JPH01291163A - 多孔質担体相で化学反応又は生化学反応を行う方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は一種又はそれ以上の反応相手が固形担体に付着
し又は付着している化学反応を行うための方法及び装置
に関する。このような反応は溶液又は生体液の分析試料
中の化学種若しくは生化学種の定量に特に有効であり、
その際、これらの種は担体表面に結合若しくは吸着した
反応体と直接に反応するか、又は前記担体にまず固定さ
れ、その後シグナル発生反応においてそれらに特異的な
反応体と反応する。

本発明の方法及び装置は、健康診断及び臨床診断の分野
、具体的には免疫試験及び核酸プローブ試験に特に有効
であるが、これらのものには限定されない。

〔従来の技術及びその課題〕

生体外診断学において、最も有効な試験の中に免疫診断
に基づくものがある。これらの試験は臨床的に感度が高
く且つ臨床的に特異的であることから、患者の診断及び
治療の面において非常に重要である。これらの試験の使
用例としては、薬物療法の監視、糖尿病の治療の監視、
妊娠の探知、種々の癌の検出及び監視、微生物怒染の検
出、脂質及び脂肪タンパク代謝不全の検出及び監視並び
に肝炎又は旧Ｖ１Ｍ等のウィルス感染の検出が挙げられ
る。

免疫診断アッセイは、緊密、急速且つ効果的な不可逆反
応シーケンスにおける、特異的結合物である抗体とその
結合相手である抗原との反応に基づいている。一般に免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）クラスの抗体である糖タンパ
ク質は分子量が約１５０．０００ダルトンで、自然形の
ものでは結合部位が２つある。各結合部位は、標的の抗
原分子上にある（通常同一の）三次元構造体（エピトー
プ）を認識する。抗体はこのエピトープに対して非常に
特異的であり、非常に大きな親和性でしっかりと且つ効
果的に抗原に対して理想的に不可逆結合する。この方法
では、抗原抗体反応（即ち、免疫学的検定法）に基づく
生化学分析が、反応の特異性のために非常に特異的であ
り且つとりわけ反応の親和性（即ち、結合の緊密性）ゆ
えに感度がよい。このように特異性がありかつ感度がよ
いので、抗原抗体反応（免疫学的検定法）は、生化学分
析の領域、特に診断／予診医学のような臨床医学の領域
において極めて有効である。一般的に、この免疫学的検
定法の目的は、体液中に非常に低濃度（くμｍｏｌ／２
）で存在する疾患の状態を示す化合物を、物理的に類似
した化合物の階乗レベルでの高濃度の存在下で検出及び
／又は監視することにある。このような化合物（標的抗
原）の検出は、通常、従来の手段により適当な高親和性
抗体を得た後、抗原を感度よく特異的に検出するアッセ
イシステムを設計することにより達成される。単純な態
様、即ち、競合免疫学的検定法では、このようなシステ
ムには、標識（後で種々の手法により同定できる）を担
持している既知の所定濃度の精製標的抗原及び既知の所
定濃度の特異的抗体が使用される。

標的抗原と標識抗原が特異的抗体との結合において競合
し、その結果、分析試料中の標的抗原により、抗体に結
合する標識抗原の割合が減少する。

これにより用量一応答関係の基準が得られるので、未知
濃度の標的抗原を有する試料についてこの基本操作を行
うことができ、且つ公知の標準標的抗原溶液と対比して
「未知」の試料を操作し、そのデータを内挿するだけで
標的抗原濃度を正確に推定することができる。

このような免疫学的検定システムを操作する際の重要な
要件の一つとして、遊離種からのシグナルと複合体結合
標識により生じるシグナルとを識別することが挙げられ
る。このことは、通常、特異的結合シグナル又は遊離シ
グナルを検出する前に、遊離種及び結合波を物理的に分
離することにより達成される。

このような分離を行う手段は広範囲にわたっている。一
般的に、この「分離」工程は、免疫学的検定試験シーケ
ンスにおいて最も重要な工程の一つであり、最も大きな
誤差源である。この危険を避けるために、物質の分離を
行わずに、即ち、操作工程なしに、遊離標識シグナルと
結合波シグナルとを識別することが可能なシステムが提
案された。しかしながら、これらの手法（「均一」免疫
学的検定法と定義されている）は、分析時間の点におい
である程度成功したにすぎない。

事実、これらの非分離システムで高域度のものはなく、
且つこれらのシステムの基本的な物理化学的性質から、
高分子量かあるいは低分子■標的抗原のどちらかに限定
されてしまう。このようなことから、広範囲の分子量の
標的抗原に用いることのできる高感度アッセイを行うに
は、分離工程のある免疫学的検定、即ち、不均一免疫学
的検定でなければならない。

現在のところ、上記したように、現代の診断医学におい
て進めるべき最も重要な事柄は、技術的に高度化してな
い試験環境（例えば、医院）下で、高域度で且つ特異的
なアッセイを行うことである。

しかしながら、これも上記したことであるが、適切な分
析基準を満足するには、アンセイプロトコールにおいて
分離工程を使用する必要があり、このため、アッセイが
非常に複雑となるとともに高度技術が要求される。従っ
て、産業界及び大学内における研究の方向が、オペレー
タが関与するのができるだけ少なくてすむ簡単な構成の
分離免疫学的検定を行うことに向いてきた。本発明の目
的の一つは、この要求を満たすことにある。又、試料及
び試験作業量が多い専門家の研究所においても、依然と
して、このような免疫学的検定を行うための信軌性のあ
る全自動システムについての要求がある。本発明の更な
る目的は、このようなシステムの基本構成要素を供゛給
することによりこの要求をも満たすことにある。

このような簡単な分離免疫手法の開発は、通常、計装が
必要でなく且つオペレータの操作（例えば、正確なピペ
ツティング等）ができるだけ少なくてすむ独特の物理的
構成に基づいて行うか、あるいはアッセイシーケンスに
おける全ての手動操作を効果的に自動化する専用に設計
した計装を用いてアッセイシーケンスにおける主要な工
程を自動化することに向けられる。後者の解決法は、高
価であり且つ？ｊ！　ｉｔであるが、正確で再現性があ
り且つ定量的な結果は、他の手段では得ることができな
い場合が多い。現在のところ、上記したような生化学的
及び化学的分析を行うための小型、高感度、特異的且つ
定量的な分析器は存在していない。本発明は、特に免疫
学的検定に有効で、分散した試験環境だけでな（中心的
な試験室用の定量的又は定性的アッセイシステムの両方
の開発を初めて可能にする新規なタイプのアッセイ形態
に関する。

基本的には、ここで使用される手法には、試薬が吸着又
は結゛合により固定される担体相が用いられる。最も簡
単な場合には、免疫対の反応相手の一つを担体に固定し
、他方の相手（通常は溶液の形態である）を担体と接触
させることにより免疫複合体形成等の反応が生じる。反
応相手の一つには、続いて測定されるシグナルを発生す
ることのできるマーカが担持されている。通常、このマ
ーカは、放射性同位体、蛍光若しくは着色標識又は酵素
シグナル発生剤でよい。この反応に続いて、過剰の溶液
を担体相から洗い流して未結合標識を結合標識から分離
し、使用される試薬及び免疫学的検定の種類に応じて、
担体上若しくは溶液中の一方又は両方でシグナルを測定
する。

この領域における関連先行技術には、種々の担持固相を
使用し、適当な時間に抗原抗体反応生成物を分離するも
のがある。これに関して、これまで数多くの固相が使用
されてきた。いくつかの例としては、プラスチック管若
しくはウェル表面及びプラスチックボール若しくはビー
ズ表面が挙げられる〔ケイ　ジエイ　キャト（Ｋ、Ｊ、
ＧＡＴＴ）　、ジー　ダブリュ　トレギア（Ｇ、Ｗ、Ｔ
ＲＥＧＩｌ！ＡＲ）等、クリニ　チム　アクタ（ＣＩｉ
ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔ）、２７．　２６７〜２７９（１
９７０）　；　イー　エングハル（Ｅ、　ＥＮＧＶＡＬ
Ｌ）及びビー　バールマン（Ｐ、ＰＥＲＬＭＡＮＮ）　
、ジェイ　イムツル（Ｊ、　ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１０
９．１２９〜１３５（１９７４）参照〕。

又、微粒子状セルロース〔エル　ワイド（Ｌ、Ｗｉｄｅ
）等、バイオケム　バイオフィズ　アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　、１３０．２５７　（１
９６６）参照）、制御多孔質ガラス粒子〔エイチ　ェイ
チ　ライ−トール（Ｈ，１１，Ｗｈｅｅｔａｌｌ）等、
バイオテクノロジー　バイオエンジニアリング（Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎ、Ｂｉｏｅｎｇｉｎ、）　、１５．４５５（
１９７３）　、コーニンググラスワークス参照〕、磁化
性微粒子及び掻微小架橋デキストランビーズ（米国特許
第４，４２５，４３８号も参照のこと）等の数多くの微
粒子状固相もある。しかしながら、ビーズ又はチューブ
の内部等の被覆マクロ表面の場合、反応に関与する表面
積が非常に小さいので、最大特異シグナルが制限される
。又、標的抗原の大部分は反応表面から物理的に離れて
いるので、このような系では、事実上拡散律速される。

一方、微粒子の場合ムは、有効表面積が大きいので、高
濃度の特異試薬がアッセイで導入できるとともに、「マ
クロ」固相の場合に問題となる拡散律速因子を減少する
ことができる。しかしながら、微粒子固相は取扱いが難
しく、且つ物理的分離（最も普通に用いられている手法
は遠心分離）が非常に必要である。

このようなことから、反応速度が速い利点と分離が簡単
である利点とを併せ持つ新規なタイプの固相、例えば、
多孔質相担体が必要とされていた。

実際のところ、微粒子状固相の場合、液体中に固体を分
散させ、固体を液体中で動かすことにより混合分離を行
うので、根本的に不満足なものである。この問題の解決
について、より満足でき且つ実用的な方法として、固相
内部に液相を分散させ、この固体内部で液体を移動させ
ることにより混合及び分離を行うことが挙げられる。液
相を分散することにより、接触が行われる表面積を増加
することができる。後者の方法には、明らかに３つの利
点がある。第一に、再凝集させることができない粒状固
体とは異なり、分散した液相を集めて均一相とするのが
比較的容易である。第二に、標的抗原自体が液相中に分
散されとともに、固相内部での液相の分散を制御するこ
とによう液相を固相の反応性表面と接触させることがで
きる。第三に、固相の反応性帯域を通って液相が移動す
るので、標的抗原を漁り取ることができるとともに、完
全反応の効率が高まる（吸収カラムはアフィニティーカ
ラムと比較して）。このように、多孔質担体は、微粒子
担体に対して顕著な利点がある。このような多孔質担体
は、よく知られている濾紙の形態で人手でき、最近では
、物理的には類似しているが顕微鏡的及び化学的に異な
る材料、即ち、膜の形態で入手できる。これらの膜は市
販されており、剛性な物理的特性を有し、多くの化学溶
媒に対して反応性がなく且つ規則的な孔構造を有してい
る。又、多数の市販の製品が、化学的に改質されて高活
性表面にされ、簡単且つ迅速に高濃度の特異試薬を膜構
造体内部に固定できるようになっている〔例えば、米国
１１５４２ニユーヨーク州グレンコープにあ−るポール
社製バイオジン（Ｂｉｏｄｉｎｅ）（商標）；ミリボア
社製のイムノピロン（ｒｍｍｏｂｉ　ｔｏｎ）（商標）
；米国９４８０４カルホルニア州リツチモンドのグリフ
インアベニューにあるバイオラッド社製ニトロセルロー
ス〕、これらの固相は、微粒子及びマクロ固相両方の好
ましい要素を保有し欠点がほとんどない。

アッセイを行うためのこのような多孔質固相保持体の基
本的有用性を利用した例が当該技術分野に多数ある。こ
れらのほとんどの例が、固相を保持するレセプタクルの
構造及び種々の溶液をどのようにして固相を通過させる
かに関するものである。米国特許第３，８８８，６２９
号は、フィルター等の吸収パッド内で反応を行う方法を
教示している。

ここに記載されている反応セルは、反応が生じるマトリ
ックスパッドを保持している容器を包含している。この
容器は、全ての液体がパッドを通過できるような構造と
なっている。この手法は、主に放射性同位体を利用する
アッセイに使用するようにしたものであった。現在の試
験の要件から見て、このようなシステムはいくぶん時代
遅れの惑がある。更に、当該技術分野における関連技術
として、米国特許第４，２４６．３３９号に記載されて
いるような、２つの構成要素、即ち、部材を有する試験
装置が挙げられる。これらの部材は、互いの方向に又は
互いに離れるように相対移動できるように配置されてお
り、特異試薬が担持されている膜を吸上げ剤として作用
する吸収パッドと接触させて、膜と物理的に均質に接触
したときにその膜を通って溶液を吸引させる。更に、関
連技術として米国特許第４，６２３，４６１号が挙げら
れる。ここでの試験装置では、液体をフィルターを通過
させるのでなく、横方向に固相反応マトリックスを通過
させて移送し、適用位置から外方向に吸収剤の方に流す
ようになっている。この関連技術によれば、結果がより
正確になるとともに、特異的シグナルが生成する膜のど
ちら側でもシグナルを読み取ることができると記載され
ている。先行技術の更なる例としては、米国特許第４．
６３２，９０１号が挙げられる０、ここでは、特異試薬
を支持部材又はフィルターに、−試料が作用する領域よ
りも小さい領域に結合させている。又、別の実施態様と
して、ミクロ毛管が入っている吸収パッドを膜と直接接
触させて配置することが記載されている。更に、関連先
行技術としては、米国特許第４．４０７，９４３号、米
国特許第４．３６６．２４２号及びヨーロッパ特許第０
．０２００３８１号が挙げられる。これらの先行技術に
おいては、はとんどの場合、発生した反応シグナル、一
般的には発現した色又は蛍光を、多孔賀吸収和からのに
より直接観察しており、従って、得られる結果は定量的
ではなく定性的である。例えば、最初の例を除く上記の
場合の全てにおいて、反応生成物は固相内で着色沈澱物
として検出できることを想定している。一般的には、結
合対の一方の相手を酵素に結合させてもよい。種々の反
応に続いて、試薬パッド構造体内で沈澱する色素生成物
質を添加することにより結合酵素を検出し、生成した色
は視覚化することができ標準色と比較できる。この方法
は、シグナルの性質からして、定性又は半定量分析にし
か適さない。即ち、膜又はフィルターパッド構造体内に
沈澱している色素を正確に定量化するのは困難である。

そこで、既知の物理的寸法を存する正確に定めた光学セ
ル内の溶液中で生成する色を測定する手法が選択される
こととなる。

しかしながら、多孔質マトリックスにおける拡散抑制状
態とならないようにする問題が残っている。反応相手が
一緒に激しく攪拌される微粒子状固形担体を用いても、
数百如の厚さの未混合液相が固相表面に残存し、反応が
全体的に分散するのが抑制される結果となる。従って、
不均質操作に固有の拡散についての問題を克服しようと
する場合、多孔質担体媒体の均質構造についての詳細な
知識が非常に重要である０通常の分析キュベツトの自由
に利用できる空間においては一般的である均質条件下で
操作したときには、このような問題が起こらないことは
明白である。これらの問題及び適当な多孔質反応多孔質
を選択する方法については、アール　イー　エフセン（
Ｒ，ｆ！、ＡＸＥＮ）等によりヨーロ、ツバ特許出願公
開第１３４．２３６号（ファーマシア）に詳細に記載さ
れている。

試薬を固定した状態で分析反応を行うための多孔質支持
体の理想的なものは、反応部位によって占められる総空
間が、通常の分析セルの空間にほぼ等しいか又はそれを
大きく超えないように、比較的小さな体積において十分
な試薬を固定するに十分な表面積を有するものである。

更に、結合した試薬と分析物との反応速度が、溶解した
分析物がマトリックスの孔内に拡散する速度とは少なく
とも実質的に無関係であるような多孔質構造が理想的で
ある。

免疫学的検定法等の不均質微量分析法では、分析物と特
異的試薬との間の接触を良好に行うことに加えて、複合
体又は結合している分析物を溶液中に遊離している分析
物から完全に分離する必要がある。このようなアッセイ
が不正確となる主原因は、分離がよくないことにあるの
は周知の通りである。従って、理想的には、支持体は、
分離が非常に簡便且つ良好になされなければならない。

ミクロ多孔質マトリックスを用いる定量アッセイでは、
はとんどの場合、反復洗浄工程を設けて遊離成分をマト
リックス内に結合した成分から分離する必要がある。あ
る程度までは、多孔質マトリックスにおける孔のサイズ
が小さいほど（従って、反応物間の接触が良好であるほ
ど）、反応後液相を完全に分離するのが困難になるであ
ろう。

このように、多孔質マトリックスにより、使用者にとっ
て実用的に分離が簡便になる態様が提供されることにな
るが、一方では、分析物とその相手の試薬とを完全に接
触させたり、結合成分と遊離成分とを完全に分離するの
が困難になる。

従来技術の方法では、−衣液体（通常は分析物を含有す
る試料又は試料の希釈液）を、ピペット又は他の手段で
乾燥マトリックスに添加する。この液体は、マトリック
スの孔における毛管力によりマトリックスに吸引されそ
こに保持される。分析物の測定を行うには、孔の活性表
面全体を液体で湿潤させるとともに、マトリックス内に
空気が閉じ込められないことが重要である。通常、液体
が確実に完全に充填されるように、湿潤剤を液体に添加
するか又はマトリックス内に存在させる。

第一反応が完了した後、液体をマトリックスから除去す
る。この液体は、圧搾して液体を放出させたり（マトリ
ックスが圧縮可能な場合）、吸引したり（例えば、真空
下で）、又はマトリックスの毛管保持能を超える毛管力
の多孔質パッド又はスポンジと接触させることにより除
去することができる。しかしながら、これらの技法は、
実際には、定量的な面及び操作上の面でのいくつかの理
由から十分なものではない。理由の一つとして、多孔質
マトリックスから液体を完全に搾り出せるのはまれであ
り、又、吸引装置で吸引すると好ましくない気泡がマト
リックスの孔に入り、それを取り出すのが困難であると
ともに死体積に液体が閉じ込められ易いことが挙げられ
る。時間を節約したり一次液体を完全に分離するために
、繰り返し洗浄したり吸引したりすることがある。この
ような洗浄及び吸引工程では、余分の操作や比較的多量
の液体を添加したり処分したりする必要がある。

更に、もし第一反応自体が測定可能なシグナルを発生し
ない場合には、一種又は多数の液体を次々と添加して反
応を完結させ必要なシグナルを発生させることになる。

従って、分析物の定量ができる測定可能なシグナルを発
生させるために添加する最終試薬をマトリックスに残存
させて、色を観察したり又は反射率により吸光度を測定
したりすることがある。上記したように、これらの測定
は両方とも、それ自体誤差を生じ易いか又はマトリック
スが光シグナルを分散したり若しくは吸収したりして誤
差を生じる。着色した最終生成物を、例えば、溶液とし
て取り出し、それを従来の分光光度計で測定すれば、定
量の精度が向上するであろう。

定量を正確に行うには、ある種の液体を再現性があり且
つ定量的な方法で添加（少なくとも試料と基質の添加）
必要がある。従って、多孔質マトリックス中の液相を定
量的に添加し再現性よく除去することが、正確で再現性
のある結果を得るのに必要である。洗浄により液体を効
果的に除去することができるが、この際大容量の液体を
用いると取扱いの簡便性が改善されなくなる０分析反応
を、小容量づつ液体を逐次多孔質マトリックスに添加し
て行うと、完全に分離したり汚染を防止したりするのが
特に困難となる。

従来の発色反応を利用した実質的に「乾燥」シ。

た化学系（コダックの試薬フィルム系等）がより高濃度
の分析物用として商業化に成功しているが、同様な系を
免疫学的検定等の微量定量分析に利用するのははるかに
難しいことが判明した。乾燥化学系では、湿潤性分配層
を試薬含有層に近接させて用いることにより多孔質層を
湿潤される。試料を正確な容積で添加すると、液体が多
層系に浸透して最終的に発色生成物を生成し、それを反
射率で測定する。この種の従来の発色反応には、分離工
程を設けたりあるいは液状試薬を逐次添加する必要がな
いので、免疫学的検定法におけるよりも液体置換の問題
は少ない。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の方法により、分析反応を行うための反応部位と
して多孔質マトリックスを使用した場合に付随する上記
した欠点を解消する方法が提供される。

節単に説明すると、反応速度が一次反応的又は擬−次反
応的である反応、即ち、反応相手が反応で消費されない
か（例えば、酵素のような触媒）又はその濃度が他の反
応相手の濃度よりも十分大きくて、シグナルが測定され
る時間にわたるその濃度変化が無視できるような一種の
反応を想定する。この変化しない（又は擬似不変の）反
応相手を多孔質マトリックスに固定し、他方の反応相手
を液体に溶解後所所の流速（この流速はこの種の分析全
てに関して同一に保たなければならない）でこのマトリ
ックスを通過させる０両方の相対瞬時濃度により決定さ
れるある速度で反応が生じるので、シグナルの程度（多
孔体から出てくる液体の性質の変化として測定される）
は流速に反比例する。

従って１．、、（Ａ）測定されるべき種が多孔体に固定
された不変反応相手（又はその直接の前駆体）である場
合には、他の反応相手の既知の濃度の溶液又は分散液を
所定の流速で多孔体を通過させることにより試験を行う
、この際、反応の間に、シグナルが発生（例えば、出て
くる溶液が発色する）し、これは、多孔体の出口で、例
えば、使用済溶液を適当なプローブ手段を通して排液す
ることにより測定できる。流速が小さいほど、反応が完
結する（即ち、他方の相手が全て反応で消費される）流
速の下方レベルまでは、観測される色が濃くなる。従っ
て、この下方レベルより小さい流速での操作は本発明の
範囲外であり、要するに、上記下方流速と完全な不動の
間の流速では応答が同じであり、この場合、流速はもは
や有効なパラメータではないので、別の基準（例えば、
後述するクロツク因子）を考えない限りは、非常に低い
流速は避けなければならない。

（Ｂ）測定される種が溶液又は分散液の形態である場合
には、第２の反応相手（理論量より大過剰）を多孔体に
固定し、そこに溶液を通過させる。

上記Ａで説明したのと同様の現象、即ち、応答が試料中
の種の濃度と正の関係があり、流速とは逆の関係にある
。全ての試験において同一の流速において、検量標準溶
液と比較して定量を行う。

〔具体的な説明） 変法（Ａ）としては、サンドインチ型免疫学的検定法が
挙げられる。例えば、抗原等の分析物を、前もって多孔
質マトリクスに結合させた第一抗体により該多孔質マト
リックスに固定する。その後、マーカ、例えば、酵素で
標識した、抗原と定量的に結合する第二抗体を添加する
。過剰の標識抗体を洗い流した後（必要に応じて流出部
分も測定することができる）、既知濃度の酵素基質を制
御された流速で酵素標識を有する多孔体を通過させるこ
とにより、固定化酵素の量に比例した応答が得られる。

この応答（例えば、色、蛍光、濁り、屈折率の変化、誘
電率の変化、導電率の変化又は他の性質）は、出てくる
液体を適当な検出基を通過させることにより測定される
。全ての試験を同一流速で行う場合、この応答は流速及
びマーカ活性のみにより決まり、酵素基質の容積には無
関係である。

試料中の抗原Ａｇを測定する必要がある競合免疫学的検
定法に用いる他の実施態様では、既知量の標識Ａｇ０を
試料に添加後、前もって多孔質担体に結合させた抗体（
Ａｂ）により、該混合物を該多孔質担体に固定する。実
際に固定される八ｇ０の量は、明らかにＡｇの存在量に
逆比例する。その後、固定されたＡｇ“を上記で説明し
たのと同様の技法、例えば、酵素基質溶液を制御された
流速で担体を通過させ、同量の八ｇ′″の存在下で行っ
たＡｇ標準から得られたデータと比較することにより定
量する。

逆に、この試験は試薬が過剰のアッセイにも適用される
。この場合、既知の過剰量の標識＾ｂ８を試料と反応さ
せ、抗原を固定した担体にこの混合物を通過させる。こ
の時、複合体を形成していないＡｂ”が担体に付着し、
その後、上記のようにしで定量する。

又、核酸配列も本発明により測定できる。この場合、意
図する配列に対し２て相補的な配列を多孔質多孔質に結
合させた後、そこに試料を通すことにより、意図する配
列をハイブリダイゼーションにより結合させる。その後
、上記した手法を用いて、シグナル発生標識を担持した
核酸プローブで二本鎖を同定する。これはサンドイッチ
アッセイに相当する核酸プローブ試験である。又、核酸
プローブ試験は、競合及び過剰試支アッセイと同様のも
のを用いて行うこともできる。

変法（Ｂ）としては、例えば、過剰の酵素基質を多孔質
担体に付着させ、そこに被測定酵素溶液を通過させるこ
とが挙げられる。酵素とその基質との反応生成物（発色
生成物）を、制御した流速条件下で多孔質担体から排出
しそして上記したようにして測定する。明らかに、酵素
基質の量は試験中実質的に一定のままであるので、同一
流速で行われる一連の実験における応答は、実質的に試
料中の酵素濃度によって決まり、試料容積とは無関係で
ある。

多孔質マトリックス内に反応相手を固定するのは、表面
吸着又はシラン若しくは有機チタンカプラーのようなカ
プラー等の化学手段による結合をはじめとする公知の手
段により行うことができる。

又、固定は、エム　フィオア（ＭＪｉｏｒｅ）等、シラ
ン　ケム（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）　、３４．１７２６
〜１７３２　（１９８８）に開示されているようなガラ
ス繊維上に補足した微粒子を用いても行うことができる
。

本発明を実施する際、試験中の流速は一定でも変更して
もよ（、流速の制御は能動的でも受動的でもよい。能動
的に流速を制御するには、当該技術分野において公知の
通常の手段、即ち、制御ポンプ又は吸引手段により行う
ことができる。

流速が変化し且つ受動的な流速制御が行われる試験は、
液体が重力により多孔質マトリックスを通って流れる場
合、即ち、液体が自重で流れる場合に行われる。この場
合は、実施が非常に筒車であり、且つ流速が液体カラム
の高さにより変化するけれども使用する液体の容積には
無関係である点で特に興味深いものである。より具体的
には、この場合、多孔体（フィルター、パッド、繊維層
、多孔膜又は不活性多孔材料のいずれかの層）を、上方
流路又は容器の底に配置し、液体（既知の一定試薬濃度
を有する）をそこに注ぐ。この液体は自重により多孔質
材料を通って流れ、もしこの材料が液体により適切に湿
潤されれば、最後の部分が毛管力により孔に保持され、
その後半部分が液体の表面張力により多孔体の下に位置
する隔室（例えば、排水流路）を満たす。この際、多孔
体の下に位置する排水路の直径は下から空気が入らない
ように十分小さくなければならないのは言うまでもない
。この方法において、出てくる液体中のシグナルの測定
は、液体の流れが停止したとき、例えば、多孔質パッド
の下から所定の一定距離の箇所で行うことができるので
、上流路に添加した液体の容積に無関係でも、非常に正
確な測定再現性が得られる。従って、正確なピペッティ
ングは不要である。この場合、流れが停止するｍにシグ
ナルが発生し、流れが停止した後にシグナルの測定だけ
を行う。このことについて、以下詳細に説明する。

本発明を実施するための装置を、以下添付図面を参照し
ながら説明する。

第１図は本発明の方法を行うための装置の概略縦断面図
である。第１ａ図はこの装置の上方容器部分であり、第
１ｂ図に図示した下方部分の開口部にぴったりと嵌め込
まれる（水密シール）。

第２図は、第１図の線■−Ｈについての断面図である。

第３図は、光源と光検出器の概略を示す第１図の線■−
■についての断面図である。

第４図は、装置の一部分の拡大概略縦断面図である。

第１図に概略示した装置は、プラスチック（ルーサイト
、ＰＭＭ＾、ｐｖｃ等）製で直径低減部分２を有する（
例えば、円筒状）上方容器１を含む。この部分２は、プ
ラスチック製であり自由に取り外しのできる下部分４の
ウェル３（第１ｂ図参照）に嵌め込まれる。ウェル３の
底は排出管５に通じており、この排出管の中空内部ダク
ト６は、光源７からの光線と半径方向で交差する（第３
図参照）。

管５と交差後、光線は光検出器８によってピックアップ
される。

孔９ａを有する多孔体９をウェル３の底ＩＯに配置する
。この底１０には、管５の中央ダクト６に通じている（
小さな）溝１１が付いている。

第一抗体を多孔質マトリックスに固定し、酵素で標識し
た第二抗体を添加して分析物を含有するサンドインチを
完成させる典型的なサンドイッチ免疫学的検定法を取り
上げて、上記した装置の操作を説明する。即ち、本発明
の装置は以下のようにして操作する。

まず、孔に試薬を固定するのに適した多孔質材料（即ち
、プラスチック、ガラス、多孔質シリカ、フオーム等）
で作製することのできる多孔膜体９上に、検出すべき分
析物に特異的な試薬を固定する。その後、多孔体９をウ
ェル３の底１０に配置し、上容器１の大きさの減少して
いる部分２をウェル３に嵌め込む。

定量すべき分析物（この場合には抗原）を含有する試料
を容器１に加えると、試料はそこから多孔体９に入６、
抗原とマトリックスの孔に固定した特異的抗体との間に
反応が生じる。マトリックスの孔容積を超える容積の液
体が管５の内部の下側に集まる。この液体は、出口流路
の容積並びに多孔体９の気孔率、液体の特性（粘度、表
面張力〕及び液汁の静水圧によって決まる流速に応じて
ゆっくりと出口流路を満たす。これに関連して、試験の
この段階では、シグナルは何も発生しないので、抗原溶
液がマトリックスと交差する速度はまだ分析の面では重
要でない。しかしながら、この速度は、確実に定量的に
固定するように十分遅くなければならない。従って、こ
こでは、ミクロ多孔マトリックスはアフィニティーカラ
ムのように作用し、マトリックスを通過する液体は個々
の孔の下部分に到達するまでの時間に十分反応する。

全ての液体が多孔体９に入ると、即ち、カプラーの上レ
ベルが多孔体の孔の上レベルに到達すると、下方の流れ
が停止する。これは、孔を液体で満たしておこうとする
傾向がある孔９ａにおける毛管保持力に対して、いくら
か下向きに移動する作用が働くからである。こ°のこと
は、マトリックスが湿潤性であり、液体とマトリックス
との間の接触角により、液体が更に下向きに移動するの
を妨げる上向きの毛管力が生じることによるものである
。

同時に、排出ダクト６の液体底端にメニスカス１２が形
成される。流路径が５〜６ａａであると、このメニスカ
スが、管が自然と空になったり、気泡が下から管並びに
多孔体９とウェル３の底１０との間の空間に入るのを防
止する。これに関して、上記多孔体の下のボイドスペー
ス、即ち溝１１は、この空間に最初にトラップされた空
気の全てが確実に液流と同伴するような形状とする。好
ましくは湿潤性表面を有する（流路寸法が小さい場合に
は非湿潤性表面でもよいが）集合流路では、液体を下方
に引き寄せる働きをするメニスカスが形成される。ダク
ト径が約５〜６ｍｍ未満では、管内に気泡が生成しよう
とするのを防止する。液体が出口管の末端に到達すると
、メニスカスが逆になり、液体が更に下方に移動するの
を防止する。この状態では、メニ反カスは出口管に対し
て凸状であるので、湿潤性吸収パッドを当てることによ
り接触及び破壊するのが比較的容易である。

排出流路とこのような吸収パッドとを接触させる際には
注意しなければならない点がいくつかある。即ち、パッ
ドが流路の壁に接触したままであると液体がパッドに移
動することができるので、最後には流路が空になる。こ
れは、吸収パッドを排出流路の底から一定の小距離（例
えば、０．１〜５閤）離して配置することにより避ける
ことができる。

出口流路に非湿潤性表面を使用する場合、吸収パッドが
流路を空にする可能性は少なくなる。この場合、液流が
マトリックスの下に最初から存在する空気と置換できる
ように、出口流路の寸法は、より小さい「毛管」寸法で
なければならない。従って、流路の断面寸法及びこの流
路の内部壁の材料の性質は、メニスカスの形成上並びに
気泡が液体中に入ったり浮力により上昇したりするのを
防止する上で重要である。通常、ＰｖＣ、ポリスチレン
、ＰＭＭＡ等の押出しプラスチック又はガラスで作製す
るときには、直径が約５〜６Ｍを超えない円筒状の集合
ダクト（又は実質的に等しい容量の他の幾何学形態）が
適当である。しかしながら、この管は、非常に小さな反
応容器、例えば、３胴幅のキュベツト及びより小さな容
積の物を使用する実施態様に適するはるかに小さな断面
サイズ（例えば、１００〜５００瀾）の毛細管でもよい
。

その後、分析物に対する酵素標識された第二抗体を含有
する第二液体を容３１に添加する。

マトリックスの表面での毛管保持力が無くなり、新たな
部分が多孔体に浸透し、そこから排出管に入ることによ
り、オリフィスを通って排出管から放出される最初の部
分を置換する。この技法では、液体の一部分ともう一つ
の部分との置換を、定量を行うための望ましい条件の一
つである界面での液体の混合が最小の状態で行うことが
できる。

新たな液体を添加することにより生じる下向きの静水圧
力及びマトリックス表面での毛管力の解除が、排、小管
の出口でのメニスカスの抵抗をを克服するに十−分でな
い場合には（例えば、管が毛管サイズであるときこのよ
うなことが起きる）、排水流路の出口でのメニスカスを
崩壊し且つ過剰の液体を吸収する吸収パッド又はスポン
ジを上記出口に当てて接触させることによりこの抵抗を
克服することができる。

又、ミクロ多孔体は、下部の液体が容器１に続いて添加
される液体と混合するのを効果的に防止する。出口流路
の内部寸法が小さい場合も、逐次添加される液体での置
換を界面での混合が最小の状態で行うことができる。

一種以上の洗浄液をこの段階で添加して、未反応第二抗
体を確実に分離するようにしてもよい。

最後に、第二抗体の酵素に対するシグナル発生基質を含
有する液体を添加する。この基質が、マトリックスに既
に結合した抗原との反応により固定した酵素を通過する
と、発色生成物に転化し、下の出口流路に入って光学測
定がなされる。この液体がマトリックスを通過する速度
は、とりわけ、上方容器及び下方流路の形状や壁の湿潤
性だけでなく液体の物性や多孔体の気孔率によっても異
なる。必要に応じて、制御可能な手段、例えば、バルブ
手段を本装置に使用して、流路における流れを制御する
ことができる。従来技術では、この基質溶液は、通常、
再現性のある結果を得るために既知の容量で使用する必
要がある。一方、ここで説明する方法では、マトリック
スを通過した液柱の決まった部分を測定するので、例え
ば、流れが停止したとき、マトリックスから下の一定の
距離の所で測定することにより、添加される基質の容積
が変化しても得られる測定値にはほとんど影響しない。

各液体の移動は、装置の大きさ及び多孔質マトリックス
の性質等に応じて、数秒から約２〜３分継続してもよい
。

液体中の反応生成物は、光源７からの光線を管５の中央
６を横断して通過させた後出力信号を検出器８で集める
ことにより検出及び測定されるような性質を有している
。検出器８（光電管又は光を電気信号１に転換できる他
の器械）からの信号を、通常の手段（増幅器、ディスク
リミネータ、コンパレータ、デイスプレィ、レコーダ等
）により処理して測定に必要なデータを得る。

従って、多孔質材料本体の排出部に接続した流路中の液
体に適用される監視又は測定工程は、光学手段により行
われ、この場合流路の形状が重要である。例えば、この
流路には、それに向けられる入射光線が液体と相互に作
用して、その結果、所望の測定の尺度となる応答シグナ
ルを発生することができる部分を備えていてもよい。入
射光線と液体との間の光学的相互作用には、光吸収、散
乱又は蛍光の放出がある。このようなことから、流路は
、透明材料、例えば、光線と液体との相互作用を容易す
る形状の押出し成形プラスチックで作製することができ
る。例えば、流路にレンズ状部分を設け、入力光線を液
体に集中させ且つ出てくる光線を適当な光検出器に集め
るようにすることができる。又、流路を透過導波管とし
て作用するような形状とし、光が多重内部全反射により
移動することにより、光の消えてい＜　（ｅｖａｎｅｓ
ｃｅｎｔ）波成分と流路内の液体との相互作用を生じさ
せることができる。これらの実施態様を示す装置を以下
詳細に説明する。

代替又は追加手段として、光学的なものとは異なる手段
、即ち、流速測定手段、導電率、ＥＭＦ若しくは誘電率
測定手段又は他の特徴を測定する手段も本方法において
用いることができる。

上記した装置について多くの変法が可能である。

例えば、多孔体９を、２１’！！以上で構成し、各層で
異なる反応を生じさせるようにすることができる。

例えば、分析物試料は、各分析動程が上記層の一つにお
いて反応する異なる被分析動程を含有していてもよい。

この場合、出て来る液体は逐次的画分を包含し、画留分
は上記分析動程のうちの一つに関連した性質を有してい
る。上記したように、所定濃度の第二反応相手を含有す
る液体を、定量すべき第一反応相手を固定した多孔体に
通ずと、これらの２つの相手が反応して上記多孔体の出
口で測定されるシグナルを生じる。この際、このシグナ
ルの大きさは、上記液体の流速に反比例する。

この流速を漸次減少させると、最後にはシグナルがプラ
トーとなり、その流速から流れの完全な停止までの間シ
グナルの変化は期待できない。実際には、試験における
ある参照時間に対するこのプラトーの位置（時間という
意味で）（例えば、上方容器における液体のレベルを確
認することにより容易に測定できるクロック・マーク又
は液流停止）を、このプラトーの実際の高さとは無関係
に所望の定量に使用することができる。

〔実施例〕

以下、具体例を挙げて本発明を説明する。

−ａ的に、多孔質マトリックス又は多孔体は市販のもの
を使用した。例えば、ポール・バイオジン（Ｐａｉｌ−
Ｂｉｏｄｙｎｅ）　（商標）イムノアフィニティー膜ヲ
、ニューヨーク州１１５４２のボール　ウルトラファイ
ン　フィルトレージョン　コーポレーションから入手し
た。これらのＢＪは、高分子、微孔質であり且つ予め化
学的に活性化して、膜に高タンパク質吸収量を有する迅
速永久共有結合が付与されている。濾紙としては、〜般
的に、ホワットマン　リミテッド（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｌ
ｉｍ１ｔｅｄ）　（英国メートストーン）から入手した
孔のサイズが０．４５ｍのニトロセルロース型のものを
用いた。フィルターに関して、タンパク質を緊密且つ非
共有結合的にフィルターに結合できることは当該技術分
野においてよ（知られている。試薬のうち、精製抗原で
ある低密度リポタンパク（ＬＤＬ）は、出発物質として
新鮮なヒト血漿を用いて、標準法に従ってＣｓＣ１密度
勾配超遠心分離により得た。マウス抗−ヒドアボタンバ
クＢ１００モノクローナル抗体は、英国のボーンマスに
あるケンブリッジ　メディカル　ダイアグノスティクス
（ニー　ケー）リミテッドから入手し、ポリクロナール
ウサギ抗−βリポタンパク、精製ＩｇＧ　、はデンマー
クのコペンハーゲンにあるダコバッツ（ｔｌａｋｏｐａ
　ｔ　ｔｓ）から入手した。酵素標識ウサギ抗−マウス
試薬は、特に、低い非特異結合性であ、り且つ高い特異
結合性であるものを選択した。ホースラデイツシュペル
オキシダーゼ（ＩＩＲＰ）標識ウサギ抗−マウスＩｇｇ
は米国＾にのロジャーズにあるベル・フリーツ（Ｐｅｌ
−Ｆｒｅｅｚ）から入手し、アルカリ性ホスファターゼ
ウサギ抗−ウマＩｇＧは米国カルフォルニア州のリッチ
モンドにあるバイオラド　ラボラトリーズ（Ｂｉｏｒａ
ｄ、Ｌａｂｓ、）から入手した。緩衝液に使用した他の
全ての薬品は、フル力　ニー　ゲー（Ｆｌｕｋａ　ＡＧ
）又はシグマケミカル　コーポレーション（Ｓｉｇｎ＋
ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手した試薬又は
アナラー（Ａｎａｌａｒ）グレードのものであった。ウ
シ血清アルブミンは、シグマ社から入手し、低脂肪ミル
ク〔サルイト（Ｓｎｏ−１ａｉｔ））はスイス　コーオ
ペレイテイブ　コーポレーション（Ｓｗｉｓｓ　Ｃｏｏ
ｐｅｒａｔｔｖｅ　Ｃｏ、）から入手した。

２、　坑源じじ月友牛久Ｘピ野閃１定 −ａ的に、ニトロセルロースフィルターと膜の両方に関
しては、固定される薬剤をリン酸緩衝液、０、１ｍｏｌ
　／　ｌ　、　ｐＨ７，５に希釈してタンパク濃度を１
００ｘ／ｍｌ〜２　ｍｇ／　ｒｒｒｌとした。この溶液
５〜５０ｐ！を膜に通すか、膜全体を抗体若しくは抗原
溶液に浸漬するか、又は抗体若しくは抗原溶液をウェル
３の底に予め配置した適当な大きさに切断されている一
片の膜に塗布した。この溶液を固相と共に周囲温度で５
〜３０分間イ分間インキトベート相を繰り返しく試薬量
の少なくとも５倍）洗浄後、同様の緩衝液を用いて０．
５％（乾燥Ｗ／Ｖ）低脂肪ミルクとともに１０〜６０分
間インキヱベートすることにより残存結合部位をブロッ
クした。この際、固定される試薬の露出表面積は試料と
同じであったが、変法として、例えば、試薬が膜に固定
される部分を限定するマスクを用いながら試薬を膜に添
加することにより、試料に対する試薬の表面積の割合を
１未満又は１を超える値に変更することが可能である。

この場合のマスクは、適当な表面積の適当なパターン（
例えば、円、正方形、長方形、ダイヤモンド、文字、図
形等）を有するものである。この変法においては、少量
のシグナルが常に膜に残存するので、出口流路での透過
型光度測定の正確性及び精密性を維持したまま、視覚的
に、例えば、試薬が正しく添加されたかどうかを確認で
きる。２つ以上の管を用いて並列に操作する実施態様、
即ち、二重システムでは、一つの試験は試料について行
い、二番目を試薬が正しく添加されたかどうかを確認す
るための対照についての試験とすることができる。この
態様は、３つ以上の試験及び２つ以上の分析物に拡大す
ることができる。

固定すべき試薬を付着する方法として、自動ピペッティ
ング法、スクリーン印刷法、並びにインクジェット印刷
及び静電付着（例えば、ゼロックス法）等印刷業界で通
常用いられている他の印刷法が挙げられる。これらの技
法によれば、低コストで品質のよい製品を得るのに必要
な、信頼性のある精密性及び正確性を兼ね備えた迅速で
大規模な生産が可能となる。

特異的試薬の添加に続いて、試薬及び試料の添加シーフ
ェンスに関与する膜の全表面を処理して、非特異的結合
の発生をできるだけ少なくするとともにバックグラウン
ドシグナルをできるだけ小さく保つようにする。これを
行うには多くの技法が利用できるが、本実施例で使用し
た最も筒車な方法は、適当な濃度のブロック材を用いて
、全ての残存結合部位を予めブロックすることである。

高分子量ブロック剤としてはタンパク質が挙げられ、低
分子量ブロック剤としてはポリアミン及びアミノ酸（例
えば、グリシン）が挙げられる。本実施例では、濃度Ｏ
３１〜５．０％（ｗ／ν）のウシ血清アルブミン及び濃
度０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の好ましくは粉末状の低脂
肪ミルクの両方を使用した。この低脂肪ミルクには、特
に、膜又はフィルターにおける非特異的結合を最小にす
る試薬として知られているカゼインが含有されている。

例えば、トリス／１１ｃＩ緩衝液にミルク粉末を０．５
％（ｈ／ｖ）溶解したものに、多孔相を１５〜６０分間
攪拌しながら浸漬した。膜の場合は、この溶液を０．２
２Ｊｌｌフイルター（アミコン）により予備濾過した。

必要に応じて、上記したように、試薬パッドを非イオン
性中性洗剤又はシラン化材を用いて処理することもでき
る。

目的に応じて、前者〔例えば、トウイーン（Ｔｗｅｅｎ
）２０又はブリシュ（Ｂｒｉｊ）３６）は固相の親水性
を増加するのに用いられ、後者は固相の湿潤性を改良す
るのに用いられる。

３、ｎに　い°　る　　の 上方容器Ａ（第１ａ図参照）及び下方排出管Ｂ（第１ｂ
図参照）を包含する第１図に示したような装置を用いて
、以下に概略説明した実験を行った。標準的な射出成形
装置及び黄銅製の金型を用いて、ＰＭＭＡ　（英国ＩＣ
Ｉのポリマー事業部から入手したシアコン（ＤＩ八へＯ
Ｎ）　）から２つの管（Ａ及びＢ）を射出成形した。実
験中に、２つの管についての設計パラメータを調査し、
管Ａには次に示す値が好ましいことが判明した：内径２
〜１０ｍ５の範囲、長さ５〜３０Ｍの範囲、出口での接
触角１５〜３５°、接触／試料適用出口０．５〜４ｍ＋
ｍ、以下の実験には、次の仕様の装置を実際に使用した
。管Ａ：内径３．７５胴、外径６．ＯＯｗ＋、自長８．
００ｍ＋ｓ、外長９．４０鴫、出口での接触角２０°、
試料／接触出口径１．２０ｍ。

管Ｂ：内径１．００閣、外径３．３０ｍｍｍ、自長１０
．１５ｍｍ、外長１１．５０ｍ＋ａ、この設計の場合、
直径３．ＯＯｍ＋ａの試料パッドディスクが使用できる
とともに、２つの管をスナップ嵌め合いで接合すると続
いて行う実験全てについて使用するに十分な水密構造と
なることが判明した。

装置を組み立てるために、層状パッドを切断又は打ち抜
きにより所望の寸法のパッドとした。場合によっては、
試薬で層状パッドを予備処理しておいてもよい。このパ
ッドを上管Ｂの適切な部分にそのまま置き、上管Ａの適
切な端を、２つの管がしっかりと合わさるまで押し下げ
た。この種の設計の別の利点として、試薬パッドをいっ
たん装置に挿入すれば、試薬パッドを汚染したり損傷す
たりするのは実質的に不可能であることが挙げられる。

これらの実験には、毎回２０〜１００の単品の列を組み
立てた。しかしながら、現場での使用の場合には、これ
よりもはるかに大きな列、即ち、１０００以上を最小時
間で組み立てることができる。

これらの実験の目的に応じて、必要の場合、管Ｂの下端
と吸収材料を均質に接触させることのできる専用支持体
に装置を保持した。吸収材を変更することにより管Ｂ内
の流速を変化させることができ、吸収材を選択してシス
テムの流速及び感度を所望のものになるようにした。

４、アッセイの・　８ 下記に開示する実験において、低密度リポタンパク質の
免疫学的検定法をモデル系として使用した。しかしなが
ら、本装置は、多くの免疫学的検定法の態様で、多様な
抗原並びに、例えば、固定酵素、酵素基質、−本鎖、デ
ュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）又は多重鎖のポリ核酸の
生物的粒子若しくは種を包含する非免疫学的検定分析物
に有効であると考えられ、このモデル系は一つの可能な
実施態様を示しているにすぎない。免疫学的検定法の化
学作用については、生体試料に含有される分析物の定性
的及び定量的測定の観点から種々の論文に発表されてい
る。従って、基本的技法はここでは詳細には説明しない
が、免疫学的検定法の原理について記載されている適当
なものとして、アール　ビー　エキンス（Ｒ，Ｐ、Ｅｋ
ｉｎｓ）、「ラジオイムノアッセイ　アンド　リレイテ
ッド　ブロセジュアーズイン　メデイスン（Ｒａｄｉｏ
ｉｍａ＋ｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄＰ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｔｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）　Ｊ　
、ブロク　シムプベルリン（Ｐｒｏｃ、Ｓｙ＋ｍｐ、Ｂ
ｅｒｌｉｎ）　（***）　１９７７年及び１、Ａ、Ｅ、
Ａ、、ウィーン、１９７８年が挙げられ、酵素標識免疫
学的検定法については、特に、イー　エングバル（Ｅ、
Ｅｎｇｖａｌｌ）、メソッズ　イン　エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ３＋＋＋ｏｌｏｇｙ）
、第７０巻、４１９〜４３９（１９８０）が挙げられる
。

最初の一般的実施例では、抗原（精製ＬＤＬ）を試薬パ
ッドに固定した。次に、この固相抗原を、特異的抗ヒト
アポタンパク１Ｂ１００マウスモノクローナル抗体と予
備混合した試料溶液と反応させた。

即ち、この予備混合試料と抗体とを、試薬パッドに添加
する前に所定時間インキュベートするか又は試薬パッド
に同時に添加した。又、別の方法では、抗体と試料溶液
を、これらの添加の間に予め定めたインキュベーション
時間を設けて試薬パッドに順番に添加した。モノクロー
ナル抗体を使用したが、ポリクローナル抗血清も試験要
件及び試薬の入手容易性によっては適当な場合がある。

同様に、モノクローナル抗体はマウス由来のものであっ
たが、マウス／ラット融合相手又は同様にマウス／ウシ
融合相手等の他のモノクローナル抗体源もこの系で使用
できる。抗体又は部分的に精製した抗血清の断片を使用
することもできた。どんな試薬源及び反応シーケンスを
使用するかの決定は、必要とされるアッセイ感度及びタ
イミングとの相関的要素である。

第一のアッセイ形態は、特異的抗体が、試薬パッドに予
め固定された抗原に結合するという原理に基づくもので
ある。溶液中で特異的抗体と抗原含有試料を先に混合す
ることにより、抗体が試料中の抗原に結合するので固定
抗原へは結合せず、反応に続いて試薬パッドを介して溶
離又は洗浄することができる。従って、抗原濃度が低い
試料では、パッドに結合した抗体が比較的多量に残り、
一方、抗原濃度が高い試料では、試薬パッドに結合した
特異的抗体が残る量は比較的少量である。

この種のアッセイは、両方の抗原濃度よりも低い濃度で
ある抗体が、結合において固定抗原及び溶液抗原と効果
的に競合するので「競合」免疫学的検定法と呼ばれてき
た。固定された抗体の検出は、酵素又は蛍光標識等のシ
グナル発生剤を利用して抗体を先に標識する種々の方法
により行うことができる。しかしながら、これらの例の
場合には、結合した抗体は、モノクローナル抗体−アポ
Ｂ１００と固定ＬＤＣ及び溶液相ＬＤＣとの間の特異的
結合反応を行った後、試薬パッドを、酵素に結合した抗
−マウスＩｇＧと共にインキュベートすることにより検
出される。この抗−マウスｔｇｃは固定マウスＩｇＧに
結合する。未結合物質を除去するための洗浄工程に続い
て、固定された特異的マウスモノクローナル抗体の濃度
に比例して検出可能シグナルを発生する酵素基質を添加
する。

この第一のアッセイシステムは抗原を試薬パッドに固定
した状態で操作するが、このシステムは抗体を試薬パッ
ドに固定した状態でも同様に掻作でき、この際、抗原は
標識結合相手である。これは抗原が小さい場合に特に有
効である。

使用された第ニジステムでは、第一抗体を予め試薬パッ
ドに一定し、固定化抗体よって次に結合される抗原を含
有する試料溶液を添加する。次に、第二抗体を試薬パッ
ドに添加する。この第二抗体は、抗原上の別部位（エピ
トープ）に結合し、その結果、抗体、抗原、抗体のｒサ
ンドイッチ」を形成する。未結合物質を除去するための
洗浄工程に続いて、上記と同様の方法で第二結合抗体を
検出することができる。この場合、第一システムとは異
なり、このシグナルは抗原濃度に比例する。

この種の「サンドイッチ」アッセイは、２一部位アッセ
イ又は過剰試薬アッセイとしても知られており、従って
、特異的抗体の相対濃度は、試料中の抗原濃度よりも高
くなければならない。この第ニジステムについての例で
は試料と試薬を順番に添加するが、第二抗体を抗原とと
もに所定の時間予備インキュベートするか、又は第二抗
体と試料抗原を実質的に同時に試薬パッドに添加するこ
とも同様に考えられる。明細書において詳述している実
施例においては、第−予備固定化抗体はポリクローナル
抗血清に由来するものであり、第二抗体、即ち、もう一
方の抗体はマウスモノクローナルである。しかしながら
、このことにより本発明において使用される一方又は両
方の抗体がポリクローナル又はモノクローナル由来であ
ることに限定されるものではない。同様に、抗体は２種
以上の異なるモノクローナル又はポリクローナル由来物
質の混合物であってもよい。これらの両方の場合におけ
る試薬の選択は、所望のアッセイ性能との相関的要素で
ある。これに関して、最も性能の良いアッセイには、抗
体に緊密に結合する抗体があることは一般的によく知ら
れている。

ここにおいて一実施例として使用されるシグナル検出シ
ステムには、酵素で予め標識した抗−マウスＩｇＧ抗体
を使用した。酵素として、例えば、実質的に溶解性の発
色物質を生じる酵素（ホースラデイツシュペルオキシダ
ーゼ、ＨＲＰ）と実質的に不溶性の生成物を生じる第二
酵素（アルカリ性ホスファターゼ、ＡＰ）の２つの酵素
を選択した（又、基質溶液及びインキュベーション条件
を適当に選択した）０、これらの酵素、酵素基質反応及
び生成物の特性は境在技術的に知られており、いろいろ
な論文、例えば、メソッズ　オブ　エンザイモロジー、
第７０巻（１９８０）に報告されている。

５、　　　　・ア・・セイブロトコール全ての反応を周
囲温度で行ったが、本発明はこれに限定されるものでは
なく、このシステムは周囲温度よりも高温又は低温でも
可能である。緩衝液は全て、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
１，０，５％（ｗ／ｖ）乾燥粉末ミルク及び０．０１（
ｖ／ｖ）　）ウィーン２０を含有する０、１ｍｏｌ／１
　リン酸塩（ｐＨ７，４）であった。装置内に固定した
風乾反応パッドに、抗原（ＬＤＬ）を予め膜に固定した
状態で、濃度１　ｔａｒ　／　ｌｌ１１の特異的抗−ア
ボＢ抗体５０ｍと試料５０Ｊ１１を含有する予備混合溶
液１００Ｉを添加した。この場合における予備混合工程
は１０秒間のみ行った。この溶液をパッドと５分間反応
させた後、パッドを、アッセイ緩衝液約５００Ｊ１１に
より２回洗浄した０次に、抗−マウスＩｇＧ　（酵素標
識）を酵素緩衝液［５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣ１及び０．
０５％（−／ν）乾燥粉末ミルクを含有するトリス緩衝
液３　１００ｍに添加した。その後、試薬パッドを、ア
ッセイ緩衝液（０，５ｄ）を用いて４回洗浄することに
より未結合物質を除去後、適当な基質溶液を添加して発
色させた。

基質溶液を重力だけか又は吸収パッドを排出流路の出口
に当てて流速を増加させて多孔質試薬膜を通過させた。

しかしながら、同一列における制御及び実験は常に同一
に行い十分な再現性が得られるようにした。吸収材とし
ては、わずかに湿った綿毛又はアクリレートフオームを
用いることにより満足のいく結果が得られた。

６、　．−５　　は「サントイ・・チ　ア・・丸不この
場合、ウサギ抗−β−リポタンパクｉ　（ＤＡＫＯ）を
上記した方法で試薬パッドに予備固定後、使用前に試薬
パッドを装置内で風乾させた。試料１００μ！を試薬パ
ッドに添加し１０分間インキュベートした。その後、こ
のパッドをアッセイ緩衝液で２回（各約５００Ｉｉｌ）
洗浄した。

次に、別の抗体、モノクローナル抗−アボＢ１００をア
ッセイ緩衝液で３０００分の１に希釈したものを１００
Ｉｌｌ添加し、１０分間インキュベートした。パッドを
アラ苓イ緩衝液で３回（０，５ｄ相当）洗浄して未結合
物質の全てを除去した。その後、限定試薬アッセイと同
様に、結合抗体を検出した。

７．２１±上皇役斑 比較対照として溶解性発色生成物及び不溶性発色生成物
の両方を用いる２つの主要な検出法を使用した。溶解系
にはＨＲＰ標識抗体を使用し、基質溶液は０−フェニレ
ンジアミン／ＨｔＯｔから調製し、管Ｂ内で最終溶液の
透過測光をλ＝　４６０ｎｍで行った。比較の不溶性生
成物系には、アルカリ性ホスファターゼ標識抗体、及び
ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＢＣＩＰ＝　５−ブロモ−４−クラ
ロー３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩；Ｎ
ＢＴ＝ニトロ−ブルー−テトラゾリームクロリド）基質
溶液を使用した。

上記で概略説明したように、異なる濃度でＬＤＬを含存
する標準物質を用いてアッセイを行った。

標準は、正常ヒト血漿を採取し、密度勾配超遠心分離を
行うことにより調製した。　　ＬＤＬ分画を除去し、他
の全ての血漿成分を再集合させた。勾配を形成するため
に使用した塩を除去するために、ＬＤＬ除去血漿をｌＯ
倍容積゛の等張生理食塩水で透析後、透析物質を標準技
法を用いて最初の容積まで再濃縮した。この基剤をゼロ
ＬＤＬ標準として使用した。このアッセイに使用する一
連の標準を調製するために、超遠心分離により調製した
ＬＤＬを２〜５ｇ／ｌ（タンパク質、アポＢ１００）に
濃縮後、ｐＨ７，５に調製した０、　９％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａＣ１に溶解した５％（ｗ／ｖ）濃度として保存した。

この物質をＬＤＬ除去血漿に添加して、アポＢ１００ｆ
ｉ度が０〜１　ｍｇ　／　ｄの範囲で異なるＬＤＬの標
準溶液を得た。これらの物質を全てのアッセイにおいて
使用した。最初のアッセイシステムの操作を、上記で概
略説明したように、溶解性色原体を用いて、標準透過光
度計〔スイスのコントロン（ＫＯＮＴＲＯＭ）社製ウビ
コン（ｔｌＶ　ＩＫＯＮ）　６８０　）で行った。

Ｏ−フェニレンジアミン／Ｈ２Ｏ□溶液を自重で膜を通
し、流速の低下に伴う吸光度の増加を記録して測定を得
た。最高値を以下に示す。

ＬＤＬ標準（ｍｇ／ｄ）　　　　　０　　　　　　１．
０１　　　　　　　　０．６２３　　　　０．０２０２
　　　　　　　　０．６２０　　　　０．０１０３　　
　　　　　　０．６１８　　　　０．０３０４　　　　
　　　　０．６１９　　　　０．０２５これらのデータ
から明らかなように、本発明の説明において概説した透
過測光法が可能であり感度もよい、正常ヒト血清のＬＤ
Ｌは１　ｍｇ　／　ｍｌである。

沈澱色原体の従来技術法と本システムとの相関をとるた
めに、いくつかの対照操作を上記した方法により行った
。その結果、相関関係は得られたが、有意の結果を得る
には、インキュベーション時間をより長くし、且つ読み
取り（反射測定により得られる）には管の分解とパッド
の取り外しが必要であった。従って、本発明のシステム
の利点は明白である。

８、思」挿Ｕ【乙ヱ」／− 上記したように、過剰試薬アッセイは、先ず、ゼロ及び
１００ｎ／ｄ標準を用いて溶解性色原体により三重反復
試験で行った。この結果についても吸光度の読み取り値
の観点から以下に示す。

反復試験 １　　　　　　　　０．０６　　　　　０．６５２　　
　　　　　　０．０６　　　　　０．６４３　　　　　
　　　０．０５　　　　　０．６２Ｘ＋Ｓ、Ｄ、　　　
　０．０５７＋０．００６　０．６３７＋０．０１５こ
こでも、装置の適応性を示すために、沈澱色原体系をＯ
及び１■／ｄ　ＬＤＬ標準で使用した。次に、試薬パッ
ドを回収し、反射測定を行った。

上記した全ての例は、モデルアッセイとして、低密度リ
ポタンパク質（ＬＤＬ）のヒトアポタンパク質Ｂ（アポ
Ｂ）成分の測定を利用した免疫学的検定法である。　　
ＬＤＬは、最近冠動脈性心疾患及びアテローム硬化症と
強く且つ原因的にも関連付けられてきたので興味深い分
析物である。しかしながら、本発明の装置の分析用途が
この例に限定されるものではなく、同様に、酵素、酵素
基質、レクチン等の他のアフィニティー試薬、他の抗原
又は核酸鎖も膜に固定でき、且つ適当な場合には、反応
生成物が直接測定される。

この試験は基本的には、妊婦の尿に存在するヒト絨毛性
腺刺激ホルモン（ＨＣＧ　”）を、孔中に予め吸着させ
た（又は化学的に結合させた）第−ＨＣＧ抗体により多
孔質マトリックスに固定させた後、酵素標識第二抗体と
ともにインキエベートすることからなる。次に、酵素基
質をマトリックスに通すことにより、シグナルが発生し
、適当な顕化液（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）で検出する。

この試験を次のような工程で実際に行った。

第１図に関連して開示し且つ実施例１の第３項で詳述し
たような装置を用いた。上方流路の容量は約６０Ｊ１１
であり、下方流路の容量は約１０４であった。多孔質担
体は、厚さ１〜２ｍｍで直径約３閣のミリボア（商標）
膜（孔径：０．２〜０．５　ｕｔｓ　）であった。

膜に、ウサギ抗ヒトＨＣＢ　（デンマークのコペンハー
ゲンにあるダコバッツ（Ｄａｋｏｐａｔｓ）社製試薬Ａ
−２３１）の溶液５０Ｊ１１をゆっくり通過させて抗Ｈ
ＣＧを装填した。抗体溶液を自重により通過させるとと
もに、下方流路の出口を一時的にふさいでインキュベー
ション時間を長くした。次に、緩衝液（リン酸緩衝生理
食塩水、０．１Ｍ、　ｐＨ７，２）　５０　ｐｌを膜に
通して過剰の抗体を洗浄した。

膜の最終非特異的結合部位を、リン酸塩生理食塩水に溶
解した０、　５％（ｗ／ｖ）低脂肪ミルクでブロック（
各校に５０ｄ添加）後、膜を再び生理食塩緩衝液（２ｘ
５０ｐｆ）で洗浄した。

尿試料５０１１１（妊娠していると思われる患者より採
取したもの）を重力で膜を通過させ、上記と同様の方法
で洗浄を行った。

リン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７，２）中でウレアーゼ
と結合させた第二ＩＩｃＧ抗体〔カナダのトロントにあ
るアレリ（＾ｌ１ｅｌｉ）社から入手した３５０ｄを、
上記、した方法で膜を通過させ、残留したものを緩衝液
で椀い流した。

最後に、尿素１■／ｄ及びブロモクレゾールパープル８
０ｘ／ｄを含有する溶液を上流路に添加し、重力で膜を
通過させた。尿素濃度が比較的高いので、固定化酵素と
の接触で分解する量は、流速だけで決まる（濃度は一定
に保つ）、従って、上流路に添加する尿素溶液の実容積
は重要ではない。

下流路で発色した紫色を、５８８ｎｍでの吸収により分
光光度測定した。得られた結果を、ＩＩＣＧの校正溶液
を用いて同一の条件下で調製した一組の溶液と比較し、
分析試料中のＨＣＧｆｉ度を推定した。

現場での使用に際しては、上記した操作全てを分析ごと
に繰り返す必要はない。例えば、第一抗体で予備処理し
たミリボアディスクを使用して、被試験尿中のＨＣＧを
直接そこに固定してもよい。

この試験は、基本的には尿中のヒト絨毛性腺刺激ホルモ
ン（ＨＣＧ）を検出することからなる。これらの実験に
は、ヒブリテク　インク（ｌｌｙｂｒｉｔｅｃｈＩｎｃ
、）社のアイコン（Ｉｃｏｎ）システムからの膜及び試
薬を使用した。

直径３ＩＩＩＩｎの膜ディスクを、タンデム　アイコン
（Ｔａｎｄｅｍ　Ｉｃｏｎ）ＨＣＧ　（尿）装置からの
膜の中央を打ち抜いて得た後、上記した成形管アセンブ
リーに取りつけた。

尿試料５０μｌを添加し、膜を通過させた。その後、こ
のキットに入っている抗体−アルカリ性ホスファターゼ
結合吻５０ｔｔｌを各校に添加後、洗液の５０μｌの３
つのアリコツトを添加した。

最後に、膜に結合した酵素標識（アルカリ性ホスファタ
ーゼ）の量を、ジェタノールアミン緩衝液（ＩＭ　、ｐ
Ｈ９，８）にｐ−ニトロフェニルフオスフエ）　（１ｍ
ｇ　／　ｍｇ　）を溶解して調製した溶液５０Ｉｔ！を
各校に添加して推定した。基質溶液を膜に通した後、微
先端ガラスピペットを用いて下方流路に吸引し、プール
して４０５ｎｍにおいてミクロキュベツト中で測定した
。

結果は下記の通りであった。

尿に添加したＨＣＧ（ＩＩＪ／Ｉ）　　吸光度（４０５
ｎｍ）２５０　　　　　　　　０．１０ ５００　　　　　　　　０．２４ １０００　　　　　　　　０．５１ ウルトラボンド（Ｕｌｔｒａｂｏｎｄ）ＵＳ４５０膜〔
米国ミシガン州のアン　アーバにあるゲルマン　サイエ
ンシス　インク（ｊ：ｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　
Ｉｎｃ、）　）の直径３Ｉｎの個々のディスクをシート
から打ち抜き、異なる濃度のヒトＩｇＧで処理して、こ
の膜のＩｇＧ固定化能を試験した。

ヒトＩｇＧ　　（西ドイツのハイデルベルクにあるサー
バ（Ｓｅｒｖａ）社製）を０．　Ｉ　Ｉ！ｇ、０．０５
μｌｇ、０．０２ｘ、０．０１ｘ及びＯｔｒｇ含有する
試料を、１００ｘ／ａｉ！溶液をリン酸塩生理食塩緩衝
液（０，１ａ＋ｏｌ　／　ｌ　リン酸塩（ｐＨ７，４）
、０．１４ｍｏｌ／１塩化ナトリウム、０．０５％（ｖ
／ｖ））ウィーン２０）で希釈して調製後、１．ＯＩの
アリコツトをピペットでディスク上に移した。

ディスクを室温で６０分間乾燥させた後、上記した成形
管アセンブリーに取りつけた。

次に、ブロック溶液（リン酸塩生理食塩緩衝液に０．５
％−／Ｖ低脂肪ミルクを溶解したもの）の５０１１！の
アリコツトを管に添加し、液体を膜に通した。この操作
を２回繰り返した（通過には１回当たり５〜１０分かか
る）。

その後、管を２回リン酸塩生理食塩緩衝液の５０１１１
アリコツトで洗浄した。

ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ　　（デンマ
ークのコペンハーゲンにあるダコパッツ（Ｄａｋｏ−ｐ
ａ　ｔ　ｔｓ）社製、ガンマ鎖特異性、１／１００に希
釈〕５０Ｉ１１を各管に添加した。１５分後、リン酸塩
生理食塩緩衝液５０Ｉｉを各管に添加した。

最後に、発色試薬〔４０■のＡｏＴｓ／１００ｄ、１１
００ｎリン酸塩（えん酸塩緩衝液（ｐＨ４゜０）十原液
を希釈して濃度０．００３％としたばかりの過酸化水素
〕５０ｄを各管アセンブリーに添加した。この際、反応
を停止する試薬は必要としない。

下方流路に集まった液体を微細吸引ガラスピペットで取
り出して集め、ミクロキュベツト中で４１５ｎｓ＋で測
定シタ。

結果を下表に示す。

固定化１ｇＧ　（添加Ｗｋ：ｎ）　　吸光度（４１５ｎ
＋ａ）０．１０　　　　　　　　０．２５０ ０．０５　　　　　　　　０．１２Ｂ ０．０２　　　　　　　　０．０７２ ０．０１　　　　　　　　０．０４０ ０．０　　、　　　　　　　０．００６ベルオキシダー
ゼの比色検出の代替法として、ｐ−ヒドロキシフェニル
プロピオン酸を用いた石川等〔ジャーナル　オブ　イム
ノアッセイ（Ｊ、ｏｆ１＋＋ｕａｕｎｏａｓｓａｙ）、
４（３）、１９８３年、第２３１〜２３３頁〕が挙げら
れる。

実Ｍ影 ＷＯ−Ａ〜８６１０７２８１に開示されている技法によ
り、トリメトキシ−グリシドキシ−プロピルシランを用
いて、４−ニトロフェニル−α−マルトオリゴサツカラ
イド〔クリニカル　ケム（Ｃ１ｉｎｉｃａｌＣｈｅＩ１
１．）、■、１４〜１９（１９８５）参照〕をガラスミ
クロビーズ（ＵＳ　−Ａ　−４，７１３，３３８）に開
示されているような）に固定した。

ビーズの１〜２■の層を、水性スラリーから上記した実
施例で開示した装置の上流路の底に堆積させた。

α−グリコシダーゼ溶液（３４ｋＵ／１）を５２ｍＭリ
ン酸塩−５２ｎ＋Ｍ生理食塩緩衝液（ｐｌ＋７．１　）
中に調製した。

その後、α−アミラーゼ含有尿標準のアリコツトとα−
グリコシダーゼとを１：２０〜１：１００の比で混合し
て試験溶液を調製した。

試験溶液（約５０４）を装置の上方流路に添加し、重力
で、固定化ｐ−ニトロフェニル化オリゴサツカライドを
含有する多孔質層を通過させた。

下方流路に集まった液体を、４０５ｎｍで分光光度法で
測定した。その結果、吸収値が試料中のα−アミラーゼ
濃度に直線的に比例することが明らかとなった。

〔発明の効果〕

以上の説明及び実施例から明らかなように、本発明によ
る多孔質担体相で化学反応又は生化学反応を行う方法及
び装置は、健康診断及び臨床診断の分野、特に免疫試験
及び核酸プローブ試験に有効である。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図及び第１ｂ図は本発明の方法を行うための装置
の概略縦断面図である。 第２図は第１図の線■−■についての断面図である。 第３図は光源と光検出器の概略を示す第１図の線■−■
についての断面図である。 第４図は装置の一部分の拡大概略縦断面図である。 ｌ・・・上方容器、　　　　　２・・・直径低減部分、
３・・・ウェル、　　　　　　４・・・下方容器、５・
・・排出管、　　　　　　６・・・中空内部ダクト、７
・・・光源、　　　　　　８・・・光検出器、９・・・
多孔体、　　　　　１ｏ・・・ウェルの底、１１・・・
溝。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シグナル発生分析反応により試料中の化学種又は生
   化学種を測定する方法であって、反応相手が少なくとも
   ２つであり、そのうちの一つが前記化学種若しくは生化
   学種又はそれらの誘導体若しくは前駆体であり、そして
   ２つの反応相手のうちの一つが多孔質担体マトリックス
   に固定され又は固定されており他の一方が担体マトリッ
   クスを通過する液体に溶解又は分散しており、これによ
   り前記分析反応が生じ、そして前記測定の尺度となる連
   続的に発生するシグナルを前記マトリックスの出口部分
   の液体において測定する方法において、前記液体が制御
   された速度で前記担体を通って流れ、この際所望の測定
   の尺度となるシグナルがこの速度及び前記試料中のこの
   種の量の関数であることを特徴とする方法。 ２、前記種又はその誘導体が多孔質担体に固定されそし
   て前記シグナルを発生することのできるマーカで標識さ
   れ、そのシグナルの大きさが前記液体中の他の反応相手
   の濃度によっても決まる請求項１に記載の方法。 ３、液体が流れている間の一定時点で、又は流れの開始
   若しくは終わりに関して一定の期間にわたりシグナルを
   測定する請求項２に記載の方法。 ４、前記流速が一定であり、液体の流れている間のいず
   れかの時点でシグナルを測定する請求項２に記載の方法
   。 ５、液体がマトリックスの出口に排出されている時間の
   間、流速が既知で且つ再現性のある形態で変化する請求
   項２に記載の方法。 ６、前記流れが停止した後に前記シグナルを測定する特
   許請求の範囲第２項に記載の方法。 ７、多孔質担体相が、前記液体が添加される上方流路と
   シグナルが前記液体のパラメータの形態で測定される下
   方排出流路との間に位置する請求項２に記載の方法にお
   いて、該液体を自重により多孔質担体マトリックスを通
   って下方に流すことにより、瞬時の流速が上方流路にお
   ける液体の高さ及び前記担体マトリックスにより加えら
   れる抵抗により決まり、そして排出流路における一定体
   積に相当する下方流路の前記担体から一定距離の場所で
   シグナルを測定することを特徴とする方法。 ８、前記パラメータが、排出液を適当なプローブ手段を
   通過させることにより測定される色、濁度、光学活性、
   屈折率、蛍光、導電率、ＥＭＦ等である請求項７に記載
   の方法。 ９、液体の上部レベルが、孔内の毛管現象力によって保
   持されている多孔相のそれと一致したとき、下方に進む
   液体の流れが停止する請求項６に記載の方法において、
   上方流路に新たに液体の一部を添加しても液体置換が更
   に生じるだけであり、そして前記置換において液体界面
   での汚染が非常に少ないことを特徴とする方法。 １０、液状の試薬が添加される上方流路又は容器；一種
   以上の試薬を固定保持でき且つ前記液体を制御された一
   定流速又は可変流速で通過させる、前記上方流路の下部
   に位置する多孔質固体；前記液体を集合させオリフィス
   から排出するための、前記多孔体の出口に位置する下方
   排出流路；並びに前記集合した液体が排出される前にそ
   れらの１つ以上の特性を測定するための、前記排出流路
   付近に位置する測定手段；から実質的になる請求項１に
   記載の方法を実施するための液体チャンネリング装置。 １１、添加した液体が自重で流れ、且つ装置を通過する
   瞬時流速を制御する因子が液体の瞬時レベルである請求
   項１０に記載の装置。 １２、装置を通過する液体の流速を制御する手段を更に
   包含する請求項１０に記載の装置。 １３、前記手段が、ポンプ手段又は吸引手段である請求
   項１２に記載の装置。 １４、前記吸引手段が、排出流路のオリフィスに直接適
   用されるか又はオリフィスから近距離の所に近接させた
   多孔質パッドから成る特許請求の範囲第１３項に記載の
   装置。 １５、前記測定手段が、前記排出流路における前記液体
   と相互作用して検出可能なシグナルを提供するように排
   出流路における液体に照射する光源からの光線、前記相
   互作用後に前記シグナルをピックアップする検出手段、
   及び前記検出シグナルを処理して前記定量に必要なデー
   タとする電子解析手段を包含する請求項１０に記載の装
   置。 １６、排出流路が毛管の大きさを有する請求項１０に記
   載の装置。 １７、前記誘導体又は前駆体種が前記液体中に第一反応
   相手として存在し、理論量よりも大過剰の第二反応相手
   が多孔質マトリックスに固定されており、且つ前記液体
   をマトリックスを通過させることによる反応相手同士の
   反応により発生する応答が前記第一反応相手の濃度と正
   比例の関係があり、流速とは反比例の関係がある請求項
   １に記載の方法。