JPH01501120A - 位置非特異性リパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 位置非特異性リパーゼ 〔産業上の利用分野〕 本発明は、溶液状および固定化状態で上昇した熱安定性の新規な位置非特異性リ パーゼ、その製造方法並びにエステル加水分解、エステル合成およびエステル交 換への用途に関する。

〔定　義〕 次の定義の下線を引いた語が本明細書において用いられる。

リパーゼとは、水不溶性カルボン酸エステル類のエステル結合に影響を及ぼす反 応（例えば加水分解、エステル結合の合成および交換）を促進する酵素を意味す る。

皿定止ユバ二叉とは、′固定化生物触媒の特徴に対するガイドライン（Ｇｕｉｄ ｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉ ｍｍｏ−ｂｉｒｉｚｅｄ　ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ）”（１９８３）、Ｅｎｚ ｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、。

５．３０４−３０７に定義されるような、固定化酵素または固定化細胞の形態に おけるリパーゼを意味する。ｎ車止化ＩＪ　ｔ＜二叉とは、リパーゼを固定化す ることなく化学的に装飾したものを意味する＊ｇバユ叉とは、固定化もまたは誘 導体化のいずれをも行っていない未修飾リパーゼを意味する。

Ｉパーゼ（または詩１」巳し立二旦と略す）とは・トリグリセリド分子の１−お よび３−位の脂肪族アシル基と優先的に反応するものであり、そして１　１ノで −ゼ（または非＃二笠と略す）とは、トリグリセリドの３つの脂肪族アシル基す べてと同等の速度で反応するものをいう。

〔従来の技術〕

微生物起源（細胞内および細胞外双方）、並びに植物および動物起源の広範な種 々のリパーゼが既知である。ｔ８胞外徽生物リパーゼの一般的な言及については 、Ａ、ＲｏＭａｃｒａｅの「微生物酵素及びバイオテクノロジー（Ｍｉｃｒｏｂ ｉａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　（ｍ者、 Ｗ、Ｆｏｇａｒｔｙ）、ｌ５ＢＮ　０−８５３３４−１８５−０゜Ａｐｐｌｉｅ ｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　ＬＬｄ、１９８３、の２２５ｆｆ 頁を参照のこと。

次の微生物に由来する非特異性リパーゼが既知である：スタフィロコツカス・ア ウレウス（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃ■　ａｕｒｅｕｓ）（Ｖａｄｅｈｒａ、Ｄ 、Ｖ、　（１９７４）、Ｌｉｐｉｄｓ、　９．１５８）　、ペニシリウム・シク ロピウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　Ｈ虱並ｎ畦（Ｏｋｕｍｕｒａ、Ｓ、、等（ １９７６）Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｒｉｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ）＋＋　４ ０＋６５５並びにＲｅｎｓｈａｗ　Ｅ、Ｃ，およびＳａｎ　Ｃｌｅｍｅｎｔｅ　 Ｃ，Ｌ、（１９６６）　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ １１’ｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、８＋２１４）　、コリネバクテリウム・アク ネス（Ｃｏｒ　ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　７　（Ｈａｓｓｉｎｇ、Ｇ、Ｈ，（１ ９７１）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ＋　皿 ３８１およびＰａｂｌｏ　Ｇ、（１９７４）ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎ ｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｄｅｒｆｆｉａｔ０１０ｇ３１１６３１２３１）　、 プロビオバニクテリウム・アク未ス等、（１９８１）ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇ ｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１２虹３９３　）　、カンデイダ・ シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇ旦皿胆匹針〔また、カンデイダ・ルゴ尤筐 。

ｎｌ狙りとして知られている）　（Ｂｅｎｚｏｎａｎａ＋Ｇ、およびＥｓｐｏｓ ｉｔｏ。

Ｓ、（１９７１）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃ ｔａ　２３１．１５；並びにＫ　ｉｍｕｒａ　＋　Ｙ、　（１９８３）　Ｅｕｒ 、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　、　＋　１’Ｌ 　１０７j、 カンディダ・タルベータ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｕｒｖａｔａ）　（Ｔ］、？Ｉｏ ｎｔｅｔ等（１９８５）、Ｆｅｔｔｅ　５ｅｉｆｅｎ　Ａｎｓｔｒｉｃｈｍｉｔ ｔｅｌ、　８Ｌ１８１）　＊　Ｌかしながら、引用文献および本明細書の例にお けるデータは、これらのリパーゼのすべては約６０℃以上で長時間使用するには 熱安定性が不十分であることを示している。またさらに、Ｓ、アウレウス、Ｃ， アクネス、およびＰ、アクネスは病原微生物の疑いがあるか、または病原微生物 と判明している。

ゲオトリクム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕ＋ａ　ｃａｎｄｉｄｕｍ）由 来のリパーゼ（Ｊｅｎｓｅｎ、Ｒ，Ｇ、　（１９７４）Ｌｉｐｉｄｓ、　９　＋ １４９；Ｊｅｎｓｅｎ＋Ｒ，Ｇ等（１９７２）Ｌｉｐｉｄｓ　７．７３８：並び にＴｓｕｊｉｓａｋａ、Ｙ、およびＩｗａＬＭ。

（１９８４）化学と工業、５８　、６０）は、位置非特異性であるが、しかし一 定の不飽和脂肪族アシル基に対しては高い特異性を有し、しかも熱安定性でない 。

さらに、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　４）（Ｌｉｕ、Ｗ、Ｈ ，＋Ｂｅｐｐｕ、Ｔ、およびＡｒｉｍａ、　Ｋ、　（１９７３）　Ａｇｒｉｃｕ ｌ　ｔｕｒａｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ＋　３７ ＋１’３４９　）およびクロモバクテリウム０ビスコスム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｓ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ）　（Ｓｕｇｉｕｒａ。

翫およびｌ５ｏｂｅ、Ｍ、（１９７５）　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｐｈａｒ ａ＋ａｃｅｕｔｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ、２３１２２８）由来のリパーゼが非 特異性リパーゼとして開示されている。しかし、その後の結果（Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｖｉｅｗ ｓ＋ｖｏ１３．（９月、１９８５）２００頁〕は、これらの２種のリパーゼが実 際には特異性であることを示している。またさらに、本明細書の例におけるデー タも、Ｃ，ビスコスムのリパーゼが特異性であることを実証する。

固定化非特異性リパーゼはＹ、Ｋｉｍｕｒａ等により、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｍｉｃ−ｒ ｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ、１７（１９８３）　、１０７−１１２頁に開 示されている。

該リパーゼはカンデイダ・シリンドラセアに由来するものであり、記載中のデー タは該固定化リパーゼが約４０℃の至適温度を有し、そして５０℃においてかな りの失活があることを示す。

固定化非特異性リパーゼおよびその脂質のランダムなエステル交換への用途は、 Ｍａｃｒａｅ、Ａ、Ｒ，により（１９８３）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆｔｈｅ　Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’　５ｏｃｉｅｔｙ　（ＪＡＯＣＳ ）＋　６（Ｌ２９１に開示されている。しかしながら、処理温度は４０℃だけで あった。この低い温度は、カンディダ・シリンドラセアリバーゼの熱安定性がお そらく劣るために選ばれたのであろう。

熱安定性で非特異性リパーゼの必要性は、溶媒を用いないで約６０℃以上の高い 融点を有する基質の処理、例えばマーガリン工業での脂質のランダム化について 存在する。この言及は、Ａ、Ｒ，ＭａｃｒａｅおよびＲｏＣ，Ｈａｍｍｏｎｄ： 　”リパーゼ”の現在及び将来の利用（Ｐｒｅｓｅｎｔ　ａｎｄ　Ｆｕｔｕｒｅ 　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆＬｉｐａｓｅｓ）−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅνｌ　ｅＷｓ　 ＋３　、１９３−２１７　（１９８５）になされている、従来技術の調製品の熱 安定性が満足できるものでないことから、本発明の目的は、可溶性または固定化 状態において６０℃以上における長期間の使用に対して十分な熱安定性を有する 非特異性リパーゼを提供するにある。リパーゼは、これらを経済的に製造するこ とができるためには微生物性でなければならない。

〔発明の陳述〕

本発明者等は、カンディダムに属する多数の菌株が新規な非特異性リパーゼを産 生ずることを見い出した。驚くべきことに、これらの新規なリパーゼは可溶性お よび固定化状態で、Ｃ，クルベータＣＣ，ｃｕｒｖａｔａ）およびＣ，ルゴサ（ Ｃ，…■旦＋Ｃ，シリンドラセア（Ｃ，■旦ｄ）由来のものを含む従来知られて いるすべての非特異性リパーゼより、より一層熱に安定である。

従って、本発明のり、ＰＪの第１は、位置非特異性カンデイダリバーゼ調製品で あって、ｐ）１６．５の０．０８Ｍのシトレート−ホスフェート緩衝液中、７０ ℃で６０分インキュベーション後の残留リパーゼ活性が、１０％超、好ましくは ５０％趨であり、最も好ましくは８０％超であることを特徴とする前記調製品を 提供する。

本発明の第２の態様では、位置非特異性リノ々−ゼ調製品であって、（ａ）ｐＨ ６，５かつ６０℃で６０分間インキュベーションし、次に（ｂ）ｐＨ６，５の０ ．１　Ｍシトレート−ホスフェート緩衝液中、６５℃で６０分インキュベーショ ンした後のリパーゼ活性が、（ａ）後に残存する該活性の少なくとも２０％であ ることを特徴とする前記調製品を提供する。

本発明の第３の６１では、Ｃ，アンタルクチ力（Ｃ。

ａｎｔａｅｃＨｃａ）、Ｃ，ツタバエンシス（Ｃ，ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ） 　−’・フミコーラ（Ｃｈｕｍｉｃｏｌａ）もしくはＣ，ホリオルム（Ｃ。

ｈｏｌｉｏｒｕｍ）の菌株由来のリパーゼ、またはかかるリパーゼと免疫化学的 同一性を示し、しかも好ましくは前記リパーゼと同一の分子量を有するリパーゼ を含んで成ることを特徴とする位置非特異性リパーゼ調製品を提供する。

本発明の第４の態様では、カンディダ・アンタルクチ力、Ｃ，ツタバエンシス、 Ｃ，オーリクラリアエ（Ｃ，ａｕｒｉｃｕｌａ旦旦）、Ｃ，ホリオルムまたはＣ ，フミコーラの菌株の培養で得られることを特徴とする位置非特異性リパーゼ調 製品を提供する。

本発明の第５の態様では、前記のリパーゼの固定化により得られる固定化非特異 性リパーゼ調製品を提供する。

本発明の第６のＢ様では、水で部分的°にかまたは完全に飽和されている基質に よる連続固定床エステル交換（好ましくはアシドリシス）における６０℃でのリ パーゼ活性の半減期が１．０００時超であることを特徴とする熱安定性を有する 固定化非特異性カンディダリパーゼ調製品を提供する。

本発明の第７の態様では、トリオレイン中、８０℃で７２時間インキュベーショ ンした後の残留リパーゼ活性が１０％超、最も好ましくは５０％超であることを 特徴とする熱安定性を有する固定化非特異性カンディダリバーゼ調製品を提供す る。

さらに本発明は、位置非特異性リパーゼの製造方法であって、カンディダ・アン タルクチ力、Ｃ，ツタバエンシス、Ｃ。

オーリクラリアエ、Ｃ，フミコーラまたはＣ，ホリオルムの菌株を、好気性条件 下で資化性炭素源、窒素源およびリンを含有する栄養培地で培養し、好ましくは 引き続き発酵ブロスからリパーゼを回収することを含んで成ることを特徴とする 前記製造方法を提供する。

またさらに本発明は、次の （ａ）遺伝子の発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配列およびカンディダリ パーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる適当な組換えＤＮＡのクローニング ベクターを提供する工程； （ｂ）工程（ａ）由来のクローニングベクターで適当な宿主生物体を形質転換す る工程；並びに （ｃ）形質転換した宿主を適当な培地で培養し、所望により該培地からリパーゼ を回収する工程、を含んで成る非特異性カンディダリバーゼの製造方法を提供す る。

最後に、本発明は、前記のリパーゼ調製品または前記の方法で産生されるリパー ゼのリパーゼが触媒する方法（即ち、加水分解、エステル合成またはエステル交 換）における用途を提供する。

〔発明の詳細な説明〕

本発明によるリパーゼは、カンディダ属、特にＮ、Ｊ、Ｗ、Ｋｒｅｇｅｒｖａｎ 　Ｒｉｊ　により、Ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ、ａ　Ｔａｘｏｎｏｍｊｃ　５ｔｕｄｙ 　ｔｈｉｒｄｒｅｖｉｓｅｄ　ａｎｄ　ｅｎｌａｒｇｅｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅ ｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍ５ｔｅｒｄａｏ＋（１９８４）に定義されているようなカ ンディダのグループ■に属する菌株の培養により産生され得る。グループ■は、 カンディダの担子菌類アナモルフを包含する。好ましい菌株は、前記の本に定義 されるようなＣ，アンタルクチ力（Ｓエ　ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（Ｇｏｔｏ等 ）　Ｋｕｒｔｚｍａｎ等、Ｃ，ツタバエンシス（Ｃ，ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ ）　、Ｃ，オーリクラリアエ（Ｃ，ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）　、Ｃ。

フミコーラ（Ｃ，ｈｕｍｉｃｏｌａ）またはＣ，ホリオルム（Ｃ。

ｆｏｌｉｏｒｕｍ）である、また、Ｃ，アンタルクチ力は、別名スポロボロマイ セス・アンタルクチ力（Ｓ　ｏｒｏｂｏｌｏｍ　ｃｅｓ　ａｎｔａｒｃ旦組ｕ（ Ｇｏｔｏ等）、ステリグマドマイセス・アフイデイス（Ｓｔｅｒｉ　ｗ＋ａｔｏ ｓ＋　ｃｅｓ　Ｊ（Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒおよび−１ｎｄｉｓｃｈ）、およびトリ コスポロン・オリザエ（ｋ旦蝕■虹匹　肛■耗）（Ｉｔｏ等）として記載されて おり、そしてＣ，オーリクラリアエは別名トルロプシス・オーリクラリアエ（ｎ 匹旦旦旦ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）として記載されていることが認められる。

好ましいカンディダ菌株は、後に例示するリパーゼの１以上に対し免疫化学的同 一性を示す非特異性リパーゼを産生ずるものである。

好ましい菌株は、Ｃ，アンタルクチ力の次の３株を包含し、これらの菌株はブタ ペスト条約の条件に従いＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒ ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に寄託されている・−！丘１号−−！圧旦− ＤＳＭ　３８５５　１９８６．９．２９ＤＳＭ　３９０８　１９Ｂ６．１２．８ ＤＳＭ　３９０９　１９８６．１２．８さらにまた、好ましい菌株は下記のもの を包含し、これらの菌株は、下記に示す寄託番号に基づきＣｅｎｔｒａｌｂｕｒ ｅａｕ　ｖｏｏｒＳｃｈｉｗ＋ｌ１ｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ（ＣＢＳ）、Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（八ＴＣＣ）、Ａ ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ（ＮＲＲＬ）及び発酵器（ＩＦＯ）から第三者に自由に分譲され得る。

Ｃ，アンタルクチ力　ＣＢＳ　５９５５．ＪＴＣＣ３４８ＢＢ、ＮＲＲＬ　Ｙ− ８２９５（タイプ・ストレイン） Ｃ，アンタルクチ力　ＣＢＳ　６６７８．ＡＴＣＣ２８３２３Ｃ，アンタルクチ 力　ＣＢＳ　６８２１．ＮＲＲＬ　Ｙ−７９５４Ｃ，ツクバエンシス　ＣＢＳ　 ６３８９．ＡＴＣＣ２４５５５，ＮＲＲＬ　Ｙ−７７９２（タイプ・ストレイン ） Ｃ，オーリクラリアエ　ＣＢＳ　６３７９．ＡＴＣＣ２４１２１，ＩＦＯ１５８ ０（タイプ・ストレイン） Ｃ，フミコーラ　ＣＢＳ　５７１．ＡＴＣＣ１４４３８，ＩＦＯ０７６０（タイ プ・ストレイン） Ｃ，フミコーラ　ＣＢＳ　２４０１．ＡＴＣＣ９９４９，ＮＲＲＬ　Ｙ−１２６ ６゜ＩＦＯ０７５３ Ｃ，フミコーラ　ＩＦＯ１５２７ Ｃ，ホリオルム　ＣＢＳ　５２３４．ＡＴＣＣ１８８２０（タイプ・ストレイン ） 上に示したような５種の好ましいカンディダ菌株のすべてのタイプ・ストレイン が、本発明のリパーゼの産生をすることが見い出された。

上記菌株の変異株および変種もまた、本発明の範囲内にあると考慮される。

当該技術分野で知られている遺伝子工学技術は、他の菌種に本発明のリパーゼ産 生能力を転移するために使用することができる、かかる菌種の使用もまた、本発 明の範囲内にあると考慮される。

塾３ｉＪｊ＝１ 本発明のリパーゼは、可溶性および固定化状態で良好な熱安定性を有する。Ｃ， アンタルクチ力、Ｃ，オーリクラリアエおよびＣ，ツタバエンシスのリパーゼが 好ましく、特に、これらの熱安定性のためにＣ，アンタルクチカ由来のリパーゼ が好ましい。

本発明による数種のリパーゼ調製品は、熱処理期間の始めのうちは、それらがか なり速やかに活性を失うが、しかし一定時間後に残存する活性はその後の熱処理 に対して非常に安定である。この挙動は異なる熱安定性の２種以上のリパーゼの 存在、および／または熱不安定のプロテアーゼの存在および／または限定した量 のリパーゼ安定化構成要素の存在のためであるかも知れない。

Ｃ，アンタルクチカリバーゼの熱処理は、例えば６０℃で１−３時間により特に 熱安定性のリパーゼをもたらす。

カンディ　゛の立　による１パーゼのｌｊ告木本発明使用されるカンディダ菌株 は、好気性条件下、当該技術分野で公知の成分からなる培地、資化性炭素源およ び窒素源と他の微量栄養素とを一緒に含む栄養培地で培養できる。

好ましい炭素源は、炭水化物、脂質および他のエステル類であることができる。

好ましい窒素源は、無機物（例えば、硝酸塩もしくはアンモニウム塩）または有 機￥ｙＪ（例えば酵母エキストラクト、コーン・ステープ・リカー、大豆粉、綿 実粕もしくはコーングルテン）であることができる。

培地のｐｉ（は、３．５−９．５、好ましくは５．５−８．５であることができ る。発酵温度は、１５−４０℃、好ましくは２０−３４℃であることができる。

発酵後、液状酵素濃厚物は、プロスから夾雑物の除去により、そして所望により エバポレーションによるか、または逆浸透により濃縮することで製造することが できる。なお、最後に保存剤を該濃厚物に添加することもできる。

固形酵素調製品は塩、例えばＮａ２ＳＯｓ沈澱または水混和性溶媒、例えばエタ ノールもしくはアセトン沈澱により精製および／または濃縮したブロスから調製 することができ、またさらに適当な乾燥手段、例えばスプレードライをブロス中 の除去に用いることもできる。

誘導体化（化学的に修飾した）リパーゼは、当該技術分野で既知のいずれかの方 法により調製することができる。−例としては、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ、Ａ、等 （１９８６）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋８．７２−７８ に開示されているポリエチレン−グリコール（ＰＥＧ）変性法がある。

ノ１バーゼＡおよびＢ Ｃ，アンタルクチ力のリパーゼは、２成分のリパーゼＡおよびＢを含むことが見 い出された。それぞれＱ特性および用途は、本明細書で後に説明する。

精製リパーゼＡおよびＢは、発酵後のリパーゼから、例えばゲル濾過により調製 することができる。

他方、組換えＤＮＡ技術は、リパーゼＡおよびＢをコードする遺伝子の選択的な 転換に使用することができる。これについての好ましい方法は、以下に記載され る。

リパーゼＡはより熱安定性であり、リパーゼＢはＡより一層アルカリ耐性である 。そのため高温またはｐＨでの処理は、それぞれ主成分としてリパーゼＡまたは Ｂを含有する調製品を得るために使用することができる。

リパーゼＡは、４３ＫＤの分子量および８．０±０．２の等電点（ｐｌ）を有す る。リパーゼＢは、３３ＫＤの分子量および６．０±０．２のｐＩを有する。

１パーゼの　・ｔ゛　の゛ 本発明の好ましいリパーゼは、上記のカンディダ国の１つ由来のリパーゼ、殊に 上記の菌株の１つ由来の、具体的にはＤＳＭ３８５５由来のリパーゼＡまたはＢ と免疫学的な相同性を示す。

最も好ましいリパーゼは、これらのリパーゼの１つと免疫学的な相同性も、同一 の分子量をも併有する。

免疫学的な試験に用いられる抗血清の調製は、Ｎ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎ：Ｈａｎ ｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｒｍｏ＋ｕｎｏｐｒｅｃｔｐｉｔａｔｉｏｎ−ｉｎ　Ｇｅｌ 　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９８３）の第４１章に記載されている。

タンパクの免疫学的な相同性および分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　（例えば、ノボ分析法ＡＧ２１７−ＧＢによ る）、次いでＪ、Ｈａｌｄ等、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ 　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ）＋＋ｖｏ１．１（Ｌ　１５〜２６頁（１９８７）に基づ く免疫プロンティングにより測定することができる。

ＤＳＭ３８５５由来の精製リパーゼＡ（例７．由来）に対して生じる単一特異性 のラビット抗血清を、上記した方法による５ＤＳ−ＰＡＧＥの免疫プロッティン グに用いて次のリパーゼについて試験した。

Ｃ，アンタルクチ力由来二例３のように調製される粉末の０．２００溶液 Ｃ，ツタバエンシス由来：例５由来の粉末の０．２０Ｌｌ溶液Ｃ，オーリクラリ アエ由来二例６由来の粉末の０．１０Ｕ？８液Ｃ，フミコーラ由来：例６Ｂ由来 の粉末の０．７５％溶液Ｃ，ホリオルム由来：例６Ａ由来の粉末の３％溶液４３ ＫＤ位にＣ，アンタルクチ力のリパーゼは、強いバンドを示し、そしてＣ，ツタ バエンシスおよびＣ，フミコーラのリパーゼは弱いバンドを示した（即ち、これ らはＣ，アンタルクチカ由来のリパーゼと免疫学的に相同性を有し、かつ同じ分 子量を有するリパーゼを産生ずる）、Ｃ，オーリクラリアエおよびＣ，ホリオル ムのリパーゼについては、どのようなバンドも観察されなかった。

また、相同性試験は、周知のオクチル口ニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）の二重 免疫拡散法か、またはＮ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎによる上記の本の第５章および第 １４章に開示されている交差免疫電気泳動法により行うことができる。

えＤＮＡ　′°による１パーゼの 組換えＤＮＡ技術は、リパーゼを高収率で得るために、または単一成分のリパー ゼ、例えば前述のＣ，アンタルクチカ由来のリパーゼＡまたはＢを良好な収率で 産生せしめる目的で使用することができる。

好ましい方法は、宿主としてアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）菌株を 用いそして次の工程を含んで成る。

（ａ）遺伝子の発現を促進する機能をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列およびカンディ ダリパーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成る適当な組換ＤＮＡクローニング ベクターを供給する工程； （ｂ）（ａ）工程由来のクローニングベクターを用い適当、な宿主生物体を形質 転換する工程；並びに（ｃ）形質転換した宿主を適当な培地で培養し、そして所 望により培地からリパーゼを回収する工程。

特に、引用により本明細書の内容となるＥＰｏ、２３８，０２３の宿主としての Ａ、オリーゼ（Ａ、肛ｕ耗）を使用することが好ましい。

朋淀」ニレ立二ヱ 本発明の実施については、当該技術分野のいずれかの既知の方法、例えばに、Ｍ ｏ５ｂａｃｈ　（ｍ者）＝Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｎ　Ｅｎｚｙａ＋ｏｌｏｇＬ４４ ゜”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ″（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７６）に記載の方法によりリパーゼを固定化するこ とができる。酵素固定化に利用できる方法は、細胞均質化物の架橋法、不溶性の 無機もしくは有機担体への共有結合法、ゲル中への包括法およびイオン交換樹脂 もしくは他の吸着剤への吸着法が包含される。また、Ｍａｃｒａｅ　Ａ、Ｒ，お よびＨａｍｍｏｎｄ　Ｒ，Ｃ０（１９８５）　。

に開示されているような、粒状の担体上への被覆法も使用することができる。

固定化方法は、好ましくは粒状の多孔質樹脂を使用する。

リパーゼは該樹脂上に容易に吸着することができるか、または当該技術分野で既 知のグルタルアルデヒドもしくは他の架橋剤を用いる架橋により該樹脂上に結合 することができる。

好ましい樹脂のタイプは、例えばアクリル、ポリスチレンまたはフェノールホル ムアルデヒド型の弱塩基陰イオン交換樹脂である。商品化されている製品の例と しては、Ｌｅｗａｔｉｔ＠Ｅｌ　９９９／８５　（Ｂａｙｅｒ製、Ｗｅｓｔ　Ｇ ｅｒｍａｎｙ）及びＤｕｌｉｔｅｅ　ＥＳ−５６８（Ｒｏｈｍ＆　Ｂａａｓ）が 挙げられる。このタイプの樹脂上への固定化は、引用により本明細書の内容とな るＥＰＯ１４０５４２に従うのが好ましい。

他の好ましい樹脂のタイプは、フェノールホルムアルデヒド型の吸着樹脂である 。この樹脂上への固定化は、引用により本明細書の内容となる、ＤＫ８５−８７ ８に従って行うのが好ましい。

さらに他の好ましい樹脂のタイプは、アクリル型の吸着樹脂である。商品の例で はＬｅｗａ　ｔｉ　ｔ＠　Ｅ２００１／８５　（Ｂａｙｅｒ製）がある。

他の好ましい固定化方法は、無機担体を用い、そして好ましくはリパーゼを吸着 または共有結合により咳担体へ付着せしめる。かかる担体および固定化技術は、 Ｋ、Ｍｏ５ｂａｃｈ　（ｍ者）：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ ＋４４．”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ’　（ＡｃａｄｅｍｉｃＰ ｒｅｓｓ　、　１９７６）に開示されている。

！バーゼ　１−Ｌ−コ 本発明のリパーゼは、次の方法のいずれかに使用することができる（カッコ内に は反応体を示した）。

エステル加水分解方法（エステル＋水）エステル合成方法（酸＋アルコール） エステル交換方法、 アシドリシス方法（エステル＋酸） アルコリシス方法（エステル＋アルコール）エステルの相互交換またはエステル の転位方法（エステル＋エステル）を包含する。

前記アルコールは、モノ−もしくは多価の一級および／または二級アルコールま たはこれらの混合物であることができる。前記酸は、いずれかのカルボン酸また はこれらの混合物であることができる。前記エステルは、前述のアルコールおよ び酸由来のいずれかのエステルまたはこれらの混合物であることができる。いく つかの有利な方法の具体例を以下に説明する。

エ　ス　−　ル　ロ　ノ　”　； この方法は、回分式かまたは連続式かのいずれかにより実施することができる０ 回分反応器中では、脂質および水が必要量のリパーゼと共に機械的に撹拌される ０反応時間は、酵素量および所望の転化率に依存するが、一般的に４−６時間か ら３−４日迄である。固定化リパーゼを用いるならば、反応終了時に回収しそし て再使用することができ、それによって工程の経済性を改善することができる。

連続方法では、固定化リパーゼを保持する反応容器を通して、その融点以上で脂 質が流される。種々の方法、例えば脂質に水を分散させるか、または固定化リパ ーゼ中に断続的に水を吸着させるかにより、この系に水を添加することができる 。

回収における節約のために、一般に水の含量は４０％（ｗ／ｈ）以下に保たれる 。温度は反応混合物の融点以上にされ、８０℃程度の温度とすることができる。

好ましい温度は４５−７０℃である。

該方法の例は脂質の開裂である。高率の加水分解が望まれるならば、リパーゼＡ もリパーゼＢをも含んでいるＣ、アンタルクチ力のリパーゼを用いることが好ま しい。

本方法の第２の例は、コレステロールエステルの加水分解である。

第３の例として、高含有量のオレイン酸またはリルイン酸を含有する脂質はＣ， アンタルクチ力のリパーゼ、好ましくはリパーゼＡにより加水分解することがで きる。飽和脂肪酸は加水分解されるが、オレイン酸およびリルイン酸は大部分が 未反応のまま残る。遊離の脂肪酸を取り除いた後は、はぼ完全な加水分解を化学 的にまたは酵素的に、例えばＣ。

アンタルクチ力のリパーゼＢにより行うことができる０分離後、オレイン酸また はリルイン酸の高含有率の脂肪酸が得られる。この方法により、オリーブ油から オレイン酸を得ることができ、そして綿実油、大豆油またはサンフラワー油から リルイン酸を得ることができる。

基２ｊソり卸良友法 本発明は、他の方法では製造することが困難な二級アルコールのエステル化、そ して酸またはアルコールが高い融点を有するもののエステル化に特に有利である 。

本方法は、回分的にか、または連続的に実施することができる。回分方法では、 固定化リパーゼを回収しそして再利用することで経済性を高めることができる。

好ましくは反応期間を通じて、例えば減圧蒸留またはモノキュラシープへの吸着 により水を除去する６反応温度は、反応混合物を液体にするような、好ましくは ６０−９０℃より好ましくは６０−８０℃である。

単鎖のアルコール（−級または二級）からのエステルを合成するには、Ｃ，アン タルクチカリパーゼに含有されるリパーゼＢを用いるのが好ましい、長鎖の非揮 発性アルコールからエステルを合成するには、Ｃ，アンタルクチカリバーゼに含 有されるリパーゼＡを用い、水の除去のため減圧下で実施することが好ましい。

ニス文四交換 この方法では有機溶媒、例えばヘキサンまたは他の炭化水素を反応混合物中に含 ませることができる。しかしながら、本発明のリパーゼの優れた熱安定性のため に、殆どの場合溶媒を用いることなく溶媒した５質について該方法を実施するこ とが可能であり、かつ好ましいであろう。

また、反応混合物は酵素の活性を持続せしめるために、少量の水を含ませること もできる。飽和までの含有量の水を使用することができるが、高い水の含有率は 加水分解により好ましくない高率の副生物を誘導する。

反応体の純度により、固定化リパーゼの最高の生産性を達成するために該反応に 先立ち精製が必要である可能性がある。

通常の精製方法、例えば漂白法、アルカリ精製法および脱臭法を用いることがで きる。

本発明のリパーゼの優れた熱安定性のために、反応温度は９０℃までの高さであ ることができる０反応温度の下限は、反応混合物の融点および粘度により決定さ れる。好ましい温度は、６０−９０℃、最も好ましくは６０−８０℃である。

エステル交換に関しては、簡便性および経済性の理由で固定化リパーゼが特に好 ましい、また、成分Ａを含有するＣ。

アンタルクチカリバーゼが好ましい。反応は、回分式または連続式に遂行するこ とができる。

回分方法では、基質および必要により適当な溶媒が固定化リパーゼを充填して好 ましい温度に加熱されている回分反応容器中で混合される。基質は、水で部分的 にまたは完全に飽和せしめることができる。酵素量は、所望の転化率および反応 時間に基づき１０％までとすることができる。反応時間は２．３時間から数日と することができる０反応後、酵素は濾別されそして所望により溶媒洗浄後、再使 用される。

連続方法では、固定化リパーゼを含有するカラムを通して基質が流される。基質 は、酵素カラムに挿入される前に水で部分的にまたは完全に飽和することができ る。これは、例えば水で飽和した樹脂を充填している予備カラムによるか、また は基質貯蔵容器中で基質を水で飽和せしめることにより行われる。所望の転化率 は、カラムを通過する流速の調製、即ち滞留を変化せしめることにより達成する ことができる。

かかる系での操作時間は、数千時間までとすることができる。活性の漸減が生ず る場合は、流速を低下する、即ち反応混合物の滞留時間を増大せしめることによ り補うことができる。最初の滞留時間は、所望の転化率次第であり、具体的には ５分から２時間とすることができる。

この方法の実用例は、脂質のランダム化や多不飽和脂肪酸のグリセリドの製造で ある。

詣Ｉ」ヨじＣｆり化 この方法の好ましい態様は、反応混合物がトリグリセリド脂質である脂質のラン ダムエステル交換であり、反応はトリグリセリド分子間のアシル基の交換により 住する。

反応混合物は、単一の脂質分画から成ることができ、この場合は３つの異なる位 置のアシル基間で交換が起こる。

また、反応混合物は２種以上の脂質から成っていてもよく、具体的には１つは外 界温度で液体であり、他の１つは高い融点を示す脂質である。後者は、天然源か らの精留によるか、または水素添加により得ることができる。かかる混合物のラ ンダム化により得られる生成物は、マーガリン製造業で有用である。

エステル交換方法の他の好ましい態様では、反応体はトリグリセリド脂質および カルボン酸エステルから成り、特にメチルまたはエチルエステルから成る。

エステル交換後、該生成物をさらに処理することもできる。

副生物、例えば遊離の脂肪酸は常法、例えば苛性アルカリ精製によりその後除去 することができる。

生成物それ自体は、特別な用途に応じて、精留し、他の油または類似物と配合す ることができる。

ヒ　のグ１セ１ド 本発明のリパーゼは、脂質および脂肪酸または高含有率の多不飽和脂肪酸（ＰＵ ＦＡ）を有するエステル（特にメチルもしくはエチルエステル）のアシドリシス またはエステル交換に用いて、ダイエツト飲食品用の高ＰＵＦＡ含有率の脂質を 製造することができる。この目的には、Ｃ，アンタルクチカリパーゼがＰＬＩＦ Ａのエステル交換反応について高い活性を有することから特に適している。

図面の説明 第１図、第２図および第３図は、それぞれＣ，アンタルクチ力、Ｃ，ツタバエン シスおよびＣ，オーリクラリアエのリパーゼに対するｐＨ−活性曲線を示す（詳 細は例１４で示す）。

第４図は、Ｃ，アンタルクチ力のリパーゼＡおよびＢに対するｐＨ−活性曲線を 示す（詳細は例７に示す）。

第５図および第６図は、それぞれ種々の温度で固定化Ｃ。

アンタルクチ力のリパーゼを用いるアシドリシスおよびエステル交換の結果を示 す（詳細は例３１に示す）。

第７図および第８図は、それぞれｎ−プロパツールおよびイソプロバールを用い て、固定化Ｃ，アンタルクチヵにょるミリスチン酸エステル合成の結果を示す（ 詳細は例３７に示す）。

第９図および第１０図は、それぞれ固定化Ｃ，アンタルクチカのリパーゼを用い る連続アシドリシスおよびエステル交換の結果を示す（詳細は例３６および３９ に示す）。

主皿立裏鋏■ 口゛′　１パーゼ′　のアーセイ　（ＬＵおよびｏｕ２方法が用いられる。第１ の方法は、一定のｐＨでのトリブチリンの加水分解嘔基づ＜、ＩＬＩＩ（リパー ゼ単位）は、乳化剤としてのアラビアガムを有するｐＨ７，０，３０’Ｃにて１ 分当たり１ｐＩ１１０１＃Ｊ定される酪酸を遊離する酵素量である。さらに詳細 は、請求により入手可能なノボ分析法（Ｎｏｖｏ　ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＭｅｔ ｈｏｄ）　ＡＦ９５１５に示されている。

オリーブ油の加水分解によるリパーゼ単位の活性測定（並）は次のように行われ る。

酵素溶液ＩＮ！、乳状液〔オリーブ油２５−および２％ポリビ、：−ルフルコー ７Ｉ／　Ｃ（？ＩＷ約７２．０００）　７５Ｍ！をワーリングプレングー中で乳 化した）５ｗ１１、および緩衝Ｍ（５０ｍＭ）リス−マレエート緩衝液ｐＨ７， ０）を混合し、１層分間４０’Ｃにて振盪している温浴中でインキュベートする 。反応は、停止剤（アセト７５００１Ｒ１、エタノ−）Ｌｔ　５００−およびＩ 　ＮＮａＯＨ１１＊ｊ）を添加して停止する。サンプルおよびブランクサンプル （停止剤を加えた後乳化）は、０．０５ＮＮａＯＨによりｐＨ９，２まで滴定す る。活性（ＯＨ）は、サンプルとブランクとの間の滴下ＮａＯＨにおける差異か ら計算され、そして１分当たりに１廂遊離するフリーの脂肪酸として表示する。

０？六　１バーゼの　。

これはトリグリセリドの短時間加水分解で得られたジグリセリド（ＤＧ）の分析 により測定することができる。特異性リパーゼは、はとんど１．２−ＤＧのみを 生成するが、他方非特異性リパーゼはＤＧ分画中にがなりの含有率の１．３−Ｄ Ｇを与える。加水分解および処理時間は、アシル転移を避けるために短めにして おかねばならない。

より具体的には、測定は次のように行われる。

酵素液（４−１００００／ｍｆ）２５０ｍ、トリス−マレエート緩衝液（ｐＨ７ ，０）　２５０μ！および基質（トリオレイン：２％ポリビニルアルコール、Ｉ ’１Ｗ７２．０００；　１　：　３　）をエソペンドルフ遠心管中で混合し、４ ０℃で３０−９０分間振盪した。反応は、Ｃ）ＩＣ４’　。

をＬＯｍｌを混合することにより停止した（０．２％リトコール酸が内部標準と して使用されうる）。前記Ｃ）ＩｃＮ　：ｌはＮａ２ＳＯ４で乾燥した。ＩＪ！ １を１層りロマトグラフィーロンド（Ｃｈｒｏｔｎａｒｏｄ　Ｔｙｐｅ　ＳＩＩ ＋Ｎｅｗｍａｎ−Ｈｏｗｅｌｌ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｌｔｄ）上にスポット し、そして２容媒としてヘキサン／エーテル／＠酸（７０：３０：　１　）を用 いて２０分間展開した。部分グリセリドはＦＩＤアナライザー（Ｉａｔｒｏｓｃ ａｎ　丁Ｈ１０，ＮｅＫＩＩｌａｎ−ＨｏｗｅＩＩＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｌｔ ｄ）により定量した。結果は、総ＤＣ中の１゜３−ＤＣの％とじて記載した。こ のようにして、特異性リパーゼはＯを与え、そして完全な非特異性リパーゼは約 ３３％を与えることが予期されるであろう。

１バーゼの　シ゛１シス゛　（ＢＩＤ　ＢＩＵ−）この活性は、溶媒の存在下ま たは不存在下でパルミチン酸とトリオレインとの反応により測定した。パルミチ ン酸の総取り込みをトリグリセリドのＦＡ？１Ｅ−ＧＬＣにより測定した。２− 位への取り込みは、トリグリセリドを膵リパーゼで処理して１−および３−位を 加水分解した後、得られる２−モノグリセリドをＦＡＭＥ−ＧＬＣで分析するこ とにより測定した。

ＦＡＭＥ−ＧＬＣ（脂肪酸メチルエステル−ガスー液体クロマトグラフィ）は、 ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｏｉｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’　５ｏｃｉｅｔｙ（Ａ ＯＣＳ）により公表されているＣｅ　２−６６法およびＣｅ　１−６２法に従い 行うことができる。

溶媒を用いる反応の場合は、反応混合物はトリオレン０．６ｇ、パルミチンｊｄ ｏ、１７４および石油エーテル８．０８３　ｇから構成する。溶媒を用いない反 応についてはトリオレイ３．Ｏｇおよびパルミチン酸０．８７ｇを用いた。

いずれの場合も適当量の酵素を水和し、１−４時間、所定の温度で前記反応混合 物とインキュベートした後、濾過して反応を停止した。濾過物をアルミカラムで 精製し、そしてトリグリセリドをＦＡＭＥ−ＧＬＣにより分析した。別に、濾過 物２ｍ！由来のトリグリセリドを活性アルミナ４ｇ上で同様に精製した。トリグ リセリド約１００ｗ、膵リパーゼ溶液（ＳｉｇＩＩａカタログｍＬ３１２６由来 の豚膵リパーゼ２５０■をＩＭ）リス緩衝液、ｐＨ８，１０Ｗｉに溶％ｆした） ３ｄ、２　Ｍ　ＣａＣ１＊　３００ｍおよび０．２％（Ｗ／Ｖ）タウロコール酸 塩０．７５＠ｌを混合した。この乳化物を４０℃の湯浴中、２分間加熱し、そし てライ−レイ（Ｗｈｉｒｌｅｙ）ミキサーで１．５分間混合した後、その反応を ９６％エタノール４ｍＺを添加して停止した。サンプルを分液ロートに移し、ジ エチルエーテル（４Ｘ２０ｒｎりで抽出した。

エーテル相を脱イオン水２ｏｒｎｌで４度洗浄した後、エーテル相を１ｌｉａ２ ｓＯａで乾燥しそしてエバポレートした。サンプルを１゜１．１−トリクロルエ タン１−に溶解した。グリセリドをＭｅｒｃｋ社製のプレコートＴＬＣプレート シリカゲル６゜（１１０℃で３０分活性化した）により、展開溶媒としてジエチ ルエーテル／ｎ−ヘキサン（７０：３０）を用いて飽和した展開槽中で分離した 。このＴＬＣは２０”Ｃで４０分続けた。

モノグリセリドバンドをヨウ素蒸気で確認して削り取り、ジエチルエーテル１０ ｒｎｌで３度抽出した。エーテル相を濾過し、蒸発せしめそしてサンプルをメチ ル化し、次いでＧＬＣにより分析した。

Ｉ　ＢＩＵ（バッチエステル交換単位）は、溶媒の存在下または不存在下で所定 の温度における１μｍｏｌｅ／分の初速度でパルミチン酸を取り込む固定化リパ ーゼの量を示す。Ｉ　ＢＩＵ−２（２位におけるＢＩＵ）は、２−位の取り込み に由来する同様のものを意味する。

古　リパーゼの　ニ　エステル交換ゞ　（Ｂ　Ｉ　Ｕ）この活性は、等モル量の トリオレインおよびトリパルミチン混合物により測定した。混合トリグリセリド （ＰＯＯ、ＰＰＯ等）の生成物は、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） により測定した。

より具体的には、トリオレイン（ＯＯＯ）　０．８８５５ｇおよびトリパルミチ ン（Ｐ　Ｐ　Ｐ）　０．８０７３ｇ　（それぞれ１ｍＭ）を溶融し、そして乾燥 状酵素２５０■を１０％（Ｗ／Ｗ）水にて加湿して添加した。サンプルを所定の 温度で１５分間、湯浴中で振盪した後、ＨＰＬＣで分析した。

ＨＰＬＣは、Ｇ、讐、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　、２０４． ４０７（１９８１）に従い行うことができる。

ＩＢＴＵ（バッチ相互転移エステル化単位）は、所定の測定における１μ■ｏｌ ｅ／分の初速で混合トリグリセリドを生成する固定化リパーゼの量として定義し た。

古　！バーゼの　’　（ＮＳＩ　、ＮＳＩ　）これは、エステル交換（例えばア シドリシス）による最高の測定値を示した。２−位における交換の測定は非特異 性を示す、ここでは、トリオレインおよびバルミチン酸を用いるＮＳＩ＋法並び にＸＯＸ　＋−リグリセリド（Ｘ＝パルミチン酸／ステアリン酸、○＝ニオレイ ン）およびラウリン酸を用いるＮ５Ｉｚ法の２方法を用いた。最良の方法はＮＳ Ｉ、であるが、分析が非常に扱いにくい。Ｎ５ＩＺ法は簡便に行うことができる が、その結果はリパーゼの脂肪酸特異性により影響を受ける。この２つのアシド リシス法は、可溶性リパーゼについて使用される加水分解法によりも、アシル基 の移動のために誤差の生ずる傾向は少ない。

Ｎ５Ｉｔ法では、ＢＩＵおよびＢＩＩＪ−２が測定されそして指数はＮ５ＩＩ＝ 　３　Ｘ　ＢＩＵ−２／ＢＩＤとして算出される。この値は、完全な特異性リパ ーゼでは０どなり、そしてすべての３つの位置で等しく反応する非特異性リパー ゼではｌとなるにちがいない。

Ｎ５Ｉｚ法では、固定化リパーゼは活性化の必要に応じ、−ｉに約１０％水に水 和される０次の混合物を使用した。

ココアバターステアリン３４５ｑ（Ａａｒｈｕｓ　０ｉｌｅＡ　／　Ｓ　％Ｄｅ ｎｓ−ａｒｋより購入、約９５％のＸＯＸ　）リグリセリドを含有する）、ラウ リンｎ　（Ｍｅｒｃｋ）　４８０ｗ　（純度９９％）、石油エーテル（ＢＤＨ） 　８．１　ｇ　（沸点８０−１００℃）、および固定化リパーゼ２５０■（乾燥 物）。

上記成分の混合物を適当な転化率を得るに必要な時間および温度（４０−６０℃ の範囲内）で、振盪湯浴中でインキュベートした。その後、純粋なトリグリセリ ドをアルミナクロマトグラフィーにより単離し、脂肪酸組成をＦＡＭＥ−ＧＬＣ で測定した。

指数は次のように決定した。

ＮＳｈ・・３Ｘ（オレインの減少り／（ラウリンの取り込み量）特異性および非 特異性リパーゼ間の識別は、３０−６５％の範囲内のラウリン酸取り込みがもっ とも適していると考えら次の組成の培地を例で使用した。各々の培地は１２１− １３０℃で２０−９０分間オートクレーブした。

ファルマメディアの組成は、発酵培地組成物（ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＭｅｄ ｉａ　Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）についてのＴｒａｄｅｒｓ’ガイド（Ｔｒａｄ ｅｒｓ’　０１１Ｍ１ｌｌ　Ｃｏ、、　５０−５１頁）に開示されている。

ａｎｔａｒｃｔｕｃａ）菌株（ＤＳＭ　３８５５）培養物をＢｏｕ−３培地８０ ０−を有する ２００〇−振盪フラスコに移し、２６℃で】日振盪した（２００ｒｐｍ、振幅約 ２ｃｍ）。

得られる培養ブロスを、’１ＯＣａ　１　ｅ−２培地を有する一般的な１０１発 酵槽について種母として用いた。

発酵条件は次の通りであった。

発酵槽の型式：実験用発酵槽Ｆ　Ｌ　１１０（ＢｉｏｔｅｃＡ　Ｂ製、Ｂｒｏ＠ −５ｅａ、Ｓｗｅｄｅｎ）ａ 通気：６Ｎｆ／分 撹拌：　５２０ｒｐａ＋（各々６枚翼を備える２個の攪拌機による攪拌） 温度：２６℃ ｐＨ：未調整 時間：１１９時間 リパーゼの収量は１５７Ｌυ／ｗｉであった。

発酵槽から取り出した培養ブロスを６０００　Ａローターを備えたソールパル（ Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ−３Ｂ遠心機により４．１１００ｒｐで３５分間遠心した 。上澄液（総量５１りを１０．ＯＯＯＭＷカフトオフの濾過シートを備えるミリ ボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）由来のペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過装置 による限外濾過（そしてそれぞれ同一容量の水で５度洗浄した）で６００　ｍｌ に濃縮した。９９％冷エタノール６００　Ｔｎ！を前記ＵＦ　’４４厚物の５６ ０−に加え、混合物を４℃で３０分間攪拌した後、前記と同様に遠心した。

次に、−次エタノール沈殿物由来の上澄液に９９％冷エタノール２．５倍量加え た。この混合物を３０分間撹拌しそして前記と同様に遠心した。この遠心由来の ベレットを約２３０ｄの水に溶解し、そして凍結乾燥して２２ｇの粉末（１６， ２ＯＯＬＵ／ｇ）が得られた。

このリパーゼをエタノール溶離による疎水的相互作用クロマトグラフィーを用い てさらに精製し、次いで減圧下で乾燥して約９２，０ＯＯＬＵ／　ｇの粉末を得 た。

月Ｉｊ０−　Ｃ，ルベー　（Ｃ，ｃｕｒｖａｔａ　τパーゼのＵカンディダ・ク ルベータ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｕｒｖａｔａ）ＣＢＳ５７０菌株（別名、ＡＴＣ Ｃ１０５６７）を用いた。ＣＢＳはＣｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒＳ ｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、　Ｂａａｒｎ、　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを 示し、ＡＴＣＣはＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡを示す。この菌株の寒天−３スラン ト（例１参照）上の培養物を、それぞれＢｏｕ−３培地（例１参照）１ｏｏｒｎ ！を有する４個５００ａｆ振盪フラスコに移し、２６℃で１日振盪した（２０Ｏ ｒｐｍ、振幅約２０）。

Ｂｏｕ−３振盪フラスコの培養ブロスを種母として用い、各々ＬＲ−１５培地２ ００−を含有する２００個の５００　＋ｎＺ振盪フラスコを接種した。

ＬＲ−１５培地組成は次の通りであった。

底−分　Ｉ一度 フアルマメディア　５０ｇ／Ｉ Ｋ、ＨＰｏ、　５　− ＮａＮ０．　１　− ＭｇＳＯ４，７Ｈ１００，５− Ｔｗｅｅｎ−８０２０− ｐＨ７，０（ＨＣｌで調整） （１２１℃、４０分間オートクレーブした）ツウィーン−８０（Ｔｗｅｅｎ−８ ０）は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステルである（Ｍｅｒ ｃｋから入手した）。

各々の振盪フラスコを０．５−２−のＢｏｕ−２培養ブロスで接種し、２６℃で ４日間、２００　３０Ｏｒｐｍ　（振幅約２ｃｍ）にて振盪した。

この振盪フラスコ由来の培養ブロスを１５ＬＵ／−のリパーゼ活性を有する総量 で２９．５１までの収穫物を与えるものとして採集した。該ブロスを例１に記載 したように遠心し、次いでまた例１に記載したように濃縮したが、しかし１容量 の水で２度洗浄しただけである。かくして、１６８ＬＵ／ａｆのリパーゼ活性を 有する濃厚物３．９１を与えた。

肛、パイロートプーントにお番るＣ、アン　ルクチカの冨バーゼの制゛告 カンディダ・アンタルクチカ菌株ＤＳＭ３８５５の培養物をＹＰＧ−寒天含有の フエルンバッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）フラスコに接種した。

このフェルンバフハ・フラスコを２６℃で８日間培養した後、通常の混合により 接種しそして次の組成を有する培地３００１ｔを含有する種母発酵槽を通気した 。

酵母エキストラクト　３．　Ｏｋｇ ＫＨｔＰＯａ　０．２− ＮａｚＨＰＯａ、１２ＨｚＯＯ，２− グルコース　０．３− Ｐｌｕｒｏｎｉｃ＠　６０Ｌ　１２５　ＪｐＨ５，６ 前記ブロスを２６℃で１日発酵後、通常の混合物を接種に使用し、次の組成を有 する培地１５００１を含有する発酵槽を通気した。

酵母エキストラクト　７．　Ｏｋｇ ファルマメディア　５６．０− ＫＨ，Ｐｏ、　４．０− ＮａＪＰＯ，，１２ＨｚＯ−３，０− シュクロース　４．２− ＭｇＳＯ４，７ＨｚＯ１，４− 大豆油　４２１ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ・６０Ｌ　６００　＋ｎｆｐＨ６，２ 発酵は、２６℃で５日間、１０００　ＮＮ　／分の通気および２００ｒｐｍの攪 拌をしながら行った。

次の方法によりリパーゼを回収した。

１）培養ブロスのドラム濾過、２）澄明な濾過、３）限外濾過による濃縮、４） ５０％Ｗ／Ｗまでエタノールを添加、５）澄明な濾過、６）限外濾過による濃縮 、７）７７％Ｗ／Ｗまでエタノールを添加、８）遠心、９）減圧乾燥、１０）水 に再溶解、１１）回分式疎水相互作用精製（リパーゼを疎水性マトリックスに吸 着せしめ、水で洗浄そして５０％Ｗ／Ｗエタノールで溶離した）　、１２）エタ ノールを留去し次いで凍結乾燥した。得られた粉末は１４３．０００　ＬＵ／　 ｇの活性を有していた。

例３．Ｃ，アン　ルクチカリバーゼ　、の制゛告カンディダ・アンクルクチカＤ ＳＭ３８５５培養物をＰＤＡ−寒天スラント上に保存した。

ＰＤＡ−寒天の組成： バクトじゃがいもデキストロース寒天（Ｄｉｒｃｏ）　３９　ｇ　／　１寒天　 １０− （１２１℃で２０分間オートクレーブした）。

Ｃａ１ｅ培地を含有する５０個の振盪フラスコを寒天スラントから接種し、２５ ℃で６４時間培養した。

ブロス（４６０１］／ａｔ）を最高４，４００ｇで２０分間遠心した。

上澄を１１に濃縮し、ＨＩＰ　１０−２０カート’Ｊ　７ジ（カットオフ１０、 　ＯＯＯＭＷ）を備えるアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限定濾過装置で水ＩＩ！を用 いて脱塩し、そして凍結乾燥した。この粉末の活性は４００００ｔｌ／　ｇであ った。

例４．Ｃ，アン　ル　チカ：バーゼの’ｊＬ告ＰＤＡ−寒天スラント（例３参照 ）上に保存した菌株ＤＳＭ３９０８およびＤＳＭ３９０９の培養物を、ＹＳ−４ 、ＹＳ−２５またはＣａ４ａ培地を含有する振盪フラスコに移し、２５℃で２ま たは３日間培養した。ブロスのリパーゼ活性（ＯＵ）を測定した。

結果 菌　株　培地　発酵時間　ＯＵ／ｒｎ１１、　ＤＳＭ　３９０８　ＹＳ〜４　３ 日　８．５２、　ＤＳＭ　３９０８　ＹＳ−２５２−４，０３、ＤＳＭ　３９０ ８　Ｃａ４ａ　３−　２６．０４、　ＤＳＭ　３９０９　ＹＳ−４３−１０，５ ５、ＤＳＭ　３９０９　ＹＳ−２５２−５，０６、ＤＳＭ　３９０９　Ｃａ４ａ 　２−　２３．３例５．Ｃ，ツクバエンジスフパーゼのＥ告カンディダ・ツタバ エンシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）ＣＢＳ６３８９培養物 をＰＤＡ−寒天スラント（ＰＤＡ−寒天の組成は例３に示した）上に保存した。

２個のＹｅＤＰ振盪フラスコを接種し、２５℃で２４時間培養した。

この培養物を用いてＣＧｉｇ培地を含有する５２個の振盪フラスコを接種した。

該振盪フラスコを２５℃で４日間培養した。ブロスを最高４．４００ｇで２０分 間遠心した。上澄（３１）を４５０　ｍＩにン薯縮しそして旧Ｐ　１０−２０カ ートリツジを備えたアミコン限外濾過装置上で水２１により脱塩し、凍結乾燥し て２２３０Ｕ／ｇ　。

１３５ＬＬｌ／　ｇの粉末２４ｇを得た。

例６．　Ｃ，ｎニニュじ４１１７１１２社ニガ１」わ１カンデイダ・オー１クー １アエ（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）ＣＢ５５７０の培養物を ＰＤＡ−寒天スラント上に保存した。

７０個のＣＧ４ｈ振盪フラスコを前記寒天スラントで接種しそして２５℃で４日 間培養した。

ブロスを最高４．４００ｇで２０分間遠心し、次いで最高１２、２００　ｇで１ ０分間遠心した。ＨＩＰ　１０−２０カートリツジを備えたアミコン限外濾過装 置上で上澄５．５１を９５０ｍ１まで濃縮し、そして凍結乾燥して９３０Ｕ／ｇ および３．４ＬＵ／ｇの粉末２９．１ｇを得た。

例７．Ｃ，ホリオルムリパーゼの′！゛告ＣＢ５５２３４の培養物をＰＤＡ−寒 天スラント上に保存した。それぞれＣＧ４ｈ培地１５０ｄを含有する６０個の振 盪フラスコを前記寒天スラントで接種した後、２５℃で４日間培養した。

ブロスを最高４．ＯＯＯｒｐｍで２５分間遠心し、次いで最高１０、０ＯＯｒｐ ＋ｎで１０分間遠心した。アミコン限外濾過装置　。

（ＰＩＨ１Ｏ−２０）上で上澄６１を５５０−に濃縮し、脱イオン水１１で脱塩 した後、凍結乾燥して活性２７５０Ｕ／　ｇまたは３１３ＬＵ／ｇの粉末３８． ４　ｇを得た。

例８．　Ｃヒエミュー１バーゼのｉ、噺ｌＩＣＢ５５７１を、ＰＤＡ−寒天スラ ント上で４日間２５℃で培養した。

ＹｅＰＤ培地（例５に組成を示す）の種培養物を、寒天スラントから接種し、つ いで１７時間２５℃で培養した。　ＹＳ−４培地（例４参照）を含有する３９個 の振とうフラスコを、種培養物から接種し、ついで４日間２５℃で培養した。

ブロスを、４．０００ｒｐｍで１５分間遠心し、ついで１５分間１２、０００ｒ ｐｇｍで遠心した。上澄み（１，３００ｍ１）を、アミコンＰＩＨ１０−２０を 用い濃縮し、ついで４１の脱イオン水で脱塩し、最終濃度を２００ｄとした。こ れを凍結乾燥し、活性度２．０００００／ｇを用する粉末１０．４　ｇを得た。

例９．５　のカンー゛イ　゛　の１パーゼのｌ１１１１゛告以下に示す各々の菌 株を、ＰＤＡ−寒天スラント（例３参照）上に接種し、ついで３日間２５℃で培 養した。

ついで細胞を９ｍ７の滅菌脱イオン水に懸濁させ、ついで種培養物としてＹｅＰ Ｄ培地（例５参照）中に接種し、１７〜２３時間培養した。２〜７−の培養ブロ スと、Ｃａ１９ｇ培地、ＹＳ−４培地またはＹＳ−２５培地（例４参照）ととも に振とうフラスコ内で再接種し、ついで振とうしながら３日間２５℃で培養した 。

ついでブロスのｐＨ及びリパーゼ活性（ＯＵ）を測定した。

結果 １、Ｃ，アン　ルクーカ　ＤＳＭ　３８５５　Ｃａ１９ｇ　？、０　２７．８２ 、−−　ＣＢ５５９５５　Ｃａ１９ｇ　６．７　２５．３３、−−　ＣＢ５６６ ７８　Ｃａ１９ｇ　６．６　２５．３４、−−　ＣＢ５６８２１　Ｃａ１９ｇ　 ６．６　４６．８５、Ｃ，ツクバエンシス　ＣＢＳ　６３８９　Ｃａ１９ｇ　７ ．５　１１．８６゜−−ＣＢ５６３８９　ＹＳ−４１１，８７、Ｃ，オー１クー １アエ　ＣＢＳ　６３７９　ＹＳ−４０，８８、Ｃ，＊’ｉ匹ＣＢ５５２３４　 Ｃａ１９ｇ　７．０　７．３９、　Ｃ，７−、Ｄ−−ＣＢ５２０４１　Ｃａ１９ ｇ　５．９　１５．０１０、−−　ＣＢＳ　２０４１　ＹＳ−４７，７２０，５ １１、−−ＣＢ５５７１　Ｃａ１９ｇ　−１０，８１２、−−ＣＢＳ　５７１　 ＹＳ−４７，２３８，８１３、−−ＩＦＯ１５２７Ｃａ１９ｇ　−１，８対照と して、旦、左上バえ（ｃｕｒνａ　ｔａ）　ＣＢ５５７０を、同様の方法で、Ｙ Ｓ−２５培地中４日間培養した。活性は３４．８０Ｕ／　ｇであった。

例２において得られたアンタルクチカ由来の部分精製リパーゼを、更に次のよう に精製した。１ｇの酵素粉末を、ｐＨ６のトリス−アセテート５０１に懸濁され た。１ｇのＤＥＡＥ−セファデックスＡ５０を膨潤させついでｐＨ６のトリスー アセテー）５（ｌａＭ中で洗浄し、ついで酵素懸濁液に添加した。混合物を室温 で１時間攪拌しついで半融ガラス漏斗上でろ過した。

ついでろ液を超遠心法により濃縮しついでｐＨ４，５のシトレート緩衝液２０ｏ ＋Ｈに対し透析し、ついで同緩衝液で平衡化したＣＭ−セファロースカラムに適 用した。溶離液としてＢ−Ｅｌ素が溶出しついでＡ−酵素が塩グラディエンドに より溶出した。

８〜２５％ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　グラディエンドゲルを用い、ファルマシアフェー スト（商標）システムを用い、Ａ及びＢ酵素の分子量を測定した。Ａ及びＢ酵素 に対する分子量は、それぞれ４３ｋＤおよび３３ｋＤであった。Ａ及びＢ酵素に 対する等電点を、３．５〜９．５のｐＨ範囲でＬＫＢアンフォリンベージプレー トを用いて測定した。Ａ酵素に対するｐｌは８．０±０．２であり、Ｂ酵素に対 しては、６．０±０．２であった。

更にＢ酵素を精製するため、ＣＭ−セファロースからの溶離液として得られたプ ールを、ｐＨ１０の２０１ボレートに対し透析し、ついで同じ緩衝液で平衡化し たモノ−Ｑ（商標）（ファルマシア）カラムに適用した。活性なり酵素が、ファ ルマシアＦＰＬＣ装置を用い塩グラディエンドにより溶出せしめた。

ＭＩｊ１肛に【１ Ａ及びＢ酵素を、ｐＨ６または７に対し２０１のホスフェート緩衝液中で希釈し 、ついでｐＨ８，９または１０に対し２０ｍＭのボレート緩衝液中で希釈した。

最終酵素濃度を、０Ｄ２８゜−１になるまで調節し、ついで室温で１．５時間イ ンキュベートし、更に４℃で一夜インキユベートした。下記の表にＬＵ法により 測定した残留活性（％）を示す、ｐＨ７の酵素活性を、１００％として調節した 。Ａ酵素は、４℃で一夜インキユベーションしたのちｐＨ１０で全体として不活 性であるように思われ、一方Ｂ酵素は、ｐＨ１０でその活性の７８％超を有して いたがｐＨ６では安定性が少なかった。

ＡＵ　、　Ｂ−一一 ′　に・　る：Ｉｉ庁の六 リパーゼ活性をＬＵ法により測定した。ただし温度は変化せしめた。結果を次に 示すが、３０℃での活性を１００％とした。

゛　に　Ｈの六 リパーゼ活性をＬＵ法により測定したが、ｐＨは変化させた。

酵素が存在しない場合の各々のｐＨにおける得られた結果を、自発的加水分解に 対し対照として用いた。結果を第４図に示す、ブロスＡ及びＢ酵素に対する最適 ｐＨは、ｐＨ７付近であった。

例１１ １バーゼの執〜 例９（Ｃａ１９ｇまたはＹＳ−４培地を用いる）におけるごとく調製した培養ブ ロスのサンプルを、６０℃、７０℃及び８４℃で３０分間熱処理した。熱処理サ ンプル及び熱処理しない対照サンプルのリパーゼ活性を、ｐＨ５，５で寒天中に オリーブ油、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及びブリリアントグリーンを含有 する拡散プレートにサンプルを適用し、ついで３０℃で２４時間拡散後色変化の 帯域（直径（ｎ））を測定することによって検出した。

以下の内容が明らかにされる。すなわち−ｑエフ乙）Ｌｔ？）５−左及びふエフ 　”Ｆユニ立由来のリパーゼは８４℃まで安定であり−ｑ−」址ユ〕二ｌｚｊ、 ヨは、７０℃まで安定であり、更にＣ，オーユ久旦ユヱ孟は６０℃まで安定であ り、一方従来技術のニー左上バｌは６０℃で不安定であった。

例１２ 可ｒ　リパーゼの凱− 以下のリパーゼの熱安定性を比較した。

本発明： Ｃ，アン　ルクチカ二例１で得られた粉末の０．８％溶液精製リパーゼＡ：　例 １０で得られたサンプルを、ｐＨ７の１５ｍＭのトリス−マレエー ト緩衝液に対し一夜遇析した。

参考： Ｃ，シリン゛−シア：名糖産業から得られるリパーゼＯＦの１％？容液 Ｃ工ｊソ扛Ｒクー：　参考例１がらのＵＦ−コンセントレート 次の緩衝液を実施例で用いた： トリス−マレエート緩衝液０．１　Ｍ、　ｐＨ６，Ｏ：０．１Ｍのトリス（ヒド ロキシメチル）アミノメタン５〇−及び０．１　Ｍのマレイン酸２６−ジトレー トーホスフエート緩衝液０．１　Ｍ、　ｐＨ６，５：０．０５Ｍのクエン酸１４ ２−及び二塩基性リン酸ナトリウム（ＮａｚＨＰＯ４）３５５ａ／ ホスフェート緩衝液０．１　Ｍ、　ｐＨ７，５：０．１ＭのＮａＨｚＰＯ４１６ −及び０．１　ＭのＮａＪＰＯａ　３４ａｆ試験管内で１−のリパーゼ溶液と４ ｄの緩衝液を混合して、熱安定性を測定した。試験管を６０℃、６５℃または７ ０℃の水浴中で６０分間インキュベートした。熱安定性は、インキュベーション する前、酵素緩衝液混合物の活性（ＬＵ／ｍ／）のパーセントで残留活性（ＬＵ ／ｍＺ）として表わす。

結果（残留活性）は次のとおりであったニドリスマレエート緩衝液を用いて旦工 互上バＬに対しｐＨ６でのインキュベーションが含まれていた。何故ならそれら はリパーゼに関する記ｔｉｔ　（Ｆｅｔｔｅ　５ｅｉｆｅｎ　Ａｎｓｔｒｅｃｈ ｍｉｔｔｅｌ　１９８５＋８７＝１８１−１８５）におけるり、モンテント等に よって用いられた条件であり、従ってこのリパーゼに対し適当であると考えられ る。以下の内容を結論づけることが出来る。すなわち旦−アンタルクチカリバー ゼ及びリパーゼＡは従来技術のＣ，シュｌ久立之ヱ及びＣ，カルバタリバーゼよ りはるかに熱安定性である。

例１３ 執几　″の１ノマーゼの肋８ この実験において、リパーゼサンプルをまず、６０℃で、ｐ）１６．５で１時間 次のように処理した：本発明： Ｃ，ツタバエンシス二例５で得られる粉末を、ｐＨ６，５の緩衝液（上記参照） に溶解しく７％）ついで６０℃で１時間予備処理した。

硝ＪＬ隻ｙ＜　−ｆ　Ａっ：カラム（例１０）からの溶出液を、１５ｄのトリス −マレエート緩衝液（ｐ！（７）に対し一夜透析し、ｐＨ６，５の緩衝液で５倍 に希釈しついで６０℃で１時間予備処−ｑ工ｊソにバｌ−：参考例１からのＵＦ −コンセントレートを、ｐＨ６，５に調節しついで６０℃で、ｐｌ’１６．５で １時間インキユベートシた。この予備処理サンプルを、熱安定性実験に対し緩衝 ？Ｐｉ、（ｐＨ６、６，５、７，５、上記参照）中５倍に希釈した。

ついで上記予備処理サンプルを、６５℃でがっｐｌ’！６．０゜６．５または７ ．５で１時間インキュベートした。結果は次のとおりであった： 以下の内容が明らかである。すなわち本発明の２種のリパーゼは６０℃での予備 処理中にある程度の活性は失うが、予備処理したサンプルは６５℃で非常に安定 である。Ｃ，カルバ叉からの従来技術のリパーゼは６５℃で急速に失活する。

例１４ Ｃ，アン　ルクチカ！パーゼの執 例３におけるごとく得られたリパーゼを、水に溶解しく１％）、ついで更に５０ ｍＭのトリスマレエート緩衝液（ｐＨ７）中で５倍に希釈した。この溶液を、０ 分、６０分及び１８０分間６０℃で予備処理し、ついで種々の温度で３０分間熱 処理した。各々の工程後の残留活性を、ＯＵ法により測定した。

結果は以下の内容を示す、いく分かのリパーゼ活性が、６０℃で予備処理中に失 なわれるが、残存リパーゼ活性は、８０℃においてさえ極めて熱安定性である。

あるデーターが相当に１００％を超えている理由は明らかでＣ，アン　ルクチカ ！パーゼ（例３で得られる粉末０．１％）のＵ素活性を３０℃、４０℃、５０℃ 、６０℃、６５℃及び７０℃で測定した。活性を、本明細書中に記載したＯＵ法 により測定したが、インキュベーションは種々の温度で行なった。結果は次のと おりであった。

インキュベーション温度　３０　４０　５０　６０　６５　７０活性（００／ｍ ｌ）　２．１　２．３　３．４　５．２　６．３　５．８Ｃ，アン　ルクチカ（ 例３からの粉末０．２％溶液）、旦。

ツタバエンシス（例５からの粉末の３．０％溶液）、Ｃ，オ−−去りｊロＬヱ１ 工（例６からの粉末の３．０％溶液）、Ｃ，フミコ旦（例７）及びニー主ユ主五 人（例８）の活性に対するｐＨ依存性を測定した。

ｐＨを、０．５の単位の段階で４．０から１０．５まで変化させた。

用いた緩衝液は、ｐＨ４，０〜５．５の酢酸ナトリウム／酢酸（Ｃ，アン　ルク チカに対し２００ｍＭ及び他のリパーゼに対し１００ｍＭ）、ｐＨ５，５〜８． ５の５０１１１Ｍのトリス−マレニー）／ＮａＯＨ。

ｐｎ　９．０〜１０．５のグリシン／Ｎａ０）ｌ　（Ｃ，アンタルクチ力に対し ２００＋ｎＭ及び他のリパーゼに対し１００ｍＭ）。

測定はＯＵ法におけると同様に行なったが、１−の酵素溶液及び５ｒｎｌのトリ ス−マレエート緩衝液のかわりに緩衝液に溶解した５−の酵素を用いた。

ｐＨ活性曲線を、Ｃ，アンタルクチ力、Ｃ，ツクバエンシス及びＣ，オー１クー リアエに対しそれぞれ第１図、第２図及び第３図に示す、−ｑエニとよ≦しニラ −及びＣ，ホリオルムリパーゼに対する曲線は顕示のものであった。従って全て のリパーゼはｐＨ７〜８付近で最高を示す。

例１７ ０ｒ　リパーゼの　。

例９におけると同様に調製した培養プロスを、すでに説明した非特異性法により 試験した。結果は、全ジクリセリドのパーセントで１．３−グリセリドとして示 すニ一種−１銖１豆　３−ジグ１セ１　′ＶＣ，アンタルクチ力　ＣＢＳ　６６ ７８　３２％Ｃ，７ミ：７−ｙ　ＣＢＳ　２０４１　５１％Ｃ，ツタバエンシス 　ＣＢＳ　６３８９　４８％Ｃ，ホリオルムＣＢＳ　５２３４　４５％Ｃ，オー リクラリ７４　ＣＢＳ　６３７９　５０％カン−イ　゛アン　ルクチカ由来のリ パーゼ（例３で得られた粉末の０．２％溶液）、Ｃ，ツクバエンシス（例５で得 られた粉末の３．０％溶液）、Ｃ，オー１り一アエ（例６で得られた粉末の３． ０％溶液）を同様の方法で測定した。

Ｃ，アンタルクチ力＝　４１％ Ｃ，ツクバエンシス：　４８％ Ｃ，オー１クーリアエ：５０％ 全てのリパーゼは非特異性であると思われる。

精製リパーゼＡ及びＢ（例１ｏによる）の種々の基質に対する活性を比較した。

トリブチリン及びオリーブ油に対する活性を、ＬＵ法及びＯＵ法に従ってそれぞ れ測定した。エチルオレエート、メチルラウレート及びラセミジオレインに対す る活性を、次の変法によるＬＵ法により測定したニトリブチリンのかわりに１％ 基質（Ｎｕ　Ｃｈｅｃｋ　Ｐｒｅｐがら入手出来る９９％純粋なメチルラウレー ト、Ｎｕ　Ｃｈｅｃｋ　Ｐｒｅｐがら入手出来る９９％純粋なメチルオレエート 、またはシグマから入手出来る９９％純粋なラセミジオレイン）、及びｐＨ７， ０のがゎりにｐｏａ、ｓで水酸化ナトリウムの滴定による。

以下に結果を、トリブチリンに対する相対活性（％）として表わすニ ーー玉−！−一一　リパーゼＡ　リパーゼＢトリブチリン（ＬＵ）　１００％　 １００％オリーブ油（ＯＵ）　１１０％　６５％ラセミジオレイン　２７％　３ １３％ メチルラウレート　２２％　１４０％ メチルオレエート　８％　６０％ 以下の内容が明らかである。すなわちリパーゼＢは、ジグリセリド及びメチルエ ステルに対し高活性を存し、一方リパーゼＡはトリグリセリドに対し活性に関し それらよりも比較的低活性である。

例１９ イオン六　によるＣ、アン　ルクチカ１パーゼの古止 例１で記載したごとく得られたカンディ　゛アンタルクチカリバーゼ０．６ｇを 、水で希釈し７．５ｇとし、ついでｐＨ７に調節した弱塩基性陰イオン交換樹脂 （バイエル社製品）Ｌｅｗａｔｉｔ＠Ｅ１９９９／８５の１．５ｇ乾燥物と混合 した。

混合物を、室温で２４時間回転せしめた。水で洗浄後、調製物を真空下で室温で 乾燥し、１．８３ｇ　（乾物含量９８％）を得た。ろ液中に残存する活性は、３ ９％であり、これは乾物固定化リパーゼ１ｇあたり約１９０００ＬＬＩＯ量に相 当する。

例２０ 例２におけるごとくして得られたＣ、アン　ルクチカリパーゼ１２．５−リパー ゼ溶液（１２，５００ＬＵ／＠ｌ）及びｐ）１７に調節した４、２５ｇ乾物Ｄｕ ｏｌｉｔｅ＠　ＥＳ−５６８弱塩基性陰イオン交換樹脂（ロームアンドハアス社 製品）を、混合しついで室温で２４時間回転せしめた。水で洗浄後、調製品を室 温下で乾燥し、４．６ｇの乾物固定化リパーゼを得た。ろ液中に残存する活性は 、３３％であり、これは乾物固定化リパーゼ１ｇあたり約２２７００ＬＵＯ量に 相当する。活性は、９．２ＢＩＵ／ｇでありこの活性は先に示した方法により測 定した。

例２におけるごとくして得られたＣ、アン　ルクチカリパーゼ１００ａｆ　（１ ５０００ＬＵ／−を有する）、ｐＨ７に調節した洗浄ＬｅｔｍａｔｉｔＯＥ　１ ９９９／８５弱塩基性陰イオン交換樹脂４６ｇ（乾燥重量）と混合した。混合物 を室温で２４時間撹拌した。水で洗浄後、調製物を室温で真空下で乾燥し５１． ５ｇ　（乾物含量９８％）を得た。ろ液中に残存する活性は１％であり、これは ２９．２００ＬＵ／　ｇの量に相当する。活性は３７．６　Ｂ１１１／　ｇであ った。

例２に記載したごとくして得られた１２５００ＬＬＩ／−のＣ，アンタルクチカ リバーゼロ０ｍを、ｐ）１７に調節した洗浄Ｌｅｗａｔｉｔ０Ｅ　２００１／８ ５非イオン性樹脂（バイエル社製品）の２５ｇ（乾燥重量）と混合した。混合物 を、室温で２４時間撹拌した。

水で洗浄後、調製物を室温で真空下で乾燥し、２５ｇ（乾燥乾物含量９８％）を 得た。残存ろ液中の活性は、１．６％でありこれは３０．２００ＬＩｌ／　ｇの 量に相当した。

例２３ ６による古 １５．０ＯＯＬｔｌ／−のＣ，アン　ルクチカリバーゼ及び５０ｇの樹脂を用い 先の実施例を繰り返えし、５８ｇ（乾物含量９８％）を得、残存ろ液中の活性は ２％であり、これは２５．８００ＬＵ／ｇの量に相当する。活性は５２．２　Ｂ ＩＵ／　ｇであった。

例２４ １′＋バーゼＡの古　ヒ 担体の調製：１０ｇのＬｅｗａｔｉｔＯ２００１／８５を、Ｇ−２ガラスフイル ター上で洗浄し、０．０５Ｎの水酸化ナトリウムを用いｐＨ−シュタフトにより ｐＨ７に調節しく２時間の操作）、再び洗浄し、ガラスフィルター上で乾燥した 。乾物を、６１．５５％として測定し更に２．５ｇの乾燥重量を固定化に対し用 いた。

酵素の調製：リパーゼＡ（例１０）を、１５ｍＭのトリス−モリエート緩衝液（ ｐＨ８）に対し一夜透析し、８０００ＬＵ／　ｍｌで１５ａｆを得た。

固定化：担体及び酵素を一夜混合し、ガラスフィルター上で洗浄し、真空下で２ 時間乾燥した。乾物は９６％であった。

溶液中に残存する活性は２％であり、これは２８．２００ＬＵ／　ｇに相当する 。

例２５ １■１パーゼＡの古　し 担体を先の例におけるごとく調製した。乾物は、７６．３２％として測定され、 更に４，４ｇの乾燥重量を固定化に対し用いた。

酵素は先の例におけるごとく調製し、５４００ＬＵ／−で２４．７ｄ得た。

固定化：担体及び酵素を一夜混合し、ガラスフィルター上で混合し、ついで真空 下で５時間乾燥した。乾物は１００％であった。活性の２８％が溶液中に残存し 、これは２２，３００ＬＵ／　ｇの量に相当した。

例２６ −１１リパーゼＢの古　ヒ 先の例で調製した２、６ｇの乾燥重量の担体を、固定化に対し用いた。

リパーゼＢ（最１０）を例２４におけるごと（調製し、３２００ＬＵ　／　ｍＺ で２４．９−得た。

固定化：担体及び酵素を一夜混合し、ガラスフィルターで洗浄し、真空下で５時 間乾燥した。乾物は１００％であった。活性の６．４％が溶液中に残存しこれは ２９，２００ＬＵ／　ｇの量に相当した。

活性は４．４８１０７ｇであった。ＮＳＩ２分析を２５０■の乾物リパーゼ及び わずか４−の反応混合物を用いて２時間行なった。

ラウリン酸の混入は、わずか１４モル％であり、更にＮ５Ｉｚは０．６５であり 、これはリパーゼＢが非特異性であることを示す。

例２７ 固定化Ｃ，チアンルクチカリバーゼ及び固定化リパーゼＡの例２２によって得ら れる固定化カン−イ　゛アン　ルクチカ並びに例２４で得られる固定化精製リパ ーゼＡの活性、熱安定性及び非特異性を比較した。

活性を、ＢＩＵ分析（６０℃、有機溶剤無し）により及び７０℃でのＢＴＵ分析 の両方で測定した。

非特異性を、ＮＳＩ、及びＮＳｈ分析の両方により測定した。

熱安定性を次の方法により測定した： １．２ｇのトリオレインを、１５０■（乾燥重量）の１０％永和水和に添加した 。ついでサンプルを、８０℃で３日間インキュベートした。残存活性（ＢＴＵ） を、３４８■のバルミチン酸とともに１２−の石油エーテルを添加した後４０℃ で測定した。熱安定性を、冷蔵庫内に３日間保存した対照サンプルの活性（％） で表わす。

結果を次表に示す： ８１０７ｇ　（６０℃、溶剤無し’Ｊ　４１．９　２１．４ＢＴＵ／ｇ　（７０ ℃’）　１８６　１２８ＮＳＬ熱安定性　０．６７　０．７５ ８０℃で３日間　７８％　６９％ ２種の固定化製品は、全ての試験において極めて顕示の性質を有する。双方とも 非特異性であり、加酸分解及びエステル交換を触媒するのに有効であり、更に双 方とも極めて熱安定性である。

例２８ 古　、の２　び 次の固定化リパーゼを、対照として調製した：Ａ）　１２，０ＯＯＬＵ／ｇ　（ 名糖産業製品）を有する２、７２　ｇの左ヱヱイ　シｉン　−シアリパーゼを、 ２５ａｆの水に溶解した。弱塩基性アニオン交換樹脂（バイエル社製品）をＬｅ ｗａｔｉｔＯＥ１９９９／８５　８．５　ｇの乾物を、ｐ）１６に調節し、つい でリパ−ゼ溶液と混合した。室温で２４時間回転後、水で洗浄し調製品を室温で 真空下で乾燥し９．２７ｇ　（乾物含量９７％）を得た。

漏液中に残存する活性は、０．２％であり、これは１ｇの乾物固定化あたり２８ ．０ＯＯＬｔｌＯ量に相当する。

Ｂ　）　６５．７００ＬＵ／　ｇの活性を有するクロモバクテリウムビスコサム リパーゼ（東洋醸造（日本）製品）２．０ｇを、２５−の水に溶解した。弱塩基 性アニオン交換樹脂Ｄｕｌｏｌｉｔｅ＠　ＥＳ−５６８Ｎ（ロームアンドハース 社（ｔＪｓＡ）製品）４．２５ｇの乾物をｐＨ７に調節し、ついでリパーゼ溶液 と混合した。室温で４時間回転後、調製品を漏下し、水で洗浄後ついで真空下で 乾燥した。収率は４．５２ｇ　（乾物９４％）であり漏液中の残存活性は６％で あり、これは１ｇの乾物固定化リパーゼあたり２８、０ＯＯＬＵの量に相当する 。

非特異性指数（ＮＳＩ２）を、明細書中先に記載したごとく、固定化Ｃ，アンタ ルクチカリパーゼ（例１９の製品）、２種の上記調製品及び固定化ムコールマイ ヘイ　（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）　’）バーゼ（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ’ｌｅ　 ｌＭ２Ｏ、ノボインダストリーＡ／Ｓ製品）を用いて測定した。

下記の表に脂肪酸組成を、６０℃で２時間反応後モル％で示す。

これらの結果は以下の内容を示す、すなわち２種のカンディダリパーゼは、位置 非特異性であり、更にクロモバク−１つＡ及びムコールマイヘイは１．３−特異 性である。

例２９ と１バーゼの執６ カンー゛イ　゛アン　ルクチカ及びカンー゛イ　゛シ１ン゛−シアリパーゼ（そ れぞれ例１９及び２８）の固定化製品の熱安定性を次のように調べた： ２５０　Ｎの乾物調製品を１０％ｗ　／　ｗに水和した。６００■のトリオレイ ンを添加し、ついで７０℃で０．２．４及び２４時間インキュベートした。イン キュベーション後、サンプルを冷却し、１７４■のパルミチン酸を含有する１２ ｄの石油エーテルを添加し、ついで混合物を４０ｔで１時間インキュベートした 。各々の場合に混入したバルミチａ（Ｗ／Ｗ　％）を、先に述べたごと＜ＡＦ２ ０６法に記載したごとく行いその結果を次表に示す： ０２１．６２５．１ ２　２０．５　１４．０ ４　２０．７　１３．４ ２４　２０．８　６．７ 結果は固定化Ｃ，チアンルクチヵリバーゼの秀れた熱安定性を示す。何故なら該 リパーゼは、７０’Ｃで２４時間後はとんど全てのその安定性を保持しており、 一方従来技術のリパーゼはほとんどその活性を失っている。

−次の可逆反応として計算すると、Ｃ，アン　ルクチヵリバーゼは７０℃で２４ 時間後はぼ９０％の活性を保持しており、Ｃ，シ１ン゛−シアリパーゼの残留活 性は１０％未満であることが推定される。

例３０ 固定化Ｃ，チアンルクチカリパーゼによる酸分解及びエステル交換 例２２の固定化製品を、ＢＩＵ及びＢＴＵ法に従い種々の温度で溶剤を用いず酸 分解（トリオレイン＋パルミチン酸）及びエステル交換（トリオレイン＋トリバ ルミチン）に対し用いた。

活性（ＢＩＵ及びＢＴＵ）をそれぞれ第５図及び第６図に示す。これらは明らか に固定化リパーゼの極めて秀れた熱安定性を示しており、最高の活性は試験した 最高の温度、すなわち８５〜９０℃で見いだされた。

例３１ Ｃ０ン　バク　カ１バーゼによるエスールムエステル合成を触媒するため固定化 Ｃ，チアンルクチカ（例２２から調製）、固定化精製リパーゼＡ（例２５から調 ！り及び固定化精製リパーゼＢ（例２６から調製）の能力を、次の方法で比較し た：使用前２０時間１０％水和した１５０■（乾燥重量）、１．Ｅ＋ｌＨＭのア ルコール（１−プロパツール、２−プロパツールまたはオレイルアルコール（工 業純度、ＢＤＨ））及び１．５ｍＭの遊離脂肪酸（ミリスチン酸（純度９９％、 シグマ社）またはオレイン酸（９２％、ＢＤＨ）を、８ｄのバイアル中で混合し ついで６０℃の水浴中で振とうした。約１ｇのサンプルを、２０分及び９０分イ ンキュベートした後取り出した。１５０−の中和エタノールをサンプルに添加し ついで残存遊離脂肪酸を水酸化カリウムで滴定した。得られたエステル合成物を 、１００％マイナス滴定残存遊離脂肪酸として計算する。

結果を次表に掲げる： 以下の内容が明らかである。すなわち固定化リパーゼＢは、全ての実験において リパーゼＡよりもエステル合成に対しより有効であり、双方とも長鎖及び短鎖ア ルコールを有し、更に双方とも第１及び第２アルコールを有する。

固定化リパーゼＡは、長鎖アルコールの場合にエステル収率が低いが、長鎖アル コールの場合にはより有効である。

固定化Ｃ，アンタルクチカリパーゼ（リパーゼＡ及びリパーゼＢの双方を含む） は、短鎖アルコールに対しリパーゼＢと同様の収率を与え、更に長鎖アルコール に対しリパーゼＡまたはＢよりＤよりよい収率を与える。

例３２ 古　１バーゼ　いた　馳ノ　”におｌるヒ　二の５斑２５０■（乾燥骨）の固定 化Ｃ，チアンルクチカリ）＜−ゼ（例２７から調製）または１５０■（乾燥骨） の固定化リノ々−ゼＡ（例２５から調製）を、２０時間で１０％に水和しつし） で３ミリモルのトリカプリン（シグマ級■）及び３ミリモルの以下の脂肪酸の一 種と混合した：８ｒｎｌのバイアル中のレウリン酸（メルクアート８０５３３３ ）　、ミリスチン酸（シグマ級９９％）、バルミチンａ（ＢＤＨ特に純粋）、ス テアリン酸（メルクアート８００６７３）　、オレイン９　（Ｎｕ　Ｃｈｅｃｋ 製品９９％）及びリルイン酸（Ｎｕ　Ｃｈｅｃｋ製品９９％）。混合物を７０℃ で振とう水浴中でインキュベートし、サンプルを活性を測定するまで適当な時間 後取り出した。トリグリセリドを精製し、メチル化し、ＧＬＣで分析しついで活 性を、先に記載したＥＴＵ法で前記のごとく計算した。

結果を次に示す： 固定化Ｃ，チアンルクチカリパーゼ 固定化精製リパーゼＡ 例３３ 古　１バーゼ　いた■　ノ　”にお番る″　−のイ盟他の実験において、１５０ ■（乾燥骨）の固定化旦−ヱＺＬルクチカリパーゼ（例２２からの調製）または 固定化精製リパーゼＡ（例２５からの調製）を、２０時間１０％に水和し、つい で次の反応物を各々の３ミリモルと混合した＝８ｔｎｌバイエル中のトリラウリ ン（シグマ社、等級９８％）、パルミチン酸（ＢＤＨ，特に純粋）、オレインＢ 　ＣＮｕ　Ｃｈｅｃｋ製品、９９％純度）、及びリルイン酸（Ｎｕ　Ｃｈｅｃｋ 製品、９９％純度）０反応混合物を７０℃の振とう浴に入れる。固定化Ｃ。

ヱ之文五久±左リパーゼに対し１．・５時間及び３．５時間後サンプルを取り出 し更に固定化リパーゼＡに対し１．５時間及び５．５時間後取り出し、トリグリ セリドを精製しエチル化しついで先に記載したごと＜ＧＬＣにより分析した。結 果を以下に示す： 以下の内容が明らかである。すなわちリパーゼＡは、飽和酸に対するよりもモノ −及びジー不飽和酸に対しはるかに低い活性を有する。Ｃ，アン　ルクチカリパ ーゼ（リパーゼＡ及びリパーゼＢの双方を含有）はモノ−及びジー不飽和酸に対 しほんのわずかに低い活性を有する。

例３４ ポ１　、ヒ　いた古　冨バーゼの　砧　７ポリ不飽和脂肪酸をトリグリセリドに 導入するため固定化Ｃ，チアンルクチカ（例２２からの調製）、固定化精製リパ ーゼＡ（例２５からの調製）及びムコールマイヘイ由来の固定化特異的リパーゼ （Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠　ｌＭ２Ｏ％ノボインダストリーＡ／Ｓ製品）の能力を、 ８−のバイアル中、２５０■（乾燥骨）の固定化リパーゼ（１０％水和）　、１ ２７６■のトリラウリン（シグマ社、等級９８％）及び２５００■の脂肪酸混合 物を混合することによって比較した。脂肪酸混合物を、パルミチン酸と加水分解 メンヘーデン油からの多不飽和脂肪酸リンチフラクシジン（真空蒸溜により得る ）と混合することによって得た。脂肪酸混合物は、２４．９モル％のバルミチン ｆｉ　（Ｃ１６：　０）、２０．４モル％のエイコサペンタエンｉｌ　（Ｃ２０ ：　５）　、７．２モル％のドコサペンタエンａ　（Ｃ２２：　５）及び２６． ２モル％のドコサヘキサノン酸（Ｃ２２：　６）、反応は７０℃の振とう水浴中 で行なった。サンプルを３時間及び５時間後取り出し、ついでトリグリセリドを 精製し、メチル化し、ついで前述のようにＧＬＣにより分析した。

トリグリセリドの脂肪酸組成（モル％）及びこれらの割合を以下に示す： 以下の内容が明らかである。すなわちＣ，アン　ルクチカリパーゼは、飽和酸に 対するのと同様にほぼ同程度に容易に多不飽和酸の導入において有効である０本 発明の２種のリパーゼは、Ｃ２２：６酸を導入するのに有効である。

例３５ ８−　いたエスール４ 第１及び第２アルコールからエステルを合成する際、左ヱー゛イ　゛アントーク チカ由来のリパーゼ並びにムコールマイヘイ由来の１，３−位置特異性リパーゼ の活性における際の説明。

１１．４２ｇ　（０，０５モル）のミリスチン酸（メルク社、純度９８％）及び ３．０１ｇ　（０，０５モル）のｎ−プロパツールもしくはイソプロパツール（ メルク社、純度９９％）を、１ｇの固定化リパーゼとともに６０℃で一緒に振と うした。左ｌヱ土゛アン　ルクチカ由来の固定化リパーゼ（例２２からの調製） またはムコールマイヘイ由来の商業的に入手可能な１．３−位置特異性リパーゼ （Ｌｉｐｏｚｙｍｅ＠　１Ｍ２０）のいずれかを１０％の水分含量に調節した。

エステル化反応を、サンプルを取り出しついで未反応の脂肪酸を滴定することに よって行った（例３１に記載のごとく）。

ｎ−プロパツール及びイソプロパツールを用いた結果をそれぞれ第７図及び第８ 図に示す。

結果は以下の内容を示す、すなわちＣ，アン　ルクチカリパーゼは、第１及び第 ２アルコールの双方を用いたエステル合成に対し有効であり、一方位置特異性ム コールリパーゼは、第１アルコールに対してのみ有効である。

長鎖エステルを合成するためのカンー゛イ　゛アン　ルクチカリパーゼの能力を また調べた。

１１．４２　ｇ　（０，０５モル）のミリスチン酸（メルク社純度９８％）及び １０．７２ｇ　（０，０５モル）のミリスチルアルコール（メルク社純度９８％ ）を、６０℃で真空下固定化リパーゼ（例２２から調製）とともに反応せしめた 。測定されたエステル（％）を以下に示す： ■−素−里−１ 反応時間　１ｇ　０．２ｇ １／２時間　９８％　５７％ １−９８％　８６％ 結果は以下の内容を示す。すなわちＣ，アン　ル　カリバーゼは、短鎖及び長鎖 アルコールを用いた双方のエステル合成に対し有効である。

例３６ 迷胱盆立■ ４．５ｇの固定化Ｃ，チアンルクチカリパーゼ（例２１）を、内径１．５■のジ ャケットカラムに充填した。

カラムは熱循環水のための水ジャケットを備え、６０℃または８０℃に保持され た。水飽和樹脂（ＤｕｏｌｉｔｅＯＥＳ５６１）を含有するプレカラムを、酵素 カラムの前に置き、ついで同じ温度に保持した。３未満のパーオキシド値を有す る７１％の高精製大豆油並びに２９％の分析用等級ラウリン酸からなる基質を、 カラムにポンプ注入した。酵素カラムの出口で、サンプルを分析用に取り出し、 ついでラウリン酸の導入をＧＬＣにより測定した。１４％ｗ　／　ｗのラウリン 酸の導入を行ないついで流速を調節し、その値での転換を保持した。流速の測定 は実際の転換が１４±１％になった時打なった。プレカラムが乾燥する時は、い つも新しいものに取り換えた。

アルミナカラムプロマドグラフィにより遊離脂肪酸及びモノ−及びジグリセリド を除去し、しかる後ＮａＯＨ３によりトリグリセリドをメチル化しついで最終的 にＧＬＣによりメチルエステルを分析することによって該サンプルを分析した。

結果は第９図に示すが、この９図中、流速（トリグリセリド（ｇ）７時間／固定 化酵素（ｇ））の自然対数時間（時）が示される。以下の内容が明らかである。

すなわち、６０℃で、リパーゼの活性は２４００時間中はぼ一定であり、すなわ ち調製品は極めて安定である。

例３７ 塁肱加水豆■ オリーブ油を８１のサーモスタット制御したタンク中撹拌しなからＣ，アン　ル クチカリバーゼ（例２におけるごとく調製）を用いて６０″Ｃで加水分解した。

油対水の割合は６０：４０または７０　：　３０　（Ｗ／Ｗ）であり、リパーゼ の用量は７５ＬＵ／油（ｇ）であった、結果（加水分解％）は次のとおりであっ た： 油対水の割合 竺皿」片Ｌ６０　：　４０　７０　：　３０以下の内容が明らかである。すなわ ち本質的に完全な加水分解が得られ、リパーゼは、６０℃で４日後においてさえ 活性であった。

例３８ 執几　″の１バーゼの執６ Ｃ，アンクルクチ力由来のリパーゼ（例１からの粉末の０．１％溶液）、Ｃ，ツ クバエンシス由来のリパーゼ（例５で得たもの３％）及び−ｑユｊ（二」シ乞う ニシエＪ工由来のリパーゼ（例６から得たもの３％）を試験した。

各々の酵素溶液をまず、６０℃で１時間予備試験し、ついで０℃、４０℃、５０ ℃、６０℃、７０℃または８０”Ｃで３０分間インキュベートした。活性をＯＵ 法で測定した。

以下の内容が明らかにされる。すなわち熱処理−ｑ−ｊ−Ｚ汐−ルクチカリバー ゼは、８０℃でさえ極めて熱安定性である。

熱処理ｃ、ラックバンシスリパーゼは、７０℃までは安定であり、更に熱処理Ｃ ，オー１り一１アエリバーゼは６０℃〜７０℃まで安定である。

例３９ 迷並エム土上交換 例２３の固定化リパーゼを、ヤシ油中間フラクションと大豆油の同量の基質混合 物とともに６０℃で用いた。他の条件は例３６と同様であった。

出口のサンプルをＨＰＬＣにより分析し、ついで流速を調節し、出口のトリオレ イン含量をほぼ６％に保持した。これは約６３％の平衡変換を意味し、出***量 は１１．０％であった。尚測定は出***量が６％±１％のとき行なった。

結果を、第９図（例３６）と同様の方法で第１０図に示す。

流速は約±２０％の変化を示すが、６０℃での約１．０００時間の操作において 失活は認められない。

国際出廟番号　！’ＣＴ１０計７．．．’Ｏ（’　＋　２７ｍ際出Ｈ番号Ｐ　Ｃ Ｔ／ＤＩＣ８７１００１２７国際出履番号ＰＣＴ１０Ｋｓｒ７ｏｏｓ２ｖ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．カンディグ（Ｃａｎｄｉｄａ）由来の位置非特異性のリパーゼ調製品であっ て、該調製品が、ｐＨ６．５の０．０８モルシトレートーホスフェート緩衝液中 、７０℃で６０分インキュベーションした後の残留リパーゼ活性が、１０％超、 好ましくは５０％超であり、最も好ましくは８０％超であることを特徴とする、 前記リパーゼ調製品。
2. ２．カンディダ由来の位置非特異性のリパーゼ調製品であって、（ａ）ｐＨ６． ５でかつ６０℃での６０分後次いで（ｂ）ｐＨ６．５の０．１モルのシトレート ーホスフェート緩衝液中、６５℃で６０分後のリパーゼ活性が（ａ）の後の残存 活性の少なくとも２０％であることを特徴とする、前記調製品。
3. ３．Ｃ．アンタルクチカ、Ｃ．ツクバエンシス、Ｃ．オーリクラリアエ、Ｃ．フ ミコーラもしくはＣ．ホリオルムの菌株から由来するリパーゼ、またはこの様な リパーゼと免疫化学的同一性を示し更に好ましくは該リパーゼと同じ分子量を有 するリパーゼを含むことを特徴とする、位置非特異性リパーゼ調製品。
4. ４．前記菌株がＣ．アンルクチカまたはＣ．ツクバエンシスに属し、最も好まし くはＣ．アンルクチカに属する、請求の範囲第３項記載の調製品。
5. ５．菌株がＤＳＭ　３８５５，ＤＳＭ　３９０８，ＤＳＭ　３９０９，ＣＢＳ　 ５９５５，ＣＢＳ６６７８，ＣＢＳ　６８２１，ＣＢＳ　６３８９，ＣＢＳ　６ ３７９，ＣＢＳ　５７１，ＣＢＳ　２０４１，ＩＦＯ　１５２７，ＣＢＳ　５２ ３４または突然変異菌株もしくはそれらの変異菌株である、請求の範囲第３項記 載の調製品。
6. ６．ＤＳＭ３８５５由来のリパーゼ成分または該リパーゼと免疫化学的同一性を 示し更に４３ｋＤまたは３３ｋＤの分子量を有し更にそれぞれ約８．０または６ ．０の等電点を有するリパーゼを含んでなる、請求の範囲第５項記載の調製品。
7. ７．カンデイダアンタルクチカ、Ｃ．ツクバエンシスＣ．オーリクラリアエ、Ｃ ．ホリオルムまたＣ．フミコーラの菌株を培養することによることを特徴とする 、位置非特異性リパーゼ調製品。
8. ８．菌株がＣ．アンルクチカまたはＣ．ツクバエンシス、最も好ましくはＣ．ア ンルクチカに属する、請求の範囲第７項記載の調製品。
9. ９．菌株がＤＳＭ　３８５５，ＤＳＭ　３９０８，ＤＳＭ　３９０９，ＣＢＳ　 ５９５５，ＣＢＳ６６７８，ＣＢＳ　６８２１，ＣＢＳ　６３８９，ＣＢＳ　６ ３７９，ＣＢＳ　５７１，ＣＢＳ　２０４１，ＩＦＯ　１５２７，ＣＢＳ　５２ ３４またはその突然変異菌株もしくはそれらの変異菌株である、請求の範囲第７ 項記載の調製品。
10. １０．請求の範囲第１項〜第９項のリパーゼ調製品を固定化することによって得 られる位置非特異性リパーゼ調製品。
11. １１．熱安定性を有する固定化非特異性カンデイタリパーゼ調製品であって、基 質が部分的にまたは完全に飽和している場合、連続固定所エステル交換における ６０℃でのリパーゼ活性の半減期が約１０００時間である前記カンデイタリパー ゼ調製品。
12. １２．熱安定性を有する固定化非特異性カンデイタリパーゼ調製品であって、ト リオレイン中８０℃で７２時間インキユベーションした後残留リパーゼ活性が１ ０％超である、前記カンデイタリパーゼ調製品。
13. １３．リパーゼが粒状の、マクロポーラスが弱塩基性アニオン交換樹脂、好まし くはフェノールフォルムアルデヒドまたはアクリル酸タイプの樹脂に固定化され ている、請求の範囲第１０〜１２項の調製品。
14. １４．リパーゼが粒状の、マクロポーラスが弱イオン性吸着剤樹脂、好ましくは アクリルタイプの樹脂に固定化されている、請求の範囲第１０〜１２項記載の調 製品。
15. １５．位置非特異性リパーゼの製造方法であって、炭素、チッ素及びリンの同化 性源を含有する栄養培地中嫌気性条件下カンディダアンタルクチカ、Ｃ．ツクバ エンシス、Ｃ．オーリクラリアエ、Ｃ．フミコーラまたはＣ．ホリオルムの菌株 を培養し、好ましくは引き続き発酵ブロスからリパーゼを回収することを含んで なる、前記方法。
16. １６．菌株がＣ．アンルクチカまたはＣ．ツクバエンシス、最も好ましくはＣ． アンタルクチカに属する、請求の範囲第１５項の方法。
17. １７．菌株が【配列があります】 またはその突然変異株または変異株である、請求の範囲第１５項の方法。
18. １８．更に好ましくは５０〜７５℃で１５分〜５時間更に熱処理を行なう、請求 の範囲第１５〜１７項の方法。
19. １９．請求の範囲第１項記載のリパーゼ調製品の製造方法であって、以下の工程 （ａ）〜（ｃ）： （ａ）遺伝子発現を促進する機能を暗号化するＤＮＡ−配列およびカンディグリ パーゼを暗号化するＤＮＡ−配列を含んで成る適当な組換体ＤＮＡクローニング ベクターを得；（ｂ）工程（ａ）のクローニングベクターを用いて適当な宿主生 物体を形質転換し；次いで （ｃ）適当な培地中で形質転換した宿主生物体を培養し次いで所望により培養ブ ロスからリパーゼを回収する前記方法。
20. ２０．宿主がアスペルギルス菌株であり、更に次の（ａ）〜（ｃ）の工程： （ａ）適当なアスペルギルス宿主のゲノムに１又はそれ以上のコピーで相互移行 可能であり更に遺伝子発現を促進する機能を暗号化するＤＮＡ配列；形質転換体 を選択するための適当なマーカー；およびカンデイタリパーゼを暗号化するＤＮ Ａ配列を含んで成る組換体ＤＮＡクローニングベクター系を得； （ｂ）選ばれた選択マーカーに対し機能的遺伝子を有さないアスペルギルス宿主 を、工程（ａ）の組換体ＤＮＡクローニングベクター系で形質転換し；次いで （ｃ）適当な培地中で形質転換したアスペルギルス宿主を培養し次いで所望によ り培養プロスからリパーゼを回収する、前記方法。
21. ２１．エステル加水分解、エステル合成またはエステル交換において、請求の範 囲１〜１４項のリパーゼ調製品／または請求の範囲１５〜２０の方法によって得 られるリパーゼ調製品の使用。