JPH01280469A - 吸着体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は血液中の有害成分を除去するための吸着体に関
する。さらに詳しくは血液あるいは血漿、血清中からリ
ボ蛋白、とくに極低密度すポ蛋白（ＶＬＤＬ）および（
または）低密度リボ蛋白（ＬＤＬ）を選択的に吸着除去
するための吸着体に関する。

［従来の技術・発明が解決しようとする課題］血液中に
存在するリボ蛋白のうちＶＬＤＬ、　ＬＤＬはコレステ
ロールを多く含み、動脈硬化の原因となることが知られ
ている。とりわけ家族性高脂血症などの高脂血症、高コ
レステロール症においては正常値の数倍のＶＬＤＬおよ
び（または）ＬＤＬ値を示し、冠動脈の硬化などをひき
おこす。

これらの疾患の治療には食事、療法、薬物療法が行なわ
れているが効果に限度があり、副作用も懸念されている
。とくに家族性高脂血症に対してはＶＬＤＬ％ＬＤＬを
多く含んだ患者の血漿を分離したのち、正常血漿または
アルブミンなどを成分とする補液と交換してＶＬＤＬ値
、ＬＤＬ値を低下させる、いわゆる血漿交換療法が現在
のところほぼ唯一の効果的な治療法である。

しかしながら、血漿交換療法は周知のごとく、（１）高
価な新鮮血漿あるいは血漿製剤を用いる必要がある、（
２）肝炎ウィルスなどの感染の惧れがある、（３）有害
成分のみでなく有用成分も同時に除去してしまう、すな
わちリボ蛋白のばあいを用である高密度リボ蛋白（ＩＩ
ＤＬ）も同時に除去してしまうなどの欠点を有する。

叙上の欠点を解消する目的で膜による有害成分の選択的
除去が試みられているが、選択性の点で満足できるもの
はいまたえられていない。

また同じ目的で抗原、抗体などを固定した、いわゆる免
疫吸着体を用いる試みがなされており、該方法は選択性
の点ではほぼ満足できるものの、用いる抗原、抗体の入
手が困難かつ高価であるという欠点を有する。

さらには、除去対象物質に特異的な親和性（アフィニテ
ィー）を有する物質（以下、リガンドという）を担体に
固定した、いわゆるアフィニティークロマトグラフィー
の原理による吸着体も試みられている。該方法に用いら
れるリガンドは抗原、抗体などに比べれば入手しやすい
物質が多いが、生体に由来する物質が多いため体外循環
治療に用いるには滅菌操作などに対する安定性、価格、
安全性などの点で満足しうるちのはほとんどない。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは叙上のごとき欠点を克服すべくさらに鋭意
研究を重ねた結果、特定の粘度と硫黄含量を有するデキ
ストラン硫酸および（または）その塩を水不溶性多孔体
に共有結合を介して固定することによって、高効率でか
つ安全に、しかも選択性よくリボ蛋白を吸着除去しうる
体外循環治療用吸着体かえられることを見出し、本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明は極限粘度（１Ｍ食塩水溶液中、２５
℃で測定、以下同様）が０．１２ｄｌ！　７ｇ以下でか
つ硫黄含量が１５ｆｆｆ　ｍ５以上、好ましくは１５〜
２２重量％のデキストラン硫酸および（または）その塩
が水不溶性多孔体に共有結合を介して固定されてなる体
外循環治療用リボ蛋白吸着体に関する。

〔実施例・発明の効果］ デキストラン硫酸および（または）その塩とはロイコノ
ストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ
　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｌｄｅｓ）などにより生産される
多糖であるデキストランの硫酸エステルおよび（または
）その塩である。

デキストラン硫酸および（または）その塩がカルシウム
などの２価カチオンの存在下にリボ蛋白と沈殿を形成す
ることが知られており、通常該目的には分子量が５０万
（極限粘度が約０．２０ｄＲ１ｇ）程度のデキストラン
硫酸および（または）その塩が使用される。しかしなが
ら、比較例に示すように叙上のごときデキストラン硫酸
および（または）その塩を水不溶性多孔体に固定しても
ＬＤＬおよび（または）　ＶＬＤＬの仮管能力は低く、
実用に耐えない。本発明者らは種々検討を重ねた結果、
極限粘度がＯ，１２ｄｉｌ　７ｇ以下、より好ましくは
０．０８ｄＮ　７ｇ以下でかつ硫黄含量が１５重量％以
上のデキストラン硫酸および（または）その塩が高いＬ
ＤＬおよび（または）ＶＬＤＬ吸着能力と選択性を示す
ことを見出した。

さらに驚くべきことに、叙上のごとき沈殿法では１０〜
４０ｍＭの２価カチオンを必要とするのに対し、本発明
の吸着体では２価カチオンの添加を必ずしも行なわなく
とも高い吸着能力と選択性を示すことが見出された。ま
たデキストラン硫酸および（または）その塩の毒性は低
いが、分子口がある程度以上大きくなると毒性が増加す
ることが知られており、この点からも極限粘度が０．１
２ｄＮ　／ｇ以下、より好ましくはｏ、ｏｓｄｆＩ／ｇ
以下の比較的低分子量のデキストラン硫酸および（また
は）その塩を用いることによって、固定されたデキスト
ラン硫酸および（または）その塩が万が一説離した際の
危険を防止できる。

さらには、デキストラン硫酸および（または）その塩は
大部分がα　−１，６−グリコシド結合であるので高圧
蒸気滅菌などの操作を施しても変化が少ない。

デキストラン硫酸および（または）その塩の分子口の測
定法には種々あるが、粘度測定によるのが一般的である
。しかしながら、デキストラン硫酸および（または）そ
の塩は高分子電解質であるため溶液のイオン強度、ｐｌ
＋、さらにデキストラン硫酸および（または）その塩の
硫黄含量（すなわち、スルホン酸基の量）などによって
同じ分子量のものでも粘度が異なる。本発明でいう極限
粘度とは、デキストラン硫酸および（または）その塩を
ナトリウム塩とし、中性の１Ｍ食塩水溶液中、２５℃で
計１定したものである。

本発明に用いるデキストラン硫酸および（または）その
塩は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、塩としてはナトリウ
ム、カリウムなどの水溶性塩が好ましい。

本発明に用いる担体の水不溶性多孔体としてはつぎの性
質を備えていることが好ましい。

（１）機械的強度が比較的高く、カラムなどに充填して
、血液、血漿などの体液を流したばあいの圧力損失が小
さく、目詰りなどをおこさない。

（２）充分な大きさの細孔が多数存在すること、すなわ
ち吸着除去対象物質が細孔内に侵入できることが必要で
あり、球状蛋白質およびウィルスを用いて測定した排除
限界分子量が１００万〜１億の範囲である（ただし排除
限界分子量とは細孔内に侵入できない（排除される）分
子のうち最も小さい分子量をもつものの分子量をいう）
。

（３）表面に固定化反応に用いつる官能基または容易に
活性化しうる官能基、たとえばアミノ基、カルボキシル
基、ヒドロキシル基、チオール基、酸無水物基、サクシ
ニルイミド基、塩素基、アルデヒド基、アミド基、エポ
キシ基などが存在する。

（４）高圧蒸気滅菌などの滅菌操作による変化が少ない
。

なお、（′２Ｊの球状蛋白質およびウィルスを用いて測
定した排除限界分子量（以下、排除限界分子量という）
に関しては、排除限界分子ｆｆｉ　ｔｏ。

万未満の担体を用いたばあいはＶＬＤＬ、　ＬＤＬの除
去量は小さく実用に耐えないが、排除限界分子量が１０
０万〜数百万とＶＬＤＬＳＬＤＬの分子量に近い担体で
もある程度実用に供しうるちのがえられる。一方、排除
限界分子量が１億を超えると、リガンドの固定量が減少
して結果的に吸着量が減り、またゲルの強度も低下する
ため好ましくない。かかる理由のため本発明に用いる水
不溶性多孔体は排除限界分子量が１ｏｏ万〜１億の範囲
であることが適当である。

叙上のごとき性質を備えた水不溶性多孔体の代表例とし
ては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、架橋ポリ
ビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋された
ビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、架橋された
スチレン−無水マレイン酸共重合体、架橋ポリアミドな
どの合成高分子の多孔体や多孔質セルロースゲル、さら
にはシリカゲル多孔質ガラス、多孔質アルミナ、多孔質
シリカアルミナ、多孔質ヒドロキシアパタイト、多孔質
ケイ酸カルシウム、多孔質ジルコニア、ゼオライトなど
の無機多孔体があげられるが、これらに限定されるわけ
ではない。また水不溶性多孔体の表面は多糖類、合成高
分子などでコーティングされていてもよい。

水不溶性多孔体の粒子径は一般的には小さい方が吸着能
力の点で好ましいが、粒子径があまりに小さくなるとカ
ラムに充填したばあいの圧力損失が大きくなり好ましく
なく、１〜５，０００μの範囲であることが好ましい。

また水不溶性多孔体は単独で用いてもよいし２種類以上
混合して用いてもよい。

叙上の代表例の中でも多孔質セルロースゲルは前記（１
）〜（４）の性質を備えているばかりでなく、デキスト
ラン硫酸および（ま−たは）その塩を効率よく固定する
ことができるため本発明に最も適した水不溶性多孔体の
ひとつである。

デキストラン硫酸および（または）その塩を水不溶性多
孔体に固定する方法には種々あるが、体外循環治療に用
いるにはリガンドが脱離しないことが重要であるので、
リガンドが結合の強固な共有結合を介して水不溶性多孔
体に固定されていることが望ましい。

固定化方法の代表例としては、ハロゲン化シアン法、エ
ピクロルヒドリン法、ビスエポキサイド法、ハロゲン化
トリアジン法などがあげられるが、結合が強固でリガン
ドの脱離の危険性が少ないエピクロルヒドリン法が最も
本発明に適している。しかしながら、該エピクロルヒド
リン法は反応性が低く、とくにデキストラン硫酸および
（または）その塩を固定するばあいにはリガンドの官能
基が水酸基であるためさらに反応性が低く、通常の方法
では充分なリガンド固定量をうろことは難しい。

本発明者らは種々検討の結果、エピクロルヒドリンで活
性化されたエポキシ化水不溶性多孔体とデキストラン硫
酸および（または）その塩を反応させる工程において、
デキストラン硫酸および（または）その塩の濃度（水不
溶性多孔体（乾燥重量）を除く全反応系重量に対する濃
度、以下同様）を３重量％以上、より好ましくは１０重
量％以上に保つことによって充分な量のデキストラン硫
酸および（または）その塩が固定されることを見出した
。デキストラン硫酸および（または）その塩の固定化量
については、有意なリボ蛋白吸着量をうるにはカラム体
積１ｍｌあたり　０．２麿ｇ以上が好ましく、また経済
性を考慮すると　１００　ｍｇ以下が望ましい。

また、多孔質セルロースゲルを用いると他の水不溶性多
孔体に比べ、同じ条件でもデキストラン硫酸および（ま
たは）その塩の固定量が多く、好都合である。

エピクロルヒドリンにより活性化された水不溶性多孔体
とデキストラン硫酸および（または）その塩との反応で
えられる吸着体は、デキストラン硫酸および（または）
その塩が式：％式％ （式中、ＯＡはデキストラン硫酸および（または）その
塩の水酸基に由来する酸素原子、０８は水不溶性多孔体
の表面水酸基に由来する酸素原子）で示される結合を介
して水不溶性多孔体に固定されている。

なお、固定化反応終了後、未反応のデキストラン硫酸お
よび（または）その塩は回収して精製などの工程を経て
再使用することもできる。

デキストラン硫酸を固定したのち、未反応の活性基（エ
ピクロルヒドリンを用いたばあいはエポキシ基）はモノ
エタノールアミンなどで封止しておくのが望ましい。

本発明による吸着体を体外循環治療に用いるには種々の
方法があるが、入口と出口に体液成分（血球、蛋白質な
ど）は通過するが吸着体は通過できないフィルター、メ
ツシュなどを装着したカラムに充填し、該カラムを体外
循環回路に組み込み、血液、血漿などの体液をカラムに
通して行なう方法が代表的である。

つぎに実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はかかる実施例のみに限定されるわけではない
。

比較例１ セルロファインＡ−３（チッソ■製の多孔質セルロース
ゲル、排除限界分子量５０，０００．ＯＯＯ，粒子径４
５〜１０５胴）　１０ｍ１に２０％ＮａＯＨ４ｇ、ヘブ
タン１２ｇおよびノニオン系界面活性剤トウィーン（Ｔ
ｖｅｅｎ）２０を１滴加え、４０℃で２時間撹拌後エピ
クロルヒドリン５ｇを加えて２時間撹拌した。

静置後上澄みを捨て、ゲルを水洗濾過してエポキシ化セ
ルロースゲルをえた。

つぎにＬＤＬ沈殿用として重版されている極限粘度０．
２０ｄＩ／ｇ、平均重合度（原料デキストランの平均重
合度、以下平均重合度という）３，５００、硫黄含量１
７．７重量％のデキストラン硫酸ナトリウム０．５ｇを
水２　ｍｌに溶解し、これに叙上のごとくしてえられた
エポキシ化セルロースゲル２ｍｌを加え、ｐＨ１２に調
整した（デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は約１０重
量％）。これを４０℃で１６時間振盪後ゲルを炉別し、
２Ｍ食塩水、０．５Ｍ食塩水、水で洗浄し、デキストラ
ン硫酸ナトリウムが固定化されたセルロースゲルをえた
。未反応のエポキシ基はモノエタノールアミンを用いて
封止した。固定されたデキストラン硫酸ナトリウムの量
はカラム体積１　ｍｌあたり４．２ｍｇであった。

比較例２ デキストラン硫酸ナトリウムを極限粘度０．１２４　ｄ
ｌ　／ｇ、平均重合度１４０．硫黄含量５．７重量％の
ものにかえたほかは比較例１と同様にしてデキストラン
硫酸ナトリウムが固定されたセルロースゲルをえた。固
定されたデキストラン硫酸ナトリウムの量はカラム体積
１　ｍｌあたり２．５＋ａｇであった。

実施例１ デキストラン硫酸ナトリウムとして （１）極限粘度０．０２７　ｄＲ／ｇ、平均重合度１２
、硫黄含量１７．７重量９６ （′２Ｊ極限粘度０．０５５　ｄＮ　／ｇ、平均重合度
４０゜硫黄含量１９重量％ （３）極限粘度０．０８３　ｄｊｌ！　／ｇ、平均重合
度１４０、硫黄含量１９．２重量％ （４）極限粘度０．１１８　ｄｆｌ／ｇ、平均重合度２
７ｏ１硫黄含量１７．７重回％ の４種類を用い、比較例１と同様にしてデキストラン硫
酸ナトリウムが固定されたセルロースゲルをえた。固定
されたデキストラン硫酸ナトリウムの量はカラム体積１
　ｍｌあたりそれぞれ２．０ｍｇ５　１．５１℃１ｇｓ
　　４．Ｏａ＋ｇ、　　４．３ｍｇであった。

実施例２ 架橋ポリアクリレートゲルであるトヨバール１１Ｗ６５
（東洋曹達■製、排除限界分子量５．０００，０００、
粒子径５０〜ＬＯＯ緬）　１０ｍ１に飽和Ｎ　ａ　ＯＩ
Ｉ水溶液６ｍｌ、エピクロルヒドリン１５ｍ１を加え、
撹拌しながら５０℃で２時間反応させたのち、ゲルをア
ルコール、水で洗浄してエポキシ化されたゲルをえた。

えられたゲル２　ｍｌに極限粘度０．０５５　ｄｊＪ　
／ｇ。

平均重合度４０、硫黄含量１９重量％のデキストラン硫
酸ナトリウム０．５ｇおよび水２　ｍｌを加えた（デキ
ストラン硫酸ナトリウムの濃度は約１３重量％）。つい
でｐ１１１２に調整し、４０℃で１６時間娠浸し、ゲル
を炉別し、２Ｍ食塩水、０．５Ｍ食塩水、水で洗浄して
デキストラン硫酸ナトリウムが固定されたゲルをえた。

未反応のエポキシ基はモノエタノールアミンを用いて封
止した。固定されたデキストラン硫酸ナトリウムの量は
カラム体積１　ｍｌあたり　０．４ｍｇであった。

実施例３ 極限粘度０．０５５　ｄｆＩ／ｇ、平均重合度４０．硫
黄含ｍ１９重量％のデキストラン硫酸ナトリウムを用い
、固定化反応におけるデキストラン硫酸ナトリウムの濃
度を２．５重量％にかえたほかは比較例１と同様にして
デキストラン硫酸ナトリウムが固定されたゲルをえた。

固定されたデキストラン硫酸ナトリウムの量はカラム体
Ｎ　１　ｍｌあたり　０．１５ｍｇであった。

試験例 比較例１〜２、実施例１〜３でえられたデキストラン硫
酸ナトリウムが固定されたゲルのそれぞれ１　ｍｌをカ
ラムに充填し、高脂血症患者の血漿（総コレステロール
濃度３００Ｉ１ｇ／ｄＩ）　６　ｍｌを流し、吸着され
たＬＤＬの量を総コレステロールを指標として測定した
（用いた血漿中のコレステロールはほとんどがＬＤＬに
由来するため）。

結果を第１表に示す。

実施例４ 実施例１でえられた吸着体のうち、極限粘度０．０２７
　ｄｆＩ／ｇ、平均重合度１２、硫黄含量１７．７重量
％のデキストラン硫酸ナトリウムを固定したものを生理
食塩水中に分散させた状態で１２０℃２０分間高圧蒸気
滅菌を施し、実施例３と同様にしてＬＤＬの吸着量を測
定したところ、該滅菌操作による吸着量の減少はわずか
であった。

実施例５ 実施例１でえられた吸着体のうち、極限粘度０．０２７
　ｄ＃　／ｇ、平均重合度１２、硫黄含量１７．７重量
％のデキストラン硫酸ナトリウムを固定したもの１　ｍ
ｌをカラムに充填し、これに正常ヒト血漿（ＬＤＬコレ
ステロールとＩＩＤＬコレステロールの比が約１：１）
６ｍｌを通したところ、ＬＤＬは大幅に減少したが、Ｉ
ＩＤＬはほとんど吸着されなかった。

実施例６ 実施例５で用いた吸着体１　ｍｌをカラムに充填し１．
：　しく、１：　ＶＬＤＬ、　ＬＤＬ　ＳＨＤ［、を含
む正常ウサギの血漿６　ｍｌを通し、カラム通過前後で
の血漿中のリボ蛋白をポリアクリルアミドゲルを用いた
ディスク電気泳動法で調べた。第１図はその結果を示す
チャートである。第１図中、曲線ＡおよびＢはそれぞれ
カラム通過前、ａ過後の電気泳動の結果であり、縦軸は
５７０ｎｍにおける吸光度、↑はそれぞれＶＬＤＬ、　
ＬＤＬ　、　ＩＩＤＬのバンドが出現した位置を示す。

第１図に示すごと＜　、ＶＬＤＬ、　ＬＤＬは吸着され
たが、ＩＩＤＬはほとんど吸着されなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリアクリルアミドゲルを用いたディスク電気
泳動の結果を示すチャートである。 ２１圀

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　極限粘度が０．１２ｄｌ／ｇ以下でかつ硫黄含量が
   １５重量％以上であるデキストラン硫酸および（または
   ）その塩が水不溶性多孔体に共有結合を介して固定され
   てなる体外循環治療用リポ蛋白吸着体。 ２　水不溶性多孔体の排除限界分子量が１００万〜１億
   の範囲である特許請求の範囲第１項記載の吸着体。 ３　水不溶性多孔体が多孔質セルロースゲルである特許
   請求の範囲第１項または第２項記載の吸着体。 ４　デキストラン硫酸および（または）その塩が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、０＾Ａはデキストラン硫酸および（または）そ
   の塩の水酸基に由来する酸素原子、０＾Ｂは水不溶性多
   孔体の表面水酸基に由来する酸素原子である）で示され
   る結合を介して水不溶性多孔体に固定されてなる特許請
   求の範囲第１項、第２項または第３項記載の吸着体。 ５　デキストラン硫酸および（または）その塩の固定量
   がカラム体積１ｍｌあたり０．２ｍｇ以上である特許請
   求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載の吸
   着体。