JPH01146900A - 鉄含量が高い可溶性ポリペプチド誘導体とその製法及びこれを含有する製薬組成物 - Google Patents
鉄含量が高い可溶性ポリペプチド誘導体とその製法及びこれを含有する製薬組成物Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は鉄を0.1〜45重量%含有するポリペプチド
誘導体であって、中性又は塩基性pHで高い溶解性を有
し、酸性pHでは不溶性で、しかも哺乳動物への経口投
与に完全に耐えられるところの極めて優れた鉄損体であ
ることが証明されたポリペプチド誘導体に関する。
誘導体であって、中性又は塩基性pHで高い溶解性を有
し、酸性pHでは不溶性で、しかも哺乳動物への経口投
与に完全に耐えられるところの極めて優れた鉄損体であ
ることが証明されたポリペプチド誘導体に関する。
本発明はまた。上記のポリペプチド誘導体とアルカリ及
び/又はアルカリ土類金属並びに製薬上許容される有機
塩基との塩に関する。
び/又はアルカリ土類金属並びに製薬上許容される有機
塩基との塩に関する。
さらに1本発明は前記の誘導体及びその塩の製造法と、
これら誘導体及び/又はその塩を含有し、ヒト又は動物
用の製薬組成物の製造法に関する。
これら誘導体及び/又はその塩を含有し、ヒト又は動物
用の製薬組成物の製造法に関する。
ヒト及び動物のような生体において、鉄はヘモグロビン
及びその他の酵素の如き成分を形成するうえで1重要な
役割を演じている。
及びその他の酵素の如き成分を形成するうえで1重要な
役割を演じている。
鉄欠乏の病理学的兆候は、低色素性で鉄欠乏性の貧血で
あって、この貧血の原因は失血、腫瘍形成、吸収不足な
ど様々である。
あって、この貧血の原因は失血、腫瘍形成、吸収不足な
ど様々である。
鉄欠乏性貧血の経口治療は、無機塩、有機塩又はコンプ
レックス誘導体で行われるが、この治療はしばしば胃腸
障害、下痢及び嘔吐のような副作用を伴う。
レックス誘導体で行われるが、この治療はしばしば胃腸
障害、下痢及び嘔吐のような副作用を伴う。
本件出願人の出願に係るイタリア国特許第115021
3号には、動物性又は植物性蛋白質を様々な度合でスク
シニル化したスクシニル化蛋白質と鉄■イオンとの相互
作用で誘導された鉄含量が0.1〜20重量%である高
分子蛋白誘導体が記載されいるが、溶解性や生化学的特
性に関係する高濃度物については、鉄損体としての生物
学的利用能及び副作用の有無が示されなければならない
、事実、鉄含量が20重量%を越える上記特許の誘導体
は、如何なるpH値でも(塩基性、中性及び酸性)不溶
である。
3号には、動物性又は植物性蛋白質を様々な度合でスク
シニル化したスクシニル化蛋白質と鉄■イオンとの相互
作用で誘導された鉄含量が0.1〜20重量%である高
分子蛋白誘導体が記載されいるが、溶解性や生化学的特
性に関係する高濃度物については、鉄損体としての生物
学的利用能及び副作用の有無が示されなければならない
、事実、鉄含量が20重量%を越える上記特許の誘導体
は、如何なるpH値でも(塩基性、中性及び酸性)不溶
である。
さらに、鉄含量が約10%以上の当該誘導体は、製薬学
的用途に適当な濃度の溶液とした場合、使用が困難な程
高粘度になる。従って、商業的に入手可能な医薬は、鉄
含量が5〜6重量%の前記公知化合物〔以下これをFa
SP(Fe−5uccinyl−ated Prote
ins)と言う〕を使用する。
的用途に適当な濃度の溶液とした場合、使用が困難な程
高粘度になる。従って、商業的に入手可能な医薬は、鉄
含量が5〜6重量%の前記公知化合物〔以下これをFa
SP(Fe−5uccinyl−ated Prote
ins)と言う〕を使用する。
今、驚くべきことに、前記の誘導体をプロテアーゼで適
当に加水分解すると、鉄含量が上に示した範囲よりかな
り高い化合物が得られ、このものは最適な溶解性と生化
学的特性を示すことが見出された。この化合物は塩基性
及び中性媒体に可溶で、酸性pH値で不溶である。この
うち第1の特性は、鉄を胃十二指腸レベルで最適に吸収
させるうえで、また腸障害及び下痢作用(これはフリー
の鉄に関係し、フリーの鉄は中性及び塩基性pH条件下
で刺激性の高い不溶性水和酸化物を生成する)を回避す
るうえで、必須である。また、酸性媒体で不溶性である
ことは、胃中での鉄イオンの放出を防止し、結果的に胃
に障害をもたらさない、さらに、高濃度で鉄を含有する
当該新規誘導体の溶液は、効能度でもその粘度は極めて
低い。
当に加水分解すると、鉄含量が上に示した範囲よりかな
り高い化合物が得られ、このものは最適な溶解性と生化
学的特性を示すことが見出された。この化合物は塩基性
及び中性媒体に可溶で、酸性pH値で不溶である。この
うち第1の特性は、鉄を胃十二指腸レベルで最適に吸収
させるうえで、また腸障害及び下痢作用(これはフリー
の鉄に関係し、フリーの鉄は中性及び塩基性pH条件下
で刺激性の高い不溶性水和酸化物を生成する)を回避す
るうえで、必須である。また、酸性媒体で不溶性である
ことは、胃中での鉄イオンの放出を防止し、結果的に胃
に障害をもたらさない、さらに、高濃度で鉄を含有する
当該新規誘導体の溶液は、効能度でもその粘度は極めて
低い。
そして、採用する加水分解条件下では、加水分解に付さ
れる出発誘導体の絶対鉄含量に、実質的な変化が起らず
、その鉄含量はそのまま最終生成物に持ち越されること
も見出された1例えば、5重量%の鉄を含む誘導体を加
水分解すると、約10重量%の鉄を含む生成物が回収さ
れ。
れる出発誘導体の絶対鉄含量に、実質的な変化が起らず
、その鉄含量はそのまま最終生成物に持ち越されること
も見出された1例えば、5重量%の鉄を含む誘導体を加
水分解すると、約10重量%の鉄を含む生成物が回収さ
れ。
反応媒体中にはフリーの鉄も沈澱した鉄も認められず、
存在が認められるのはペプチド残渣だけである。
存在が認められるのはペプチド残渣だけである。
鉄を含有するポリペプチド誘導体を調製する本発明の第
1の方法は、鉄スクシニル蛋白質の溶液又は懸濁液(F
e含量に依存しない)を、適当なpH及び温度条件下に
、純粋な又は混合プロテアーゼで処理し、得られた誘導
体を酸性化(酵素又はその自己加水分解生成物が溶解す
る条件)した後、中性pHで再溶解して再沈澱させ(再
沈澱は完全精製を目的とする)1次いで中性pHで水性
溶媒を真空蒸発、凍結乾燥又は噴震乾燥で除去すること
により、最終固体生成物を取得することからなる。
1の方法は、鉄スクシニル蛋白質の溶液又は懸濁液(F
e含量に依存しない)を、適当なpH及び温度条件下に
、純粋な又は混合プロテアーゼで処理し、得られた誘導
体を酸性化(酵素又はその自己加水分解生成物が溶解す
る条件)した後、中性pHで再溶解して再沈澱させ(再
沈澱は完全精製を目的とする)1次いで中性pHで水性
溶媒を真空蒸発、凍結乾燥又は噴震乾燥で除去すること
により、最終固体生成物を取得することからなる。
上記と同様な誘導体は、鉄イオンをスクシニル化蛋白質
の部分的な酵素加水分解から得られる生成物と、ペプチ
ドのスクシニル化で得られ、スクシニル化の程度が異な
るスクシニル化ポリペプチドとの両方に作用させること
によっても調製することができる。この場合のペプチド
は動物性又は植物性蛋白質の一次加水分解で、あるいは
合成で導かれ、また、スクシニル化の程度が異なる範囲
は1元の蛋白質又はペプチドに存在するスクシニル化可
能な基の10〜100%がスクシニル化されてた範囲で
ある。従って、本発明の目的は。
の部分的な酵素加水分解から得られる生成物と、ペプチ
ドのスクシニル化で得られ、スクシニル化の程度が異な
るスクシニル化ポリペプチドとの両方に作用させること
によっても調製することができる。この場合のペプチド
は動物性又は植物性蛋白質の一次加水分解で、あるいは
合成で導かれ、また、スクシニル化の程度が異なる範囲
は1元の蛋白質又はペプチドに存在するスクシニル化可
能な基の10〜100%がスクシニル化されてた範囲で
ある。従って、本発明の目的は。
a)イタリア国特許第1,150,213号に記載され
た鉄スクシニル蛋白質(FeSP)コンプレックスを、
適当なpH及び温度条件下に、酵素で分解する、 b)スクシニル化の程度が異なるスクシニル化蛋白質(
この蛋白質は動物性又は植物性のいずれでも可)の加水
分解で得られるスクシニル化ポリペプチドと鉄イオンを
相互にさせる、又は。
た鉄スクシニル蛋白質(FeSP)コンプレックスを、
適当なpH及び温度条件下に、酵素で分解する、 b)スクシニル化の程度が異なるスクシニル化蛋白質(
この蛋白質は動物性又は植物性のいずれでも可)の加水
分解で得られるスクシニル化ポリペプチドと鉄イオンを
相互にさせる、又は。
C)ポリペプチド(このポリペプチドは動物性又は植物
性蛋白質の加水分解又は合成で得られる)を、適当な条
件下に無水こはく酸又はスクシノイルモノクロライドと
反応させて得られるスクシニル化の程度が異なるスクシ
ニル化ポリペプチドと鉄イオンを相互に作用させる、の
いずれかの手段で得られる鉄含量が0.1〜45重量%
の鉄−ポリペプチドコンプレックスを提供することにあ
る。
性蛋白質の加水分解又は合成で得られる)を、適当な条
件下に無水こはく酸又はスクシノイルモノクロライドと
反応させて得られるスクシニル化の程度が異なるスクシ
ニル化ポリペプチドと鉄イオンを相互に作用させる、の
いずれかの手段で得られる鉄含量が0.1〜45重量%
の鉄−ポリペプチドコンプレックスを提供することにあ
る。
上記の誘導体は後記の実施例で実証される通り1次のよ
うに特徴付けられる。すなわち、当該誘導体は中性又は
塩基性水性媒体に極めて可溶であって、酸性媒体には不
溶である。また、この誘導体は哺乳類に経口投与した場
合、既に公知のFaSPに比較して同じ鉄含量でも、よ
り効果的に鉄を放出する。そしてまた、この誘導体は溶
解度が高く、鉄含量も多く、その溶液が低粘度であるた
めに、薬剤調製により好適である。
うに特徴付けられる。すなわち、当該誘導体は中性又は
塩基性水性媒体に極めて可溶であって、酸性媒体には不
溶である。また、この誘導体は哺乳類に経口投与した場
合、既に公知のFaSPに比較して同じ鉄含量でも、よ
り効果的に鉄を放出する。そしてまた、この誘導体は溶
解度が高く、鉄含量も多く、その溶液が低粘度であるた
めに、薬剤調製により好適である。
実施例I
A) Fe5Pの調製
上記した特許の手法に従って、1gのスクシニル化カゼ
インを20m1の水に溶解させ、20園1のpecla
水溶液を添加した(FeSPに存在することが望ましい
鉄含量に応じて、Esc1a水溶液の添加量は10〜3
0mg/mlである)、生成した沈澱をpH7゜2で溶
解させ、3.5より低いpiで再沈澱させて未反応の過
剰イオンを除去した。 Fe5Pを水に加え、NaOH
を加えてpHを7.2にすることでこれを溶解させ、凍
結乾燥した。ナトリウム塩として得られたFe5P(5
,5重量%の鉄含有)500+agを、20m1の水に
溶かし、溶液のpHを7.5〜8.0に調節した。
インを20m1の水に溶解させ、20園1のpecla
水溶液を添加した(FeSPに存在することが望ましい
鉄含量に応じて、Esc1a水溶液の添加量は10〜3
0mg/mlである)、生成した沈澱をpH7゜2で溶
解させ、3.5より低いpiで再沈澱させて未反応の過
剰イオンを除去した。 Fe5Pを水に加え、NaOH
を加えてpHを7.2にすることでこれを溶解させ、凍
結乾燥した。ナトリウム塩として得られたFe5P(5
,5重量%の鉄含有)500+agを、20m1の水に
溶かし、溶液のpHを7.5〜8.0に調節した。
B)酵素による分解
上記の溶液をトリプシンに加えて酵素対基質の比を1
: 10Gとし、酵素の比活性が蛋白質重量当り、 5
,000 BAEEυ/■gとした。加水分解は0、I
NのNaOHを添加してpHを6〜10.好ましくは
7.5〜8.5の範囲の一定値に保持しながら、0〜5
0℃(好ましくは25〜30℃)で行った6反応は約4
時間又はスタート時の酵素活性が約1/10に減少する
まで続け、溶液を酸性化(pH2〜3)することで反応
と完了させた。赤褐色沈澱と上澄みが得られた。この上
澄みについて行った鉄分析では、痕跡程度(反応に存在
した全鉄の0.05%未満)の鉄しか認められなかった
。
: 10Gとし、酵素の比活性が蛋白質重量当り、 5
,000 BAEEυ/■gとした。加水分解は0、I
NのNaOHを添加してpHを6〜10.好ましくは
7.5〜8.5の範囲の一定値に保持しながら、0〜5
0℃(好ましくは25〜30℃)で行った6反応は約4
時間又はスタート時の酵素活性が約1/10に減少する
まで続け、溶液を酸性化(pH2〜3)することで反応
と完了させた。赤褐色沈澱と上澄みが得られた。この上
澄みについて行った鉄分析では、痕跡程度(反応に存在
した全鉄の0.05%未満)の鉄しか認められなかった
。
C)スクシニル化された鉄−ポリペプチドの単離
上記の赤褐色沈澱をデカンテーション(又は濾過若しく
は遠心分離)で回収し、HCIでpH3とした水で洗浄
した。この沈澱を5■lの水に懸濁させ、pH値が確実
に7を越えるまで0.INのNaOHを加えてこれを溶
解させた。これに塩酸を加えてpHを3にする酸性化で
、鉄誘導体を沈澱させ、濾過によりこれを回収した0次
いでこの沈澱を水に加え、NaOHでpHを7〜7.2
にすることで再溶解させ、凍結乾燥した。
は遠心分離)で回収し、HCIでpH3とした水で洗浄
した。この沈澱を5■lの水に懸濁させ、pH値が確実
に7を越えるまで0.INのNaOHを加えてこれを溶
解させた。これに塩酸を加えてpHを3にする酸性化で
、鉄誘導体を沈澱させ、濾過によりこれを回収した0次
いでこの沈澱を水に加え、NaOHでpHを7〜7.2
にすることで再溶解させ、凍結乾燥した。
こうして得られた生成物は、スクシニル化されたポリペ
プチド誘導体であって、Arznei■。
プチド誘導体であって、Arznei■。
Forsch、34. (If ) 、9,948−9
52.1984年に記載されているようにO−フェナン
トロリンとの反応で鉄含量を測定すると、前記誘導体は
10.2重量%の鉄を含んでいた。スクシニル化された
蛋白質に帰属するバンドの無存在を確かめるために、こ
の誘導体を電気泳動分析にかけ、さらにコンプレックス
中の鉄の原子価状態と、スクシニル化の程度を評価する
ために、ESR分析にかけた。
52.1984年に記載されているようにO−フェナン
トロリンとの反応で鉄含量を測定すると、前記誘導体は
10.2重量%の鉄を含んでいた。スクシニル化された
蛋白質に帰属するバンドの無存在を確かめるために、こ
の誘導体を電気泳動分析にかけ、さらにコンプレックス
中の鉄の原子価状態と、スクシニル化の程度を評価する
ために、ESR分析にかけた。
m この分析は酢酸セルロースの小片で行った。試料
を沈積する直前に、約5Mのトリス−トリシン緩衝液(
pH8,6)で予め処理した。
を沈積する直前に、約5Mのトリス−トリシン緩衝液(
pH8,6)で予め処理した。
小片に40V/c園の一定電圧を30分間与え、緩衝液
にトリス−トリシン(p)I 8.6)を使用して電気
泳動を行った。電気泳動バンドをポンソーレッド(po
nceau red)で染色して発現させた。試料につ
いて得られた実験結果は、FaSPに存在するスクシニ
ル化蛋白質のために、バンドがないことを示し、また可
動性の電気泳動バンドはFe5Pのそれより高かった。
にトリス−トリシン(p)I 8.6)を使用して電気
泳動を行った。電気泳動バンドをポンソーレッド(po
nceau red)で染色して発現させた。試料につ
いて得られた実験結果は、FaSPに存在するスクシニ
ル化蛋白質のために、バンドがないことを示し、また可
動性の電気泳動バンドはFe5Pのそれより高かった。
ESR誘導体水溶液の9,083 Gに於けるESRス
ペクトルは、酸素原子によって結合された3価の鉄を含
む構造によって、 g=2.004に中心を持つバンド
の存在を示゛した。
ペクトルは、酸素原子によって結合された3価の鉄を含
む構造によって、 g=2.004に中心を持つバンド
の存在を示゛した。
、=tt< i こはく酸含量は、スクシニル化
された鉄−ポリペプチド試料をIN HCIで処理し、
窒素雰囲気中、100℃で12時間6NのHCI(10
飄l)で加水分解して鉄を奪取することで放出されるこ
はく酸と、こはく酸チオキナーゼ(Method of
Enzymatic Analyslg、第3巻、16
16−1621頁、U、Bergmeyer Ed、、
Verlag Chemie、1974年参照)との
酵素反応によって測定した。この反応により、試料中に
こはく酸が存在していることが確認された(含量は7.
5重量%)。
された鉄−ポリペプチド試料をIN HCIで処理し、
窒素雰囲気中、100℃で12時間6NのHCI(10
飄l)で加水分解して鉄を奪取することで放出されるこ
はく酸と、こはく酸チオキナーゼ(Method of
Enzymatic Analyslg、第3巻、16
16−1621頁、U、Bergmeyer Ed、、
Verlag Chemie、1974年参照)との
酵素反応によって測定した。この反応により、試料中に
こはく酸が存在していることが確認された(含量は7.
5重量%)。
実施例2
実施例1に記載したように調製されたFe5P試料(1
000mg)を50m1の水に溶解させ、 NaOHを
加えることでpHを7.8に調節した。この溶液にトリ
プシンとキモトリプシンとをそれぞれ基質に対して1
: 100の比又は0.01:100及び10:100
の比(1:100の比が好ましい)で添加した(酵素の
比活性は5000 U BAEt!/−g トリプシ、
ン及び4000 UATEE/■gキモトリプシンであ
る)、約2時間で反応を停止し、15.4重量%の鉄を
含有するスクシニル化ポリペプチド誘導体を得た。この
ものは6.5以上のpHで水性媒体に容易に溶解する。
000mg)を50m1の水に溶解させ、 NaOHを
加えることでpHを7.8に調節した。この溶液にトリ
プシンとキモトリプシンとをそれぞれ基質に対して1
: 100の比又は0.01:100及び10:100
の比(1:100の比が好ましい)で添加した(酵素の
比活性は5000 U BAEt!/−g トリプシ、
ン及び4000 UATEE/■gキモトリプシンであ
る)、約2時間で反応を停止し、15.4重量%の鉄を
含有するスクシニル化ポリペプチド誘導体を得た。この
ものは6.5以上のpHで水性媒体に容易に溶解する。
実施例3
5%の鉄を含有するFe5P試料(2000mg)を2
00m1のNaOHに溶かして(最終溶液のpH=7)
、実施例2に記載したと同様に処理した。
00m1のNaOHに溶かして(最終溶液のpH=7)
、実施例2に記載したと同様に処理した。
反応媒体から経時的にフラクションを抜き出し、これを
酸性化(HCIの添加でpiを約3にする)することで
加水分解を中断させた0次いで実施例1の工程C)に記
載したように、水性媒体中で再溶解することで、鉄を含
有する沈澱を精製した。
酸性化(HCIの添加でpiを約3にする)することで
加水分解を中断させた0次いで実施例1の工程C)に記
載したように、水性媒体中で再溶解することで、鉄を含
有する沈澱を精製した。
スクシニル化ポリペプチド試料の鉄含量を次表に示す。
第1表
1 15 6 −0.8−3 1
20 11 −0.1−プロテアーゼの反
応時間を変えることにより、特定量の鉄を含有するFe
5P試料から、所望量の鉄を含有するポリペプチド誘導
体が得られることが分かる。
20 11 −0.1−プロテアーゼの反
応時間を変えることにより、特定量の鉄を含有するFe
5P試料から、所望量の鉄を含有するポリペプチド誘導
体が得られることが分かる。
実施例4
回収してリサイクルされる固体マトリックスに支持させ
たトリプシン及びキモトリプシンを使用しても、実施例
1及び実施例2のようにスクシニル化された鉄−ポリペ
プチド誘導体を得ることができる。すなわち、5000
−gの誘導体を水250■lに溶かしたFe5P溶液を
pH8とし、トリプシン及びキモトリプシンが支持され
ている20−1のセファローゼ(Sepharose)
ゲルを含有する円筒状反応器にFe5P溶液をリサイク
ルさせた。
たトリプシン及びキモトリプシンを使用しても、実施例
1及び実施例2のようにスクシニル化された鉄−ポリペ
プチド誘導体を得ることができる。すなわち、5000
−gの誘導体を水250■lに溶かしたFe5P溶液を
pH8とし、トリプシン及びキモトリプシンが支持され
ている20−1のセファローゼ(Sepharose)
ゲルを含有する円筒状反応器にFe5P溶液をリサイク
ルさせた。
この場合、支持されたトリプシンの比活性は4000
U BAEE/100+egセフ 70−ゼであり、キ
モトリプシンの比活性は2000 U ATEE!/1
00■gセファローゼであった。溶液はその粘度が最初
の粘度の1/10に減少するまでリサイクルさせた。
pH3に酸性化してスクシニル化された鉄−ポリペプチ
ド誘導体を回収し、これを実施例1のC)に記載したよ
うに精製した。得られた誘導体は19.5%の鉄を含ん
でいた。
U BAEE/100+egセフ 70−ゼであり、キ
モトリプシンの比活性は2000 U ATEE!/1
00■gセファローゼであった。溶液はその粘度が最初
の粘度の1/10に減少するまでリサイクルさせた。
pH3に酸性化してスクシニル化された鉄−ポリペプチ
ド誘導体を回収し、これを実施例1のC)に記載したよ
うに精製した。得られた誘導体は19.5%の鉄を含ん
でいた。
実施例5
トリプシン−キモトリプシンに代えてパンクレアチン(
他のプロテアーゼの一種)を酵素対基質の比5 : 1
00で使用し以外は実施例2の手順を繰り返した。
他のプロテアーゼの一種)を酵素対基質の比5 : 1
00で使用し以外は実施例2の手順を繰り返した。
14重量%の鉄を含有するスクシニル化鉄−ポリペプチ
ド誘導体が得られた。
ド誘導体が得られた。
実施例6
FeC1,の添加を繰返し、各添加毎にpHを約7に再
調整して鉄含量20%の誘導体を取得する以外は上と同
様な方法で調製されたFaSP試料1000mgを、2
0m1の水に加えて激しく攪拌後、NaOHを加えて最
終pHを7.8の一定にした。得られたゲル状懸濁物を
実施例2と同様に、トリプシン−キモトリプシン混合物
(酵素対基質の比3 : 100)で24時間処理した
。最終的に得られる溶液を塩酸で処理し、沈澱をpH7
で再溶解し、塩酸でpHを3.2にして再沈澱させ、再
びpH7で再溶解させることで精製後、凍結乾燥した0
分析の結果。
調整して鉄含量20%の誘導体を取得する以外は上と同
様な方法で調製されたFaSP試料1000mgを、2
0m1の水に加えて激しく攪拌後、NaOHを加えて最
終pHを7.8の一定にした。得られたゲル状懸濁物を
実施例2と同様に、トリプシン−キモトリプシン混合物
(酵素対基質の比3 : 100)で24時間処理した
。最終的に得られる溶液を塩酸で処理し、沈澱をpH7
で再溶解し、塩酸でpHを3.2にして再沈澱させ、再
びpH7で再溶解させることで精製後、凍結乾燥した0
分析の結果。
この誘導体は36重量%の鉄を含有するスクシニル化ポ
リペプチド誘導体からなるものであった。
リペプチド誘導体からなるものであった。
実施例7
5.6%の鉄を含有するスクシニル化アルブミン試料を
、実施例2に記載した方法で処理した。
、実施例2に記載した方法で処理した。
得られたスクシニル化ポリペプチドコンプレックスを実
施例1のC)に記載した方法で回収、精製した。このコ
ンプレックスは12%の鉄を含有し、pH>5で溶解性
を示した。
施例1のC)に記載した方法で回収、精製した。このコ
ンプレックスは12%の鉄を含有し、pH>5で溶解性
を示した。
実施例8
スクシニル化アルブミンと鉄のコンプレックス(鉄15
%含有)の試料を、実施例4と同様に。
%含有)の試料を、実施例4と同様に。
トリプシン−キモトリプシン混合物で処理した。
25%の鉄を含有し、pH>7で水に溶解するスクシニ
ル化鉄−ポリペブチド誘導体が回収された。
ル化鉄−ポリペブチド誘導体が回収された。
実施例9
カゼイン試料を、Biochim、Biophys、A
cta、29゜578、1958年に記載された方法で
スクシニル化した。この誘導体を30℃で約60分間ト
リプシン及びキモトリプシン(酵素対基質比1:0.2
:100)により加水分解した0反応pHは7〜8とし
、NaOHを連続添加して常にこのpHを維持した0反
応完了後、pHを3.2に調節し、沈澱(出発物質の約
40%)を回収した。この沈澱についてアミノ酸分析を
行ったところ、塩基性及び中性アミノ酸の減少が認めら
れた。
cta、29゜578、1958年に記載された方法で
スクシニル化した。この誘導体を30℃で約60分間ト
リプシン及びキモトリプシン(酵素対基質比1:0.2
:100)により加水分解した0反応pHは7〜8とし
、NaOHを連続添加して常にこのpHを維持した0反
応完了後、pHを3.2に調節し、沈澱(出発物質の約
40%)を回収した。この沈澱についてアミノ酸分析を
行ったところ、塩基性及び中性アミノ酸の減少が認めら
れた。
このポリペプチド誘導体を濃度1g/10m1でNaO
Hに溶解させ(最終pH=7)、pHを7.8の一定に
保持しなからFeCl3溶液(ポリペプチド誘導体1g
当り1.5g)と反応させた。 pHを3.2に酸性化
することで沈澱を生成させ、この沈澱をpH8で再溶解
して未反応の鉄を除去し、8C1で再沈澱させることで
、18.2重量%の鉄を含有し、pH>6.5で水に溶
解するポリペプチド誘導体を得た。
Hに溶解させ(最終pH=7)、pHを7.8の一定に
保持しなからFeCl3溶液(ポリペプチド誘導体1g
当り1.5g)と反応させた。 pHを3.2に酸性化
することで沈澱を生成させ、この沈澱をpH8で再溶解
して未反応の鉄を除去し、8C1で再沈澱させることで
、18.2重量%の鉄を含有し、pH>6.5で水に溶
解するポリペプチド誘導体を得た。
実施例10
3000mgの固体カゼイン(食事用酸カゼイン)をN
aOHと共に水に溶解させて最終容積を50菖lとした
。この溶液にトリプシンを加え(酵素対基質比1:10
0)、混合物を3時間混合した。酸性化でpHを3.4
にすることで加水分解反応を停止□させ、遠心分離で不
溶性残渣を回収した。この残渣をアルカリ媒体(INの
NaOH添加)に溶かし、最終pHを7.6とした。
2NのNaOHを添加してpHを7.6に維持しながら
、無水こはく酸を少しずつ添加した。
aOHと共に水に溶解させて最終容積を50菖lとした
。この溶液にトリプシンを加え(酵素対基質比1:10
0)、混合物を3時間混合した。酸性化でpHを3.4
にすることで加水分解反応を停止□させ、遠心分離で不
溶性残渣を回収した。この残渣をアルカリ媒体(INの
NaOH添加)に溶かし、最終pHを7.6とした。
2NのNaOHを添加してpHを7.6に維持しながら
、無水こはく酸を少しずつ添加した。
反応は室温で約2時間行った0反応媒体を2NのHCI
で酸性化(pH=3.4) L/、遠心分離することで
、反応媒体から生成スクシニル化ポリペプチドを回収し
、再溶解(pH=8)、再沈澱(pH=3.4)及び遠
心分離(毎回上澄みを除去)を繰り返すことで、過剰の
こはく酸を除去した0回収された生成スクシニル化ポリ
ペプチドをNaOHと共に水に溶解した(最終pHは7
.6の一定)、 pH7,6を維持しながら、この溶液
lこFeC1a溶液を、ポリペプチド誘導体1g当り1
.5gの割合で添加した。酸性化によって鉄を含有する
沈澱を生成させ、これを上記の実施例と同様にして精製
し、P)l)6.5で水によく溶けるところの、17.
5%の鉄をスクシニル化ポリペプチド誘導体を得た。
で酸性化(pH=3.4) L/、遠心分離することで
、反応媒体から生成スクシニル化ポリペプチドを回収し
、再溶解(pH=8)、再沈澱(pH=3.4)及び遠
心分離(毎回上澄みを除去)を繰り返すことで、過剰の
こはく酸を除去した0回収された生成スクシニル化ポリ
ペプチドをNaOHと共に水に溶解した(最終pHは7
.6の一定)、 pH7,6を維持しながら、この溶液
lこFeC1a溶液を、ポリペプチド誘導体1g当り1
.5gの割合で添加した。酸性化によって鉄を含有する
沈澱を生成させ、これを上記の実施例と同様にして精製
し、P)l)6.5で水によく溶けるところの、17.
5%の鉄をスクシニル化ポリペプチド誘導体を得た。
実施例11
500mg(1りポIJ IJジ:/ (MV=170
00 D)を上記ノ実施例と同様な方法でスクシニル化
した。但し、ポリリジン対無水こはく酸の重量比は1:
2とした。蒸留水を用いた透析でスクシニル化ポリリジ
ンを精製し、凍結乾燥した。スクシニル化で得られたこ
の誘導体(スクシニル化度80%以上)をFeCl3水
溶液(25s+g/醜1溶液)と反応させた。
00 D)を上記ノ実施例と同様な方法でスクシニル化
した。但し、ポリリジン対無水こはく酸の重量比は1:
2とした。蒸留水を用いた透析でスクシニル化ポリリジ
ンを精製し、凍結乾燥した。スクシニル化で得られたこ
の誘導体(スクシニル化度80%以上)をFeCl3水
溶液(25s+g/醜1溶液)と反応させた。
得られた沈澱から過剰の鉄イオンと塩を透析濾過で除去
することにより、 18重量%の鉄を含有し、水によく
溶ける最終生成物を得た。
することにより、 18重量%の鉄を含有し、水によく
溶ける最終生成物を得た。
実施例12
スクシニル化大豆蛋白質の鉄コンプレックス(鉄含量7
%)を使用した以外は実施例2の方法を繰り返した。こ
れにより16%の鉄を含有するポリペプチド誘導体が得
られたが、このものは出発物質である蛋白質誘導体より
も水によく溶解した。
%)を使用した以外は実施例2の方法を繰り返した。こ
れにより16%の鉄を含有するポリペプチド誘導体が得
られたが、このものは出発物質である蛋白質誘導体より
も水によく溶解した。
スクシニル化 −ポリペプチドの経口 収スクシニル化
鉄−ポリペプチド試料の経口投与による鉄吸収を、ラッ
トで評価した。すなわち、当該誘導体を水溶液の形で、
体重kg当り元素状鉄1mgに相当する投与量にてラッ
トに経口投与し、血清鉄レベルを経時的に測定した。第
2表に示す実験結果は、実施例1の方法で調製された誘
導体で処理したラット(B欄参照)、無処理のラット(
A欄参照)及び出発物質であるところのFaSP (加
水分解前の鉄含量5.2%)を投与したラット(C欄参
照)それぞれについての鉄含量を示している。
鉄−ポリペプチド試料の経口投与による鉄吸収を、ラッ
トで評価した。すなわち、当該誘導体を水溶液の形で、
体重kg当り元素状鉄1mgに相当する投与量にてラッ
トに経口投与し、血清鉄レベルを経時的に測定した。第
2表に示す実験結果は、実施例1の方法で調製された誘
導体で処理したラット(B欄参照)、無処理のラット(
A欄参照)及び出発物質であるところのFaSP (加
水分解前の鉄含量5.2%)を投与したラット(C欄参
照)それぞれについての鉄含量を示している。
第2表
0.5 95 270 320上のデータ
は、スクシニル化鉄−ポリペプチドが対応するFaSP
より効率良く、鉄を血漿サイクルに与えられることを示
している。さらに、本発明によるスクシニル化鉄−ポリ
ペプチドは。
は、スクシニル化鉄−ポリペプチドが対応するFaSP
より効率良く、鉄を血漿サイクルに与えられることを示
している。さらに、本発明によるスクシニル化鉄−ポリ
ペプチドは。
対応するFaSPに比較して、許容性、溶解性及び粘性
に関して優れたものであることも強調できる。
に関して優れたものであることも強調できる。
本発明は含鉄治療(■artial therapy)
に用いる試薬として、スクシニル化鉄−ポリペプチドを
使用することについての工業的な利用にも関係する。従
って、本発明の実質的な目的は、活性成分としてスクシ
ニル化鉄−ポリペプチド(又はその塩)を、予め決めら
れた治療に有効な量で、使用可能な通常の賦形剤と共に
含有する製薬組成物を提供することにもある。そして、
こうした組成物の例としては、単位投与量当り20〜1
60mgの鉄に相当する量で鉄−ポリペプチド(又はそ
の塩)を含有する錠剤、糖衣錠、カプセル、シロップ、
バイアル(vialg)などを挙げることができ、これ
らは1日に1〜2回投与することができる。
に用いる試薬として、スクシニル化鉄−ポリペプチドを
使用することについての工業的な利用にも関係する。従
って、本発明の実質的な目的は、活性成分としてスクシ
ニル化鉄−ポリペプチド(又はその塩)を、予め決めら
れた治療に有効な量で、使用可能な通常の賦形剤と共に
含有する製薬組成物を提供することにもある。そして、
こうした組成物の例としては、単位投与量当り20〜1
60mgの鉄に相当する量で鉄−ポリペプチド(又はそ
の塩)を含有する錠剤、糖衣錠、カプセル、シロップ、
バイアル(vialg)などを挙げることができ、これ
らは1日に1〜2回投与することができる。
特許出願人 イタルファルマコ ニス、ピー、エイ。
手続補正書
昭和63年11月21日
2、発明の名称
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
名 称 イタルファルマコエス、ピー、エイ。
代表者 フランチェスコ デ サンティス4、代理人
東京都千代田区麹町4丁目5番地(〒102)6、補正
の内容 明細書第6頁第1行の「胃十二指腸レベル」を「胃十二
指腸−腸レベル(中性−塩基性pH)Jlと補正する。
の内容 明細書第6頁第1行の「胃十二指腸レベル」を「胃十二
指腸−腸レベル(中性−塩基性pH)Jlと補正する。
以 上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、約6.5より低いpHで水に不溶で、約6.5より
高いpHで水に可溶な鉄−スクシニル化ポリペプチドコ
ンプレックス又は当該コンプレックスとアルカリ金属又
はアルカリ土類金属との塩又は当該コンプレックスと製
薬上許容される有機塩基との塩。 2、鉄を0.1〜45重量%含有する請求項1記載の鉄
コンプレックス。 3、鉄を10〜45重量%含有する請求項1記載の鉄コ
ンプレックス。 4、請求項1〜3記載のコンプレックスを活性成分とし
て含有するヒト及び獣の含鉄治療用製薬組成物。 5、単位投与量当り20〜160mgの鉄が結合したス
クシニル化ポリペプチドコンプレックスを含有する請求
項4記載の製薬組成物。 6、スクシニル化蛋白質と鉄とのコンプレックスを1種
若しくはそれ以上の蛋白質分解酵素で、6〜10の一定
pHに保持しながら温度0〜50℃の条件下に、所望の
鉄含量のスクシニル化ポリペプチドコンプレックスが得
られるまで、酵素で分解し、その生成コンプレックスを
透析濾過及び凍結乾燥によって回収するか、あるいは反
応混合物を不溶物があればこれを濾別後、pH2〜3.
5に酸性化し、得られた沈澱を中性又は塩基性pHで水
性媒体に再溶解し、その水溶液から公知の方法により生
成コンプレックスを回収することからなる鉄−スクシニ
ル化ポリペプチドコンプレックスの調製法。 7、酵素による分解を7.5〜8.5のpH及び20〜
30℃の温度で行う請求項6記載の方法。 8、トリプシン、キモトリプシン及びパンクレアチンか
らなる群から選ばれる酵素を使用して分解を行う請求項
6又は7記載の方法。 9、酵素対基質の重量比を約1:100として酵素によ
る分解を行う請求項6〜8記載のいずれかの方法。 10、pH7〜8で鉄イオンをスクシニル化ポリペプチ
ドと反応させ、得られた沈澱を請求項6記載の方法で単
離する請求項1〜3記載の鉄−スクシニル化ポリペプチ
ドコンプレックスの調製法。 11、スクシニル化蛋白質の酵素による分解で得たスク
シニル化ポリペプチドを使用する請求項10記載の方法
。 12、ポリペプチドのスクシニル化で得たスクシニル化
ポリペプチドを使用する請求項10記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT22276/87A IT1222912B (it) | 1987-10-14 | 1987-10-14 | Derivati polipeptidici a elevato tenore di ferro e altamente solubili atti alla terapia marziale procedimenti di preparazione e loro forme farmaceutiche |
US22276A/87 | 1987-10-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01146900A true JPH01146900A (ja) | 1989-06-08 |
Family
ID=11194046
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63256876A Pending JPH01146900A (ja) | 1987-10-14 | 1988-10-12 | 鉄含量が高い可溶性ポリペプチド誘導体とその製法及びこれを含有する製薬組成物 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0319664A1 (ja) |
JP (1) | JPH01146900A (ja) |
IT (1) | IT1222912B (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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IT1237783B (it) * | 1989-11-16 | 1993-06-17 | Italfarmaco Spa | Derivati di ferro-albumina biodisponibile, loro procedimento di preparazione e relative composizioni farmaceutiche. |
IT1251725B (it) * | 1991-11-04 | 1995-05-23 | Italfarmaco Spa | Composti di ferro biodisponibile con ovotransferrina acilata o suoi derivati di idrolisi acilati |
IT1297022B1 (it) * | 1997-12-24 | 1999-08-03 | Chemi Spa | Complesso di ferro-succinilcaseina, processo per la sua preparazione e composizioni farmaceutiche che lo contengono |
RU2001126394A (ru) * | 1999-03-01 | 2005-01-20 | Сосьете де Продюи Нестле С.А. (CH) | Комплекс для обогащения железом |
US6994876B1 (en) | 1999-03-01 | 2006-02-07 | Nestec S.A. | Iron fortification system |
HUE032746T2 (en) | 2010-06-30 | 2017-10-30 | Italfarmaco Spa | For the preparation of iron (III) succinylcasine and process |
CN102836419B (zh) * | 2012-09-25 | 2014-06-25 | 济川药业集团有限公司 | 一种蛋白琥珀酸铁口服溶液及其制备方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB673063A (en) * | 1947-06-23 | 1952-06-04 | Medical Res Proprietary Ltd | Metallic compounds of amino acids and preparation thereof |
US4167564A (en) * | 1974-09-23 | 1979-09-11 | Albion Laboratories, Inc. | Biological assimilation of metals |
US3969540A (en) * | 1975-09-11 | 1976-07-13 | Albion Laboratories, Inc. | Enzymatically prepared metal proteinates |
US4208405A (en) * | 1977-01-24 | 1980-06-17 | Kelatron Pharmaceutical Division of Intermountain Laboratories Inc. | Trace element composition for iron deficiency anemia |
US4216144A (en) * | 1977-10-20 | 1980-08-05 | Ashmead H H | Soluble iron proteinates |
US4172072A (en) * | 1977-10-20 | 1979-10-23 | Ashmead H H | Buffered enzymatically produced metal proteinates |
IT1150213B (it) * | 1982-03-02 | 1986-12-10 | Italfarmaco Spa | Derivati di ferro biodisponibile esenti da gastrolesivita',procentimento di preparazione e relative composizioni farmaceutiche |
IT1207996B (it) * | 1986-03-18 | 1989-06-01 | Magis Farmaceutici | Composti contenenti ferro biodisponibile, procedimento per la loro preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono. |
-
1987
- 1987-10-14 IT IT22276/87A patent/IT1222912B/it active
-
1988
- 1988-10-06 EP EP88116537A patent/EP0319664A1/en not_active Ceased
- 1988-10-12 JP JP63256876A patent/JPH01146900A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0319664A1 (en) | 1989-06-14 |
IT1222912B (it) | 1990-09-12 |
IT8722276A0 (it) | 1987-10-14 |
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