JPH01502266A - １―アミノ―１―デオキシオリゴ糖とその誘導体の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １−アミノ−１−デオキシオリゴ環とその誘導体の製造発明の背景 動物、虫、Ｍ物及び例えば酵母のような、単細胞性真核細胞によって合成される 、ある種の蛋白質はグリコジル化されている；すなわちオリゴ１１Ｍはポリペプ チド・バックボーンに共有結合的に付着している。糖蛋白質は細胞の原形質膜の 外面とリゾソームまたはゴルジ体のような細胞内オルガネラの内腔面に主として 存在する。これらは細胞外液中にも分泌される。

糖蛋白質の炭水化物成分は個々の糖蛋白質の生物学的活性と細胞内及び細胞間の 認識イベント（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｅｖｅｎｔ）との両方に影響を与える 、多様な生物学的機能に関与すると考えられる。特定の糖蛋白質の炭水化物単位 は蛋白質の溶解性を調節し、蛋白質を熱変性または蛋白加水分解から保護し、そ の循環寿命を調節し、動物におけるその摂取部位を指示し、その抗原性に影響を 与えることができる。

細胞の原形質膜の外面に露出された蛋白質結合炭水化物成分は、生物学的認識の 重要な決定因子であると考えられる。これらはある種の成長因子、ホルモン、毒 素、ウィルス、バクテリア及びレクチンの細胞表面受容体として役立つ、細胞表 面炭水化物は、細胞と細胞外マトリックスまたは他の細胞との相互作用にも関与 する。

糖蛋白質のオリゴ糖の既知のまたは仮定された生物学的機能を考えると、これら の炭水化物単位は実験研究の非常に興味ある対象であった。この炭水化物の研究 には、構造分析、生合成系路の決定、代謝系路の個々の酵素の特異性の検討、炭 水化物の変化による糖蛋白質の生物学的活性の調節、炭水化物の蛋白質への付着 、さらに当然これらの生物学的機能の決定の試みが含まれる。

天然起源から得られた遊離還元性オリゴ糖とその誘導体も、このような研究に広 く用いられている。大ていの構造研究のためには、放射性、蛍光性またはＵｖ活 性発色団のようなレポーター基をオリゴＩ！鎖の還元末端に導入することが望ま しい、これを行うための最も一般的な方法はＮａＢ　（’Ｈ）、による還元〔ニ ス、タカサキ（Ｓ　、　Ｔａｋａｓａｋｉ）とエイ、コバタ（Ａ　、　Ｋ　ｏｂ ａｔａ）　。

メト、エン　イモル、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　）５０．５０〜５４（１ ９７８））または２−アミノピリジンとホウ水素化ナトリウムによる還元アミノ 化〔ニス、ハセ（Ｓ、　Ｈａｓｅ）等、ジェイ、バイオケム　トヨウ　Ｊ、　Ｂ ｉｏｅｈｅｅｓ、Ｔｏｋ　ｏ））である。

生成物と同様な誘導体もグリコジルトランスフェラーゼとグリコシダーゼの研究 、及び炭水化物鎖と受容体との相互作用の研究に有効であった。

遊離の還元性オリゴＷまたはそれらの誘導体も種々な目的のために、還元糖を介 して他の材料に結合されている。この例には、アフィニティ・リガンドとしての 使用のための樹脂へのオリゴ糖の結合、炭水化物に対する抗体を製造するための キャリヤ蛋白質への結合、及び蛋白質の生物学的活性を変えるための蛋白質への 結合がある。蛋白質の生物学的活性の考えられる改良には、溶解性上昇、蛋白質 加水分解または熱変性に対する安定性の上昇、抗原性または免疫原性の低下、血 清中での寿命の増加または減少、または肝細胞もしくはマクロファージのような 体内の特定の細胞種類への標的化である。

炭水化物を蛋白質または他の基質に結合させるためには、多くの手段が用いられ ている〔ライ。シー、シー（Ｙ、Ｃ，Ｌｅｅ）とアール、ティ、シー（Ｒ，Ｔ、 Ｌｅｅ）、・グリココンジュゲ−”　Ｔｈｅ　Ｇｌ　ｃｏｅｏｎ’ｕ　ａｔｅｓ ）、■巻、エム、アイ、ホロビッツ（Ｍ、１．　Ｈｏｒｏｗｉｔｚ）（編集）、 アカデミツクプレス（Ａｃａｄｅ＋５ｉｃＰ　ｒｅｓｓ）　、ニューヨーク、１ ９８２．５７〜８３頁；ジェイ、ディ、アブリン（Ｊ　、　Ｄ　、　Ａｐｌｉｎ ）／とジェイ、シー、ウリシストン。ジュニア（Ｊ、　Ｃ，Ｗｒｉｎｓｔｏｎ、 　Ｊｒ）、シーアールシー、クリト、レブ。

（ＣＲＣ、Ｃｒｉｔ、　Ｒｅｖ、　）１０巻　２３９〜３０６頁（１９８１）） 　、これらの方法はジアゾ結合、チオカルバミル化、アミド化、アミジン化、還 元アルキル化、トランスグルタミン化及び例えば２，４゜６−ドリクロローｓ− ｈリアジン及び２．４−ジイソシアノトルエンのような、二官能性試薬の使用を 含むが、これらに限定されるわけではない。

種々のオリゴ糖誘導体の製造に用いられる反応は一般に、ピラノース還の開放鎖 形（アルジトール）への還元またはオリゴ糖還元末端に対する○−またはＳ−グ リコシド結合を生ずる。

Ａｓｎ結合グリカン鎖から誘導したオリゴ糖を用いる場合には、これらの誘導反 応を実施することは困難である。

本発明はＡｓｎ結合結合オリ全糖むペプチド並びに蛋白質から１−アミノ−１− デオキシオリゴ環を得、これをＡｓｎ結合オリゴ蛋白質のβ−グリコジルアミン 結合とピラノシル還とを保有するＮ−グリコシド誘導体に転化するための酵素反 応に関する。

死！！■１糺 本発明はＡｓｎ結合結合オリ全糖むグリコペプチドまたは糖蛋白質から１−アミ ノ−１−デオキシオリゴ環を得るための酵素反応を提供し、炭水化物成分の構造 、生合成及び機能の研究に有用なアミノデオキシオリゴ糖の誘導体について述べ 、これらのアミノデオキシ糖を蛋白質に結合させて、その生物学的活性を強化す る方法を提供する。

区Ｉ！」１（４説朋− 第１図はＡｓｎ結合結合オリ全糖ミダーゼとＮ−グリコシダーゼの作用による加 水分解機構を説明する。

第２図は１−アミノ−１−デオキシオリゴ環のアシル誘導体のりジン残基のε− アミノ基への結合を説明する。

第３図は１−アミノ−１−デオキシオリゴ環のアシル誘導体のシスティン残基の チオール基への結合を説明する。

第４図は１−アミノ−１−デオキシオリゴ環のアシル誘導体のグルタミン酸また はアスパラギン酸残基のカルボキシレート基への結合を説明する。

第５図は１−アミノ−１−デオキシオリゴ環のアシル誘導体のグルタミン残基の アミド基への結合を説明する。

第６図はアーモンド・エマルジンからのアスパルチルＮ−アセチルグリコジルア ミンアミドヒドロラーゼによる七面鳥・オボムコイド・グリコペプチドの加水分 解を説明する０反応の６時点で記録した’ＨＮＭＲスペクトルの一部をプロット する（一定の比例で縮小したものではない）、アスパラギン残基に結合したＮ− ア七チルグルコサミンオリゴ糖のアノマープロトン（５，０２０ｐｐｍ）とＮ− アセチル基（２，０ＯＯｐｐ＊）及びアスパラギンの２つのβ−プロトン（２， ８９３と２．７６６ｐｐｍ）のＮＭＲシグナルは、加水分解が進行するにつれて 強度が低下する。同時に、遊離炭水化物部分の還元末端残基のＮ−アセチル基（ ２，０３７ｐｐｍ）と加水分解反応中に形成されたアスパラギン酸の２つのβ− プロトン（２，７３０と２．６２０ｐｐｍ）に対するＮＭＲ−・グナルが出現す る。　５．１８８ｐｐｍのＮＭＲシグナルは最終的平衡化生成物のα−アノマー のアノマー・プロトンである；１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖が酵素触媒作 用によって形成され、次に非酵素的加水分解を経てアンモニアを放出することに 一致して、このシグナルの出現は遅延する。

第７図はβ−アスパルチルＮ−アセチルグリコジルアミンアミドヒドロラーゼと ターキー・オボムコイド・グリコペプチド（Ｔ　ＯＧ　）との反応中に形成され る１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖の捕捉を説明する。Ａ、酵素による加水分 解前のＴＯＧの’ＨＮＭＲスペクトルの１部、Ｂ、ＴＯＧの酵素との１時間イン キュベーション後、反応を無水酢酸によって抑制する。

５．０４５ｐｐｍのＮ　Ｍ　Ｒシグナルはβコンホーメーションで捕捉された１ 、２−ジアセトアミド中間体のアノマー・プロトンである。

このシグナルは一部、オリゴ糖のマンノース残基のアノマー・プロトン（５，０ ５８ｐｐ−）に重複する。０．４時間インキュベーション後、アミノデオキシオ リゴ糖の加水分解のために、中間体捕捉量は大きく減少する。　５．１８８ｐｐ ＋ｓのシグナルは最終平衡化生成物の還元末端のα−アノマーのアノマー・プロ トンである。Ｄ。

加水分解反応からの完全に平衡化した炭水化物部分。

第８図はターキー・オボムコイド・グリコペプチドの炭水化物部分のＮ−アセチ ル基（Ａ）と、１時間インキュベーション後に無水酢酸によって加水分解反応を 抑制した場合に形成される１−アセトアミド誘導体（Ｂ）を説明する。　Ａ、　 ２０００ｐｐ−のＮ−アセチル基はアスパラギンに結合したＮ−アセチルグルコ サミンのＮ−アセチル基である。Ｂ、アセチル化すると、１−アミノ−Ｎ−アセ チルグルコサミン−オリゴ糖中間体のβ−１−アセトアミド誘導体が形成される 。２，００２と２，０ＯＯｐｐ−のＮＭＲシグナルは還元末端のＮ−アセチルグ ルコサミン残基の１−アセトアミド基と２−アセトアミド基のシグナルである。

−アセチルグリコサミン・アミドヒドロラーゼによるターキー・オボムコイド・ グリコペプチドの加水分解を説明する６反応の２時点で記録したＩＨＮＭＲスペ クトルの１部をプロットする。シグナルは第６図に述べた通りである。３６時間 にも、完全に平衡化したオリゴ糖（５，１８８ｐｐｍ）は殆んど観察されない。

アンモニアまたはある種のアミンと遊離還元単糖との反応による種々のオリゴシ ルアミンの製造方法は幾つか存在する〔例えば、エッチ、ニス、イスベル（Ｈ， Ｓ、ｌ５ｈｅｌｌ）とエッチ。

エル、フレンチ（Ｈ、Ｌ　、　Ｆ　ｒｅｎｃｈ）メト、カルブ、ケム（Ｍｅｔｈ 。

Ｃａｒｂ、　Ｃｈｅｗ、　）４巻、２５５頁（１９８０））　、生成するグリコ サミンはアルカリ性ｐＨで安定であるが、約４〜６のｐＨ値では迅速に加水分解 する。遊離還元性オリゴ糖をアンモニアによる処置によってグリコジルアミンに 転化させることも、原則として、可能である。

本発明の１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖は、１種類以上のＡｓｎ結合結合オ リ含糖むグリコ糖または糖蛋白質を中性またはアルカリ性ｐＨにおいてβ−アス パルチルグリコジルアミンアミドヒドロラーゼによって処理することによって得 られる。

この種類の酵素はＮ−アセチルグルコサミニルアスパルテート結合を開裂して、 アスパラギンＲ残基と１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖とを生ずる。このアミ ノデオキシオリゴ糖は次に非酵素的反応によってアンモニアを放出する（第１図 ）、単純なグリコジルアミンの場合と同様に、アンモニア放出速度はｐＨ依存性 であり、酸性ｐＨでは迅速であるが、アルカリ性ｐＨでは緩慢になる。

アスパルチルグリコジルアミンアミドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、１９６ ５年に化学文献で初めて紹介された〔イー、デ仁カバルグネバ（Ｅ、　Ｄ、　Ｋ ａｖｅｒｇｎｅｖａ）、ズブ、ア　ド・す　・ニス、ニス、ニス、アール、セル 、　ム（Ｉ　ｚｖ、　Ａｋａｄ、　Ｎａｕｋ。

Ｓ、　Ｓ、　Ｓ、　Ｒ，Ｓｅｒ、　Ｋｈｉｍ）１０．１９１１（１９６５）：エ ム、ムラカミ。

（Ｍ、　Ｍｕｒａｋａｓｉ）とイー、エッチ、アイター（Ｅ、　Ｈ−Ｅｙｌａｒ ）。

ジェイ、パイ　ル、　ム、　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）２４０号、５ ５６（１９６５）　、シー、ビー、ジェイ、ロストン、　（Ｃ、Ｐ　、Ｊ　、Ｒ ｏｓｔｏｎ）。

ジェイ、シー、カイギル（Ｊ　、　Ｃ、Ｃａｙｇｉｌｌ）とエフ、アール。

−ジェオニス（Ｆ、　Ｒ，Ｊｅｏ論ｓ）、バイ　ム、ジｘ　４　、　（Ｂ　１ｏ ｃｈｅ＋ｓ。

Ｊ　、　）９７．４３（１９６５））　、種々なソースからのこのような酵素は β−アスパルチルＮ−アセチルグルコシルアミンアミドヒドロラーゼであること が分っている〔エム、マキノ（Ｍ、　Ｍａｋｉｎｏ）等、バイ　ム、バイ　ワイ ズ。レス、コム、ＢｌｏＣｈＣ輪ｂＲｅｓ、　Ｃｏｍｅ、　）２４，９６１＜１ ９６６）；エイ、エル、クレソチン（Ａ、Ｌ。

Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ）とエフ、マレイ、　（Ｆ、　Ｍａｌｅｙ）−、バイ　ム。

バイオフィズ（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　）１３０， ２９５〜３０３（１９６９）　；ジェイ、コンチー（Ｊ　、　Ｃｏｎｃｈｉｅ） とアイ、ストラチャン（Ｉ　、　Ｓ　ｔｒａｃｈａｎ）　、バイ　ム、ジエイ　 １１５，７０９〜７１５（１９６９）　ニジエイ、コンチー等、バイ　ム、ジエ イ、　１１５，７１７〜７２３（１９６９））　。

これらの好ましい基質はβ−アスパルチルＮ−アセチルグルコサミン（Ａｓｎ− Ｇ１ｃＮＡｅ’）であ°るが、ある種のＡｓｎ−オリゴ糖も加水分解される。ア スパラギンのアミノ基またはカルボシル基の置換によっても、酵素によって加水 分解されない基質が生ずる。このように、グリコペプチドと糖蛋白質は基質では ない。

β−アスパルチル−Ｎ−アセチルグルコシルアミンアミドヒドロラーゼはＡｓｎ 結合結合オリ含糖化破壊に役割を果たすと考えられる。ヒトの同酵素は肝臓から 均質になるまで精製され〔エム、エム、マクガーバン（Ｍ　、　Ｍ　、　ＭｃＧ ｏｖｅｒｎ）等、ジエイ、バイ　−ル、　ム２５Ｂ、１０７４３〜１０７４７（ １９８３））　、ているが、このアスパルチルＮ−アセチルグルコシルアミンア ミドヒドロラーゼが欠乏すると、アスパルチルグルコサミン尿症と呼ばれる遺伝 的欠乏症が生ずる。臨床症状は精神１弱、顔面及び骨格の異常、及び高レベルＡ ｓｎ−Ｇ１ｃＮＡｃの尿中***である。

アスパルチルＮ−アセチルグルコシルアミンアミドヒドロラーゼは、ブタ血清、 ニワトリ卵管、ラット肝臓及びヒト肝臓を含めた幾つかのソースから精製されて いる。この酵素は４．０〜６．０の広い最適ｐＨ領域を有する。蛋白質の報告さ れた分子量はｓｏ、ｏｏｏ〜１１０，０００ｋＤの範囲である。

アスパルチルＮ−アセチルグルコシルアミンアミドヒドロラーゼがＡｓｎ−Ｇｆ ｃＮＡｃ結合のＮ−グリコシド結合を開裂させると最初考えられたが、次にこの 酵素はアミダーゼであることが提案されたく第１図）〔エム、ムラカミ等、バΔ 二１クツｍオーフィズ、レス、コム、旺、９６１（１９６６））　。

この結論を支持する実験的根拠を次に述べる：１、低いｐＨ値では、化学量論量 のアスパラギン酸、アンモニア及びＮ−アセチルグルコサミンが形成されるが、 アルカリ性ｐＨでは、反応混合物が酸性化するまで、予想アンモニアのごく少量 が放出されるにすぎない。

２、純粋な１−アミノ−１−デオキシ−Ｎ−アセチルグルコサミンと同じのクロ マトグラフィ移動性を有する化合物の検出。

アミノデオキシ糖中間体を生ずるように思われるアスパルチルＮ−アセチルグル コシルアミンアミドヒドロラーゼには、ブタ血清からの酵素〔エム、マキノ等、 バイオ　ム、バイオフィズ、レス、コム、２４，９６１（１９６６））　、ニワ トリ卵管からの酵素〔エイ、エル、クレソチンとエフ、マレイ、アー　、バイオ ゲム、バイ　フィズ、ｌ立、２９５〜３０３（１９６９）　）及びラット肝臓か らの酵素〔ジェイ、コンチーとアイ、ストラチャム、バイオケム。

ジェイ、　１１５，７０９〜７１５（１９６９））がある、さらに、ブタ血清か らの酵素がオバルブミンＡｓｎオリゴ糖を加水分解して、アミノデオキシ誘導体 の特徴を有するオリゴ糖を生ずることが観察され特表平１−５０２２ｔ；Ｇ　（ ４） な、１９７７年に、タカハシはグリコペプチドとある種の糖蛋白質中に存在する が非置換アスパラギニル誘導体には存在しないβ−アスパルチルグリコジルアミ ン結合を開裂することのできる、アーモンド・エマルシンから単離した酵素を述 べている〔バイ　ム、バイ　ワイズ。レス、コム、　７６．１１９４〜１２０１ （１９７７））　０次の論文では、このアスパルチルＮ−アセチルグリコジルア ミン結合の加水分解がアンモニアの放出に先行することの証拠が紹介された。こ の論文では、アーモンド酵素の触媒作用を受ける反応は、アスパルチルＮ−アセ チルグリコジルアミンアミドヒドロラーゼによって行われる２段階反応と同じで あり、「中間体１−アミノ−Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖の形成は確認さ れていないが、・・・これらの実験データは酵素がＮ−グリコシダーゼではなく アミダーゼであるという見解を支持する」と結論されている〔エヌ、タカハシ（ Ｎ　、Ｔａｋａｈａｓｈｉ）とエッチ、ニシベ（Ｈ，Ｎ１５ｈｉｂｅ）、ジェイ 、バイ　ム、（ＬＢｉｏｃｈｅｍ、　）８４．１４６７〜１４７３（１９７８） ）　、この記述にも拘わらず、アーモンド、エマルシンからの同酵素とフーボバ クー１ウム後にはＮ−グリコシダーゼと呼ばれている〔テ仁エッチ、プルマー、 ジュニア（Ｔ、　Ｈ，ＰＩｕｍｓ＋ｅｒ、Ｊｒ、　）とエイ、エル、夕、　レン チノ（Ａ　、　Ｌ　、　Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ）　、ジｘ４．バイ　−ル、ケム。

０旦、１０２４３〜１０２４６（１９８１）　、エイ、エル、クレソチンとティ 、エッチ、プルマー、ジュニア、ジェイ、パイオール、　ム、２５７．１０７７ ６〜１０７８０（１９８２）　；イー、エム、タガ（Ｅ、　Ｍ、　Ｔａｇａ）等 、バイオミスト’　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　）２３，８１５〜８２２（１９ ８４）　；ティ、工’ｙチ、プルマー、ジュニア等、乏；イ、バイ　−ル、　ム 、翻旦。

１０７００〜１０７０４（１９８４）　；エイ、エル、クレソチン等、バ土木九 支工と丈二、２４．４６６５〜４６７Ｈ１９８５））　、アーモンド酵素は広範 囲な特異性を有し、グリコペプチド及び糖蛋白質における高級マンノース型、バ イブリド型及び複合体型のオリゴ糖とアスパラギニル残基との間の結合を加水分 解することができる〔エヌ、タカハシとエッチ、ニシベ、バイ　ム、バイ　クイ ズ。アクタ。

（旦か」閂Ｌ」Ｉ凹止■工五ｅｔａ、　）肋ヱ、４５７〜４６７（１９６１）； エッチ。

イシハラ（Ｈ、Ｉ　５ｈｉｈａｒａ）等、同誌、６６１，２７４〜２７９（１９ ８１））　、　Ｌかし、この酵素は多くの糖蛋白質、好ましくはグリコペプチド 基質に対して少しは作用するとしても、緩慢にしか作用しない〔エイ、エル、ク レソチンとティ、エッチ、プルマー、ジュニア、ジェイ、パイオール、タム。翻 ヱ、１０７７６〜１０７８０（１９８２））　。

アーモンド・エマルシンからのアスパルチルＮ−アセチルグルコシルアミンアミ ドヒドロラーゼは、前記のアスパルチルＮ−ア七チルグルコシルアミンアミドヒ ドロラーゼニ殆んど同じｐＨ速度プロフィルを有するが、幾つかの重要な点で異 なる＝１、その好ましい基質はグリコペプチドである；２、この酵素はＡｓｎ− オリゴ糖を開裂することができない。

３、この酵素は低い分子量（６７，０ＯＯｋＤ　）を有する。

４、単独の単糖を含むグリコペプチド（ＧｌｃＮＡｃ）は基質ではない。

アーモンド・エマルシンからの酵素に類似しているように見える酵素がタチナタ マメ・ミール中に検出されている〔ケイ。

スグジャマ（Ｋ　、　Ｓ　ｕｇｕｊａｓａ）等、バイ　ム、バイ　フィズ。

レス、コム、Ｕ又、１５５〜１６０（１９８３））　。

で検出され〔ティ、エッチ、プルマー、ジュニア等、ジェイ、パイオル、ケム　 ０旦、１０７００〜１０７０４（１９８４））　、均質になるまで精製されてい る〔エイ、エル、クレソチン等、バイ　ミストに、旺、４６６５〜４６７１　（ １９８４）　）　。

このフーボバクー曇　ム酵素は次の点でアーモンド・エマルシンからのアミドヒ ドロラーゼに似ている：１．１！蛋白質とグリコペプチドを基質として好む；２ 、ＡｓｎオリゴＮまたは単独ＧＩｅＮＡｅを含むオリゴペプチドを加水分解する ことができない； ３、種々なオリゴ糖に対して同様な広範囲の特異性を有する。

しかし、幾つかの重要な相違点も存在する。

フーボバ　−１ウム酵素は、 １．１！蛋白質基質の加水分解でより活性である；２、非常に小さい分子量（３ ５，０００）を有する；３、非常に高い最Ｗｉ　ｐ　Ｈ値（８，６）を有する。

これらの重要な相違点を考えると、２シしＫが２しヴ色、アミドヒドロラーゼは 全く異なる作用機構を有するといえる。グリコペプチドからのＡｓｎオリゴ糖の 開裂中にアスパラギン残基がアスパルテートに転化するので、この酵素はアミダ ーゼ活性を有するように思われる〔ティ、エッチ、プルマー、ジュニア、等、ジ ェイ、パイオル、ツム０翻且、１０７００〜１０７０４（１９８４））　、我々 の知るかぎりでは、酵素機構の研究は存在しない。

アスパラギン残基によって蛋白質に結合するオリゴ環の構造は非常に多様である ０本発明はアミドヒドロラーゼの基質になるいずれのオリゴ環にも適用される。

Ｉ！蛋白質は典型的に、分子上に存在するオリゴ環に関してミクロ不均一性（ｍ ｉｃｒｏ−ｈｅｔｅｒｏ６ｅｎｅｉｔｙ）を示す、従って、単独の均質物質が望 ましい場合には、アミノデオキシオリゴ環またはその誘導体を精製することが必 要である。精製は多くの場合、誘導体の方が容易であろう。精製方法はレクチン 、ゲルー過、イオン交換、シリカゲルまたは逆相クロマトグラフィのような、あ る種のクロマトグラフィが好ましい。

糖蛋白質からあまり精製せずに直接得られる比較的均質なオリゴ環の例には、大 豆アグルチニンからのＨ，Ｎ−ＧｆｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ　−Ｍａｎｓ、リボ ヌクレアーゼＢからの、Ｈ＝Ｎ　ＧｌｃＮ　Ａｃ　ＧｆｃＮ　Ａｃ　Ｍａｒ＋３ 〜ｓ、フイブリノダンまたはヒトトランスフェリンからの２アンテナ性複合鎖、 ウシ１６Ｇからの近位フコース残基を含む２アンテナ性複合鎖、フェチュインか らの３アンテナ性複合鎖、及びα１−酸糖蛋白質からの４アンテナ性複合鎖があ る。

アーモンド・エマルシンとフーボバ　−１ウムメニンゴセブ九友丸からの酵素は 均質になるまで精製されている、市販されている〔セイカガク（Ｓ　ｅｉｋＢａ ｋｕ）　、日本；ジエンザイムコーポレーション（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｐｏｒ ａｔｉｏｎ）、マサチュセツツ州、ボストン〕、広範囲な基質特異性を有する、 基質としてグリコペプチドと糖蛋白質を利用することができる、中性ｐＨと塩基 性ｐＨにおいて活性であるので、アミノデオキシオリゴ環の放出に特に有用であ る０本発明では、アミドヒドロラーゼによる反応で生成する１−アミノ−１−デ オキシオリゴ環が初めて直接観察された。さらに、放出されるアミノデオキシオ リゴ環は主としてβ−アノマーとして存在するｌ後に、１−アミノ−１−デオキ シオリゴ環は安定な誘導体として初めて取り出された。

１−　ミノ−１−一　キシ　１ゴ　；　の　゛告グリコジルアミンのアシル誘導 体が製造可能であり、このアシル化グリコジルアミンは水溶液中で加水分解され ない、−ｉに安定な化合物であることは知られている〔エム、ニス、イスベルと エッチ、エル、フレンチ、メト、　ルブ、　ム、■巻２５５（１９８０））　、 　１１蛋白質中のＡｓｎオリゴ糖結合自体がグリコジルアミンの安定なアシル誘 導体の例である。現在まで、グリコペプチドの酵素加水分解によって製造された アミノデオキシオリゴ環がアシル誘導体に転化された例はない；出発物質のグリ コジルアミンは従来、遊離還元糖とアンモニアの反応によって製造されていた。

本発明では、グリコペプチドと糖蛋白質からアミドヒドロラーゼによって放出さ れたアミノデオキシオリゴ環のアシル誘導体の形成が可能であることを実証する 。−鍛には、酸塩化物、酸無水物または他の活性アシル化合物のような、反応性 アシル誘導体（これらの大部分は化学文献で周知である）をアルカリ性または中 性ｐＨにおいて、放出１−アミノ−１−デオキシオリゴ環と混合する。グリコジ ルアミンの加水分解を最小にするために、酵素反応と捕捉はｐＨ８〜９の間で実 施するのが好ましい、捕捉反応は加水分解されたペプチドまたは糖蛋白質の存在 下で実施することができるが、最初にペプチドまたは糖蛋白質を除去することが 好ましい、これはエタノール、ジオキサンまたはテトラヒドロフランのような溶 媒を加えて蛋白質を沈澱させることによって、行われる。捕捉反応は水溶液中ま たは例えばアルコール／水、テトラヒドロフラン／水、ジオキサン／水、ジメチ ルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドのような混合溶媒中で実施される。

トリエチルアミン、ピリジンまたは炭酸水素ナトリウムのような塩基を加えて、 反応中に放出される酸を中和することもできる。

ある場合には、目的生成物を直接製造する方法で、捕捉反応を実施することがで きる。他の場合には、それ自体が次の反応で他の物質に結合する２官能性リンカ −によってアミノデオキシオリゴ環を捕捉することが望ましい。

非誘導体化オリゴ環は、「レポーター」基を有さないため、通常の方法で分析す ることが困難である。実際に、感度を高めるために蛍光基または放射性基のよう な標識を導入することが、ルーチン手段である。最も一般的な標識方法の中の２ 方法は、２−アミノピリジンとホウ水素化ナトリウムによる還元アミン化〔ニス 、ハセ等、ジエイ、バイオケム　トウ　ヨウ）、９５，１９７〜２０３（１９８ ４））と、ホウ重水素化ナトリウム（ｓｏｄｉｕ＋＋＋　ｂｏｒｏｔｒｉｔｉｄ ｅ）による還元〔ニス、タカサキ（Ｓ　、　Ｔａｋａｓａｋｉ）等、メト、エン ｆ土ｉと、（性畦Ｌ」Ｊ１リー、）隘、２６３〜２６８（１９８２）　〕である 。

これらの方法のそれぞれは、おそらく遊離還元オリゴ環を形成するアンモニアの 放出を伴なうアスパルチルＮ−アセチルグリコジルアミンアミドヒドロラーゼに よって放出されるオリゴ環の分析のために用いられている〔アイ、イシイ（Ｉ　 、Ｉ　５ｈｉｉ）等、ジェオ。クロマト、　（Ｊ　、　Ｃｈｒｏｗ＋ａｔ、　） ３４５，１３４〜１３９（１９８５））　。

次に、標識オリゴ環をバイオゲルＰ４カラム上でのゲルー過りロマトクラフイ〔 ゲイ、ヤマシタ（Ｋ　、　Ｙａｍａｓｈｉｔａ）等、メト。

互Ｚｉ土％／）　阻、１０５〜１２６（１９８２）　）　、高圧液体クロマトグ ラフィ〔ア仁イシイ等、ン」Ｌ±工１克上−，３４５，１３４〜１３９（１９８ ５）　；ジェオ。ベンジゲル（Ｊ　、　Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ）とエム、ナトゲイ ・ノチ（Ｍ　、　Ｎ　ａｔｏｗｉｅｚ）　、アナル、バイ　ムＡｎａ１．　Ｂ　 ｉｏｃｈｅｍ、　）１１２゜３５７〜３６１（ニス、ジエイ、メリス（Ｓ　、　 Ｊ　、　Ｍｅｌｌｉｓ）とジエイ。

ベンジゲル、アナル、バイオケム、Ｕ↓、２７６〜２８０（１９８１））及びエ キソグリコシダーゼ消化〔ケもヤマシタ等、メト、エンザイモル、　８３，１０ ５〜１２６（１９８２））のような方法によって、分析することができる。

本発明の１実施態様では、オリゴペプチドまたは糖蛋白質からアミドヒドロラー ゼによって放出されるアミノデオキシオリゴ環をレポーター基の反応性誘導体に よって直接捕捉することができる。この例を次に挙げるが、これに限定されるわ けではない： １、塩化ダンシル処理によるジメチルアミノナフチルスルホンアミド（ダンシル ）誘導体の形成； ２、フルオレセイン・イソチオシアネート処理によるフルオレセイン誘導体の形 成； ３、アミノデオキシオリゴ環の塩化ダブシル処理による４−ジメチルアミノアゾ ベンゼン４′−スルホンアミド（ダブシル）誘導体の形成； ４、［’Ｈ）または（１４Ｃ）無水ｒ＃酸によってアミノデオキシオリゴ糖を処 理することによる〔３Ｈ）または〔Ｉ４Ｃ〕１−アセトアミド−１−デオキシオ リゴ糖の形成。

２、リコシルトランスフェラーゼとエンド−びエキソグリコシダーゼの　の　告 上記の項で述べた１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖の誘導体は、グリコジルト ランスフェラーゼとエキソ−及びエンド−グリコシダーゼの基質としても有用で ある。これらの酵素の分析には、単純な単糖と三糖類がしばしば用いられる（例 えばｐ−二トロフェニルグリコシドはエキソグリコシダーゼの分析に用いられる ）、しかしこれらの基質はしばしば酵素との結合が不充分である。自然の基質に 密接に類似するオリゴ糖を用いて分析することは非常に有利である。この目的を 実施するために、本発明の１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖誘導体は、さらに β−グリコジルアミン結合と、アスパラギンに予め結合したピラノース形のＮ− アセチルグルコサミン残基とを保有する。

３．４　バイオロジーに　するためのプローブ上記の種々な誘導体は細胞バイオ ロジーの分野にさらに用途を有している。これらの用途には、細胞、細菌または ウィルス上の受容体またはこれらから単離した受容体とオリゴ糖の相互作用の研 究がある。誘導体を！織スライスまたは全動物中のオリゴ糖結合蛋白質の所在確 認に用いることもできる。

４、ネオ　のン 上記の理由から、オリゴ糖を蛋白質に結合させる（それによって、ｒネオ糖蛋白 質」を形成する）方法をＰ発することは重要である。蛋白質のカルボキシル基と のアミド結合の形成による合成グリコジルアミンの蛋白質への結合に関しては幾 つかの報告がある。リストン〔フエブス、レット（Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　Ｌｅｔｔ、 ３３．９３〜９５（１９７３）　）はキモトリプシノゲンを１−エチル−３（３ −ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（Ｅ　Ｄ　Ｃ）と合成１−アミ ノ−デオキシグルコースによって処理している。彼はキモトリプシノゲン１分子 に対して約３当量のアミノグルコースの結合を報告している。

モツアール（Ｍｏｅｚａｒ）と共同研究者は、一連の論文において、酸性ｐＨで のＥＤＣ結合によって製造したリゾチームの幾つかのグリコジルアミン誘導体を 述べている〔イー、モツァール（Ｅ　、　Ｍｏｅｚａｒ）、イ　スペ１エンシア （Ｅｘ　ｅｒｉｅｎｔｉａ）、２９．１５７６〜１５７７（１９７２）　；イー 、モツァールとジェイ、レボ−（Ｊ　、　Ｌｅｂｏｕｅ）フェブス、レッド、四 −１３００〜３０２（１９７５）　、イー、モツアールとジー、ヴアス（Ｇ、　 Ｖａｓｓ）、ｈ　：ｆＣｂ　Ｆｌｋ、　Ｌ／２．　（Ｃａｒｂｏｈ　ｄｒ。

Ｒｅｓ、　）５０，１３３〜１４１（１９７６））　、使用したグリコジルアミ ンは、それぞれ対応する糖とアンモニアとの反応によって製造された、ラクトシ ルアミン、グリコジルアミン、ガラクトシルアミン及びマンノシルアミンであっ た。

本発明の好ましい結合方法は、２官能性試薬によるアミノデオキシオリゴ糖の捕 捉と含む。

蛋白質とオリゴ糖誘導体との結合には、化学文献で周知の種々な化学作用を用い ることができる〔例えば、ソイ。シー、シーとアール、ティ、シー、　１ココン ジユゲ一゛■巻；エム、アイ、モロヴイッツ編集、アカデミツク・プレス、１９ ８２．５７〜８３頁；ジェイ、ディ、アブリンとジェイ、シー、リストン、ジュ ニア、シーアールシー、　１ト、シブ。跨、２５９〜３０６（１９６１）参照の この方法では、蛋白質とオリゴ糖との間に挿入された「リンカ−」またはｒスペ ーサ」が存在する。この方法は広範囲な結合化学作用の使用を可能にし、蛋白質 の副反応を最小にし、オリゴ糖を他の分子との結合に利用可能にする。

誘導体化が可能である側鎖を有するアミノ酸には、ε−アミノ基を有するリジン ；ヒドロキシル基を有するセリン、スレオニンまたは千ロジン；チオール基を有 するシスティン、カルボキシレート基を有するアスパラギン酸またはグルタミン 酸、イミダゾール環のヒスチジン、芳香族環を有するフェニルアラニン、トリプ トファンまたはチロシン及びアミド基を有するグルタミンがある。好ましい結合 方法の例を次に挙げる：８．１ジンのε−アミノ　び　または蛋白−のＮ−１≠ アえ！（第２図） アミノヒドロラーゼによって放出される１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖を最 初に、例えば無水コハク酸または無水グルタル酸のような、無水環式化合物によ る処理によって捕捉する。

次にリンカ−の遊離カルボン酸基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのよ うな誘導体の形成によって、活性化する０次に、この活性化誘導体を所望の蛋白 質と反応させる。

ｂ、シス−インの　オール　（第３図）１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖は活 性化アシル誘導体とマレイミド部分とを有するリンカ−による処理によって捕捉 される。生成物は所望の蛋白質の誘導化に用いることができる。

１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖は活性化アシル誘導体と保護されたアミノ基 とを有するリンカ−による処理によって捕捉される。脱保護後に、生成物をＥＤ Ｃまたはカルボニルジイミダゾールのような、結合剤試薬によって蛋白質に結合 させることができる。前述のように、アミノデオキシオリゴ糖を蛋白質に直接結 合させることもできるが、第４図に示した方法は、ＥＤＣとの反応に好ましいｐ Ｈ（ｐＨ４〜６）においてアミノデオキシオリゴ糖のアンモニアと遊離オリゴ糖 への分解を心配する必要がないという利点を有する。

ｄ、グルタミンのアミド基（第５図） は、トランスグルタミナーゼ酵素によって触媒作用される反応によって、グルタ ミンのＮ８２基と置換することができる〔ニス、ヤン（Ｓ、Ｙａｎとエフ、ボル ド（Ｆ　、　Ｗｏｌｄ）　、）＜４　Ｓ　２’五火、垣、３７５９〜３７６５（ １９８３））　。

誘導体化反応の利用の１つは蛋白質の血清中寿命の延長である０例えば、小蛋白 質（３０，０００ｋ　Ｄ　）は主として腎臓によって迅速に循環から***される が、大きい蛋白質は別のｔｉ楕によって除去される。このように、例えばインタ ーロイキン−２のような治療用蛋白質は、腎臓からの***のため、短い血清半減 期を有する。適当なオリゴ糖を結合させることによって、腎臓によるクリアラン スが阻止される。この場合に結合させるべき最適の炭水化物値は、例えばフィブ リノゲン、トランスフェリン、フェチュインまたはα−１−酸糖蛋白質から誘導 されるような、複合オリゴ糖である。前記結合方法のいずれも用いることができ る。

誘導体化反応の第２用途は蛋白質を特定の細胞型の目標に設定することである。

！特異性細胞表面受容体を有する細胞は相補的炭水化物を有する循環蛋白質と結 合して、蛋白質を細胞内に取込むことができる。３種類の周知の糖結合受容体゛ ：・肝細胞上のアシアロ糖蛋白質（ガラクトース特異性）受容体、細網内皮細胞 上のマンノース／Ｎ−アセチルグルコサミン受容体、及び肝細胞とリンパ球上の フコース受容体が存在する。（考察のためには、イー、ノイフェルド（Ｅ　、　 Ｎｅｕｆｅｌｄ）とジー、アシュヴエル（Ｇ、　Ａｓｈｗｅｌｌ）、バイ　ミス トｌ　−オフク１　：］７’ナル゛ソ（Ｗ、　Ｌｅｎｎａｒｚ）編集、ブレニュ ーム　ブレス（Ｐ　ＩｅｎｕｍＰ　１ｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８０．２４ １〜２６６を参照のこと〕。適当な１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖を結合さ せることによって、蛋白質をこれらの細胞型のそれぞれの目標に設定することが できる。蛋白質をマクロファージの目標に設定するためには、大豆アグルチニン またはりボヌクレアーゼβのような糖蛋白質からのオリゴ糖を用いることができ る。蛋白質をアシアロ糖蛋白質受容体を含む細胞の目標として設定するためには 、フィブリノゲン、トランスフェリン、フェチュインまたはα−１−酸糖蛋白質 から、末端シアル酸残基を除去するための処理（ノイラミニダーゼまたは希酸） 後に、単離した複合オリゴ糖を用いることができる。

５、　ビーズ　び　に　るＩガント ネオＷ蛋白質の製造に関して述べた化学作用と同じ化学作用を用いて、樹脂、ビ ーズ及びフィルムのような、種々な固体物質の誘導体を製造することができる。

これらの誘導体化物質の用途は次の通りである： ａ、受容体、レクチン、グリコジルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼの精 製のためのアフィニティ樹脂としての使用； ｂ、オリゴ糖、受容体、レクチン、グリコジルトランスフェラーゼ、及びグリコ シダーゼを検出するための診断キッドへの使用。

次の例１と２は、ジェ仁エム、リスレイ（Ｊ、　Ｍ、　Ｒ１５ｌｅｙ）とアール 、エル、ヴアン　エテノ（Ｒ，Ｌ、Ｖａｎ　Ｅｔｔｅｎ）、区り仁バイオルケム 、翻皇、１５４８８〜１５４９４（１９８５）がら引用するものである。

肛 ７−％＞）”二」２在レシンか　のアスパル　ルＮ−アセ　ル　Ｉコジルアミン 　ミ゛ヒドロー−ゼに　７　−−　ボムコドグリコベプ　ドからの１−アミノ− １−オキシ第１ゴ枦の好ましい温度に平衡化した、９９．９６％２Ｈ２０中５０ ｍＭリン酸塩、１）２Ｈ７，ＯＷ衝液液中ターキー・オボムコイド糖蛋白質（イ ー、エム、タガ等、バイオケミストリー２３，８１５〜８２２（１９８４）に述 べられているように精製した、３種類の構造的に関連した複合体型オリゴ糖の不 均質混合物）１ｍｇの溶液に、全量が０．５ｍｆになるように、アーモンド・ア ミドヒドラーゼ酵素を加える０反応を’ＨＮ？１４ｍよってニアｔｏ−した。９ ９．９６％２ＨｚＯ中５０５Ｍ　！Ｊ　’／酸塩ｐ２Ｈ７，ＯＭ衝液中の１−ア ミノ−１−デオキシ−Ｎ−アセチルグルコサミンの２−アセトイミド−２−デオ キシ−Ｄ−グリコースへの加水分解を基準化合物として、’ＨＮＭＨによってフ ォローした０重要なプロトン・ピークを積分し、ピーク面積の自然対数の時間関 数としてのプロットの傾斜から擬似−次速度定数を算出した。

ターキー・オボムコイド（ＴＯＧ）がら中間体（ＩＮＴ）を経て最終炭水化物生 成物（ＣＨＯ）に至る、不可逆的と忍ゎれる２段階加水分解反応は、２つの独立 した反応によって表される。

ｋ、　ｋ。

ＴＯＧ−−−−−Ｉ　ＮＴ−−−−→ＣＨＯ酵素　Ｈ２０ に、とに２は各段階の速度定数である０式１の反応を表す微分式のセットを次に 示す： ｄ（ＴＯＧ）／ｄｔ＝−に＋　（ＴＯＧ）　（２）ｄ（ＩＮＴ）／ｄｔ＝−に、 （ＴＯＧ）−に２ＣＩＮＴ）ｔ３　（ＣＨＯ）　／ｄｔ＝−に２　（Ｉ　ＮＴ） これらの微分式はパラメータ方法の変化によって解かれる。

ＩＮＴとＣＨＯの初期濃度が零である場合には、解決は次のように縮少する： 〔ＴＯＧ〕は酵素基質の初期濃度である。

酵素の触媒作用を受ける加水分解反応中に生ずる新しいオリゴ糖の還元末端の糖 に該当すると思われる（温度依存性）化学シフトをモデル化するために、２−ア セトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコースのＩＨＮＭＲスペクトルを記録した 。観察された化学シフトはＮ−アセチル基に対して２．０４３ｐｐｍであり、ア ノマー・プロトンに対しては５．１９５ｐｐｍ（Ｊ　Ｉ　、２＝３．５８Ｈ２） と４．７０９ｐｐｍ（Ｊ　＋　、２＝８．４０Ｈｚ）（７７７者がα−アノマー 、後者がβ−アノマー）であった、−次ドメインから単離されるターキー・オボ ムコイド・グリコペプチドの炭水化物成分は、複合型オリゴ糖である。アーモン ド・アミドヒドロラーゼと共にインキュベートし、’ＨＮＭＲによってフォロー したターキー・オボムコイドの典型的な加水分解反応からのスペクトルを第６図 に示す、ターキーオボムコイドグリコペプチド中のアスパラギンに結合したＮ− アセチルグルコサミンオリゴ糖のアノマープロトンとＮ−ア七チル基はそれぞれ 、５．０２０ｐｐｍ（Ｊ　１．２＝９．５６Ｈｚ）と２．０００ｐｐｍの化学シ フトを有し、アスパラギンの２つのβ−プロトンは２．７６６ｐｐｍと２．８９ ３ｐｐｍの’ＨＮＭＲ化学シフトを有する。第６図にみられる他の’ＨＮＭＲシ グナルは、マンノース−４（５，０５８ｐｐ−）とマンノース−４’　（５，０ １８，５，００９７，４，９０８ｐｐ輸）のアノマープロトン、リシンのε−メ チレン・プロトン（３，００２ｐｐｍ、Ｊ　＝７．３２Ｈｚ）、グルタミン酸の γ−メチレン・プロトン（２，２０４ｐｐｍ、Ｊ　＝７．９８Ｈｚ）、及びター キー・オボムコイドのＮ−アセチル基（２，０Ｂ１　２．０２２９ｐｐ−）に対 するものである。加水分解反応中に、Ｎ−アセチル・シグナル（２，０００ｐｐ 輪）、アスパラギンのβ−プロトン・シグナル（２，７７６と２．８９３ｐｐｍ ）及びアノマー、プロトンシグナル（５，０２０ｐｐｍ）は、グリコペプチドが 酵素によって加水分解されるとともに弱まるが、同時に２．０３７ｐｐｍ、２． ６２０ｐｐ−と２．７３０ｐｐｍのシグナルが出現する。新しいＩＨＮＭＲシグ ナルも５．１８８ｐｐｍに出現するが、その出現は遅延する。モデル糖化合物に 基づくと、２．０３７と５．１８８ｐｐ−のＮＭＲシグナルはそれぞれ、遊離炭 水化物成分のＮ−アセチルグルコサミン・オリゴ糖のＮ−アセチル基とアノマー ・プロトン（α−アノマー）に割当てることができる。　２．６２０と２．７３ ０ｐｐｍのＮＭＲシグナルはポリペプチド鎖中のアスパラギン酸の２つのβ−プ ロトンに割当てることができる。　２．０ＯＯｐｐ＋ｍ、２．７６６ｐｐｍ、２ ．８９３ｐｐｍ、５．Ｏ２０ｐｐｍ、２．０３７ｐｐ−１２，６２０ｐ、鋤、２ ．７３０ｐｐｍ、及び５．１８８ｐｐ−の８個の夏ＨＮＭＲシグナルを全て用い て、反応過程をフォローした。　５．１８８ｐｐｍの’ＨＮＭＲシグナルが遅延 して出現したことは、加水分解反応における１−アミノオリゴ糖中間体の形成に 一致した。１−アミノオリゴ糖中間体は、１−アミノ基を有する糖のアノマープ ロトンとＮ−アセチル基とに対する明確なＩＨＮＭＲシグナルを有すると予想さ れた。しかし、１−アミノオリゴ糖のアンマー・プロトンの’ＨＮＭＲシグナル は検出されず、Ｎ−アセチル基の’ＨＮＭＲシグナルは２．０３７ｐｐ−シグナ ルの出現後も変化しなかった。＠者の観察は、中間体のＮ−アセチル基の化学シ フトとＮ−アセチルグルコサミンオリゴ糖のＮ−アセチル基の化学シフトが殆ん ど同じであると仮定すると、１−アミノオリゴ糖中間体の形成に一致した。これ らの可能性を検査するために、見かけの２段階酵素触媒加水分解反応で形成され る、可能な１−アミノオリゴ糖中間体の加水分解のモデル化合物として、１−ア ミノ−１−ジデオキシ−Ｎ−アセチルグルコサミンを用いた。

モデル化合物の加水分解速度は’ＨＮＭＲを用いて、実際に測定した。加水分解 時に、モデル化合物のアノマープロトンの’ＨＮＭＲシグナルは４．１８９ｐｐ ｍ（、Ｌ　、！＝９．３５８Ｚ）がらダウンフィールドの５．１９５ｐｐ−と４ ．７０９ｐｐ−（Ｊ　、　、、＝３．３８Ｈｚ）に移動するが（前者は生成物の Ｎ−アセチルグルコサミンのα−アノマー、後者はβ−アノマー）、Ｎ−アセチ ル基の化学シフトは変化しない、酵素触媒反応とモデル化合物の加水分解に対す る擬似−次速度定数を第１表に示す：最小自乗標準誤差分析に基づくと、擬似− 次速度の精度は±５％である。これらの限られたデータから酵素触媒反応の活性 化エネルギー９．５ｋｃａ１１モルとモデル化合物の活性化エネルギー１７．７ ｋｃａ１７モルが算出される。

匠２ ９９．９６％”８．０中５０ｎＭリン酸塩ｐ２８７．０緩衝液０．４ａｌ中のタ ーキー・オボムコイド・グリコペプチドＩＭｇの溶液を水浴中で３７℃において 平衡化した。酵素（緩衝液０．１ｄ中１．２ｔｙ）を加え、溶液を３７℃におい てインキュベートした。加水分解反応を’ＨＮＭＲによってチェックした。イン キュベーション終了時に、無水酸Ｗ１（５〜１０μりを加えて、中間体を１−ア セトアミド−Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖として捕捉し、酵素活性を抑制 した。この溶液をバイオゲルｐ４カラム（１０４Ｘ　３　ｃｍ）に塗布し、２重 蒸留脱イオン水によって室温において平衡化した。Ｂｚ１画分を回収し、Ａ２８ ０ｎｍを測定することによってポリペプチドの存在をモニターし、フェノール− 硫酸法によって炭水化物をモニターした。炭水化物含有画分を凍結乾燥し、酸化 シュウチリウムによって平衡化した：すなわち９９．７５％２Ｈで３回、９９． ９６％２Ｈで２回、９９．９９６％２Ｈで２回、２４時間平衡化し、それぞれ続 いて凍結乾燥した。炭水化物の’ＨＮＭＲを９９．９９６％２Ｈ２０中で記録し た。　９９．９９６％Ｈ２０中で無水酢酸を１−アミノ−１−ジデオキシ−Ｎ− アセチルグルコサミンと反応させて、１．２−ジアセタミドー１，２−ジデオキ シ−β−Ｄ−グルコビラノースを得ることによって、標準の基準化合物を製造し た。モデル化合物のアセチル化時にアノマー・プロトンの’ＨＮｌ’ｌシグナｌ しは４．１８９ｐｐｍ（Ｊ　、　、２＝９．３５Ｈｚ）からダウンフィールドの ５．０５３ｐｐｍ（Ｊ　Ｉ、２＝９．３３Ｈｚ）へ移動し、２−アセトアミド基 は２．０４７ｐｐ−からアップフィールドの、２個のアセトアミド基が２．０１ １ｐｐｍと２．００９ｐｐ酸の化学シフトを有する位置まで移動した；アノマー ・プロトンの結合定数は、１−アミン化合物がアセチル化時に予想量りにβ−コ ンホーメーションを保持することを示している。

ターキー・オボムコイドグリコペプチドのマンノース−４（５，０５８ｐｐｍ） とマンノース−４’　（５，０１８，５，００７，４，９０８ｐｐｍ）のアノマ ー・プロトンを第７Ａ図に示す、グリコペプチドをｐ　２　Ｈ７，０と３７℃に おいてアーモンド・アミドヒドロラーゼと共にインキュベートし、１時間インキ ュベーション後（第７Ｂ図）、２時間インキュベーション後と４時間インキュベ ーション後（第７Ｃ図）に無水酢酸を加えて反応を抑制した場合に、単離炭水化 物成分の還元末端Ｎ−アセチルグルコサミンオリゴ糖のアノマー・プロトンの’ ＨＮＭＲシグナルはダウンフィールドの５．０４５ｐｐｍ（Ｊ　＋　、ｚ＝９． ８１Ｈｚ＞へ移動した；このシグナルはマンノース−４のアノマー・プロトンの ＩＨＮＭＲに一部重複する。

最終炭水化物生成物のＮ−アセチルグルコサミン還元末端のα−アノマーのＩＨ ＮＭＲシグナルは５．ＩＳ８ｐｐｍ（Ｊ　Ｈ，２＝２．２７Ｈｚ）に出現する。

モデル化合物に基づくと、５．０４５ρｐ−のＮＭＲシグナルはβ−コンホーメ ーションのアセチル化１−アミノオリゴ糖−仮定中間体のアノマー・プロトンで ある。ＩＨＮＭＲスペクトルを積分し、アセチル化１−アミノオリゴ糖と最終炭 水化物生成物との量を総単離生成物の割合（±５％）として算出した。

予想される生成物の理論的割合を２段階反応の微分式（式３）を用いて、反応速 度データから算出した０反応１時間後に生成物の８２％が中間体として捕捉され 、１８％が最終炭水化物生成物として存在した。これと一致して、予想量はグリ コペプチド３％（酵素によって加水分解されない）、中間体８２％、最終生成物 １５％であった。捕捉前の２時間インキュベーション後に、生成鞠は中間体７２ ％と完全加水分解炭水化物２８％の混合物であった（中間体の６７％と最終生成 物の３２％は、我々の反応速度モデルに基づいて予想された。最後に、捕捉前の 反応４時間後に、中間体は４０％であり、遊離炭水化物は総生成物の６０％であ った（予想量はそれぞれ、４３％と５７％であった）、完全に加水分解され、平 衡化した炭水化物成分の同じ領域の’ＨＮＭＲスペクトルは還元末端Ｎ−アセチ ルグルコサミンオリゴ糖のα−アノマー、マンノース−４及びマンノース−４′ のアノマープロトンの共鳴シグナルを示す（第７Ｄ図）、グリコペプチドのアス パラギンに結合したＮ−アセチルグルコサミンオリゴ糖のＮ−アセチル基の’Ｈ ＮＭＲシグナルは２．０ＯＯｐｐ−に出現する（第８Ａ図）。

１時間インキュベーション後のアセチル化炭水化物のＮ−アセチル基の’ＨＮＭ Ｒスペクトルは第８Ｂ図に示す、２．ＯＯＯｐｐｍと２．００２ｐｐ−に出現す る、２つの’ＨＮＭＲシグナルは糖の還元末端の２個のＮ−アセチル基のシグナ ルである０反応２時間後と４時間後に記録されたＮ−アセチル基の’ＨＮＭＲス ペクトルは２．０００と２．００２ｐｐ−の２個のシグナルの大きさが縮少し、 １ＨＮ　Ｍ　Ｒシグナルが２．０３７ｐｐｍに出現することを示す、このように 、捕捉実験の’ＨＮＭＲデータはターキー・オボムコイド・グリコペプチドのア ーモンド・アミドヒドロラーゼ触媒加水分解の中間体として１−アミノオリゴ糖 が形成されることを直接、明確に実証する。

匠ｌ フラボバク−１ウム　メニンゴセブ　カムからのアスパルチルＮ−アセチルグリ コサミン・アミドヒドロラーゼによる、ターキー・オボムコイドグリコペプチド からの１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖の放出。

３７℃において平衡化した、９９．９６％２Ｈ，Ｏ中５０−Ｍリン酸塩ｐ２８ｓ 、０緩衝液中ＴＯＧＯ，７ｚｙの溶液に、２単位のＮ−グリカナーゼ（ゲンザイ ム、マサチュセッツ州ボストン）を加え、最終反応量を５８μｌにした。アーモ ンド・エマルジョン酵素反応に関して述べたように、反応を’ＨＮ］’ｌによっ てフォローした。

ＴＯＧの加水分解後に、アスパラギン残基に結合したＮ−アセチルグルコシルア ミン基の’ＨＮＭＲシグナルが消失した。

放出された１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖の生成は２．０３７ｐρ−のアセ チルシグナルの出現をモニターすることによってフォローした。この反応条件下 で、ＴＯＧの加水分解は３６時間後にほぼ８０％完成したく第９図）０反応は大 きな単位の酵素を添加することによって促進することができる。

例１においてｐＨ７，０で実施した反応とは異なり、放出されたβ−１−アミノ −１−デオキシオリゴ糖はｐＨ８において安定であった。従って、３６時間後に も、加水分解されたアミノデオキシ糖のα−アノマーの’ＨＮＭＲシグナル（５ ，１９ｐｐｍ）は検知されない。

例１と同様に、１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖は無水酢酸の添加によって捕 捉された。

匠± グリコジルアミンの塩イダンジルによる捕塩化ダンシルによるグリコジルアミン 捕捉の実用性なモデル化合物の２−アセトアミド−１−アミノ−１，２−ジデオ キシグルコースを用いて研究した。

０．２Ｍ　ＮａＨＣｏ、２１１１中のアミノデオキシａＦ　（４４ｍ１Ｆ）を塩 化ダンシル（６０ｉ＋９）含有アセトン１．１１と混合した０反応混合物を７０ ℃において２時間攪拌しながら加熱した０反応の終了時に、最初の黄色が痕跡の み残留する均質な溶液が得られた。シリカゲル薄層クロマトグラフィによる反応 混合物の分析（塩化メチレン／メタノール容量比５／１）は、次の反応成分二塩 化ダンシル（ｒｆｏ、９９）、ジメチルアミノナフタレンスルホンアミド（ｒｆ ｏ、９５）、ジメチルアミノナフタレンスルホン酸（ｒｆｏ、３４＞、痕跡量の ２−アセトアミド−１−アミノ−１，２−ジデオキシグルコース（ｒｆＯ，０６ ）及び新しい生成物（ｒｆｏ、５５）の存在を明らかにした。　ｒｆｏ、５５の スポットに対応する反応生成物をシリカゲルクロマトグラフィ（２Ｘ　１５ｃｍ カラム、塩化メチレン／メタノール容量比６／１によって溶出）によって精製し た。目的生成物の１部を汚染物を含まない状態で得た（この生成物の溶出量は１ ００〜１１０ｚ１であった）、減圧濃縮後に、黄色ガラスＩＺｗｇが得られた。

ＩＨＮＭＲ分析は、この物質が予想された２−アセトアミド−１゜２−ジデオキ シ−１−ジメチルアミノナフタレンスルホンアミド−β−Ｄ−グルコースである ことを確証しな：１．５０（Ｓ　３Ｈ。

ＣＨ３−Ｃ−ＮＨ）、２．８５（Ｓ　６　Ｈ、（ＣＨ５）２　Ｎ　＞、３．１０ −３．９０（ｍ６Ｈ，ピラノース環プロトン）、４．５５（ｄ、　Ｉ　Ｈ、アノ マー、Ｊ＝９．４Ｈｚ）、７．２７−７．５９（ｓ、　３　Ｈ、芳香族）、８． ２５　８．５４（−、３Ｈ。

芳香族）、単離生成物中にはα−アノマー（δ５．１０）が少量（５％）存在す るように見えた。生成物のＵＶスペクトルは２５１ｎ−と３３６ｎｍにλ―ａ× を有する、２つの吸光ピーク（ＥｔＯＨ）を示した。

１−アミノ−Ｎ−アセチル　ターキー・オボムコイド温度　グルコサミン　酵　 素　グリコペプチド１０ｘｋ（ｍｉｎ−’　）　１０３ｘ１０３ｘｋ（’’Ｃｕ ｇ ２２　０．８８ ２４　（１，０８）’　３７．５　１．０５３７　３．８１　３７．５　１．９ １ ７５．０　２．８０ （１２００，６１，１２ ３９（４，５６ビ　５０．０　３．１９１　”Ｈ７，Ｏにお番る　応の　−ご゛ −、　手続補正書（方式）− 祖嬶、おａ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０３２７ｇ ２、発明の名称 １−アミノ−１−デオキシオリゴ糖とその誘導体の製造３、補正をする者 名　称　ジエンジム・コーポレーション　（外２名）４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の１」付　平成１年　４月　４日　侵送日）６、補正の対象 、（１）出願人、発明者、出願人の代表者名を正確に記載した国内書面（２）委 任状及び翻訳文（全員のもの）国際調査報告 Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： １−Ａｍ１：”ａｏ−１−ｃｉｅｏｘｙｏｌ　ｉｇｏｓａｃｃｎａｒ　ｌ　ｄｅ ｃｉｅｏｘｙｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅａｓｐａｒｔｌＶ１９１：ｙ’ｃ Ｏ５ａｍｉｎｅ　ａｍｌｄｏｎｙａｒｏｌａｓｅｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄ ｅ、５ａｃｃｈａｒｉ６ｅ１−ａｅｏｘｙ Ｆｌａｖｏ’ｏａｃｔｅｒｉ＊ｍ １ｍａｎｄ ａｓｐａｒ：ｙ１ｇｌｕｃｏｓａｍｌｎ？ＰＣ？／ビ５６７１０３２７８ Ｇｒｏｕｐ　Ｉ工Ｘ、　Ｃ１ａｉｚ　９．　６ｒａｗｎ　ｔｏ　ａｒ＋　ｏｒｇ ａｒ、ｉｃ　５ｕｐｐｏｒ＝。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも６．５のｐＨにおいて、１個以上のＡｓｎ結合オリゴ糖含有グリ コペプチドまたは糖蛋白質をβ−アスパルチルグリコシルアミン・アミドヒドロ ラーゼと反応させることから成る、１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖の製造方 法。
2. ２．前記β−アスパルチルグリコシルアミン・アミドヒドロラーゼをアーモンド ・エマルジョンまたはフラボバクテリウム菌株から誘導する請求の範囲第１項記 載の方法。
3. ３．前記ｐＨが６．５〜９．５の範囲である請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖を共有結合させたペプチド、ポリペプチ ドまたは蛋白質。
5. ５．前記１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖に対する前記結合が２官能住試薬に よるものである請求の範囲第４項記載のペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質。
6. ６．アミノ基をフルオレセイン基、バイオルミネセント基、アミノ酸と反応しう る基、放射性原子を含む基または酵素によって誘導体化した１−アミノ−１−デ オキシオリゴ糖。
7. ７．グリコシルアミン結合が４〜１０の全てのｐＨ値において、２５℃の水溶液 中で２日間に１０％未満の加水分解を示す請求の範囲第６項記載の誘導体化した １−アミノ−１−デオキシオリゴ糖。
8. ８．前記２官能性試薬の１つの官能基が前記１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖 のアミノ基と反応し、前記２官能性試薬の他の官能が前記ペプチド、ポリペプチ ドまたは蛋白質のアミノ酸の化学基と反応するが、前記化学基がアミノ末端アミ ノ酸の遊離アミノ基、カルボキシ末端アミノ酸の遊離カルボキシル基、リジンの ε−アミノ基、セリン、スレオニンまたはチロシンのヒドロキシル基、システイ ンのチオール基、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基、ヒスチ ジンのイミダゾール環、フェニルアラニン、トリプトファンまたはチロシンの芳 香族環、またはグルタミンのアミド基である請求の範囲第５項記載のペプチド、 ポリペプチド、または蛋白質。
9. ９．１−アミノ−１−デオキシオリゴ糖を共有結合させた有機固体支持体。
10. １０．下記オリゴ糖を求電子試薬と反応させることから成る、１−アミノ−１− デオキシオリゴ糖のアミノ基の誘導体化方法。
11. １１．前記求電子試薬が前記アミノ基をアミド誘導体に転化させる請求の範囲第 １０項記載の方法。
12. １２．前記アミド誘導体がカルボキサミド、スルホンアミド、またはウレタンで ある請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．前記反応を７〜１１のｐＨ値において実施する請求の範囲第１０項記載の 方法。