JPH0141316B2 - - Google Patents

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JPH0141316B2
JPH0141316B2 JP57016699A JP1669982A JPH0141316B2 JP H0141316 B2 JPH0141316 B2 JP H0141316B2 JP 57016699 A JP57016699 A JP 57016699A JP 1669982 A JP1669982 A JP 1669982A JP H0141316 B2 JPH0141316 B2 JP H0141316B2
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JP
Japan
Prior art keywords
acid
amino
glycine
bacterial cells
glutamyl
Prior art date
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Expired
Application number
JP57016699A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS58134997A (ja
Inventor
Hidehiko Kumagai
Tatsurokuro Tochikura
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
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Granted legal-status Critical Current

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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
この発明はγ−グルタミル−α−アミノ−ｎ−
ブチリル−グリシン（γ−glutamy1−２−
amino−ｎ−butyry1−glycine、以下「オフサー
ルミン酸」と記す）の製造法に関する。 オフサールミン酸（ophthalmicacid）は眼球
表面に存在し、眼薬として使用出来ることが示唆
されている。 本発明者はこのようなオフサールミン酸のより
簡易な製造法を開発すべく研究したところ、γ−
グルタミル−α−アミノ−ｎ−ブチリツクアシド
（γ−glutamyl−α−amino−ｎ−butyric acid、
以下「GAB」と記す）とグリシン（glycine）と
をグルタチオンシンセテース（glutathione
synthetase、６，３，２，３ γ−Ｌ−
glutamyl−Ｌ−cysteine：glycine ligase
（ADP））の作用により水性溶液中にてpH4ない
し10の範囲で反応せしめることにより、効率よ
く、オフサールミン酸が得られることを知つた。 即ち、この発明は、GABとグリシンとを含有
する水性溶液をグルタチオンシンセテースの存在
下にpH4ないし10の範囲に保つことを特徴とする
オフサールミン酸の製造法である。 グルタチオンシンセテースとしては、精製酵素
標品のみならず、これらの酵素以外の成分をも含
有した粗標品をも使用出来る。また、グルタチオ
ンシンセテースはいずれの起源の酵素でも使用可
能である。すなわち、この酵素活性を有すること
が知られているもの、例えば、ハト肝臓、ブタ肝
臓などの動物起源のもの、マメ胚芽、コムギ胚芽
などの植物起源のもの、サツカロマイセス・セレ
ビシエATCC7752、サツカロマイセス・カールス
ベルゲンシスATCC9080などのサツカロマイセス
属、キヤンデイダ・ユーテイリスATCC15239な
どのキヤンデイダ属、シゾサツカロマイセス・ボ
ンペIAM4779などのシゾサツカロマイセス属、
トルロプシス・バーサテイリスNRRLY−6652な
どのトルロプシス属、その他、ピキア属、ブレタ
ノマイセス属、マイコトルラ属、ハンゼヌラ属、
エンドマイセス属などの酵母起源のもの、シユー
ドモナス・エルギノサATCC10145などのシユー
ドモナス属、コリネバクテリウム・エクイ
ATCC6939などのコリネバクテリウム属、スタフ
イロコツカス・アウレウスATCC4012などのスタ
フイロコツカス属、エシエリヒア・コリ
ATCC11246などのエシエリヒア属、エンテロバ
クター・エロゲネスATCC13048などのエテロバ
クター属、プロテウス・ブルガリスFERM−
P4795、プロテウス・ミラビリスIFO3849などの
プロテウス属、アルカリゲネス・フエカリス
ATCC8750などのアルカリゲネス属、バチルス・
サブチリスATCC13952、バチルス・ブレビス
ATCC8185などのバチルス属、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC6871などのブレビバ
クテリウム属、アグロバクテリウム・ラデイオバ
クターATCC4718などのアグロバクテリウム属、
アルスロバクター・シンプレツクスATCC6946な
どのアルスロバクター属、ミクロコツカス・リゾ
デイクチカスATCC4698などのミクロコツカス
属、エルビニア・ヘルビコラATCC21434などの
エルビニア起源のもの、ムコア・ジヤパニカス
ATCC15242などのムコア属、リゾープス・デル
マーIFO4775などのリゾープス属、アスペルギル
ス・オリーゼATCC15240などのアスペルギルス
属、ペニシリウム・ムテウムATCC9644などのペ
ニシリウム属、ノイロスポラ・クラツセ
ATCC9277などのカビを起源したもの、ストレプ
トマイセス・フラデイアATCC10745などのスト
レプトマイセス属などの放線菌起源のものなど、
いずれも使用可能である。 動植物起源のグルタチオンシンセテースを使用
する場合には組織を破砕してそのまま使用できる
が、または適宜硫安分画、セルロースカラムクロ
マトグラフイーやバイオゲルカラムクロマトグラ
フイーなどを行つて酵素蛋白を精製するなどして
使用する。微生物起源のものを使用する場合には
以下のように調整すればよい。 微生物の培養物または菌体を得る方法は特定の
方法を用いることを必要とせず、通常の培地を用
いて通常の方法で培養すればよい。グルタチオン
シンセテースとして、培養物をそのまま用いても
良いし、菌体、洗浄菌体処理物（凍結乾燥菌体、
アセトン乾燥菌体、トルエン、界面活性剤等と接
触せしめた菌体、リゾチームで処理した菌体、超
音波にさらした菌体、機械的に破砕した菌体な
ど）これら菌体、または菌体処理物から通常の酵
素分画法によつて得られたグルタチオンシンセテ
ース活性を有する酵素蛋白区分、さらにはこれら
の菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物等いず
れも使用出来る。 GABとグリシンとからオフサールミン酸を生
成せしめるには、水性溶媒中にGAB、グリシン
およびグルタチオンシンセテースを溶解し、溶液
を10から70℃の範囲の適当な温度、およびPH４か
ら10の範囲の適当なPHに暫時保てばよい。水性溶
液中に抗酸化剤、界面活性剤などを添加すれば好
ましい結果が得られることがある。また、反応
中、必要ならば、反応液に原料であるGASおよ
びまたはグリシンを追補添加してもよい。反応液
は特に強い撹拌をする必要はないが、必要により
適宜撹拌する。 水溶液中に生成蓄積されたオフサールミン酸を
採取する方法は、イオン交換樹脂を用いる等の通
常の方法で行うことが出来る。 実施例 １ 培養：１当り、グルコース10g、MgSO4・
7H2O 0.2g、KH2PO4 10g、NaNH4HPO4
10g、クエン酸・１水和物7.0g、Ｌ−スレオニ
ン25mg、Ｌ−ロイシン50mg、Ｌ−プロリン
25mg、Ｌ−アルギニン50mg、Ｌ−ヒスチジン
10mg、サイアミン1.0mgおよびペプトン10gを
含み、PH8.0に調節した培地200mずつ５容
フラスコ５本に入れて加熱殺菌した。これにあ
らかじめ、ブイヨン培地にて前培養したプロテ
ウス・ミラビリスIFO3849を接種し、28℃にて
36時間振揺培養した。一方、100容ジヤーフ
アーメンターに上記と同じ組成の培地25入れ
殺菌後、上記フラスコ５本の培養液を入れた。
培養は好気的条件下にて28℃で24時間培養を行
つた。このようにして得られた培養液を
20000rpmにて連続遠心処理後、湿重量750gの
菌体を得た。これを−20℃にて凍結保存した。 グルタチオンシンセテースの調整 １ 無細胞抽出液 凍結した菌体750gの融解後0.01Mリン酸緩
衝液（PH7.0、5mM MgCl2含有）にて全量
４とし、「ダイノミル」にて細胞膜を破砕
し、遠心分離後無細胞抽出液を3.8得た。 ２ 硫安分画 無細胞抽出液を硫安40〜80％にて分画した
後、0.01Mリン酸緩衝液にて４℃で透析を行
つた。 ３ プロタミン分画 塩基性蛋白質および核酸類を除くために総
蛋白の約10％のプロタミン硫酸を加え、遠心
分離により生成した沈澱物を除去した。 ４ DEAE−セルロースカラム処理分画 この上澄液を0.01Mリン酸緩衝液（PH7.0，
5mM MgCl2含有）にて平衝にしたDEAE−
セルロースカラムを用いてクロマトグラフイ
ーを行つた。0.05M NaCl溶液の活性部位を
硫安80％にし、約10日間静置後、遠心分離を
行い、沈澱した酵素蛋白質を0.01Mリン酸緩
衝液に溶かし酵素液を得た。 活性測定は第１表に示す反応液組成を用い
て37℃で30分反応を行つた。第２表に精製手
順と比活性とをまとめた。反応液中のグルタ
チオンの定量は液体クロマトグラフイーにか
けニンヒドリン発色法、および210nmでの吸
光度分析（カルボキシル基の測定）によつて
定量した。またニトロプルシツド法およびテ
トラチオネート法により定量を行つたが、い
ずれも一致した値を示した。
【表】
【表】 オフサールミン酸の生成反応 第３表に示す組成の反応液を30℃に48時間保
つた。反応収率は、対GAB収率49％でオフサ
ールシン酸が生成した。（生成したオフサール
シン酸は、アミノ酸アナライザーにて定量を行
つた。）
【表】 調整
オフサールミン酸の単離と同定 上記の反応により得られた反応液を
「Dowex50」（H+型）樹脂、「Dowex1×８」
（CH3COO-型）樹脂に通し、オフサールミン
酸を単離した。単離収率は43.7％であつた。得
られたオフサールミン酸はNMRにて同定し
た。また、単離したオフサールミン酸の結晶を
加水分解してグルタミン酸、グリシン、α−ア
ミノ−ｎ−ブチリル酸が生ずることを確認し
た。 実施例 ２ グルコース10g／、KH2PO4、2g／、
MgSO4・7H2O 1g／、ペプトン10g／、酵母
エキス10g／（PH7.0（KOH中和））からなる培
地50mを肩付フラスコ（500ml容）に分注し、
115℃にて15分間殺菌し、放冷した。 これにあらかじめ、ブイヨン培地で前培養した
第４表に示す微生物をそれぞれ接種し、31℃にて
24時間振盪培養した。得られた培養液をそれぞれ
遠心分離処理して菌体を集め、超音波処理により
それぞれ破砕し、更に遠心分離して、それぞれ無
細胞抽出液を得た。 それぞれの抽出液を酵素液として実施例１の方
法により生成したオフサールミン酸に定量をアミ
ノ酸アナライザーにて行つた。
【表】
【表】

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ γ−グルタミル−α−アミノ−ｎ−ブチリツ
    クアシド（γ−glutamyl−α−amino−ｎ−
    butyric acid）とグリシンとを含有する水性溶液
    をグルタチオンシンセターゼ（glutathione
    synthetase）の存在下にpH4ないし10の範囲に保
    つことを特徴とするγ−グルタミル−α−アミノ
    −ｎ−ブチリル−グリシンの製造法。
JP57016699A 1982-02-04 1982-02-04 γ−グルタミル−α−アミノ−ｎ−ブチリル−グリシンの製造法 Granted JPS58134997A (ja)

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JP57016699A JPS58134997A (ja) 1982-02-04 1982-02-04 γ−グルタミル−α−アミノ−ｎ−ブチリル−グリシンの製造法

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JP57016699A JPS58134997A (ja) 1982-02-04 1982-02-04 γ−グルタミル−α−アミノ−ｎ−ブチリル−グリシンの製造法

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JPS58134997A JPS58134997A (ja) 1983-08-11
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JP57016699A Granted JPS58134997A (ja) 1982-02-04 1982-02-04 γ−グルタミル−α−アミノ−ｎ−ブチリル−グリシンの製造法

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JPS58134997A (ja) 1983-08-11

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