DK171626B1 - Vækstfremmende middel til dyr samt fremgangsmåde til fremstilling af og anvendelse af midlet til fremme af dyrevækst - Google Patents

Description

i DK 171626 B1

Den foreliggende opfindelse angår vækstfremmende middel til dyr samt fremgangsmåde til fremstilling af og anvendelse af midlet til fremme af dyrevækst.

5

Fremme af vækst hos dyr, navnlig husdyr, er tidligere blevet opnået ved at tilsætte kataboliske steroidforbindelser, såsom østrogen, til dyrefoder. Fremgangsmåden er for nyligt blevet mødt med modvilje, eftersom der akkumuleres høje mængder af steroider i dyrevævet. Som 10 følge heraf opstår uønskede virkninger, som udvikling af bryster hos drenge, som spiser kyllinger, der er fodret med store mængder østrogen.

En anden udbredt praksis er tilsætningen af antibiotika til 15 dyrefoder. Dette hjælper med til at styre opportunistisk bakterieinfektion, hvilket giver en samlet bedre helbredstilstand hos dyrene med heraf følgende vægtforøgelse. Denne praksis er blevet nøje undersøgt af sundhedsmyndighederne og er blevet fordømt som værende med til at lette frembringelsen af antibiotikaresistente 20 stammer af mikroorganismer. Dette er af speciel interesse i de tilfælde, hvor de antibiotika, som anvendes som foderti Isætnings-midler, er almindeligt anvendte terapeutiske midler til mennesker.

Det er endvidere blevet foreslået at fremme dyrevækst ved at anvende 25 forskellige fordøjelsesenzymer som fodertilsætningsmidler. Disse enzymer hjælper med til at nedbryde foderråmaterialet i tarmene, hvorved en stigende mængde af næringsstofferne bliver tilgængelige for adsorption ud fra en given foderration i forhold til det, der er tilgængeligt under normale fordøjelsesbetingelser.

30

Inkorporeringen af enzymer i foder har den ulempe, at enzymerne ofte denatureres og inaktiveres ved passage gennem maven eller vommen, hvor der findes ekstreme pH-værdier. Eftersom enzymer har specifikke krav med hensyn til pH, temperatur, cofaktorer mv. for at opretholde 35 biologisk aktivitet, kan afvigelse fra optimale værdier føre til nedsættelse af enzymaktivitet eller enzyminaktivering, som kan være irreversibel. Det har vist sig, at tilsætningen af fordøjelsesenzymer til dyrefoder generelt er ineffektiv til fremme af dyrevækst. Eftersom kun en lille del af de tilførte enzymer overlever passage gennem vommen eller maven, kræves der endvidere store mængder af 2 DK 171626 B1 enzymer, hvorved en sådan behandling bliver uøkonomisk.

I beskrivelsen til australsk patent nr. 516.072 foreslås det at 5 beskytte fordøjelsesenzymer mod maveinaktivering ved at blande dem med et bindingssystem, en stabilisator og et desintegrerende middel, hvorefter blandingen belægges med en enterisk belægning. Den enteriske belægning muliggør passage gennem maven, hvorefter belægningen nedbrydes i de alkaliske omgivelser i tolvfingertarmen.

20 Bindingsmidlet og det desintegrerende middel letter en hurtig frigørelse af enzymerne i tolvfingertarmen. Dette forslag har den ulempe, at fordøjelsesenzymer inaktiveres delvis ved sammenblanding med et bindingsmiddel og desintegrerende middel i nærvær af organiske opløsningsmidler, såsom isopropanol og methylenchlorid.

25 Fordøjelsesenzymer inaktiveres endvidere også delvis af organiske opløsningsmidler, når der påføres en enterisk belægning.

Granulatstørrelsen af partikler frembragt ifølge australsk patent nr. 516.072 er almindeligvis utilfredsstillende på grund af den store størrelse, som forhindrer ensartet fordeling i foderet.

20 Fra AU 504.584 og US 4.447.412 er det endvidere kendt at mikroindkapsle fordøjelsesenzymer, men denne mi kroindkapsling løser ikke ovennævnte problemer.

Der er derfor behov for et enzymatisk vækstfremmende middel, som 25 overvinder én eller flere af ovennævnte ulemper.

Den foreliggende opfindelse angår et vækstfremmende middel til effektiv udnyttelse af foderkomponenter.

30 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes således et vækstfremmende middel til dyr, hvilket middel er ejendommelig ved, at det omfatter mikrogranula med en størrelse på mellem 25 og 500 μπι og en kerne, der består af en eller flere enzymer udvalgt blandt: 35 (i) 2 x 10^ til 2 x 10^ Vitapharm proteaseenheder 4 8 (i i) 1 x 10 til 4,3 x 10 Vitapharm amylaseenheder 3 (iii) 0,5 til 5 x 10 Vitapharm 1ipaseenheder 2 6 (iv) 2 x 10 til 2 x 10 Vitapharm cellulaseenheder DK 171626 B1 3 pr. kilogram vækstfremmende middel, og som er umobiliseret i en gelmatrix, hvorhos kernen er indkapslet i en vandopløselig film og belagt med en enterobelægning, der omfatter en alkali opløselig, 5 syreuopløselig polymer eller en højmolekylvægtig polymer, hvis struktur er substitueret med eller indeholder områder med fedtsyre eller et andet materiale, som kan opløses af tarmsafter.

Udtrykket "immobil i seret" refererer til de enzymer, som er 10 immobiliseret i et gellignende materiale, indelukket i en semipermeabel membran, adsorberet på adsorberende midler eller bundet til chelaterende midler.

Enzymer kan f.eks. immobiliseres ved hjælp af en hvilken som helst 25 af følgende metoder: (a) Indeslutninosmetoden - inkorporering af enzymer i en kerne af et gellignende materiale eller indelukning i en semipermeabel membran.

2o (b) Tværbindinasmetoden - intermolekylær tværbinding af enzymer under anvendelse af tværbindingsmidler, eller (c) Binding til et bæremateriale - fysiske eller kemiske bindinger af enzymer til et vanduopløseligt stof ved ioniske og/eller 25 covalente bindinger.

Immobiliseringen udføres på en sådan måde, at enzymerne bevarer deres biologiske aktivitet.

30 Indelukningen af enzymer i en kerne kan udføres ved at blande enzymerne med midler, som under visse betingelser er i stand til at danne en gel, således at enzymerne indfanges i den dannede gelmatrix.

35 Eksempler på geldannende midler inkluderer k-carrageenan, gelatine, alginater, cellulose eller derivater heraf, eller forskellige geldannende, syntetiske polymerer, såsom polyamider eller Chitosan. Hvis der anvendes et adsorptionsmiddel er det fortrinsvis mikrofint aktiveret kul.

4 DK 171626 B1

Chelaterende midler, som kan anvendes ved immobilisering af enzymer, inkluderer EDTA, salte eller derivater heraf, samt højmolekylære, hydrofile polymerer, såsom polyacrylamider, eller højmolekylære 5 salte, som er i stand til at dissociere deres ioniske binding i vandig opløsning eller et vandigt/hydrofilt opløsningsmiddel.

Mi krogranulatets partikelstørrelse ligger mellem 25 og 500 /xm og fortrinsvis mellem 50 og 350 fim.

10

Indkapslingen involverer aflejringen af en tynd film eller et mekanisk spærrelag over kernen, hvorved kernen i hver mikrogranu-latkorn bliver fysisk adskilt fra dets omgivelser. Dette spærrelag eller denne film er opløselig i vandig opløsning. Et eksempel på en 15 forbindelse, som danner et egnet, mekanisk spærrelag, er gelatine.

Den enteriske belægning er fortrinsvis celluloseacetatphthalat. Der kan imidlertid anvendes en hvilken som helst anden syrebestandig, alkaliopløselig polymer.

20

Butylmethacrylat eller andre højmolekylære polymerer kan substitueres med eller indeholde områder med stearinsyre eller et andet fedtsyrederivat, såsom cHi2-24'^edts,yrer’ som er i stand til at blive opløst i tarmsafte.

25

Immobiliseringen af fordøjelsesenzmer i en gel er et meget fordelagtigt træk. Navnlig begrænser gelmatrixen denaturerende midlers adgang til enzymerne, hvilket gælder de organiske opløsningsmidler, som anvendes ved påføringen af en enterisk 30 belægning (en syreuopløselig, baseopløselig belægning, såsom celluloseacetatphthalat). En væsentlig del af de fordøjelsesenzymer, som immobiliseres i gelmatrixen, er således i sidste ende tilgængelig for katalytisk aktivitet. Dette står i modsætning til de resultater, som opnås med den kendte teknik, hvor der sker et 35 væsentligt tab af enzymaktivitet ved påføring af enteriske belægninger.

Den gelmatrix, i hvilken fordøjelsesenzymerne kan immobiliseres, er porøs og permeabel. Når gelen følgelig udsættes for vandige betingelser, såsom miljøet i tolvfingertarmen, svulmer gelen op på 5 DK 171626 B1 grund af indtrængning af tarmsafte i matrixen, og fordøjelsesenzymerne frigøres og passerer ud af gelen og kan udøve deres katalytiske aktivitet.

5

Mikrogranula med en meget lille partikelstørrelse, af størrelsesordenen 50 til 500 /im, kan fremstilles uden at fordøjelsesenzymerne mister biologisk aktivitet. Navnlig er fordøjelsesenzymer, som er immobiliseret i en gel eller i en opløsning, som er i stand til at jq danne en gel, lette at håndtere og behandle og kan udsættes for milde procedurer til fremstilling af et mi krogranulat med den ønskede parti kel størrelse. F.eks. kan en gel, der indeholder fordøjelsesenzymer, ekstruderes gennem en sigte med en meget lille porestørrelse eller kan frysetørres til frembringelse af partikler 15 med den ønskede størrelse. Alternativt kan fordøjelsesenzymer i en opløsning, som er i stand til at danne en gel, sprøjtes gennem en egnet dyse til dannelse af smådråber, som føres ind i en opløsning, der får smådråberne til at danne gel, hvorved fordøjelsesenzymerne immobil i seres i den dannede gelmatrix. Størrelsen af det på denne 20 måde dannede granulat bestemmes af porestørrelsen i dysen og af det tryk, ved hvilken opløsningen atomiseres. I modsætning hertil kan. sådanne resultater ikke opnås med kendte fremgangsmåder. Ved kendte metoder blandes enzymerne blot med traditionelle bindingsmidler, som ikke er modtagelige overfor ovennævnte behandlinger til 25 frembringelse af et mi krogranulat med den ønskede partikelstørrelse.

Et mikrogranulat med en lille partikelstørrelse er meget ønskelig, eftersom det kan fordeles jævnt i foderet og tillade hurtig frigørelse af enzymer på grund af mi krogranulatets forøgede 30 overfladeareal.

Tilvejebringelsen af et vandopløseligt spærrelag omkring enzymerne i kernen tilvejebringer beskyttelse mod denaturering af enzymerne af organiske opløsningsmidler, som anvendes under påføring af en 35 enterisk belægning. Som følge af ovennævnte gelmatrix's beskyttende virkning opnås en væsentlig bevarelse af fordøjelsesenzymernes biologiske aktivitet. Dette betyder igen, at der kan opnås en væsentlig bedre økonomi med hensyn til de mængder fordøjelsesenzymer, som anvendes til fremme af vækst.

6 DK 171626 B1

Det vækstfremmende middel ifølge den foreliggende opfindelse gør det muligt, at pH-følsomme fordøjelsesenzymer kan beskyttes mod inaktivering i maven eller vommen og dog være tilgængelige til 5 virkning i tarmsystemet, navnlig tolvfingertarmen. Når det vækstfremmende middel når det alkaliske område i tarmen hos dyr med én mave, opløses den ydre belægning, eller fedtsyreområdet fordøjes. Tarmsafte er derefter i stand til at komme ind til den vandopløselige belægning, hvorved den nedbrydes. Dette eksponerer kernen, får jo den til at svulme op og frigive fordøjelsesenzymer.

Hos drøvtyggere muliggør en højmolekylær polymer, såsom butylmethacrylat med fedtsyreområder, fortrinsvis c^2-24* at det vækstfremmende middel passerer gennem vommen og maven. I 25 tarmområderne, navnlig i tolvfingertarmen, fordøjes fedtsyreområ derne af lipaser, hvorved den vandopløselige belægning nedbrydes og kernen eksponeres, hvilket får den til at svulme op og frigive fordøjelsesenzymer. I denne sammenhæng skal det bemærkes, at den lille partikelstørrelse af mi krogranulatet, som kan opnås ifølge den 2o foreliggende opfindelse, lette mi krogranulatets passage gennem vommen.

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til at forøge væksten hos dyr ved 25 indgivelse af en effektiv mængde af et vækstfremmende middel, som er beskrevet tidligere.

Dyr, som behandles ved ovennævnte fremgangsmåde, udviser en stigende vægtforøgelse, og der opnås en forbedret foderudnyttelse.

30

Dyr, som kan behandles ved den foreliggende metode, inkluderer grise, får, geder, heste, kyllinger, ænder og andre husdyr.

Dyrene kan få indgivet det vækstfremmende middel ifølge den 35 foreliggende opfindelse oralt.

Ifølge et andet aspekt af den foreliggende opfindelse anvendes en sammensætning til forøgelse af væksten hos dyr, hvilken sammensætning indeholder det ovenfor beskrevne vækstfremmende middel til dyr sammen med et farmaceutisk acceptabelt eller veterinært DK 171626 B1 7 acceptabelt bæremateriale eller excipiens. Det vækstfremmende middel kan f.eks. indgives med vand, kaolin, talkum, calciumcarbonat, lactose, natriumchlorid, kobbersulfat, zinksulfat, ferrosulfat, 5 mangansulfat, kaliumiodid, svovl, kaliumchlorid, selen og/eller vitaminer, såsom biotin, cholinchlorid, nicotinamid, folinsyre og vitaminerne A, D3, E, K, Bl, B2, B6 og B12.

Det vækstfremmende middel ifølge den foreliggende opfindelse kan jq også anvendes sammen med et passende dyrefoder.

Eksempler på et passende dyrefoder omfatter et eller flere af følgende: majs, hvede, "middling", sojabønnemel, fiskemel, græsmel, skummetmælk, tricalciumphosphat, malt, korn, ris, milo, valle, j5 lucernemel, mv.

De forskellige enzymmængder (vægt/vægt), som inkorporeres i det vækstfremmende middel, er ikke kritisk. De optimale enzymmængder, som skal inkorporeres i det vækstfremmende middel, kan let bestemmes 2o uden for megen eksperimentering.

Hver kilo vækstfremmende middel indeholder ifølge den foreliggende opfindelse følgende bestanddele: 3 7 25 Protease: 2 x 10 til 2 x 10 Vitapharm proteaseenheder.

4 8

Amylase: 1 x 10 til 4,3 x 10 Vitapharm amylaseenheder.

3

Lipase: 0,5 til 5 x 10 Vitapharm 1ipaseenheder.

2 6

Cellulase: 2 x 10 til 2 x 10 Vitapharm cellulaseenheder.

30 Fortrinsvis indeholder 1 kg vækstfremmende middel ifølge den foreliggende opfindelse: 5

Protease: 2 x 10 proteaseenheder.

Amylase: 4,3 x 10® amylaseenheder.

35 Lipase: 5 x 10* 1ipaseenheder.

Cellulase: 2 x 104 cellulaseenheder.

Hvert af de ovennævnte enzymer er af fødekvalitet, som defineret i Food Chemical Index, Ed. 111.

DK 171626 B1 8

De ovenfor anførte enzymenheder er Vitapharm standardenheder og beregnes ifølge de metoder, som er anført i eksempel 3.

5 Ifølge endnu et aspekt af opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et dyrevækstfremmende middel, hvilken fremgangsmåde omfatter: (a) immobilisering i en kerne af en eller flere enzymer 10 udvalgt blandt: 3 7 (i) 2 x 10 til 2 x 10 proteaseenheder 4 8 (ii) 1 x 10 til 4,3 x 10 amylaseenheder 3 (iii) 0,5 til 5 x 10 lipaseenheder 15 (iv) 2 x 102 til 2 x 106 cel lulaseenheder pr. kilogram væsktfremmende middel, (b) mi krogranulering af de immobil i serede enzymer, 20 (c) indkapsling af mikrogranulaene med en vandopløselig mekanisk barriere, og (d) belægning af mikrogranulaene fra trin (c) med en entero— 25 belægning, der omfatter en alkalisk opløselig, syreuopløselig polymer eller en højmolekylvægtig polymer, hvis struktur er substitueret med eller indeholder områder af fedtsyrer eller andet materiale, som kan opløses af tarmsafter.

30

Mi krogranulatet sprøjtebelægges fortrinsvis med det vandopløselige, mekaniske spærremateriale fra trin (c) og belægningen fra trin (d).

Immobilisering i en kerne refererer fortrinsvis til de enzymer, som 35 immobiliseres i et gellignende materiale.

De dyrevækstfremmende midler ifølge den foreliggende opfindelse forøger vægttilvæksten og forbedrer foderudnyttelsen. Endvidere nedsætter det vækstfremmende middel kropsfedtet. Dette giver magrere kød, hvilket er kommercielt ønskeligt.

DK 171626 B1 9

Opfindelsen vil nu blive yderligere beskrevet og illustreret under henvisning til de efterfølgende, ikke-begrænsende eksempler.

5 EKSEMPEL 1

Fremgangsmåde til fremstilling af det vækstfremmende middel til dyr.

(a) 2%-5% vægt/volumen k-carrageenan blev blandet med renset vand ved en temperatur på 65°C, indtil carrageenan'en var opløst. Denne 10 opløsning blev derefter afkølet til 50°C.

(b) 1% vægt/volumen af lige store enzymaktiviteter (lige store enzymaktiviteter defineres som den mængde enzym, som er i stand til at fordøje den samme vægt af enzymets specifikke substrat) af 15 amylase, cellulase, protease og lipase, blev opløst i en isotonisk phosphatpufferopløsning (40% 0,067 M NaHgPO^ + 60% 0,67 M NagHPO^) ved pH 6 og ved 50°C. Denne opløsning blev tilsat til opløsning (a) og blev homogeniseret ved 500 omdrejninger pr. minut i 15 minutter.

2-5% vægt/volumen ioniseret calcium i vand blev derefter tilsat til 2o opløsningen, og den fremkomne opløsning blev homogeniseret i yderligere 1 time ved 50 omdr. pr. minut og derefter afkølet til 20°C til frembringelse af en gel og en vandig fase.

(c) Den fremkomne gel og den vandige fase blev afkølet til 5°C, blev 25 dekanteret, blev filtreret og frysetørret. Det frysetørrede materiale blev formalet til en granulatstørrelse på 25-100 μπι. Granulatet blev derefter vasket med et hærdningsmiddel, såsom 2,5% vægt/vægt glutaraldehyd eller formaldehyd.

30 Alternativt blev gelfasen fra trin (b) ekstruderet og sprøjtet gennem porer på 50 μπι ved 3 kP/cm og faldt 1-5 meter ned i en 2,5% vægt/vægt glutaraldehyd- eller formalinopløsning, hvilket resulterede i dannelsen af et granulat.

35 (d) Granulatet blev derefter filtreret og vasket med et blødgøringsmiddel, såsom glycerol. Ethvert filmbiødgørende middel kan anvendes.

(e) Det fremkomne granulat blev filtreret, fluidiseret og blev varmetørret ved 40°C.

DK 171626 B1 10 (f) Granulatet fra det foregående trin blev sprøjtebelagt med 1-2% vægt/volumen gelatine i en vandopløsning ved 40°C.

5 (g) En syrebestandig, alkaliopløselig belægning blev derefter sprøjtebelagt på granulatet, indtil slutvægten var 120% (vægt/vægt). Belægningen omfattede: 6% vægt/vægt celluloseacetatphthalat, 30% vægt/vægt isopropanol, 2ø 0,5% vægt/vægt risinusolie, og acetone til 100% vægt/vægt.

(h) Som et alternativ til trin (g) sprøjtebelagtes en højmolekylær polymer, hvis struktur er afbrudt af mellemrum eller områder med 25 fedtsyrer, på granulatet, indtil slutvægten er 105% vægt/vægt.

Belægningen omfattede: 3% butyl methylacrylat, 0,15% dibutylphthalat, 2ø 0,05% stearinsyre, og ethyl acetat til 100% vægt/vægt.

I trin (a) kan k-carrageenanen erstattes af et hvilket som helst geldannende middel, såsom alginsyre, gelatine eller cellulose og 25 dets derivater.

I trin (b) kan calcium substitueres med hvilke som helst andre 2+ j.

alkaliske metalioner, såsom K, Rb , Cs , eller alkalimetalioner, 2+ 2+ 3+ såsom Mg , Sr eller bi- eller trivalente metalioner, såsom Al , 3ø Mn2+, Ba2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Pb2+ osv., eller NH^+-ioner eller aliphatiske aminer eller aromatiske diaminer, såsom tri ethyl aminer, methylendiaminer, ethyl aminer, hexamethylendiaminer mv.

EKSEMPEL 2 35 Vækstfremme hos orise.

Grise i "opvækstfasen" (22-50 kg levende vægt) og "slutfasen" (50-80 kg levende vægt) blev fodret med forskellige mængder af det i eksempel 1 omtalte vækstfremmende middel ifølge den foreliggende 5 opfindelse. Hvert kg vækstfremmende middel omfattede 2 x 10 proteaseenheder, 4,3 x 10® amylaseenheder, 5 x 101 lipaseenheder og 4 11 DK 171626 B1 2 x 10 cellulaseenheder. Det vækstfremmende middel blev tilsat til en standardfoderblanding af hvede, byg, sød lupinfrø og kødmel. Foderstoffet indeholdt 13,4 MJ fordøjeligt energi pr. kg, 18,3% 5 råprotein, som indeholdt 0,95% lysin, 0,54% methionin og 0,56% threonin, sammen med anbefalede mængder af mineraler og vitaminer.

De seks undersøgte fodringsbehandlinger bestod i at tilsætte det væksthæmmende middel i en mængde på 0, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 og 16 kg 10 pr· ton foder. Hver behandling blev givet til grise under opvækst, som blev fodret til et niveau på 3 gange opretholdelsesniveauet, hvilket svarede til 84% henholdsvis 87% fuld appetit under opvækstfasen (22-50 kg) og slutfasen (50-80 kg).

15 Resultaterne fra dette forsøg er angivet i tabel I.

20 25 30 35 12 DK 171626 B1

Tabel I

Udbytte af grise fodret med det vækstfremmende middel blandet med et basisfoderstof 5 Vækstfremmende middel nul 1 2 4 8 16 - kg/ton

Forøgelse af levende vægt "22-50 kg", g/dag 570 578 575 569 588 577 "50-80 kg", g/dag 732 759 812 791 794 800 10

Foderomdannelsesforhold ”22-50 kg" 2,75 2,69 2,79 2,70 2,66 2,71 "50-80 kg" 3,10 2,99 2,72 2,84 2,83 2,81 15 Bagfedt, ?z mm 14,1 13,4 12,9 12,8 13,1 12,1

Afpudset krop % 68 68 68 68 68 68

Det fremgår af resultaterne i tabel I, at det vækstfremmende middel ifølge den foreliggende opfindelse både forbedrede forsøgsdyrenes 2o vækst og foderomdannelse. Grisenes forøgelse af levende vægt i opvækstfasen var ikke så markant som i slutfasen. I slutfasen udviste grise, som ikke fik tilført vækstfremmende middel, en forøgelse af levende vægt på 732 g/dag. Grise, der blev fodret med 2 kg vækstfremmende middel pr. ton udviste en forøgelse af levende 25 vægt på 812 g/dag. Dette belyser det foreliggende vækstfremmende middels virkningsfuldhed.

Medens der ikke er nogen væsentlig forskel mellem % afpudset krop (eng: carcase dressing) mellem kontrol dyr og de dyr, som blev fodret 30 med det vækstfremmende middel, synes der at være en nedsættelse af kropsbagfedt (målt under anvendelse af en standardskydelære) med stigende niveau af det vækstfremmende middel.

35 DK 171626 B1 13 EKSEMPEL 3

Bestemmelse af Vitapharm standardenheder med hensvn til enzvm-aktivitet 5 Aj. Proteaseenheder

En Vitapharm proteaseenhed defineres som den mængde enzym, som vil frigøre 0,0447 mg ikke-proteinnitrogen i en 30 minutters kolorimetrisk Hæmoglobinanalyse. Denne analyse blev udført ved pH

4,7, 40°C under anvendelse af denatureret hæmoglobin.

10

Analvse:

Reagenser: 1. Hæmoglobin 2. Pulverformigt pimpsten 15 3. Hæmoglobinsubstrat 16,0 g Difco Brand Bacto Hæmoglobin (fugtfri basis) blev afvejet i et literbæger. Der blev tilsat 3 skefuld pulverformigt pimpsten, og de tørre bestanddele blev grundigt blandet. Under kontinuerlig omblanding tilsattes ca. 400 ml destilleret vand og 1-2 dråber 2o antiskumningsmiddel fra Dow-Corning. Der blev neddykket en pH-elektrode i hæmoglobinopløsningen, og under kontinuerlig omblanding blev pH-værdien indstillet til 10,0 med 2 N natriumhydroxid. Opløsningens volumen blev indstillet til 500 ml.

Opløsningen blev centrifugeret i 15 minutter ved 3000 omdr. pr.

25 minut, og supernatanten blev gemt som substrat.

4. Natriumacetatstampuffer. 2M

164 g vandfrit natriumacetat blev opløst i ca. 700 ml destilleret vand. Under anvendelse af et standardiseret pH-meter blev der tilsat 30 iseddikesyre, indtil pufferen har en pH-værdi på 4,70 + 0,05.

Opløsningens volumen var indstillet til 1 liter med destilleret vand.

5. Natriumacetatpuffer. 0.2 M

35 50 ml natri umacetatstampuffer blev pipetteret i en 500 ml volumetrisk flaske og fortyndet til voluminet med destilleret vand.

DK 171626 B1 14 6. Trichloreddikesyre (TCA), 70% 1 destilleret vand.

7. Natriumhydroxid, 2 N 5

8. Natriumhydoxid, 0,5 N

9. Folinreagens jq 1 volumen folin-Ciocalteau-phenolreagens blev fortyndet med 2 volumen destilleret vand. Fortyndet phenolreagens er stabil i 1 uge.

Procedure 1. 25 ml hæmoglobinsubstrat og 25 ml 0,2 M natriumacetatpuffer blev 15 pipetteret i et 150 ml bæger. pH-værdien af det pufrede substrat blev målt med et standardiseret pH-meter. Hvis substratet ikke havde en pH-værdi på 4,70 ± 0,05, blev pH-værdien af den 0,2M natriumacetatpuffer indstillet således, at 25 ml hæmoglobinsubstrat og 25 ml 0,2 M natriumacetatpuffer gav en pH-værdi på 4,70 ± 0,05.

20 2. 25 ml hæmoglobinsubstrat og 25 ml 0,2 M natriumacetatpuffer blev pipeteret i en 125 ml Erlermeyerflaske. Flasken blev ækvilibreret i et vandbad på 40°C ± 0,1°C i 15 minutter.

25 3. Til tiden nul blev 5 ml af en passende enzymfortynding hurtigt pipetteret over i det ækvilibrerede substrat. Et stopur blev startet til tiden nul.

4. Efter nøjagtigt 30 minutter tilsattes 5 ml TCA-opløsning til hver 30 flaske. Af sikkerhedsmæssige grunde skal der anvendes en burette eller en pipetteringsanordning. Hver flaske blev kraftigt omblandet.

5. Der blev fremstillet en blindopløsning, som indeholdt 25 ml hæmoglobinsubstrat, 25 ml natriumacetatpuffer, 5 ml destilleret vand 35 og 5 ml TCA-opløsning.

DK 171626 B1 15 6. Flasken fik lov til at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade proteinet at koagulere fuldstændig. Hver opløsning blev filtreret gennem et Whatmann nr. 42 filterpapir. Det er 5 tilrådeligt at genfiltrere den første halvdel af filtratet gennem det samme filter. Filtratet skal være fuldstændigt klart.

7. En ml af hvert filtrat, 4 ml 0,5 N natriumhydroxyd og 1 ml fortyndet phenol reagens blev pipetteret over i et reagensglas og jo blandet godt.

8. Efter 10 minutter og ikke over 20 minutter blev absorbansen af hvert filtrat bestemt ved 660 nm mod blindprøver.

15 Beregninger: Én hæmoglobinenhed (HU) er den mængde enzym, som vil frigøre 67,08 mg (5 ^ x 6 - 67,08) ikke-proteinnitrogen under analysebetingelserne.

& x F

20 HU/g = -

W

åA = enzymfordøjelsesfiltratets absorption ved 660 nm.

F = et fast forhold mellem farveudvikling af phenol reagens og 25 proteasehydrolyse. Se standardiseringsproceduren vedrørende en forklaring.

W = mg enzym tilsat til fordøjelse i 5 ml prøve.

Standardiserinosprocedure: 30 Forskellige proteaser spalter forskellige peptidbindinger. Der er ikke noget universelt forhold mellem farveudvikling af phenol-reagenset og hydrolysegraden. Men der eksisterer imidlertid et fast forhold for hver proteasetype. Det faste forhold, dvs. F-faktoren, kan bestemmes ved at inkubere hæmoglobinsubstratet med en prøve med 35 kendt hæmoglobinaktivitet. Inkuberingen følges med en Kjeldahl-nitrogen.

16 DK 171626 B1

Reagenser: 1. Borsyreopløsning, 2% 2. Kaliumsulfat 5 3. Koncentretet svovlsyre 4. Phenolphthaleinopløsning 1% i 95% ethanol 5. Hengargranulat til nitrogenbestemmelser 6. Methyl purpurindikator 10 EnzvmDræparation

Der frembringes en enzymopløsning med prøven med kendt hæmoglobin-aktivitet, således at en delprøve på 5 ml af slutfortyndingen vil give en ^l^’^-værdi på 10-12. Der henvises til beregningerne med hensyn til tiInaermningen af enzymfortyndingen.

15

Kielddahl-procedure 1. Analysen blev udført som i trinnene 1-6 i den kol ori metriske procedure. Der blev udført dobbeltblindprøver og tredobbelte enzymfordøjelser.

20 2. Der blev pipetteret 10 ml blindfiltrat i en 100 ml Kjeldahl-flaske, som indeholdt 4,0 g kaliumsulfat og 1 selenholdigt korn. Der blev udført samme procedure for hver enzymfordøjelsesprøve under anvendelse af 4 ml filtrat.

25 3. Der blev pipetteret 4 ml koncentreret svovlsyre i hver flaske og fordøjelsen blev udført i 30 minutter efter klaring. Der blev slukket for varmen, og flaskerne fik lov til at afkøle. Der tilsattes 40 ml destilleret vand og 1 dråbe phenolphthalein- 30 opløsning. Flaskerne blev anbragt i isbad i fra 10 til 30 minutter.

4. pH-værdi en af 2-procent borsyreopløsningen blev kontrolleret umiddelbart forud for en serie fortyndinger. Borsyreopløsningen skal have en pH-værdi på fra 4,3 til 4,7. Tilførselsslangen til 35 17 DK 171626 B1 destillationsapparatet blev anbragt således, at den stak ned i 40 ml borsyreopløsning, som fandtes i et 150 ml bæger.

5 5. Der blev tilsat 7,0 g natriumhydroxid til den afkølede

Kjelddahlflaske. Der blev ikke foretaget blanding. Flaskerne blev straks tilsluttet til destillationsapparatet ved hjælp af en gummimanchet. Der blev omblandet kraftigt. Der blev destilleret i 3 minutter, hvorefter borsyrebægeret blev sænket, og destillationen 10 fortsattes i 1 minut. Hvis der skete stødkogning fortsattes straks, som om destillationen var afsluttet. Tilførselsslangen blev skyllet med destilleret vand ned i borsyreopløsningen. Flammen blev fjernet under flasken.

15 6. Der tilsattes 2 dråber methylpurpurindikator og hvert destillat blev filtreret til pH 4,5 med 0,02 N saltsyre. Den gennemsnitlige titerværdi for blindprøverne og enzymfordøjeiserne blev bestemt. Den gennemsnitlige titerværdi blev anvendt til beregninger af HU/g.

20 Beregninger mg nitrogen i 10 ml filtrat hidrørende fra proteasehydrolyse blev beregnet på følgende måde: mg nitrogen (/^N) = (prøvetiter x 10/4 - blindtiter) (0,02 N) (14) 25 mg nitrogen (^N) = (prøvetiter x 2,5 - blindtiter) (0,28) 10/4 = omregning af 4 ml prøvefiltrat svarende til 10 ml.

0,02 N = normalitet af saltsyre 14 = molekylvægt af nitrogen.

30 Mængden ophæves til potensen 1,5, dvs. ^N3/2. Hvis^H3/2 afbildes mod mg enzym opnås en ret linie. Fra afbildingen af den rette linie bestemmes den vægt af enzym, som er nødvendig til at frigøre nøjagtig 5 mg N.

(^N)*^ - antilog (1,5 x log/\N) 35 18 DK 171626 B1 Hæmoglobinenheder pr. gram (HU/g) beregnes på følgende måde: tøN)1 2 3 4’5 x 1000 x 60 11,18 x 6000 5 HU/g = ---

E x 10 E

1 5 (_N) ’ = 5 mg nitrogen frigjort i 10 ml filtrat.

1000 = omdannelse af mg enzym til g enzym. jo 60/10 = omdannelse af 10 ml prøve til 60 ml total vol umen.

E = mg enzym, som giver 5 mg N.

F-faktoren for denne proteasetype beregnes på følgende måde:

15 W

F = - x HU/g ål· W = mg enzym tilsat til fordøjelse i 5 ml prøve 20 ål· = enzymfordøjelsesfiltratets absorbans ved 660 nm.

HU/g - hæmoglobinenheder pr. g protease bestemt ved Kjeldahl-standardmetoden.

35

Vitapharm proteaseenhed (1 VPPV) = 1 HU 25 2 B. Amvlaseenheder: 3 1 Vitapharm amylaseenhed defineres som den aktivitetsmængde, som 4 frigiver 1 mg reducerende sukker som maltose på 30 minutter under de herefter beskrevne betingelser for Vitapharm Amylaseanalysen.

5 30 DK 171626 B1 19

Analyse:

Reagenser:

Stivelsessubstrat 4% væqt/volurnen opløselig stivelsesopløsninq.

5 20,00 g (fugtfri basis) opløselig stivelse (Merck Reagent Soluble Starch egnet til iodometri, Merck & Co, Rahway, N.J.) blev opslæmmet i 75 ml destilleret vand. Under omblanding tilsattes opslæmningen til 300 ml kraftigt kogende, destilleret vand. Stivelsesopløsningen 20 fik lov til at komme til kogepunktet igen og blev derefter kogt forsigtigt i 3 minutter. Opløsningen blev fjernet fra varmen og overført kvantitativt til en 500 ml volumetrisk pyrexflaske. Opløsningen blev afkølet til stuetemperatur under ledningsvand og voluminet blev justeret.

15

Stivelsesindikatoropløsnino: 150 g natriumchlorid (NaCl) af analysekvalitet blev opløst i 480 ml destilleret vand og opvarmet til kogning. Der blev omrørt kraftigt ved hjælp af en motordreven omrører. Der blev langsomt tilsat en 2o jævn suspension af 5,7 g (ca. 5,0 g tørvægt) opløselig stivelse i 20 ml destilleret vand. Blandingen blev kogt i mindst 5 minutter og afkølet.

Natriumcarbonatopløsning (10,6 %) 25 Natriumcarbonatopløsning (1,06 %)

Iodstamopløsning, 0,1 N

12,7 g iod (Ig) og 48 g kaliumiodid (Kl) blev opløst i ca. 900 ml destilleret vand. Opløsningen blev kvantitativt overført til en 1 liter volumetrisk flaske, og der blev fyldt op med destilleret vand.

30

Iodopløsninq 0.02 N Svovlsyre. 0.5 N Natriumthiosul fat. 0.005 N Enzvmopløsninq 35 Enzymopløsningen skal have en sådan koncentration, at 1 ml vil frembringe en teoretisk værdi på ca. 20% maltose under inkube-ringsperioden. Amylaser er ustabile i fortyndet opløsning. Den DK 171626 B1 20 hensigtsmæssige enzymopløsning skal derfor fremstilles umiddelbart før brug. Enzymopløsningen må ikke ækvilibreres ved 40°C, eftersom der er fare for inaktivering.

5

Procedure 1. 25 ml 4% stivelsessubstrat blev pipetteret over i en 50 ml vol umetrisk flaske. Der blev tilsat 5 ml af en passende puffer og 18 ml vand. Flasken blev ækvilibreret i et 40°C + 0,5°C varmt vandbad i 1Q 15 minutter.

2. Til tiden nul blev 1 ml af enzymopløsningen hurtigt pipetteret over i den ækvilibrerede stivelsesblanding. Voluminet blev justeret (med destilleret vand), og der skete blanding ved at vende flasken 15 om. Til en substratbi indprøve tilsattes 1 ml destilleret vand i stedet for enzymopløsningen.

3. Efter at hver reaktionsflaske var inkuberet nøjagtigt 30 minutter blev 5 ml af stivelsesfordøjelsen pipetteret over i en 10 ml 2o volumetrisk flaske, som indeholdt 1 ml 10,6% natriumcarbonat.

Voluminet blev indstillet med desti leret vand og blandet ved at vende flasken om.

4. Den reducerende værdi for fordøjelsesblandingen blev bestemt på følgende måde: Prøver på 2 ml af natriumcarbonatenzymfordøjel sen 25 blev pipetteret over i 50 ml flasker med glasprop. Der blev udført dobbeltbestemmelse. 3 ml 0,02 N iodopløsning blev pipetteret over i glasflasken, og flaskesiderne blev skyllet med 3 ml destilleret vand. lodblandingen blev ækvilibreret i et vandbad ved 20°C + 0,5°C i 30 minutter. Der blev tilsat 1 ml 0,5N svovlsyre, og der blev 30 titreret med 0,005 N standardiseret natriumthiosulfat. Der blev tilsat 3 dråber stivelsesopløsningsindikator, da opløsningen blev svagt gul. Titreringen blev fortsat, indtil komplekset af stivelse og i od forsvandt.

35 5. Til en blindværdi for iod blev 3 ml 0,02 N iodopløsning, 2 ml 1,06% natriumcarbonat og 3 ml vand titreret.

21 DK 171626 B1

Beregninger

De reducerende værdier for fordøjelsen blev beregnet på følgende måde: 5 1. Sti vel sesbiindværdierne blev beregnet ved at fratrække titeren af stivelsesopløsningen fra titeren af iodblindprøven.

2. mg maltose blev beregnet ved at anvende følgende formel: mg maltose = (I2 blind - stivelseblind - Na2S20.j-titer) x 50 x 0,855 10

Den reducerende værdi for den titrerede prøve er lig med iodblindværdien minus sti vel sesbiindværdien minus natriumthio-sulfattitreringen af fordøjelsesblandingen multipliceret med 0,855.

1 ml 0,005 N natriumthiosulfat er ækvivalent med 0,885 mg maltose.

15 Den titrerede prøve er lig med 1 ml af den oprindelige fordøjelsesblanding. Den reducerende værdi for den titrerede . prøve multipliceret med 50 giver det faktiske antal mg reducerende sukker beregnet som maltose opnået ud fra 1 g stivelse.

2o 3. Hydrolyseværdierne blev korrigeret til 20% hydrolyse under anvendelse af de i tabel 2 anførte korrektionsfaktorer.

Amylasestyrken blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: mg maltose x korrektionsfaktor 25 mg/mg styrke - - mg/ml enzym 30 35 DK 171626 B1 22

Tabel 2

Korrekt i onsfaktorer Bakteriel amvlase 5 Korrektions- Korrektions- Korrektions-

Beregnet faktorer til Beregnet faktorer til Beregnet faktorer til mg omdannelse mg omdannelse mg omdannelse maltose til 20¾ maltose til 20% maltose til 20% 86 0,82 175 0,94 265 1,14 10 90 0,83 180 0,95 270 1,16 94 0,83 184 0,95 274 1,18 98 0,84 188 0,95 278 1,20 103 0,84 192 0,97 282 1,24 107 0,85 197 0,98 287 1,28 15 111 0,86 201 0,98 291 1,31 115 0,86 205 0,99 295 1,35 120 0,87 210 1,00 299 1,39 124 0,87 214 1,00 304 1,44 128 0,88 218 1,01 308 1,48 20 133 0,89 223 1,03 312 1,53 137 0,89 227 1,04 316 1,57 141 0,90 231 1,05 321 1,63 145 0,90 235 1,06 325 1,69 150 0,91 240 1,07 329 1,75 25 154 0,91 244 1,08 333 1,81 158 0,92 248 1,09 338 1,90 162 0,92 252 1,10 342 1,97 167 0,93 257 1,11 347 2,05 171 0,94 261 1,13 351 2,13 30 C. Lipaseenheder:

En Vitapharm lipaseenhed defineres som den aktivitet, som vil frigøre 1 milliækvivalent fedtsyre på 2 timer under anvendelse af 35 den neden for beskrevne Vitapharm 1ipaseanalyse.

Analyse

Reagenser 1. Puffer. 0.1 M phosphat. pH 7,3.

2,780 g Nah^PO^.l^O blev opløst i vand og fortyndet til 100 ml.

23 DK 171626 B1 2,839 g vandfrit NagHPO^ blev opløst i vand og fortyndet til 100 ml.

23,0 ml af NaHgPO^-opløsningen og 77,0 ml af NagHPO^-opløsningen blev overført til en 200 ml vol umetrisk flaske, og voluminet blev 5 indstillet med destilleret vand.

2. Substrat, olivenolieemulsion

Til 93 ml 0,1 M phosphatpuffer i en Waringblender, der blev kørt ved langsom hastighed (ved at anvende en motorindstilling på fra 25 til jq 30), blev der langsomt tilsat 200 mg natriumbenzoat og 7,0 g USP gummi arabicum. Da disse reagenser var fuldstændig opløst, blev der langsomt tilsat 93 ml USP olivenolie. Efter at al olien var tilsat, fortsattes biendi ngen med denne hastighed i 3 minutter og derefter ved høj hastighed i 5 minutter.

15 3. Pufret substrat.

Til en aftareret 100 ml volumetrisk flaske tilsattes 54,40 g olivenolieemulsion, og der blev fyldt op med 0,1 M phosphatpuffer-opløsning. Dette pufrede substrat bør have en pH-værdi på 7,3.

20 4. Ethvlal kohol. 95%.

5. Thvmolphthalein 1% (vægt/volumen) i 95% ethyl al kohol

25 6. Natriumhydroxid. 0,05 N

30 35 DK 171626 B1 24

Procedure 1. Prøver på 5,0 ml af det pufrede substrat blev piperet over i 50 ml Erlenmeyerfl asker. Der er behov for 1 flaske til hver prøve, som 5 skal analyseres. Flaskerne blev anbragt i en speciel holder og blev sat i et vandbad ved 37°C.

2. Der blev fremstillet en passende fortynding af enzymet. Prøvefortyndingen vil afhænge af præparatets 1ipaseaktivitet.

10 3. Der blev tilsat 5,0 ml destilleret vand til 1 flaske, som indeholdt substratet. Dette udgør en enzymbi indprøve. Derefter blev der tilsat 5,0 ml af hver enzymprøve til de andre substratflasker.

Der blev blandet godt og inkuberet i nøjagtigt 2 timer ved 37°C.

15 Flaskerne blev omblandet lejlighedsvis.

4. Reaktionen blev standset ved at tilsætte 3,0 ml ethylalkohol til flaskerne, og der blev tilsat 4 dråber thymolphthalein, hvorefter der blev omblandet grundigt.

20 5. Hver flaske blev titreret med 0,05 N NaOH til et svagt blå slutpunkt. Det foretrækkes at titrere blindprøven og derefter sammenligne prøverne med denne. For at bestemme enzymvirkningen skal blindprøvetitreringen trækkes fra prøvetitreringen.

25

Bereanino:

Substratets hydrolysegrad ved forskellige enzymniveauer er ikke liniær. For at opnå god reproducerbarhed er den mængde enzym, som er nødvendig for at give en titreringsforskel (prøvetiter - blindtiter) 30 på 4,0 ml 0,05 N NaOH den korrekte enzymmængde. Der er to fremgangsmåder, som kan anvendes til at bestemme denne enzymmængde.

A. Treprøvemetoden.

Tre prøver af enzympræparationen behandledes nøjagtigt som beskrevet 35 i proceduren, idet vægtene af prøven valgtes således, at én ville give en titreringsforskel på noget mindre end 4,0 ml, én lidt over 4,0 ml, og en tredie ca. lig med 4,0 ml. På koordinatmi 11imeterpapir 25 DK 171626 B1 afsattes mg enzym mod titreringsforskellen, og der blev trukket en lige linie mellem punkterne. På afbildningen aflastes mg enzym for en titreringsforskel på nøjagtig 4,0 ml, og denne værdi blev anvendt 5 til at beregne 1ipaseenheder ved formlen: 4.0 x N x 1000 = Lipaseenheder (LU)/g, hvor N er lig mg enzymprøve med normaliteten af NaOH.

10 B· Metode med standardkurve

Som standardprøve blev der anvendt en præparation, hvis aktivitet var blevet nøjagtigt bestemt, og analysen blev udført nøjagtigt ifølge proceduren under anvendelse af adskillige forskellige prøvevægte for standardprøven. De opnåede titreringsforskelle blev 15 afbildet mod milligram standardprøve, og der blev trukket en jævn kurve gennem punkterne. For at bestemme 1ipaseaktiviteten for en ukendt prøve ved hjælp af standardkurven blev der udført en analyse med en passende prøvevægt ifølge proceduren. Ud fra standardkurven blev den standardprøve bestemt, som giver den samme titreringsfor-2o skel, som den ukendte analyseprøve, og lipaseenhederne blev beregnet ved relationen: W/S- g uiStpitr X standardprøveanalyse 25 D. Cellulaseenheder: Én Vi tapharm cellulaseenhed defineres som den aktivitet, som vil frembringe en relativ fluiditetsændring på 1 på 5 minutter i et defineret carboxymethylcellul osesubstrat under analysebetingelserne. Analysen er baseret på enzymatisk hydrolyse af de indre 30 beta-l,4-glucosidbindinger i et defineret carboxymethylcel lul ose-substrat ved pH 4,5 og 40°C.

35 DK 171626 B1 26

Reagenser og oplåsninger

1. Eddikesyreopløsning, 2 N

2. Natriumacetatopløsning, 2 N

5 3. Eddikesyreopløsning, 0,4 N

4. Natriumacetatopløsning, 0,4 N

5. Acetatpuffer (pH 4,5)

Under anvendelse af et standardiseret pH-meter blev natriumacetatopløsning (0,4 N) under kontinuerlig omrøring tilsat til 400 ml jq eddikesyreopløsning (0,4 N), indtil pH-værdien var 4,5 + 0,05.

6. Natri umcarboxvmethvi cel1ulose.

Der blev anvendt natriumcarboxymethylcellul ose med betegnelsen CMC type 7HP, Hercules, Inc., 910 Market Street, Wilmington, Delaware 15 19899.

7. Natriumcarboxvmethvlcel1ulosesubstrat 0,2% vægt/volumen 200 ml destilleret vand blev overført til beholderen i en 2o Waringblender. Med blenderen på lav hastighed blev 1,0 g (fugtfrit) CMC 7HP dispergeret i beholderen, idet man omhyggeligt undgik at sprøjte noget af væsken ud. Siderne af glasbeholderen blev skyllet med destilleret vand under anvendelse af en gummi spatel. Låget blev sat på beholderen, og der blev blended ved høj hastighed i 1 minut.

25 Indholdet blev kvantitativt overført til en 500 ml volumetrisk flaske og fortyndet ved opfyldning med destilleret vand. Substratet blev filtreret gennem gaze forud for brug.

Enzympræparation 30 Der blev fremstillet en sådan enzymopløsning, at 1 ml af slutfor-tyndingen frembragte en relativ fluiditetsændring på mellem 0,18 og 0,22 på 5 minutter under analysebetingelserne. Enzymet blev afvejet og kvantitativt overført til en glasmorter. Den blev tritureret med destilleret vand, og blandingen blev kvantitativt overført til en 35 passende volumetrisk flaske. Voluminet blev indstillet med DK 171626 B1 27 destilleret vand, og enzymopløsningen blev før brug filtreret gennem et Whatman-filterpapir nr. 1.

5 Analvseprocedure: 1. Det kalibrerede viskometer blev anbragt i et vandbad på 40°C + 0,1°C i en nøjagtig vertikal stilling. Der må kun anvendes et helt rent viskosimeter. Rensning kan let opnås ved at trække et stort volumen detergentopløsning efterfulgt af destilleret vand gennem viskosimeteret. Dette kan opnås ved at anvende et sugeapparat med en gummislange forbundet til viskometerets snævre arm.

2. 20 ml af det filtrerede CMC 7HP-substrat og 4 ml acetatpuffer (pH

4,5) blev pipetteret i en 50 ml Erlenmeyerflaske. Der var mindst to 15 flasker for hver enzymprøve og en flaske til en substratbi indprøve. Flaskerne blev tilproppet og ækvilibreret i vandbadet i 15 minutter.

3. Til tiden nul blev 1 ml af enzymopløsningen pipetteret over i det ækvilibrerede substrat. Stopur nr. 1 blev startet, og opløsningen 20 blev blandet kraftigt. 10 ml af reaktionsblandingen blev straks pipetteret i viskosimeterets brede arm.

4. Efter ca. 2 minutter blev der påført et sug med en gummislange forbundet til viskosimeterets snævre arm, hvorved reaktionsbiandin- 25 gen blev trukket over det øvre mærke i drivvæskehovedet (eng: drive fluid head). Strømningstiden blev målt ved at reaktionsblandingen fik lov til at flyde frit forbi det øvre mærke. Da reaktionsblandingens meniskus passerede det øvre mærke blev stopur nr. 2 startet.

På samme tidspunkt blev reaktionstiden i minutter fra stopur nr. 1 30 (Tr) noteret. Da reaktionsblandingens meniskus passerede det nedre mærke blev tiden i sekunder fra stopur nr. 2 (Tt) noteret.

5. Reaktionsblandingen blev straks trukket op over det øvre mærke ind i drivvæskehovedet. Da reaktionsblandingens meniskus faldt frit 35 forbi det øvre mærke blev stopur nr. 2 startet igen. På samme tidspunkt blev reaktionstiden i minutter fra stopur nr. 1 (Tr) DK 171626 B1 28 noteret. Da reaktionsblandingens meniskus faldt forbi det nedre mærke blev tiden i sekunder ud fra stopur nr. 2 (Tt) noteret.

5 6. Trin 5 blev gentaget indtil der var opnået fire bestemmelser i løbet af en reaktionstid (Tr) på ikke over 15 minutter.

7. Der blev fremstillet en substratbi indprøve ved at pipettere 1 ml destilleret vand i 25 ml pufret substrat. 10 ml af reaktionsbian-lø dingen blev pipetteret over i viskosimeterets brede arm. Den tid (T$) i sekunder, som meniskussen tager at falde mellem de to mærker, blev bestemt. Der blev anvendt et gennemsnit på 5 bestemmelser for <TS>· 15 8. Der blev fremstillet en vandbiankprøve ved at pipettere 10 ml ækvilibreret destilleret vand i viskosimeterets brede arm. Den tid (T ) i sekunder, som det tager meniskussen at falder mellem de to mærker, blev bestemt. Der blev anvendt et gennemsnit på 5 bestemmelser for (Tw).

20

Beregninger

En cellulaseenhed (CU) er den aktivitet, som vil fremkalde en relativ fluiditetsændring på 1 i løbet af 5 minutter i et defineret carboxymethylcel lul osesubstrat under analysebetingelserne.

25

De relative fluiditeter (Fr) og (Tm)-værdi erne for hver af de fire udstrømningstider (Tt) samt reaktionstider (Tr) blev beregnet på følgende måde: 30 Fr = ((YTw)(VTw)

Tm = 1/2 (Tt/60 sekunder/min.) + Tr * (T2/l20) + Tr hvor

Fr = relativ fluiditet for hver reaktionstid 35 Ts * gennemsnitlig strømningstid i sekunder for substratbiind-prøve T = gennemsnitlig strømningstid i sekunder for vandbi indprøven w 29 DK 171626 B1 = strømningstid for reaktionsblandingen i sekunder Tr = forløben tid i minutter fra tiden 0, dvs. tiden fra tilsætning af enzymopløsningen til det pufrede substrat, indtil målingen af 5 strømningstiden (T^.) blev påbegyndt.

Tm = reaktionstiden i minutter (Tr) plus halvdelen af strømningstiden (Tt) omregnet til minutter.

De fire relative fluiditeter (Fr) blev afbildet mod de fire 1Q reaktionstider (T^) med den relative fluiditet som ordinat og reaktionstiden som abscisse. Ved en sådan afbildning bør der opnås en ret linie. Hældningen af denne linie svarer til den relative fluiditetsændring pr. minut og er proportional med enzymkoncentrationen. Hældningen af den bedste linie gennem en serie forsøgspunk-15 ter er et bedre kriterie på enzymaktivitet end en enkelt værdi for relativ fluiditet. Ud fra kurven kan F -værdier ved 10 og 5 minutter r bestemmes. De bør have en forskel i fluiditet på ikke over 0,22 og ikke mindre end 0,18. Den ikke-kendte enzymaktivitet beregnes på følgende måde: 20 1000F (Frl0 - Fr5) CU/g = -

W

hvor 25

Fr5 = relativ fluiditet ved en reaktionstid på 5 minutter Frl0 = rela^v fluiditet ved en reaktionstid på 10 minutter 1000 = mg pr. gram W = vægt i milligram af enzym tilsat til reaktionsblandingen i en 1 30 ml prøve af enzymopløsning.

35

Claims (10)

1. Vækstfremmende middel til dyr, kendetegnet ved, at 5 det omfatter mikrogranula med en størrelse på mellem 25 og 500 μη og en kerne, der består af en eller flere enzymer udvalgt blandt: 3 7 (i) 2 x 10 til 2 x 10 Vitapharm proteaseenheder (ii) 1 x 10* til 4,3 x 10® Vi tapharm amylaseenheder o 10 (iii) 0,5 til 5 x 10 Vi tapharm 1ipaseenheder 1 2fi (iv) 2 x 10 til 2 x 10 Vitapharm cel lulaseenheder pr. kilogram vækstfremmende middel, og som er umobil i seret i en gelmatrix, hvorhos kernen er indkapslet i en vandopløselig film og 15 belagt med en enterobelægning, der omfatter en alkaliopløselig, syreuopløselig polymer eller en højmolekylvægtig polymer, hvis struktur er substitueret med eller indeholder områder med fedtsyre eller et andet materiale, som kan opløses af tarmsafter. 20

2. Vækstfremmende middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gelmatrixen omfatter k-karrageenan, gelatine, alginater, cellulose eller derivater heraf eller geldannende syntetiske polymerer. 25

3. Vækstfremmende middel ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at granulaene har en størrelse på mellem 50 og 350 μηι.

4. Vækstfremmende middel ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at områderne af fedtsyrer eller andet materiale omfatter

30 C12-C24-fedtsyrer eller derivater af C12-C24-fedtsyrer.

5. Vækstfremmende middel ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at den vandopløselige film er gelatine. 35

6. Vækstfremmende middel ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at den alkaliopløselige, syreuopløselige polymer er celluloseacetatphthalat.

7. Væsktfremmende middel ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at den højmolekylvægtige polymer er butylmethylacrylat. DK 171626 B1

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et væsktfremmende middel til dyr, kendetegnet ved følgende trin: 5 (a) immobilisering i en kerne af en eller flere enzymer udvalgt blandt: 3 7 (i) 2 x 10 til 2 x 10 proteaseenheder 4 8 (ii) 1 x 10 til 4,3 x 10 amylaseenheder 3 10 (i i i) 0,5 til 5 x 10 lipaseenheder 2 fi (iv) 2 x 10 til 2 x 10 cellulaseenheder pr. kilogram væsktfremmende middel, 15 (b) mi krogranulering af de immobil i serede enzymer, (c) indkapsling af mikrogranulaene med en vandopløselig mekanisk barriere, og 2o (d) belægning af mikrogranulaene fra trin (c) med en enterobelægning, der omfatter en alkalisk opløselig, syreuopløselig polymer eller en højmolekylvægtig polymer, hvis struktur er substitueret med eller indeholder områder af fedtsyrer eller andet materiale, som kan opløses af 25 tarmsafter.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at mikrogranulaene sprøjtebelægges med den vandopløselige, mekaniske barriere i trin (c) og belægningen i trin (d). 30

10. Anvendelse af det vækstfremmende middel til dyr ifølge krav 1-7 til indgivelse af det alene eller i tilblanding med dyrefoder og/eller i forbindelse med en acceptabel bærer eller et acceptabelt excipiens. 35