JPH01502434A - 新規インシュリン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規インシュリン誘導体 技術分野 本発明は、改良された性質を有する新規インシュリン誘導体、その製法、並びに 該新規インシュリン誘導体を含有する製剤に関する。

発明の背景 糖尿病の治療において、多種類のインシュリン製剤が提案されかつ用いられてき た。改良されたインシュリン製剤は、インシュリン年代の期間中定常的に創案さ れてきているけれども、未だ改良された性質を有するインシュリン製剤の必要性 が存する。

インシュリンの酸性溶液は、作用時間の短い製剤として並びにプロタミンおよび ／又は亜鉛と共に持続性製剤としてすでに用いられてきた。しかし、通常の環境 のもとでは、ｐＨ４，５未満でのインシュリンの化学的安定性は低い、と言うの は、デスアミドインシュリンの形成（サンドバイ、Ｆ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２３ヱ（１９６２）　、３４０６−３４１１）および共通結合ダイマ ー（ステイナー等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　１７（１９６８）、７２５−７３６）が 生起する。従って、可溶性の作用時間の短いインシュリン製剤（血流増加剤の添 加による）および持続性製剤（プロタミンおよび／又は亜鉛の添加による）を得 るために、低ｐＨで安定なインシュリンが望ましい。

本発明の目的は、改善された性質を有するインシュリン誘導体の溶液を提供する ことにある。

本発明の第二の目的は、改善された安定性を有するインシュリン誘導体の溶液を 提供することにある。

本発明の第三の目的は、免疫遺伝学的活性が低いか又はそれを有しないインシュ リン誘導体の製剤を得ることにある。

本発明の第四の目的は、ｐｕ約２．０〜約８．０、好ましくはｐＨ約２．０〜約 ４．５およびｐ）Ｉ約６．５〜約８．０で安定であるインシュリン製剤を提供す ることにある。

本発明の第五の目的は、ｐＨ約３〜４で改善された安定性を有するインシュリン 誘導体の溶液を提供することにある。

本発明の第六の目的は、インシュリン誘導体の持続性溶液を提供することにある 。

発明の開示 本発明は、ヒト、豚、家兎およびデス（Ｂ　３０）インシュリンに関し、ここに おいてＡ２１アミノ酸は＾Ｉａ　、　Ｇｉｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｇｌｙ　。

）１ｉｓ　、　Ｉ　ｌｅ　、　Ｌｅｕ　、　Ｎｅｔ　、　Ｐｈｅ　、　Ｓｅｒ　 、　Ｔｈｒ　、　Ｔｒｐ　、　Ｔｙｒ　、　Ｖａｌ又はｈＳｅｒによって置換さ れている。

かかる化合物は次式Ｉ： （式中、ｌＮ５ＵＬはデス（Ａ２１）、デス（Ｂ２Ｏ）ヒトインシュリンを表し 、Ａ２１はインシュリン中のＣｙ　ｓ　Ａ　２０に結合したアミノ酸＾１ａ　、 　Ｇｌｎ　、　Ｇｌｕ　、　Ｇｌｙ　、　Ｈｉｓ　、　Ｉｌｅ　、　Ｌｅｕ　、 　Ｎｅｔ　、　Ｐｈｅ　、　Ｓｅｒ　、　ＴｈｒB Ｔｒｐ　、　Ｔｙｒ　、　ｌ／ａｌ又はｈＳｅｒの一種を表し、更にＢ２Ｏはイ ンシュリン中のｌ　ｙ　ｓ　＠　Ｚ　＠に結合した水素又はアミノ酸Ｓｅｒ　、 八１ａもしくはＴｈｒの一種を表す）で表される化合物である。

以下の内容は公知である。すなわち、哺乳動物インシュリンの酸性エタノール抽 出中において、多くのダイマーが形成され（シュタイナー）、更にモノデスアミ ドインシュリンが酸性条件下で形成される（サンドバイ） 今や、驚くべきことに以下の内容が見出だされた。すなわち、そのような好まし くないダイマーの形成は、用いたインシュリンが上記インシュリン誘導体くこの 誘導体中、八ｓ　ｎ　Ａ　２１は上記アミノ酸の一種によって交換されている） の一種である場合に実質的に減少又は殆ど除去される。この置換は、またはモノ デスアミドインシュリンの形成をも排除する。

新規インシュリン誘導体は、次の利点を有する：１）　免疫学的ダイマー、すな わち、２個のＡ鎖を介して（ＡＡダイマー）又は１個のＡｉを１個のＢ鎖（ＡＢ ダイマー）のいずれかに結合した共有結合インシュリン分子（ヘルビック、Ｈ， Ｊ、、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｗｏｌｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｉｎｓｔｉｔｕｔ、ｄ ｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。

１９７６）の形成は、実質的に除去される（粗製豚インシュリンのクロマトグラ フィー分画、ダイマー含有す一成分は家兎において免疫原性である（Ｓｃｈｌｉ ｃｈｔｋｒｕｌｌ等、Ｈｏｒｍ、Ｈｅｔａｂ、Ｒｅｓ。

５ｕｐｐ１．５（１９７４）、１３４−１４３＞。

〜−−−−へ −＋％＋小 ２）　新規インシュリン誘導体の安定性は、非常に高く、従ってこれらの新規イ ンシュリン誘導体を含有する製剤を室温で長期間保存することは恐らく可能であ る。これは患者にとって主な利点である。

３）　ｐＨ約２〜８、好ましくはｐＨ約２〜約４．５の範囲内で更に６．５超で のｐＨ値で新規インシュリン誘導体を含有する溶解製剤を調製することが可能で ある。

４）　ｐＨ約３で、実質的に改善された化学安定性を有する、新規インシュリン 誘導体を含む製剤を調製することが可能である。

５）　化学的不安定性のなめ、哺乳動物インシュリンに対し不適当であるｐｎ約 ３〜４の範囲において、インシュリン誘導体の有用な溶液が約０．０５Ｍ〜０． ５Ｍの濃度のマグネシウムイオンの存在中で調製である。

６）　吸収を高める化合物を添加することにより、新規インシュリン誘導体を含 有する可溶性の速効性製剤を調製することが可能である。

７）酸性溶液、すなわちｐＨ約２．５〜約４の範囲内のｐＨ値を有する溶液に、 亜鉛および／又はプロタミンを添加することによって新規インシュリン誘導体を 含有する可溶性遅延製剤を調製することが可能である。

８）　異なったプロフィルを有する新規インシュリン誘導体を含有する製剤を調 製することが可能である。

前記式■の化合物は、ペプチド転位反応によって調製することができ、この反応 において次式■：（式中、Ａ２１は先に定義した意味であり、Ｘは結合、アミノ 酸残基又はＧ１ｙ２１のアミノ基に対しｌ　ｙ　ｓ　Ｂ　２１のカルボキシル基 を架橋するペプチド残基である） で表される生合成前駆体化合物を、米国特許第４，３４３，８９８号明細書に記 載されると同様に、水および有機溶剤の混合物中触媒としてトリプシン又はトリ プシン様酵素を用いて次式■：Ｚ−ＯＲ（ＩＩＩ） （式中、ＺはＴｈｒ　、＾Ｉａ又はＳｅｒであり、ここにおいてヒドロキシル基 は保護されてることができ、更にＲはカルボキシ保護基（例えばメチル又は第三 ブチル）である）で表されるアミノ化合物と反応させ、しかる後、カルボキシ保 護基およびヒドロキシ保護基を除去する。

Ｘは、例えば次式■： （Ｑｑ−Ｋ）ｒ （式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表し、ｑは０〜３３の整数で あり、ＫはＬｙｓ又は＾ｒｇであり、更にｒは０又は１である） で表される部分である。

式■の化合物は、ヨーロッパ特許出願１６３，５２９および２１４．８２６に記 載された方法と類似の方法で調製できる。この方法により、式■を有する化合物 をコードするＤＮＡ−配列が適当な発現ベクターに挿入され、該ベクターは適当 な酵母株に移送されると、正しく位置決めされたジスルフィド架橋を有する所望 化合物を発現しうる０発現された生成物は、次いで細胞から分泌されているか否 かに応じて細胞又は培養ブロスから単離される。

中性ｐＨで、式Ｉの化合物はヒトインシュリンと同じ電荷を有する。溶液中、式 ■の化合物はヘキサマーとして存在する。

本発明による特異的な好ましい化合物の例は、次の通りである。　にｌ、Ａ２１ ヒトインシユリン、＾ＩａＡ２１ヒトインシュリン、Ｓｅｒ”　’ヒトインシュ リン、ｌ’）、、Ａ２１ヒトインシユリン、ｈＳｅｒ”　’ヒトインシュリン、 にｌ、Ａ２１豚インシユリン、＾ｌａＡ！＋豚インシュリインシュリン２’豚イ ンシユリンおよびＴｈｒＡ２’豚インシュリインシュリ ン発明のインシュリン製剤は、わずかに酸性条件での水性媒質中に式■の化合物 を、例えば約２４０〜約６０ｎモル／ｌの濃度に溶解することにより調製できる 。

水性媒質は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグリセロールを添加して等張 にすることができる。

もし持続性製剤が要求される場合、上記等張化剤を、亜鉛塩又は亜鉛塩の混合物 により式■の化合物のｎモル当たり約５μｇまでのＺｎ２＋濃度で一部又は完全 に置換できる。

更に、以下の内容が見出だされた。すなわち、多くのマグネシウム塩はｐＨ約４ 〜約６．２でインシュリンに対する可溶化作用並びにインシュリンの吸収に対す る増強作用を有する。

マグネシウム塩の種々の混合物が同様の効果を有する。従って、次のように結論 づけられる。一定濃度のマグネシウムイオンの存在は、約４〜約６．２のｐＨ値 でインシュリンの溶解性並びに吸収速度に対する臨界的パラメターである。適用 可能なマグネシウムイオン濃度の範囲は、約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍ、好まし くは約０．０５Ｍ超である。上限はある場合において（例できると仮定すること から幾分任意に選択される。

本発明の好ましい心機によれば、製剤は約０．０８Ｍ〜約０．３Ｍの濃度のマグ ネシウムイオンを有する。

更に以下の内容が見出だされた。すなわち、本発明のインシュリン誘導体の持続 性（又は更に持続性）製剤は、プロタミンを上述の製剤、すなわち、亜鉛イオン およびマグネシウムイオンを有しない製剤、亜鉛イオンおよびマグネシウムイオ ンを有する製剤に添加すると、得られる。用いるプロタミンの量はインシュリン 基準（重量／重量）で約５％〜約５０％、好ましくは約８％〜約４０％、更に好 ましくは約１０％〜約３０％である。

吸収性を増加したインシュリン製剤はまた、インシュリンの水溶液にアルギニン 又はりシンを添加することにより得ることもできる。アミノ酸の好ましい濃度は 、約０．ＯＩＭ〜約０．２Ｍである。

インシュリン製剤は、更に例えばアセテートおよびシトレート並びに保存剤、例 えばフェノール、ｍ−クレゾールおよびメチルパラベンを含有できる。溶液のｐ Ｈは所望の値に調節され、インシュリン製剤は、殺菌ろかにより殺菌される。

ｐＨ３〜６．２を有する本発明のインシュリン溶液はまた、ボンブによる注入の 目的に対し特に有用である。と言うのは、カテーテルを介しての二酸化炭素拡散 によるインシュリンの沈殿がないからである。このような沈殿は、中性注入溶液 では時おり観察され、そして二酸化炭素によって引きおこされるｐｉ値の低下に 寄因するものと信じられている。

アミノ酸残基に対し本発明で用いられる略記号は、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｅ＊、 ２４旦（１９６８）　、３５５８頁で記載されたものである。本発明で述べられ ているアミノ酸は、Ｌ配置である０本発明に関する限り、語句「インシュリン」 は複数の又は一般的意味で用いられる場合、天然のインシュリンおよびインシュ リン誘導体の双方をも含むものと意図されている　に１ｙＡ２１ヒトインシュリ ンは、＾５ｎＡｉｌがＧｌｙによって交換されているとヒトインシュリンであり かつ同様の名称に対し同様である。

本発明のインシュリン製剤は、糖尿病の治療に用いることができる０本発明の用 量は、注射用の公知のインシュリン製剤の用量の選択にするのと同様に医者によ り選択されるととが望まれる。

本発明で述べる特徴の組み合わせ又は新規特徴は、本発明に対し必須と考えられ る。

例Ｉ ＧＩｙＡ２１ヒトインシュリンの調製 ＧｌｙＡ２１ヒトインシュリンを、次式：（式中、架橋ペプチドの末端＾１ａは １ｙｓ８２　％のカルボキシル基に結合しており、さらにＬｙｓはにｌ、４２１ のアミノ基に結合している） として表すことのできる式■に係る化合物を、Ｔｈｒ−Ｏｆ４ｅ　（レートレオ ニンメチルエステル）を用いてペプチド転位反応させ、次いでエステル基を水性 水酸化ナトリウムで加水分解することにより調製した。すなわち、１００ｍｇの 式Ｖの化合物を１０Ｍの酢酸０．５ｍＺに溶解し、次いでＮ、Ｎ−ジメチルアセ トアミドに溶解した２ＭのＴｈｒ−ＯＭｅ　１　ｖａｌを添加した。混合物を、 １２℃に冷却した。　０．０５Ｍの酢酸カルシウム０．２ｍｌに溶解したＬｏｎ ｇのトリプシンを添加した。１２℃で４８時間後、２０ｍ１のア七トンを添加し てタンパク質を沈殿させた。

出発物質のＧｌｙ”’−（Ｔｈｒ−ＯＭｅ）”’への変換は、ＨＰＬＣにより８ ８％であった。

２５０ｍｇのＧｌｙＡ２１　（Ｔｈｒ−ＯＭｅ）８コＯヒトインシユリンを、２ ５社の水に懸濁させ、次いでｐＨ１０，０にＩＮの水酸化ナトリウム溶液を添加 して溶解した。　ｐＨ値を２５℃で２４時間１０．０に保持する。得られたイン シュリン誘導体を、２ｇの塩化ナトリウム、３５０＠ｇの酢酸ナトリウム三水和 物および２．５Ｂの酢酸亜塩二水和物を添加して結晶化させ、次いでＩＮ塩酸を 添加してｐＨ５，５２を得た。４℃で２４時間後、結晶物質を遠心分離により単 離し、３ｍｌの水で洗い、遠心分離により単離し、真空下で乾燥する。収率、　 Ｇｌ、Ａ２１ヒトインシュリン２１０ｍｇ。

式Ｖの化合物は、ヨーロッパ特許出願２１４．８２６の例２と同様の方法で調製 した。

例２ 式■の化合物の注射用溶液の調製 ０．５％の亜鉛を含有するＧｌ、Ａ２１ヒトインシユリン１０μ輸ｏ１を、塩酸 （ＩＮの８０μ！）を含有する水（５ｍｌ）に溶解し、次いでフェノール（６５ ｍｇ）およびグリセロール（４００ｍｇ）を含有する水溶液（１０ｄ）を添加す る。溶液のｐＨ値を、水酸化ナトリウム溶液により、３．０に調節し、全量を水 で２５ｍ１に調節する。得られた溶液を滅菌ろ過し、引き続き無菌的にバイアル （５鋤！）に移す。

例３ 持続作用を有するＧｌ、Ａ２１ヒトインシユリンの可溶性製剤１０μ鍮ｏｌのに ｌ、Ａ２１ヒトインシユリン（亜鉛なし）を水（５ａ＋ｆ）に溶解する。この溶 液に、塩酸（ＩＮの８０μｌ）および塩化亜鉛（０，６Ｍの１００μｌ）を添加 し、次いで硫酸プロタミン（３７ｍｇ）、ｍ−クレゾール（５０ｍｇ＞および塩 化ナトリウム（２００ｍｇ）を含有する水溶液（１５＠ｌ）を添加する。ｐＨを 水酸化ナトリウム溶液で３．５に調節し、全量を水で２５ｍ１に調節する。最後 に、溶液をｒ過して滅菌し、滅菌バイアルに無菌的に移す。

豚に皮下投与後の吸収状態は、周知のインシュリン懸濁液プロタフアン”　ＨＲ １００ＩＵ／　ｍｌのそれに匹敵することが判明した。

例４ 速効性を有するにｌ、Ａｌｌヒトインシュリンの可溶性製剤１５μ−０１の（、 ｌ、Ａｌｌヒトインシュリン（亜鉛なし）を水（１０ａｌｌ）に溶解する。この 溶液に、塩酸（ＩＮの４０μりおよび塩化マグネシウム（ＬＭの２．６ｍ１）を 添加し、次いでベンジルアルコール（０，３Ｍの８社）を添加する。　ｐＨを水 酸化ナトリウム溶液で５．７に調節し、全量を水で２５社に調節する。最後に、 溶液をｒ過しで滅菌し、滅菌バイアルに無菌的に移す。

例５ 製剤中のに１ｙＡ２１ヒトインシュリンの化学的安定性０．２４１１ＩＭのに１ ｙＡ２１ヒトインシ豆リン（亜鉛なし）、０．２６％（ｗ／ｖ）のフェノールお よび１．６％（ｗ／ｖ）のグリセロールを含有する三種の製剤を調製し、それら のｐｔＩ値をそれぞれ３．０゜４．０、および５．０に調節した。

対照として同じ組成を有するヒトインシュリン製剤を用い４５℃で２週間保存後 サンプルを分析した。

第１表は、ＨＰＳＥＣ（高性能サイズ排除クロマトグラフィー）によって測定さ れるようなインシュリン二量化および重合生成物の含量を示す。

第２表は、ＤＩＳＣＰＡＧＥ　（ポリアクリルアミドゲルエレクロトフォレシス ）によって測定したインシュリン酸アミド加水分解の含量を示す。

例６ にｌ、Ａ！＋ヒトインシュリンの生物学的効力にｌ、Ａ２＋ヒトインシュリンの 効力に関し、英国ファルマコビア（１９８０版）による研究では、これはヒトイ ンシュリンの効力の約８５％であった。治療目的に関する用量範囲内で、毒性の 発現は観察されなかった。

例７ 更に持続作用を有するにｌ、Ａ２＋ヒトインシュリンの可溶性製剤 １５μ鋤ｏ１のＧｌ、Ａ２１ヒトインシユリン（亜鉛なし）を水（５＠ｅ）に溶 解する。この溶液に、塩酸（ＩＮの８０μりおよび塩化並塩（０，６Ｍの１００ μりを添加し、次いで硫酸プロタミン（３７ｍｇ）、侑−クレゾール（５０ｍｇ ）および塩化マグネシウム（２００ｍｇ）を含有する水性溶液（１５＋ｍｆ）を 添加する。ｐＨを３．５に調節し、全量を水で２５ｍｊ’に調節する。

豚に皮下投与後のこの製剤の吸収は、周知のインシュリン懸濁液プロタフアン■ ＨＭ　１００ＩＵ／ｍＺのそれよりも実質的により遅いことが判明した。

国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．次式Ｉ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、ＩＮＳＵＬはデス（Ａ２１） 、デス（Ｂ３０）ヒトインシュリンを表わす） で表されるインシュリン誘導体であって、Ａ２１がインシュリン中のＣｙｓＡ２ ０に結合したアミノ酸Ａｌａ，Ｃｌｎ，Ｃｌｕ，Ｃｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅ ｕ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｖａｌ又はｈＳｅｒの 一種を表し、更にＢ３０はインシュリン中のＬｙｓＢ２９に結合した水素又はア ミノ酸Ｓｅｒ，ＡｌａもしくはＴｈｒを表し、更に好ましくはＡ２１がＰｈｅと は異なっている、前記インシュリン誘導体。
2. ２．Ａ２１がＣｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ、又はｈＳｅｒを表し、Ｂ３０が Ａｌａ、又はＴｈｒを表す、請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体。
3. ３．本発明で定義した意味を有する請求の範囲第１項又は第２項記載の式Ｉの化 合物を含有することを特徴とする、製剤。
4. ４．可溶性である、請求の範囲第３項記載の製剤。
5. ５．吸収を促進する化合物を含有する、請求の範囲第４項記載の製剤。
6. ６．前記化合物がマグネシウム塩である、請求の範囲第５項記載の製剤。
7. ７．約３〜４の範囲内のｐＨ値で溶液であり、更に約０・００５Ｍ〜約０．５Ｍ の濃度でマグネシウムイオンを含有し、更に該製剤が好ましくは式Ｉ（式中、Ａ ２１はＣｌｎとは異なる）の化合物を含有する、請求の範囲第６項記載の製剤。
8. ８．前記化合物が、アルギニン又はリシンである、請求の範囲第５項記載の製剤 。
9. ９．亜鉛イオンおよび／又はプロタミンを含有する、請求の範囲第３，４，６， ７又８項のいずれかに記載の製剤。
10. １０．約２．０〜約８、好ましくは約２．５〜約８の範囲内のｐＨ値を有する、 請求の範囲第３〜第９項のいずれかに記載の製剤。
11. １１．約２．５〜約４．５又は約６．５〜約８．０の範囲内のｐＨ値を有する、 請求の範囲第１０項記載の製剤。
12. １２．請求の範囲第１項記載のインシュリン誘導体の調製方法であって、 次式ＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）（式中、Ａ２１は請求の範囲第１項 で定義した意味であり、更にＸは結合、アミノ酸残基又はＣｌｙ２１のアミノ基 に対しＬｙｓＢ２９のカルボキシル基を架橋するペプチド残基である）で表され る生合成前駆体化合物を、水および有機溶剤の混合物中触媒としてトリプシン又 はトリプシン様酵素を用いて次式ＩＩＩ： Ｚ−ＯＲ（ＩＩＩ） （式中、ＺはＴｈｒ，Ａｌａ又はＳｅｒであり、ここにおいてヒドロキシル基は 保護されることができ、更にＲはカルボキシ保護基である） で表されるアミノ化合物と反応させ、しかる後、カルボキシ保護基およびヒドロ キシ保護を除去する、前記方法。
13. １３．前記Ｘが次式ＩＶ： −（Ｑｑ−Ｋ）ｒ （式中、Ｑはｑ個のアミノ酸を有するペプチド鎖を表し、ｑは０〜３３の整数で あり、ＫはＬｙｓ又はＡｒｇであり、更にｒは０又は１である） で表される部分である請求の範囲第１２項記載の方法。