteit niet verminderd. Het geïmmobiliseerde enzym kan ook bij hogere temperatuur, bijvoorbeeld 40°C voor de saccharose-inversie worden toegepast, zonder dat dit de activiteit nadelig beïnvloedt. Dij die hogere temperatuur verloopt de inversiereactie aanmerkelijk sneller. Wanneer bij de berei-30 ding van de geïmmobiliseerde invertase uitgegaan is van een onzuiver enzympreparaat, kan uit het geïmmobiliseerde enzym een aanmerkelijke hoeveelheid verontreinigingen worden uitgewassen, zonder dat de invertase-activiteit vermindert.

Catalase kan uit runderlever worden geïsoleerd en kan worden 35 gebruikt voor het verwijderen van waterstofperoxide, dat als desinfectans is gebruikt. Waterstofperoxide voor desinfectiedoeleinden kan worden geproduceerd met behulp van een geïmmobiliseerde glucose-oxidase volgens de uitvinding, waarna de niet verbruikte hoeveelheid waterstofperoxide weer kan worden verwijderd met een volgens 40 de uitvinding geïmmobiliseerde catalase. Zowel catalase als glucose- 790 83 26 " 6 oxidase zijn zeer sterk aan het zetmeelgel gebonden.

Een bijzonder belangrijke toepassing van de onderhavige enzympreparaten ligt in de verwijdering van zuurstof uit glucose bevattende vloeistoffen, zoals bier en andere dranken. De aanwezig-5 heid van zuurstof in bier is ongewenst, omdat hierdoor een ongunstige verandering in de smaak kan optreden. Voor de verwijdering van zuurstof uit glucose bevattende dranken kan men met succes een geïmmobiliseerd enzym volgens de uitvinding toepassen, dat zowel catalase als glucose-oxidase bevat. Ook kan hiermee gluconzuur uit 10 glucose worden geproduceerd, door zuurstof toe te voeren.

De volgende voorbeelden dienen ter illustratie van de uitvinding.

Voorbeeld I

In een dubbelwandige trog van een met sigma-vormige kneed-15 organen voorziene, in roestvaststaal uitgevoerde laboratorium- kneedmachine van het fabrikaat Wemer-Pf leider er worden 80 g luchtdroog natief aardappelzetmeel (vochtgehalte 17 gew.%) en 100 g 0,02 M kaliumfosfaatbuffer van pH 7,0 gebracht. Onder voortdurend kneden wordt de inhoud van de kneder door verhitting met kokend 20 water via de dubbele wand op 96°C gebracht. Het kneden wordt bij die temperatuur nog gedurende 1 uur voortgezet.' Vervolgens wordt in ongeveer 50 minuten afgekoeld tot 27°C, waarna een oplossing van 5>5 g van een uit Saccharomyces lactis verkregen lactaseprepa-raat in 16,5 g 0,02 M kaliumfosfaatbuffer van pH 7,0 wordt toege-25 voegd. Het geheel wordt gedurende 1 uur gekneed bij kamertemperatuur, waarna de inhoud van de kneder wordt overgebracht in een glazen vat, dat in gesloten toestand gedurende ongeveer 16 uren bij een temperatuur van 4°C wordt bewaard.

De volgende dag wordt met behulp van een roestvaststalen 50 extrusiemachine, die voorzien is van een gatenplaat met gaten van 1,0 mm doorsnede bij 20°C tot strengen geëxtrudeerd. Eetjverkregen extrudaat wordt vervolgens bij 25 - 28°0 gedurende 6 uren gedroogd in een droogstoof met luchtcirculatie tot een vochtgehalte van ongeveer 15 gew.^. Kortstondig malen in een slagmolen levert na uit-55 zeven een granulaat van cilindrische deeltjes met een diameter van 0,9 mm en een lengte tussen 0,4 en 1,2 mm. Het granulaat is lichtbruin van kleur en heeft een schimmelachtige geur.

Voorbeeld II

Op dezelfde wijze als in voorbeeld I is beschreven wordt een 40 mengsel van 110 g luchtdroog amylopectine (vochtgehalte \ ongeveer 790 83 26 v 7 11 gew.%) en 110 g 0,02 M kaliumfosfaatbuffer van pH J,Q bij 85 - 90°C gedurende 60 minuten gekneed. Na afkoelen tot 50°C wordt een oplossing van 5,0 g luchtdroog lactasepreparaat verkregen uit Saceharomyces lactis (vochtgehalte ongeveer 11 gew.%) in 25>0 g 5 0,02 M fosfaatbuffer (pH = 7,0) toegevoerd. Het mengsel wordt dan nog gedurende 1 uur bij 25° gekneed en daarna gedurende 16 uren bij 4°0 aan zichzelf overgelaten.

Hoor extrusie, drogen, malen en zeven op de in voorbeeld I beschreven wijze verkrijgt men een soortgelijk granulaat als in 10 voorbeeld I·

Voorbeeld III

Op dezelfde wijze als in voorbeeld I is beschreven, wordt een mengsel van 97 S luchtdroog aardappelzetmeel (vochtgehalte 17,2 gew.%) en 78 g 0,02 M kaliumfosfaatbuffer (pH = 7,0) onder 15 verwarming gekneed. Na het bereiken van een temperatuur van $6°G wordt nog gedurende 1 uur bij 96°C doorgekneed. Vervolgens wordt in ongeveer 30 minuten afgekoeld tot 28°C, waarna een oplossing van 4,0 g luchtdroge lactase uit Saceharomyces lactis (vochtgehalte ongeveer 8,5 gew.%) in 25,0 g 0,02 M kaliumfosfaatbuffer pH 7,0 aan 20 de troginhoud wordt toegevoegd. Het mengsel wordt dan nog gedurende 1 uur bij 28 - 22°C gekneed en daarna gedurende 16 uren in een afgesloten glazen vat bij 4°C bewaard.

Hoor extrusie, drogen, malen en zeven op de in voorbeeld I beschreven wijze verkrijgt men een soortgelijk granulaat als in 25 voorbeeld I.

Voorbeeld IV

Zuivering van de enzymkatalysator uit voorbeeld II

In een gesloten, van een roerder voorziene glazen reactievat wordt 100 g van de volgens voorbeeld II verkregen enzymkatalysator-30 granules en 800 g 0,02 M kaliumfosfaatbuffer in dubbelgedestilleerd water van pH 7,0 gedurende 7 uren onder matig roeren in beweging gehouden. Vervolgens wordt het roeren gestopt, de bovenstaande wasvloeistof afgezogen, waarna de bovenbeschreven behandeling nog tweemaal met verse porties è 800 g van de wasvloeistof wordt herhaald.

35 Het aldus verkregen, met gebufferd water verzadigde granulaat is direkt geschikt Tcor hydrolytische splitsing van lactose in waterige systemen. In gezwollen zowel als in droge toestand is dit materiaal een kleurloos smaak- en reukloos produkt.

In de droge toestand (ongeveer 11 - 13 % vochtgehalte) blijkt 40 het produkt bij een temperatuur van ongeveer 4°C ten minste drie maanden onveranderd houdbaar. He specifieke activiteit blijft gedu- 790 83 26 * 8 rende de ‘bewaarperiode gelijk aan de aanvankelijke waarde van het vers bereide preparaat.

Voorbeeld 7

Hydrolyse van lactose door middel van de voorgewassen gezwollen 5 enzymkatalysatorgranules van voorbeeld 17.

Substraat: een oplossing van chemisch zuiver lactose-monohydraat in 0,02 M kaliumfosfaatbuffer in dubbel-gedestilleerd water van pH 7,0, die tevens 2,0 mM magnesiumsulfaat per liter bevat. Deze oplossing bevat per 100 ml 5»28 g lactose, 10 berekend op het anhydrische produkt.

In een geroerde glazen reactor worden tezamen gevoegd : 1800 g van de substraatvloeistof 300 g van het gezwollen katalysatorgranulaat (dit bevat slechts 100 g luchtdroog katalysator-15 materiaal, waarin 5,0 8 van het luchtdroge enzym- preparaat zijn opgenomen).

De lactose-concentratie daalt door toevoegen van de katalysator tot 4,75 S anhydrische lactose per 100 ml. Onder voortdurend, doch matig snel roeren wordt bij 25°C de afname van het lactosegehalte in de 20 tijd door een geautomatiseerde oxydimetrische analyse gevolgd.

In tabel A is over een totale reactietijd van 60 minuten een aantal waarnemingsresultaten samengevat.

Tabel A

Hydrolyse van lactose in water onder invloed van β-galactosidase 25 (lactase in een amylouectinegel._ 7erstreken tijd Omgezette lactose in % van oorspronkelijk in minuten_ aanwezige lactose_____________________________ 0 0 10 23 30 30 58 60 82

Ha 1 uur hydrolyseren is een voor toepassing in de zuivelindustrie voldoende laag lactose-gehalte bereikt en wordt de omge-35 zette substraatvloeistof van de katalysatormassa afgefiltreerd, de katalysator tweemaal met 100 ml-porties van met kaliumfosfaat op pH = 7,0 gebufferd dubbelgedestilleerd water gewassen en na afzuigen van het laatste waswater opnieuw met 1800 g verse lactose-oplossing gemengd.

40 Deze bewerkingen werden 20 maal herhaald waarbij werd vast- 790 83 26 9 gesteld, dat de in tabel A gegeven hydrolyse-resultaten praktisch ongewijzigd blijven, ook bij de twintigste herhaling.

Na de twintigste herhaling werd de katalysator gewassen en tot constant gewicht gedroogd, waarbij door weging werd vastgesteld 5 dat door mechanische "slijtage" respectievelijk "oplossen" een gewichtsvermindering van 6 % ten opzichte van het oorspronkelijk in bewerking genomen katalysatorgewicht had plaatsgevonden. Voorbeeld TI

Op dezelfde wijze als in voorbeeld T is beschreven werden met 10 behulp van het volgens voorbeeld I verkregen enzym-granulaat hydro-lyseproeven uitgevoerd. Men gebruikte daarbij 2,0 g luchtdroog enzymgranulaat volgens voorbeeld I per 40,0 g 4,75-P^ocents waterige lactose-oplossing bij pH = 7>0 en een temperatuur van 25,0°C. Na iedere proef werd de katalysatormassa afgefiltreerd, de 15 katalysator op dezelfde wijze gewassen als in voorbeeld T en daarna opnieuw voor de volgende proef gebruikt. In de volgende tabel B zijn de resultaten vermeld.

Tabel B

Proef _Hvdrolysegraad_ 20 nr* % gesplitste lactose % gesplitste lactose _na 10 minuten_na 50 minuten·_ 1 20 48 2 — 57 5 25 60 25 4 29 60 5 29 59 6 7 — 58 8 26 58 30 9 27 58 10 26,5 58

Na de tiende proef werd het enzymgranulaat afgescheiden en weer in aanraking gebracht met 40,0 g van de 4>75“P2ocents lactose-55 oplossing. Men liet het geheel 12 maal 24 uren staan. Na die tijd bleek het enzymgranulaat nog dezelfde activiteit te bezitten als bij proef 10 werd gevonden.

Voorbeeld YII

Op dezelfde wijze als in voorbeeld V is beschreven, werden 40 met het volgens voorbeeld III verkregen enzymgranulaat hydrolyse- 790 83 26 ’ 1° proeven uitgevoerd. Men gebruikte daarbij 4,0 g luchtdroog enzym-granulaat volgens voorbeeld III, dat onder matig snel roeren gesuspendeerd werd in 80,0 g van een 4,75-P^ocents oplossing van lactose in 0,02 M kaliumfosfaatbuffer pH 7,0.

5 Na 10, 30 en 60 minuten contacttijd bij een temperatuur van 25°C werd door middel van een oxydimetrische, geautomatiseerde analyse de hoeveelheid gesplitste lactose bepaald. De omzettings-graad of hydrolysegraad werd uitgedrukt als percentage omgezette lactose. Na een inwerkingsduur van 1 uur werd de substraatvloeistof 10 door decanteren van de enzymgranules gescheiden.

De enzymgranules werden ia?volgens 2 maal gedurende ongeveer 15 minuten met porties van 70 g 0,02 M kaliumfosfaatbuffer van pH 7»0 gewassen en daarna opnieuw in verse lactose-oplossing gesuspendeerd. Vervolgens werden weer dezelfde metingen uitgevoerd.

15 Gedurende vijf op elkaar volgende dagen werden per dag 4 meet- series uitgevoerd. De resultaten zijn in tabel C samengevat.

Tabel 0

Hydrolyse van lactose in water onder invloed van lactose in een aardappelzetmeelgel._ 20 Reactie- Omzettingsgraad in % van oorspronkelijk aanwezige tijd in lactose na de n herhaling_ minuten n=o n=3 n=6 n=10 n=15 n=19 10 18,0 28,5 31,0 30,0 26,0 25,5 30 — 61,0 64,0 62,0 57,0 57,0 25 60 74,0 83,0 86,0 82,0 82,0 83,0

Na de twintigste bepaling werd de katalysator na wassen met de buffer tot constant gewicht gedroogd waarbij door weging werd vastgesteld dat ongeveer 4,2 % van het oorspronkelijke gewicht van 30 de granules door "slijtage" verloren was gegaan.

Voorbeeld 7111

Hydrolyse van lactose in gesteriliseerde magere melk bij 25°C. Substraat: bij hoge temperatuur gesteriliseerde melk merk "Lilac" (België); lactosegehalte: 4,8 8 Per 100 ml.

35 Proefopstelling, uitvoering en analyse waren geheel identiek aan die volgens voorbeeld V. Ook hier werd een serie herhalingen met hetzelfde uitgangsenzympreparaat uitgevoerd tot een totaal van twintig hydrolysen.

In tabel D zijn de resultaten samengevat.

790 83 26 11

Tabel D

Hydrolyse van lactose in magere melk bij 25°C, onder invloed van β-galactosidase ingesloten in een amylonectinegel._

Reactietijd Omzettingsgraad van lactoge in % van oorspronkelijk 5 in minuten aanwezige lactose na de n herhaling_ n=0 n=1 n=4 n=8 n=12 n=20 0 0 0 0 0 0 0 10 16,3 15,6 16,1 14,8 14,9 12,1 10 30 42-,.5 42,0 45,0 40,0 42,0 37,0 60 58,0 56,0 56,8 56,0 53,0 49,0 120 78,0 76,0 75,7 72,0 71,2 64,0

Voorbeeld IX

15 Bereiding van geïmmobiliseerde invertase.

Op dezelfde wijze als in voorbeeld I is beschreven werd een mengsel van 40,0 g luchtdroog amylopectine (vochtgehalte ongeveer 13 gew.%) met ongeveer 50 ml 0,02 M kaliumfosfaatbufferj pH 5,2, gedurende 1 uur bij 90°C gekneed en daarna tot ongeveer 40°C af-20 gekoeld. Tervolgens werd een oplossing van 0,8 g invertase in ongeveer 9 ml water toegevoegd. Het mengsel werd daarna onder voortgezette koeling tot 25°C nog gedurende 1 uur gekneed en vervolgens 16 uren in een koelkast (ongeveer 5°C) bewaard.

Hgt mengsel werd geextrudeerd op de in voorbeeld I beschre-25 ven wijze, met dit verschil dat een gatenplaat met boringen van 0,5 mm werd gebruikt. Het extrusieprodukt werd in een oven met luchtcirculatie bij 30°C gedroogd, daarna gemalen en gezeefd, waarbij een fractie met de gewenste deeltjesgrootte van ongeveer 0,3-0,6 mm werd geïsoleerd.

30 Voorbeeld X

Analoog aan de in voorbeeld V beschreven wijze werd de inver-tase-activiteit van de volgens voorbeeld IX bereide geïmmobiliseerde invertase gemeten. De ontstane hoeveelheid glucose en fructose werd door middel van een geautomatiseerde oxydimetrische analyse bepaald. 35 De metingen werden enige malen herhaald. Het enzympreparaat werd tussen de metingen bij 5°C bewaard in 0,02 M kaliumfosfaatbuffer, pH 5,2. Er werd zowel bij 25°C als bij 40°C een reeks proeven uitgevoerd. De resultaten zijn in tabel E weergegeven.

790 83 26 τ 12

Tabel Ε

Inversie van saccharose Enzympreparaat: volgens voorbeeld IX

Substraat: 5>4 gew.% saccharose in 0,02 M fosfaatbuffer, pH 5>2 5 Gewichtsverhouding enzympreparaat : substraat = 1 : 80

Bewaarperiode, Omzettingsgraad van saccharose in % van oor-voorafgaand aan spronkeli.jk aanwezige saccharose__

meting (dagen) reactie M.i 25°0 reactie bi.i iO°C

na 10 min na 30 min na 10 min na 20 min 10 1/4 27,0 62,0 45,0 75,0 1/2 30,0 62,0 50,0 80,0 2/3 28,0 - 50,0 75,0 1 26,0 59,0 47,0 72,0 2 25,5 60,0 15 40 28,0 61 ,0

Uit deze proeven blijkt, dat de geïmmobiliseerde invertase haar activiteit ook na langdurig gebruik behoudt en ook bij hogere temperatuur (40°C) bruikbaar is.

20 Voorbeeld XI

A. Bereiding van geïmmobiliseerde catalase

In een laboratoriummodel Wemer-Pfleiderer kneedmachine werden tezamen gebracht : 80 g luchtdroog amylopectine 25 90 g 0,05 M kaliumfosfaatbuffer van pH 5,6 en bij 90°C gedurende 1 uur gekneed.

Ha afkoelen tot 26°C werd aan de homogene massa toegevoegd : 30 g van een oplossing verkregen door 2.5 g catalase (Sigma C1Q met een activiteit van 3400 Sigma- 30 eenheden) op te lossen respectievelijk te dispergeren in 27.5 g 0,05 M kaliumfosfaatbuffer van pH 5,6.

Het kneden werd daarna gedurende 1 uur voortgezet. Hierna werd het preparaat bij 5°C gedurende 16 uren afgesloten bewaard en vervolgens na ex t rus ie tot strengen van 0,5 mm doorsnede in een 35 luchtstroom van 30°C gedurende 6 uren gedroogd en door malen tot een granulaat van cilindrische deeltjes die een doorsnede van 0,45 urn en een lengte van 0,3 - 0,6 mm bezaten, verkleind. Het luchtdroge produkt bevatte per milligram ongeveer 100 eenheden catalaseactiviteit.

790 8 3 26 13 B. Bepaling van activiteitsverliezen door wassen

Enzym-verliesbepaling via elektrometrische zuurstofbepaling van door inwerking der gebruikte wasvloeistof op 0,04 %-ige waterige waterstofperoxideoplossing vrijgemaakte zuurstof.

5 50 mg van het onder A verkregen enzymprodukt werden gedurende 15 minuten met 2,0 ml 0,7 M kaliumfosfaatbuffer pH 7,1 geschud.

Na decanteren werd de heldere wasvloeistof afgegoten en de daarin aanwezige catalase-activiteit gemeten door de wasvloeistof op een 0,04-procents waterstofperoxideoplossing bij 25,0°C te laten in-10 werken en de zuurstofproduktie met een zuurstofelektrode te bepalen. Deze procedure werd in totaal 15 maal uitgevoerd, waarbij steeds hetzelfde monster van 50 mg geïmmobiliseerde catalase werd gebruikt. Na 6 wassingen bleken in totaal 35>3 eenheden activiteit door uitwassen verloren te zijn gegaan, dat wil zeggen slechts 0,7 % van de 15 oorspronkelijk aanwezige caialase-acitiviteit. De na de 6e wassing optredende verliezen waren te verwaarlozen.

Voorbeeld XII

A. Bereiding van geïmmobiliseerde oatalase/gluoose-oxydase

In een labor at oriummo del Nemer Pfleiderer kneedmachine werden 20 tezamen gebracht : 79 g luchtdroog amylopectine 100 g 0,01 M fosfaatbuffer pH 5»6 en bij 90°C gedurende 1 uur gekneed.

Na afkoelen tot 36°C werd aan de homogene massa toegevoegd: 25 21 g van een oplossing die verkregen werd door 0,100 g glucose-oxydase (Boehringer Grade I; acitiviteit 200 ïï/mg) en 1,00 g catalase-oplossing (Boehringer nr. 106836; 260 000 ïï/ml) op te lossen in, respectievelijk te mengen met 20 g 0,01 M fosfaat-buffer pH = 5»6.

30 Onder voortgezette koeling werd het mengsel nog gedurende 1 uur gekneed waarbij een eindtemperatuur van 30° C werd bereikt.

Het verkregen mengsel werd gedurende 16 uren bij 6°G bewaard; vervolgens werd het verkregen gel tot strengen van 0,5 mm doorsnede geëxtrudeerd, de strengen gedurende 6 uren door een luchtstroom van 35 30°C gedroogd en tenslotte tot korrels van ongeveer 0,5 mm lengte gemalen.

B. Wasprocedure; enzym-verliesbepaling via aotiviteitsmeting der waswaters; homogene katalyse.

Van het luchtdroge (vochtgehalte ongeveer 10 gew.%), volgens 40 A bereide produkt met een glucose-oxydasegehalte van ongeveer 790 83 26 15 werd geregistreerd. Na bereiken van de verzadigings-concentratie aan luchtzuurstof werd het instrument op 100 % verzadiging ingesteld, waarna bij atmosferische druk stikstof werd doorgeleid tot de verzadigingswaarde tot 50 % was teruggebracht. De hoeveelheid 5 opgeloste zuurstof is dan ongeveer 0,14 millimol per liter of wel ongeveer 4j4 mg per liter.

Yia de capillair werd dan in het vat geïnjecteerd 0,5 ml waterige, zuurstofvrije, 32-procents glucoseoplossing, waarbij gelijktijdig 0,5 ml der bufferoplossing verdrongen werd (loopt uit 10 in de capillair). De zuurstofaf name die onmiddellijk aanving werd tegen de tijd geregistreerd op de aangesloten recorder. Zodra alle zuurstof was verbruikt, werd de glucoseoplossing uit het reactievat gedecanteerd, het enzympreparaat viermaal met 15 ml porties verse, glucose-vrije bufferoplossing gewassen en de proef herhaald. 15 In totaal werd deze procedure vijfmaal herhaald. Na 15 minu ten bleek nog ongeveer 20 % van de verzadigings-concentratie aan zuurstof aanwezig, terwijl na 30 minuten de oplossing praktisch zuurstofvrij was. Er was geen achteruitgang in activiteit te constateren.

20 Voorbeeld XIII

Zuurstofverwijdering uit bier

Volgens de in voorbeeld XII C beschreven methodiek werden 32 ml bier (Heineken’s oud bruin) waarvan het zuurstofgehalte op 6,5 mg per liter was gebracht, met 200 mg van het volgens voorbeeld 25 XII A verkregen enzymprodukt behandeld. Tabel G geeft een overzicht van de verkregen resultaten.

Tabel G

Zuurstofgehalte van bier na behandeling met geïmmobiliseerde glucose-oxydase /catalase bi.1 25°0 30 Minuten mg 02/l minuten mg 02/l 5 5,85 18 1,43 6 5,01 21 0,91 9 3,97 24 0,49 12 2,99 27 0,20 35 15 2,15 30 «ςΟ,ΙΟ TJit tabel G blijkt, dat na 24 minuten een zuurstofconcentratie is bereikt die voor bier acceptabel is terwijl na 30 minuten reeds een vrijwel zuurstofvrij,< 0,1 mg/l, bier resulteert.

790 83 26

- 16 Voorbeeld XIV

Gluconzuurvorming uit glucose

Inwerking van 400 mg van de volgens voorbeeld XII A verkregen geïmmobiliseerde enzymen op een waterige, 0,9-procents glucose-5 oplossing gebufferd met 0,005 M kaliumfosfaat bij pH 5»6 onder constant doorleiden van zuurstof bij atmosferische druk.

De produktie van gluconzuur bleek uit het verbruik van 0,1 1T natronloog dat via een automatisch doserende titratie-apparatuur onder constant houden van de pH door een recorder werd vastgelegd. 10 Per uur blijkt ongeveer 4 % van de oorspronkelijk aanwezige glucose te worden omgezet in de equivalente hoeveelheid gluconzuur.

7S0 8 3 26

Claims (16)

17

1. Geïmmobiliseerd enzym bestaande uit vormstukken van een gedroogd zetmeelgel waarin één of meer celvrije enzymen zijn ingesloten.

2. Geïmmobiliseerd enzym volgens conclusie 1 in de vorm van korrels.

3. Geïmmobiliseerd enzym volgens conclusie 1 of 2 met een enzymgehalte van ten hoogste 15 gew.%.

4. Geïmmobiliseerd enzym volgens conclusies 1-3» m e t 10 het kenmerk, dat het enzym lactase, invertase, catalase, glucose-oxydase of catalase en glucose-oxydase is.

5. Geïmmobiliseerd enzym volgens conclusies 1-4, met het kenmerk, dat het zetmeel aardappelzetmeel, amylopec-tine en/of maïszetmeel is.

6. Geïmmobiliseerd enzym volgens conclusies 1-5, m e t het kenmerk, dat het zetmeel amylopectine is.

7. Werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzym, waarbij men één of meer enzymen opneemt in een zetmeelgel, met het kenmerk, dat men een ten hoogste gedeeltelijk ge- 20 geleerd zetmeelsol met een zetmeelgehalte van 20-60 gew.% met het enzym vermengt, het mengsel laat geleren en in de vorm van gedroogde vormstukken brengt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat men het gegeleerde mengsel in de vorm van gedroogde 25 vormstukken brengt door het mengsel tot strengen te extruderen, de strengen te drogen en te verkleinen.

9. Werkwijze volgens conclusie 7 of 8, met het kenmerk, dat het enzym lactase, invertase, catalase, glucose-oxydase of catalase en glucose-oxydase is.

10. Werkwijze volgens conclusies 7-9, met het ken merk, dat het zetmeel aardappelzetmeel, amylopectine en/of maïszetmeel is.

11. Werkwijze volgens conclusie 10,met het kenmerk, dat het zetmeel amylopectine is.

12. Werkwijze voor het zuiveren van een geïmmobiliseerd enzym, met het kenmerk, dat men de vormstukken volgens conclusies 1-6 of de vormstukken verkregen volgens de werkwijze van conclusies 7-11 extraheert met water of een zoutoplossing.

13· Werkwijze volgens conclusie 12,met het ken- 40 merk, dat de zoutoplossing een bufferoplossing is. 790 83 26 * ί 18

14· Werkwijze volgens conclusie 13, m e t het kenmerk, dat de bufferoplossing een 0,02 M kaliumfosfaatbuffer is, 15· Werkwijze volgens conclusies 12-14» met het kenmerk, dat men een geïmmobiliseerde lactase zuivert door 5 extractie met een 0,02 M kaliumfosfaatbuffer pH 7>0.·

16, Werkwijze voor het uitvoeren van een enzymatische omzetting, met het kenmerk, dat men daarbij een geïmmobiliseerd enzym volgens één of meer van de conclusies 1-6 of een volgens één of meer van de conclusies 7-15 verkregen geimmobili-10 seerd enzym gebruikt. 790 8 3 26