JPH01302144A - 溶液中での電気発生のルミネセンスに基づく分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、水溶液または非水溶液中の発光性化合物が、
直接的には電極からの電子移動によって、あるいは間接
的には電気化学的に誘起される仲介的な反応による電気
パルスによって励起される方法に関する。なお前記化合
物からの発光は励起パルス終了後に検出される。

この新規な方法は検出限界が非常に低い分野に用途があ
る。たとえば、イムノア・ｌセイとハイブリッドアッセ
イのようなア・１セイを結付けるような分析方法である
。

［発明が解決しようとする課ＩＩ］ ルミネセンスに基づくいろいろな分析方法はその感度の
点で知られているが、発光種の濃度が非常に低い点が欠
点である。蛍光の感度は、非特定なバックグラウンド発
光を増加させる蛍光不純物は勿論のことレイリーおよび
ラーマン散乱によって限界がある。燐光は主として固体
状態に限られており溶液状態にあって室温燐光を有する
ごくわずかなこれら化合物の発光は普通極端に酸素に敏
感であるため実用化が阻まれている。ある種のランタニ
ドキレートの遅延蛍光はイムノアッセイの基準として用
いられているが、非常に検出が難しい、従来の蛍光や燐
光に基づく方法は光による励起を用い、適当な光源とオ
プチックスが必要である。化学発光（Ｃ［）をに基づく
これらの方法は励起用のオプチックスが必要でなく、そ
の計装は普通大変簡単である。しかし、ＣＬ法はしばし
ば難しい化学的障害をうけるものである。

本発明が示す方法は他の発光法の持つ欠点に打勝つもの
である。励起オプチクスを必要とせず、しかも、電流に
よるパルス励起に必要な電子計装は非常に簡単に製作で
きる。

本発明の核心は、寿命のながいルミネセンスを有する適
当な発光化合物を用い、そして励起パルスからしばらく
遅延して発する光を測定することによって非特定性のバ
・７フグラウンド発光を全面的に消去する事である。

［従来の技術］ 電気による化学発光（ＥＣＬＩは、古くから知られてい
る。この方法のイムノアッセイに対する応用はバードな
どによって既に揚案されている（　Ｄ、　Ｅｇｅ、　Ｗ
、　Ｂｅｃｋｅｒ　ａｎｄ　Ａ、　Ｂａｒｄ。

＾ｎａ１．　Ｃｈｅｗ、　５６　（１９８４１２４１３
，ＰＣＴ　Ｉｎｔ、＾ｐｐ１、　Ｗｏ　８Ｂ１０２７３
４１．彼等はアッセイを結合するさいにｔｌｌｌとして
ルテニウムまたはオスミウムを含有する化合物を使用す
ることを提案している。白金とガラス状炭素を実施例で
の電極の材料に使用し、この電極からの発光をポテンシ
ャルパルスの段階において測定する。

われわれがすでに発表したように電気で発生するルミネ
センスは、酸化物で覆すれたアルミニウムまたはタンタ
ル電極から適当な酸化剤の存在下で多数の無機イオンに
よって発生する。［ケー、ハバブカなど（に、　Ｈａａ
ｐａｋｋｅｔ　ａｌ、）による＾ｎａ１．　Ｃｈｉｌ、
　Ａｃｔａ、　１７１　（４９８Ｓ）　２５９］　、こ
れらの研究においても、電極からの発光は電極にポテン
シャルパルスを与えているときに測定している。

経済的で優先的に廃棄可能な電極を用い、比較的妨害の
少ない寿命のながいルミネセンスを有する化合物を使用
する方法が非常に有利であると思われる。このような方
法によれば、たとえば可成り単純で経済的な計装置でホ
モジニアスなイムノアッセイとヘテロジニアスなイムノ
アッセイとを結合するという用途があるであろう、イム
ノアッセイの場合または、もつと−数的な組合わされた
ア・ｌセイの場合、二つの成分ｂ（たがいに特定的に反
応し、生成物を適切な高感度の方法で定量する。測定す
るまえに生成物を分離することが必要ならば、その方法
はへテロジニアスと呼ばれ、分離ステップが不必要なら
ばホモジニアスな方法と呼ばれる。ＰＪ単だという理由
でホモジニアスなアッセイが好ましい、そしてヘテロジ
ニアスなアッセイは検出限界が低い、典型的には、これ
らの方法の場合、ある化合物の存在は、それに対して高
感度物質たとえば放射性同位元素、酵素、蛍光性化合物
など、定量できる化学的成分で標識することによって示
される。励起状態の発光減衰が緩慢である蛍光性化合物
で標識するのが特に有利である。イムノアッセイする大
半のサンプルは天然の蛍光性の種を含有しており、その
ためバックグラウンド発光が増加して従来の蛍光測定の
検出限界を阻害するのである。

ユーロビウムおよびテルビウムのキレートはその蛍光発
光の寿命がミリセカンドの範囲にあり、生物起源の有機
化合物の「自然」蛍光にくらべて数オーダー長い。

ルミネセンスに基づくホモジニアスアッセイは、表面に
吸着した抗体−抗原コンプレックスが溶液中の標識した
化合物を励起することなく、そして選択的に励起がるこ
とができるならば可能である。このことはすてに（米国
特許第３，９３９，３５０号１９１６年にて）石英スラ
イドに結合した抗体に結合した標識した抗原を用いるこ
とによって達成されている。試料はスライド表面から全
面的に光を反射しながら別の側から励起される。［定の
際には、固相結合部分だけが励起されるので分離段階は
不要となる。この方法では試料のスライドに厳密な光学
的要件が必要なので通常のアッセイには使用上限界があ
る。さらに散乱およびバックグラウンド蛍光が難しい問
題を残している０表面またはそのすぐ隣の発光性物質を
優先的に励起することは電気によるルミネセンスにより
技術的にさらに容易に達成できる。

［課題を解決するための手段］ 本発明はテルビウムまたはユーロビウムを含有した化学
的部分を溶質とする溶液に浸漬した電極中にそして／又
は電極の表面に電気パルスを加えることにより、さらに
同パルスをくわえてから暫くした後の遅延発光を１定す
ることにより、テルビウムまたはユーロビウムを含有し
た化学的部分の存在および／又は量を測定する方法に関
するものである。

測定した発光は電極の近傍に存在する化学的部分の量を
示すものと考えられる。この測定現象をここでは遅延電
気ルミネセンス、略してＤＥＬと名づける。

前記化学的部分の一般式は （Ｍ−Ｚ）　ｎ−Ｌｍ−Ｙｐ である、ただしＭはテルビウムまたはユーロビウムであ
り、ｎは１以上の整数であり、ｍとｐは０以上の整数で
あり、Ｚは多歯状の配位子てあり、しは結合基である。

Ｙについては後述する。Ｚ、ＬおよびＹは、遅延電気ル
ミネセンスが必要とする条件に合せた場合、化学的部分
を発光させることのできる組成物である。

最も簡単な例では、ｍとｐは共に０で、ｎは１である。

この場合、Ｍ−Ｚはテルビウムまたはユーロビウムのキ
レートである。Ｚの好ましい一つの構造は次の通りであ
る。

本方法はたとえば実施例１に述べるようにテルビウムの
高感度定量に利用できる。

もつと複雑な場合には、ｎ１ｍ≧１でありｐ≧１である
。物質ＹはＤＥＬ標識で標識できると言われる。適切な
物質Ｙのなかには沢山の生物的物質、たとえば全細胞、
亜細胞粒子、ウィルス、核酸、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、多し蛋白、ポリペプチ
ド、酵素、細胞代謝産物、ホルモン、薬理学的物質、ア
ルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、炭水化
物、血清誘導抗体またはモノクロナール抗体がある。

合成物質、たとえば薬剤、合成核酸、合成ポリペプチド
もまた本発明の範囲に含まれる。

物質Ｙは結合基りによってキレートＭ−Ｚに結合する。

結合基は２価のラヂカルでよく普通、当業者には周知の
ようにプローブ分子によって分析する分子に標識するの
に使用されるものである。これら２価の結合基のなかに
は、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＭｅ−ｔｆ）ようなウレイ
ド、チオウレイド、アミド、−Ｓ−。

−５−Ｓ−のようなチオエーテル、−３Ｏ２ＮＨ−、−
３Ｏ２ＮＭｅ−のようなスルホアミドが含まれている。

結合基りもまた長さと組成が変化するスペーサーと呼ば
れる分子鎖を含んでいる。このスペーサーはキレート部
と物質Ｙとをたがいに適当な距離に離しておくのに使用
され、しかもそれは前述の２僅の結合基を開基として有
している。これら側基の一部分は多歯状の配位子Ｚに結
合し、他部分は物質Ｙに結合する。多歯状の配位子Ｚは
−ＣＨ２Ｎ　（ＣＨ２Ｃ００Ｈ）２のようなキレート化
用側基を有する芳香態化合物であってもよい、好ましい
一つのキレートの構造は次の通りである： 本発明は問題とする標識した部分ｔ！−測定するのに使
用でき、問題とする分析物を測定するために標識した部
分を利用するのに使用でき、あるいは競合結合アッセイ
および非競合結合アッセイのいずれの場合においても問
題とする分析物を測定するために間圧の分析物のｔｓ識
した票似物を利用するのに使用できる、またこれら結合
アッセイはへテロジニアスかあるいはホモジニアスであ
る。また票似の結合アッセイは核酸ハイブリッド形成技
術に利用でき、この場合たとえば採取およびＰＣＲ（重
合酵素連鎖反応：　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ
　ｒｅａｃ−ｔｉｏｎ＋技術に基づく親和性を用いたハ
イブリッド形成アッセイとともにドツト・プロット（ｄ
ｏｔ−ｂｌｏｔ）およびサンドイッチハイブリッド形成
アッセイのような用途がある。

たとえば、競合イムノアッセイにおいて抗体を電極の表
面に被覆すると抗原とＤＥＬ標諧を有する抗原とが抗体
の活性部位に対して競争する。さて抗原は物質Ｙに対応
しそして前述したタイプのうちの一つに属することがで
きる。電極表面上の抗体・抗原コンプレックスの量は０
［［によって、免疫反応後に直接定量するか、あるいは
洗浄を行いそして例えば過酸化二値酸塩を含有した適当
な電解質溶液を添加してから定量する。さもなければ、
ホモジニアス非競合イムノアッセイを、を極表面の「捕
獲用（Ｃａｔｃｈｉｎｇ）　Ｊ抗体を固定化することに
よって行うことができる。こうした抗体で捕獲した試料
抗原は、抗原の別の場所に結合したＤＥＬ標りした抗体
を用いて定量する。この場合の抗原は、Ｙの定義に関連
して前記に掲げた物質である。

ム」じ 装置について特許請求はしていないが、本測定方法につ
いて明確なイメージを与えるためその詳細な説明を行う
。

本測定装置はパルス発生器、定電位装置、二または三ヶ
の電極を有する試料セル、オプションの光のフィルター
またはモノクロメータ−１光検出器およびゲーテイドイ
ンチブレター又は光子カウンターから構成されている。

パルス発生器は、Ｓ幅が調節でき自由にプログラムでき
るパルス鏝を発生するものなら何でもよい。

定電位装置は普通の三電極定電位装置がよいが、もし二
電極のものしか使えない場合には数十ミリアンペアの電
流を流すことのできるブースタ増幅器を用いる。

試料セルと光検出器は同一の光遮断箱に収納されている
。セルには電解溶液に浸漬した二または三ヶの電極があ
る。三電極の場合は一つの電極は参照電極・で、一つの
電極は補助電極で、いま一つの！極は作動電極である、
これらのｔ８ｉは普通の方法で定電位装置に接続しであ
る０発光は導電性材料で出来ている作動電極で測定する
。好ましい材料としては酸化物で覆われた金属たとえば
アルミニウム、タンタル、ジルコニウムまたはハフニウ
ムである。参照電極は普通の電極たとえばカロメル電極
またはＡＩＪ−＾ｇＣ１電極でよい、補助電極は導電性
材料なら何んでもよいが普通は白金を使用する。らし二
電極だけを使用する場合には；掻は同一材料たとえばア
ルミニウムで作ってもよく、この場合には光は両′ｒ４
［Ｉから発することができる。あるいは一方の電極を別
の材料でつくる。さもなければ、試料用コツプ自体をア
ルミニウムでつくってよく、その場合にはそれは作動１
ｇ極としてａ！能し光はそこから発光する。

作動電極からの光の強さを、光電子増倍管または中間に
第１チオンのフィルターまたはモノクロメータ−を持っ
たフォトダイオードを用いて測定し、光検出器からの電
気信号をゲーテイド　インチブレターまたはゲーテイド
光子カウンターへ伝える。ゲーティングは適当な遅れを
もってパルス・ゼネレーターからのパルスに同期化する
。

旦ニー必二迭 ＤＥＬを測定する試料°は溶液に溶解した化合物かある
いは作動電極の表面に吸着した化合物である。その化合
物のエレクトロルミネセンスの減衰は緩慢でなければな
らない、ｆｔＩｔ先的化金的化合物ランタニドコンプレ
ックスであり、好ましくはたとえばＴｂ”°またはＥｕ
”のキレートであってその減衰はミリセカンドの時間ス
ケールである。この化合物はそれ自体でも測定できるが
、標識としてアッセイすべき材料に結合することもでき
る。測定すべき化合物の外に、試料セル中の電解溶液に
は成る電解質が含まれているが、好ましくは導電度を増
加する硫酸塩かあるいは酢酸塩を用いる。過敢化二硫酸
塩、過酸化水素または溶存酸素のような酸化剤が溶液中
に存在してもよい、酸化剤の機能は直接または媒介され
た電解還元反応、たとえば。

によって反応性に富んだイオン基を生成することである
。

これらのイオン基は発光化合物と反応して発光する。そ
の結果、作動電極にないし陰極パルスが与えられた後、
エレクトロルミネセンスが観察される。陽極パルスはあ
る種のランタニド化合物に対して使用できる可能性があ
る。

発光化合物によって適当な持続性と衝撃係数を有する一
連の陰極パルスを作動；掻に与える。その結果生じた発
光は適当なゲートの幅と遅れを用いて陰極パルス終了後
に測定する。好ましいテルビウム・コンブレフラスの場
合、陰極パルスの長さは０．２ｍｓないし５１の範囲を
変動し、パルス後の遅延はＯ，＋ｍｓないし０．５ｓ＋
ｓであり、そしてゲート幅は２ｍｓないしＴｏｍｓであ
る。ユーロビウム・コンプレックスの場合は、約４借用
い、オープン・ゲート時間中に本積した信号は、所要な
信号対ノイズ比を達成するに必要な期間を対象に平均す
る。

［実施例］ 本例における試料溶液は、［酸ナトリウの０．３８溶液
、過酸化二硫酸カリウムの０．００１１１溶液および３
．６−ビス−［Ｎ、トビス（カルボキシメチル）アミノ
メチル］−４−ベンゾイルフェノールの１０−’Ｈ温溶
液あり、そしてそのｐＨをＳ　Ｘ　”’（７）　）すｘ
　（Ｔｒｉｓ）とＮａ０）１によッテ１１．２に調整す
る。ＯＥ［の測定は厚さ０３ＩＩ１１で純度９９．９に
のアルミニウム製の使い捨てコツプ中で行った。塩化テ
ルビウムの添加量を増加させながら加え、そして遅延エ
レクトロルミネセンスを、連続時間＋ｌｓ、振幅８．５
Ｖ、衝撃係数４％の陰極パルスを使って測定しな、アル
ミニウムコツプから発した光を光電子増信管と２チヤン
ネル光子カウンター［スタンダードリサーチ（５ｔａｎ
ｄａｒｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈｌ製モデル５Ｒ４００］で
測定した。一つのチャンネルのゲートは陰極パルス終了
後０２■Ｓないしｌ０ｍ５開いており、そして池のチャ
ンネルは＋０．２■Ｓないし２０Ｉｓのあいだｒ暗流１
光子をカウントした。１００ｓカウントしたｆ＆に２台
のカウンターレジスターの値を相互に差引いた０表１と
第１図はその結果である。

表　　　１ テレビラム　−ｏ１／ｌ　　　　　　　光子／１００ｓ
亙」Ｌ旦−一１ 指環イ用　合物の　造 （以下余白） ス（メト　シ　ルボニルメチル）アミノメチメタノール
（２０１１中に３１駕のホルムアルデヒド水溶液＋０．
８１９，１０−ｍａｌｌ　を溶かした溶液に、ジメチル
イミノジアセテート（１，６＋　ｇ、　ＴＯｍｍａｌｌ
を加えた。得られた溶液を真空中で？ａＩＩＬな、別に
用意したメタノール（２５ｍｌ）を残渣に加え、得られ
た溶液を真空中で濃縮した。残部に対し４−ヒドロキシ
−３°−ニトロベンゾフェノン（１２２０，５−一０１
）を加え、得られた混合物を撹拌しながら１１０℃で２
０時間加熱した。生成物は溶離液にクロロホルムを使用
しシリカゲルでクロマトグラフィーにより精製した。帯
黄色のオイルの収を 量は１．７６１Ｊ（６０駕）であった、ＨＮＨＲ（ＣＤ
ＣＩ３１δ　３．４８　（＋Ｈ，ｓ）、　３．５８　＋
８８．　ｓ）、　３．７１　（１２Ｈ，ｓｌ、　４．０
８　（４Ｈ，ｓｌ、　７．７３　（２Ｈ，、ｓｌ、　７
．５６−　８．５８　　ｆ４Ｈ，ｍｌ　　。

４−（３−アミノベンゾイルｌ−２，６−ビス　ＮＮ−
ビス（メトキシカルボニルメチル）アミノメチル　フェ
ノール　（２）のΔ 化合物１　（０，８９ｏ、　１．５　ａｍａｌｌを圧力
５０ｐｓｉ　（３，５２にｇ／ｃｍ　）　ノ水素雰囲気
下テｌＯＸノＰｄ／Ｃ（９０ｍｏｌを加えたメタノール
（５０ｌ１ｌｌ中で１時ｒｒｌＩ撹拌した。得られた混
合物を一過し真空中で蒸発した。生成物を、溶Ｈａとし
て軽油（ｂ、９．５０−７０℃）／酢酸エチル（２：５
１と使用しシリカゲルでクロマトグラフィーにより精製
した。帯黄色のオイルの収量は０．４００（４８％）Ｔ
ア−）な、　　　ＨＮＨＲＴＣＤＣＩ３　）　　：　Ｋ
　３５６、　（ＩＨ，ｓ）、　３．５９　（８Ｈ１ｓ）
、３．７１　ｆ＋２Ｈ，ｓ）、４．０１　＋６８．　ブ
ロードｓ）、　７．０５−７．１４　（４Ｈ，ｌ１１、
７．７０　（２Ｈ，Ｓ）　。

化合物（２）（０，４０ａ、　　０．７＋　ａｍａｌｌ
を０．５８７７）にＯＨ−エタノール（２０ｍＬ）と水
ｆ５　ｍａｌの溶液中で３時ｒ：Ｉ撹拌した。得られた
混合物を１ＨのＨＣ１で中和し真空中で蒸発した。水（
ＩＳ　ａｌｌと塩化テルビウム（０，２７ｇ、　０．７
２　■ｏｌ）を加え、ｐＨを８０に調節してから混合物
を濾過した、Ｐ液に数ミリリットルのアセトンを添加し
、テルビウムコンプレックスをＰ別した。水（３ｓＬ］
中にある本コンプレックスの小部分（６８ｍｇ）を、Ｃ
ＨＣｌ３中にあるチオホスゲン（３１μＬ、　　０．４
　　ｍｍｏｌｌとＮ　ａ　ＨＣＯ３＋４２　１！＋、　
　０．５園−０１）の混合物に対して滴下した。１時間
撹拌後、水層を分離しＣＨＣｌ３で洗浄しな、数ミリリ
ットルのアセトンを加えた後、析出物をＰ別し、溶離液
としてＣＨ３ＣＮ／Ｈ２０（４：１）を用い、シリカゲ
ルでクロマトグラフィーによって精製した。収量は１５
■ａ　［３８％：　（２）を基準として］であった。

ヒツジ−抗−ヒトＰＬＡ２抗血清の標識化：　４−（３
−インチオシアネートベンゾイル）−２，６−ビス［８
，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノメチル】フェ
ノールのテルビウムコンプレックス【実施例■の（３）
Ｊを６０倍モル過剰にして抗体とｐＨ９，５で一晩反応
させた。１５［識した抗体を、セファデックＸ　（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘｌＧ−５０（ｌｘ　５．５　Ｃｍ）　ト４
ニア　ｙ　ｏ−ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｌ　６８（ＩＸ
　５．２　ｃａｌを充填したカラムにて溶離液として９
　Ｑ／ＬのＮａＣ＋と０．０５ＸのＮａＮ３を含有する
ｐＨ９，３の０．ＩＭの炭酸ナトリウム［１液を使用し
て過剰な遊離テルビウムコンプレックスから分離した。

アルミニウムコツプの被覆ニ アルミニウムコツプ（厚さ０．３Ｈ純度９９９ｚのアル
ミニウム箔製）を、９　Ｑ／ＬのＮａＣ１とｏ、ｏｓｘ
のＮ　ａ　Ｎ３　（ＴＳＡ−Ｍｆｆｆ液）を含有したｐ
Ｈ７，５の０，５ＨのＴｒｉｓ−ＨＣＩｌｌＩ街液中で
室混液中晩物理的に吸着させることによって抗−ヒトＰ
ＬＡ２抗血清で被覆した。被覆後アルミニウムコツプを
洗浄？ｌＩ　（９ｇ／ｌのＮａＣ１、０，ＯＩＸのＮａ
Ｎ３及び０．２　Ｑ／ＬのＴＷｅｅｎ２０）で洗い、そ
して０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で−晩飽
和し、そして＋４℃で湿潤状態に保存した。

イムノアッセイ： アルミニウムコツプを一回５００μ［の洗浄液で洗浄し
た。　ＴＳＡ−ＧＩｌ街液（０，１駕のＢ−３Ａ　ｌ中
の０．９．５４および３２４　ｎｇ／ｍＬのホスホリパ
ーゼＡ２を含有した２５μ［の標準を前記コツプに加え
、次いで５９／［のＢＳＡ、　０．５　ａ／ＬのＮａＮ
３を含有したｐＨ７，８で００５ＨのＴｒ　ｉ　５−Ｈ
２５０４ＭＮ液中７７）　＋７５　ｔｔ　Ｌ　ｆ）Ｔ　
ｂ　ｃｅ識した抗−ＰＬＡ２抗体（５７０ｎｏ／ｍＬｌ
を加えた。

連続的に振とうしながら３時間製置した後、コツプを６
回洗浄液で洗った。カウンティング時開が僅か３秒であ
った点は別として、実施例工のように０．３　ｓｏｌ／
ＬのＮａ２　ＳＯ４と０．００１　ｓｏｌ／Ｌのに２　
Ｎ２０８を含有したｐＨ８゜７である４５０μＬの０．
００１　ＨのＴｒ　ｉ　５−Ｈ２５０４榎衝液を加えた
後にコツプの中でエレクトロルミネセンスを測定した。

アッセイの結果は表２と第２図に示しである。

表　　　２ ＾ＬＡ霊ｎｇ／ｍＬ　　　　光子／１０’／３゜ＯＬ、
９　１．７ ９　　　　　　　　　　　　　　３．０　　　　　２．
４５４　　　６．５　５．９ ３２４　　　１８．６　２４．４ コツプの被覆とヒツジ−抗−ヒトＰＬＡ２抗血清の標識
化は実施例■のように行ったイムノアッセイ： アルミニウムコツプを１回５００μ［の洗浄液で洗浄し
た。ヒト血清中の０．９，５４および３２４　ｎｏ／鳳
ＥのホスホリパーゼＡ２を含有した２５μＥの標準を前
記コツプに加え、次いでＳｏ／ＬのＢＳＡ、　　０．５
ａ／ＬのＮａＮ３．０．３ｓｌ／Ｌｆ）　Ｎ　ａ　２　
　Ｓ　Ｏ４，Ｏ，ＧＯ＋　　ｍｏｌ／Ｌのに２　　Ｎ２
０８を含有したＤ）１８．７で０．０５　ＨのＴ　ｒ　
ｉ　ｓ　−Ｈ２ＳＯ４［ｆｆ１ｉ中）４２５　μＬ　ノ
Ｔｂ　″ｃ標識した抗−ＰＬＡ２抗体（２３５ｎｏ／ａ
ｌｌを加えた。

連続的に振とうしながら３時間温室した後。

カウンティング時間が１か３秒であった点は別として、
実施例Ｉのようにコツプの中でエレクトロルミネセンス
を直接測定した。アッセイの結果は表３と第３図に示し
である。

表　　３ ＰＬＡ愈ｎｇ／■Ｌ　　光子／１０“／３゜ＯＬ、６　
１．５ ９　　１．８　２．１ ５４　　３．１　３．７ ３２４　　９．１　１０．４　。

【図面の簡単な説明】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、テルビウムまたはユーロビウムを含有する化学的部
   分の存在及び／又は量を、電気的パルスを溶液に浸漬し
   た電極に与えることによりそしてパルス終了後しばらく
   してからの遅延した発光を測定することにより把握する
   方法おいて、前記化学的部分が前記電極に結合している
   か、そして／又は前記溶液中に存在し、かつ前記発光が
   前記電極の近傍に存在する化学的部分の量を示すもので
   あると見做されることを特徴とする方法。 ２、前記化学的部分が一般式： （Ｍ−Ｚ）ｎ−Ｌｍ−Ｙｐ を有することを特徴とする請求項１記載の方法。ただし
   式中： Ｍはテルビウムまたはユーロビウムであり；ＺはＭの多
   歯状の配位子であり；Ｌは−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＭｅ
   のようなウレイド、チオウレイド、アミド；−Ｓ−、−
   Ｓ−Ｓ−のようなチオエーテル；−ＳＯ２ＮＨ−、−Ｓ
   Ｏ２ＮＭｅ−のようなスルホンナミドのごとき結合基で
   あり、かつＬは種々の組成と長さの分子鎖を含むことが
   でき、しかもこの分子鎖は前記の２価の基の一部分によ
   つて多歯状の配位子Ｚに結合し、また他部分によって物
   質Ｙに結合する。 そして、Ｙは一個以上の結合基Ｌを経てＺに結合する物
   質であるが；ｎは１以上の整数であり；ｐは０以上の整
   数であり；ｍは０以上の整数である。 ３、前記化学的部分が化学的物質に結合できることを特
   徴とする請求項１または２記載の方法。 ４、問題の分析物の存在を測定するための競合結合法に
   おいて、分析物と化学的部分は競合的に化学的材料に結
   合するが、化学的部分は一般式： （Ｍ−Ｚ）ｎ−Ｌｍ−Ｙｐ を有し、式中 Ｍはテルビウムまたはユーロビウムであり；ＺはＭの多
   歯状の配位子であり；Ｌは−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＭｅ
   のようなウレイド、チオウレイド、アミド；−Ｓ−、−
   Ｓ−Ｓ−のようなチオエーテル；−ＳＯ２ＮＨ−、−Ｓ
   Ｏ２ＮＭｅ−のようなスルホンナミドのごとき結合基で
   あり、かつＬは種々の組成と長さの分子鎖を含むことが
   でき、しかもこの分子鎖は前記の２価の基の一部分によ
   つて多歯状の配位子Ｚに結合し、また他部分によつて物
   質Ｙに結合する。 そして、Ｙは一個以上の結合基Ｌを経てＺに結合する物
   質であるが；ｎは１以上の整数であり；ｐは１以上の整
   数であり；ｍは１以上の整数である。 前記の方法は； ａ）前記の、化学的材料、化学的部分および分析物を、
   試薬混合物が形成するように適当な条件の下で接触させ
   る事； ｂ）溶液中に浸漬した電極に電気パルスを与えることに
   よって化学的部分の発光を誘起する事； ｃ）電気パルスを与えてから少しおくれて発する光を検
   出する事とそれによって問題の分析物を測定する事とか
   ら成ることを特徴とする。 ５、Ｙが全細胞、亜細胞粒子、ウィルス、核酸、多糖、
   蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞代謝産物、ホルモン、
   薬理学的物質、薬剤、アルカロイド、ステロイド、ビタ
   ミン、アミノ酸または炭水化物であることを特徴とする
   請求項２、３または４記載の方法。 ６、Ｙがヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリ
   ヌクレオチドであることを特徴とする請求項２記載の方
   法。 ７、Ｙが抗体であることを特徴とする請求項５記載の方
   法。 ８、前記化学的物質が全細胞、亜細胞粒子、ウィルス、
   核酸、多糖、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞代謝産物
   、ホルモン、薬理学的物質、薬剤、アルカロイド、ステ
   ロイド、ビタミン、アミノ酸または炭水化物であること
   を特徴とする請求項３記載の方法。 ９、前記化学的物質が少なくとも一つの電極の表面上に
   固定化されることを特徴とする請求項３記載の方法。 １０、前記化学的物質が抗体であることを特徴とする請
   求項３記載の方法。 １１、前記分析物が全細胞、亜細胞粒子、ウィルス、核
   酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオ
   チド、多糖、蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞代謝産物
   、ホルモン、薬理学的物質、薬剤、アルカロイド、ステ
   ロイド、ビタミン、アミノ酸または炭水化物であること
   を特徴とする請求項４記載の方法。 １２、前記分析物が抗体であることを特徴とする請求項
   １１記載の方法。 １３、前記化学的材料が抗体であることを特徴とする請
   求項４記載の方法。 １４、前記化学的物質が電極の表面上に固定された分析
   物特有抗体であり、Ｙが分析物上の別のあるいは同じ抗
   原決定基に対する抗体であり、そして分析物が抗体の間
   に結合していることを特徴とする請求項３記載の方法。 但しこの方法は非競合アッセイである。 １５、前記分析物がが全細胞、亜細胞粒子、ウィルス、
   核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、多糖、
   蛋白、ポリペプチド、酵素、細胞代謝産物、ホルモン、
   薬理学的物質、アルカロイドまたは炭水化物であること
   を特徴とする請求項１４記載の方法。 １６、方法がホモジニアスな方法であり、そして適切な
   条件が、結合化学的部分と非結合化学的部分とが電気パ
   ルスによる発光が検出される前には分離されないような
   条件であることを特徴とする請求項３、４、１４または
   １５記載の方法。 １７、方法がヘテロジニアスな方法であり、そして適切
   な条件が、電極に対して電気パルスを加えそして発光を
   測定する前に結合化学的部分と非結合化学的部分とを分
   離することから成ることを特徴とする請求項３、４、１
   ４または１５記載の方法。 １８、電極の少なくとも一つがアルミニウム製であるこ
   とを特徴とする請求項１記載の方法。