JPH01144978A - 新規組換えプラスミドpGRF2−15 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、成長ホルモン分泌調節活性を有することが知
られている牛成長ホルモン放出因子(以下、GRFと略
す。)のうち、一番目から29番目迄のペプチドフラグ
メントをカルボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵
素の生産を可能とする新規組換えプラスミドに関するも
のである。
られている牛成長ホルモン放出因子(以下、GRFと略
す。)のうち、一番目から29番目迄のペプチドフラグ
メントをカルボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵
素の生産を可能とする新規組換えプラスミドに関するも
のである。
本発明の新規組換えプラスミドpGRF2−15は、第
1図に示されるDNA配列を有する。
1図に示されるDNA配列を有する。
pGRF2−15およびpGRF2−15を含有する大
腸菌は9発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。
腸菌は9発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。
従来の技術および問題点
本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って興味深い
ポリペプチドを微生物をもちいて生産することが可能に
なった。ポリペプチドに対応する遺伝子であるDNAを
2例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離す
るなどし、その後、これを発現ベクターと呼ばれる適当
なプラスミドなどに朝み込み、その結果得られる組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入い目的遺
伝子を微生物中で発現させ、微生物から目的ポリペプチ
ドを分離精製することが行われている。このような状況
においては、目的ポリペプチド遺伝子を含み、且つ効率
よく発現させる組換えプラスミドを構築することが最も
重要な課題である。また、目的ポリペプチドが異なれば
自ずからその方法論が異なっており、この点が解決しな
ければならない技術課題である。
がある。最近、遺伝子操作技術の進歩に伴って興味深い
ポリペプチドを微生物をもちいて生産することが可能に
なった。ポリペプチドに対応する遺伝子であるDNAを
2例えば生体よりクローニングと呼ばれる方法で分離す
るなどし、その後、これを発現ベクターと呼ばれる適当
なプラスミドなどに朝み込み、その結果得られる組換え
プラスミドを大腸菌などの微生物細胞中に導入い目的遺
伝子を微生物中で発現させ、微生物から目的ポリペプチ
ドを分離精製することが行われている。このような状況
においては、目的ポリペプチド遺伝子を含み、且つ効率
よく発現させる組換えプラスミドを構築することが最も
重要な課題である。また、目的ポリペプチドが異なれば
自ずからその方法論が異なっており、この点が解決しな
ければならない技術課題である。
GRFは生長ホルモンの分泌を促すペプチドである。牛
のGRFは44個のアミノ酸からなり。
のGRFは44個のアミノ酸からなり。
その配列はアミノ末端側からチロシン−アラニン−アス
パラギン酸−アラニン−イソロイシン−フェニルアラニ
ン−トレオニン−アスパラギン−セリン−チロシン−ア
ルギニン−リジン−バリン−ロイシン−グリシン−グル
タミン−ロイシン−セリン−アラニン−アルギニン−リ
ジン−ロイシン−ロイシン−グルタミン−アスパラギン
酸−イソロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−アル
ギニン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタミ
ン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン−グルタ
ミン酸−グルタミン−グリシン−アラニン−リジン−バ
リン−アルギニン−ロイシンであり、カルボキシ末端が
アミド化されている。
パラギン酸−アラニン−イソロイシン−フェニルアラニ
ン−トレオニン−アスパラギン−セリン−チロシン−ア
ルギニン−リジン−バリン−ロイシン−グリシン−グル
タミン−ロイシン−セリン−アラニン−アルギニン−リ
ジン−ロイシン−ロイシン−グルタミン−アスパラギン
酸−イソロイシン−メチオニン−アスパラギン酸−アル
ギニン−グルタミン−グルタミン−グリシン−グルタミ
ン酸−アルギニン−アスパラギン−グルタミン−グルタ
ミン酸−グルタミン−グリシン−アラニン−リジン−バ
リン−アルギニン−ロイシンであり、カルボキシ末端が
アミド化されている。
GRFは、視床下部に存在するが、その含量は少なく、
牛500頭からせいぜい数ミリグラム程度分離精製でき
ればよい方であり、効率のよい生産方法の開発が期待さ
れている。牛GRFとその構造が極めて良く似たヒ)G
RFは、44個のアミノ酸よりなるが、このうち一番目
のチロシンから29番目のアルギニンまでのペプチド部
分く以下。
牛500頭からせいぜい数ミリグラム程度分離精製でき
ればよい方であり、効率のよい生産方法の開発が期待さ
れている。牛GRFとその構造が極めて良く似たヒ)G
RFは、44個のアミノ酸よりなるが、このうち一番目
のチロシンから29番目のアルギニンまでのペプチド部
分く以下。
GRFI−29と示す。)だけでも、GRFの約4分の
1の活性を持つことが報告されている(N、Ling
et al、、 Biochem、 Biophys、
Res、 Commun、。
1の活性を持つことが報告されている(N、Ling
et al、、 Biochem、 Biophys、
Res、 Commun、。
vol、 123. PJl、、854(1984))
。
。
だ組換えプラスミドについては2本発明者らが構築した
pGRF2B−29が公知である(特開昭62−115
287)。しかしながら、pGRF28−29を組み込
んだ大腸菌においては、目的ポリペプチドが発現される
が、その量は非常に少なく2問題である。
pGRF2B−29が公知である(特開昭62−115
287)。しかしながら、pGRF28−29を組み込
んだ大腸菌においては、目的ポリペプチドが発現される
が、その量は非常に少なく2問題である。
一般に2分子ff11万以下のポリペプチドは、大腸菌
などの宿主中で生産させても菌体中のプロテアーゼなど
によって分解されるため安定に細胞内に蓄積されない。
などの宿主中で生産させても菌体中のプロテアーゼなど
によって分解されるため安定に細胞内に蓄積されない。
これは2分子として小さいため安定なコンホメーション
をとれないためであると考えられている。従って、遺伝
子操作を利用してGRFI−29などの短いポリペプチ
ドを生産しようとした場合、融合遺伝子を作成し、融合
タンパク質として発現させることが必要であると考えら
れる。
をとれないためであると考えられている。従って、遺伝
子操作を利用してGRFI−29などの短いポリペプチ
ドを生産しようとした場合、融合遺伝子を作成し、融合
タンパク質として発現させることが必要であると考えら
れる。
発明の目的
本発明の目的は、上記の問題点を解決するために、GR
FI−29の大量生産を可能にする絹換えプラスミドを
開発することにある。また2本発明は、遺伝子操作の手
法を用いてGRFI−29を大量に生産する方法の開発
の一環として行われたものである。
FI−29の大量生産を可能にする絹換えプラスミドを
開発することにある。また2本発明は、遺伝子操作の手
法を用いてGRFI−29を大量に生産する方法の開発
の一環として行われたものである。
本発明者らは、既に本発明者らが(1)大腸菌のDHF
Rを大量に発現する発現プラスミドを構築していること
(特願 昭6O−210813)。
Rを大量に発現する発現プラスミドを構築していること
(特願 昭6O−210813)。
(2)大腸菌のDHFRのカルボキシ末端側の配列を変
化させても、枯草菌のDHFR同様酵素活性が失われな
いこと、(3)大腸菌のDHFRのカルボキシ末端側に
異種ペプチドを融合させることを可能とするプラスミド
ベクターpTP70−1を構築していること(特願 昭
61−312836)、(4) pTP70−1上の改
変DHFRは、大腸菌で効率良く発現すること、を明ら
かにしている。
化させても、枯草菌のDHFR同様酵素活性が失われな
いこと、(3)大腸菌のDHFRのカルボキシ末端側に
異種ペプチドを融合させることを可能とするプラスミド
ベクターpTP70−1を構築していること(特願 昭
61−312836)、(4) pTP70−1上の改
変DHFRは、大腸菌で効率良く発現すること、を明ら
かにしている。
本発明者らがすでに明らかにしている上記の特徴を利用
し、鋭意研究を行った結果、pTP70−1を用いるこ
とにより、DHFR遺伝子の3′末端側にc杖Fix−
29遺伝子を結合し2組換えプラスミドを作成し、これ
を大腸菌に導入し2発現させることにより、DHFRの
カルボキシ末端側にGRF 1−29が結合した融合タ
ンパク質が。
し、鋭意研究を行った結果、pTP70−1を用いるこ
とにより、DHFR遺伝子の3′末端側にc杖Fix−
29遺伝子を結合し2組換えプラスミドを作成し、これ
を大腸菌に導入し2発現させることにより、DHFRの
カルボキシ末端側にGRF 1−29が結合した融合タ
ンパク質が。
大M菌で安定に発現・蓄積することを見いだし。
その知見に従って、pTP70−1にGRFI−29遺
伝子を絹み込んだ組換えプラスミドpGRF2−15を
作成し2本発明を完成させた。
伝子を絹み込んだ組換えプラスミドpGRF2−15を
作成し2本発明を完成させた。
発明の構成
第1図は2本発明の組換えプラスミドpGRF2−15
の全塩基配列を示している。本発明のpGRF2−15
は、4715塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌
にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付与するこ
とができる。pGRF2−15は、 E、coli C
600株に導入されて安定状態に保たれ、pGRF2−
15を含有する[:、 coliC600株は、y&工
研にFERM[3P−1578として寄託されている。
の全塩基配列を示している。本発明のpGRF2−15
は、4715塩基対の大きさであり、宿主である大腸菌
にトリメトプリムおよびアンピシリン耐性を付与するこ
とができる。pGRF2−15は、 E、coli C
600株に導入されて安定状態に保たれ、pGRF2−
15を含有する[:、 coliC600株は、y&工
研にFERM[3P−1578として寄託されている。
pGRF2−15は、pTP70−10BamHI切断
部位に、GRFI−29を暗号化する配列を含む107
塩基対のDNAが挿入した構造である。第1図において
、533番目から639番目迄の配列が挿入された配列
であり、それ以外の配列がpTP70−1の配列と全く
同一である。
部位に、GRFI−29を暗号化する配列を含む107
塩基対のDNAが挿入した構造である。第1図において
、533番目から639番目迄の配列が挿入された配列
であり、それ以外の配列がpTP70−1の配列と全く
同一である。
第1図の57番目から635番目の配列は、pTP70
−1の改変DHFRのカルボキシ末端側にGRFI−2
9がイソロイシン−グルタミン酸−グリシン−アルギニ
ンよりなる4つのアミノ酸よりなる配列を介して結合し
た融合タンパク質(以下、DHFR−GRFI−29と
記す。)を暗号化する。第2図は、DHFR−GRFI
−29を暗号化する部分のDNA配列とそれから作られ
るタンパク質のアミノ酸配列を示している。DHFR−
GRF 1−29は、193アミノ酸よりなるタンパク
質であり、このうちアミノ末端側から数えて、1から1
59番目までの配列が、大腸菌の野生型DHFRに1箇
所アミノ酸置換置換が起こった(Cys−152(wi
ld type) + Glu−152)配列であり、
161から164番目のイソロイシン−グルタミン酸−
グ1ルンーアルギニンの配列は、牛血液凝固因子Xaの
認識切断配列であり、最終的に牛血液凝固因子Xaで処
理することにより、 GRF 1−29ペプチドを切
り出すことを可能とする配列である。160番目の配列
は、pTP70−1のDHFR由来のアミノ酸である。
−1の改変DHFRのカルボキシ末端側にGRFI−2
9がイソロイシン−グルタミン酸−グリシン−アルギニ
ンよりなる4つのアミノ酸よりなる配列を介して結合し
た融合タンパク質(以下、DHFR−GRFI−29と
記す。)を暗号化する。第2図は、DHFR−GRFI
−29を暗号化する部分のDNA配列とそれから作られ
るタンパク質のアミノ酸配列を示している。DHFR−
GRF 1−29は、193アミノ酸よりなるタンパク
質であり、このうちアミノ末端側から数えて、1から1
59番目までの配列が、大腸菌の野生型DHFRに1箇
所アミノ酸置換置換が起こった(Cys−152(wi
ld type) + Glu−152)配列であり、
161から164番目のイソロイシン−グルタミン酸−
グ1ルンーアルギニンの配列は、牛血液凝固因子Xaの
認識切断配列であり、最終的に牛血液凝固因子Xaで処
理することにより、 GRF 1−29ペプチドを切
り出すことを可能とする配列である。160番目の配列
は、pTP70−1のDHFR由来のアミノ酸である。
165から193番目迄がGRFI−29の配列である
。pTP70−1が作る改変DHFRは、162個のア
ミノ酸よりなり、第2図のDHFR−GRFl−29の
アミノ酸配列のうち、アミノ末端側から数えて、1から
160番目までの配列に。
。pTP70−1が作る改変DHFRは、162個のア
ミノ酸よりなり、第2図のDHFR−GRFl−29の
アミノ酸配列のうち、アミノ末端側から数えて、1から
160番目までの配列に。
Gln−11eの2個のアミノ酸配列が結合した配列を
している。
している。
DHFR−GRF 1−29は、 pTP70−1の
改変DHFRのカルボキシ末端側に、GRFI−29が
融合した構造をしているにもかかわらず。
改変DHFRのカルボキシ末端側に、GRFI−29が
融合した構造をしているにもかかわらず。
DHFR酵素活性を有する。このため、大腸菌がDHF
R−GRFl−29を多量につくると。
R−GRFl−29を多量につくると。
DHFRの阻害剤であり、抗m菌剤であるトリメトプリ
ムに対して、耐性を示すようになる。
ムに対して、耐性を示すようになる。
DHFR−GRF 1−29を暗号化する配列の上流に
は、pTP70−1の改変DHFR遺伝子の発現を効率
良く行わせる配列が存在する(特願昭6l−31283
6)。即ち、43番目から50番目までの配列がSD配
列と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、467
4674番目701701番目、コンセンサス転写プロ
モーターであり、効率の良い転写に貢献する。また、
pTP70−1は、抗菌剤であるアンピシリンに対し
て耐性を付与する遺伝子を有しており、その遺伝子の発
現は、pTP70−1のBamHI部位に異種DNAが
挿入されても影響を受けない。このことから、pTP7
0−1のBamHI部位に、 GRFl−29を暗号
化するDNA配列が挿入した構造をしているpGRF2
−15は、大腸菌に導入された場合、多量のDHFR−
GRF 1−29を作る。作られたDHFR−GRFl
−29は、菌体内に可溶性の状態で9面体タンパク質の
15〜20%にいたるまで蓄積する。このことによフて
。
は、pTP70−1の改変DHFR遺伝子の発現を効率
良く行わせる配列が存在する(特願昭6l−31283
6)。即ち、43番目から50番目までの配列がSD配
列と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、467
4674番目701701番目、コンセンサス転写プロ
モーターであり、効率の良い転写に貢献する。また、
pTP70−1は、抗菌剤であるアンピシリンに対し
て耐性を付与する遺伝子を有しており、その遺伝子の発
現は、pTP70−1のBamHI部位に異種DNAが
挿入されても影響を受けない。このことから、pTP7
0−1のBamHI部位に、 GRFl−29を暗号
化するDNA配列が挿入した構造をしているpGRF2
−15は、大腸菌に導入された場合、多量のDHFR−
GRF 1−29を作る。作られたDHFR−GRFl
−29は、菌体内に可溶性の状態で9面体タンパク質の
15〜20%にいたるまで蓄積する。このことによフて
。
pGRF2−15を有する大腸菌はトリメトブリは、p
TP70−1由来のアンピシリン耐性を付与する遺伝子
を有することから、pGRF2−15が導入された大腸
菌は、アンピシリン耐性をも示す。
TP70−1由来のアンピシリン耐性を付与する遺伝子
を有することから、pGRF2−15が導入された大腸
菌は、アンピシリン耐性をも示す。
このような特長を有するpGRF2−15は。
実施例に従って作成することができるが2組換えプラス
ミドの作成方法によって本発明が制限されるものではな
い。
ミドの作成方法によって本発明が制限されるものではな
い。
次に本発明の実施例を示す。
実施例
pGRF2−15の作成
GRF2−15を暗号化するDNAとしては。
すでに本発明者らが構築している。プラスミドpGRF
29−28 (時開 昭82−115287に記載。)
のBclI切断によって得られる107塩基対のDNA
断片(第1図の533から639番目までの配列)を用
いた。
29−28 (時開 昭82−115287に記載。)
のBclI切断によって得られる107塩基対のDNA
断片(第1図の533から639番目までの配列)を用
いた。
dam−株である大腸菌GM33にpGRF29−28
を形質導入し、pGRF28−29を含有するGM33
株から分離したpGRF29−28゜約5μgをBcl
lで切断した後、DNAをフェノール処理するすること
により、共存する酵素タンパク質を変性除去いその後エ
タノールでDNAを沈澱させた。沈澱したDNAを70
%エタノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に
沈澱を乾燥させた。乾燥させたDNAをアガロースゲル
電気泳動用のサンプル用緩衝液に溶解し、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、107塩基対のDNA断片を分離し
たくこれをDNA−1と呼ぶ。)。
を形質導入し、pGRF28−29を含有するGM33
株から分離したpGRF29−28゜約5μgをBcl
lで切断した後、DNAをフェノール処理するすること
により、共存する酵素タンパク質を変性除去いその後エ
タノールでDNAを沈澱させた。沈澱したDNAを70
%エタノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に
沈澱を乾燥させた。乾燥させたDNAをアガロースゲル
電気泳動用のサンプル用緩衝液に溶解し、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、107塩基対のDNA断片を分離し
たくこれをDNA−1と呼ぶ。)。
GRFI−19を暗号化したDNAを組み込むベクター
としては、pTP70−1を用いた(特願 昭61−3
12836)。 約1μgのp’rp70−1を、Ba
mHIで切断した後、アルカリホスファターゼ処理をし
た。アルカリホスファターゼ処理したDNAをフェノー
ル処理することにより、共存する酵素タンパク質を変性
除去し、その後エタノールでDNAを沈澱させた。沈澱
したルを除き、−減圧下に沈澱を乾燥させた。BclI
およびBamHIによるDNAの切断、アガロースゲル
電気泳動、アガロースゲルからのDNAの抽出、アルカ
リホスファターゼ処理、フェノール処理、およびエタノ
ール沈澱の各操作は、いずれも、 ”Mo1ecul
ar C1oninHA Loboratory Ma
nual”(T、Maniatis、 E、F、Fr1
tSCtT+ J、Sambrook、 eds−Co
ld Spring Harbor Laborato
ry (1982)、以下。
としては、pTP70−1を用いた(特願 昭61−3
12836)。 約1μgのp’rp70−1を、Ba
mHIで切断した後、アルカリホスファターゼ処理をし
た。アルカリホスファターゼ処理したDNAをフェノー
ル処理することにより、共存する酵素タンパク質を変性
除去し、その後エタノールでDNAを沈澱させた。沈澱
したルを除き、−減圧下に沈澱を乾燥させた。BclI
およびBamHIによるDNAの切断、アガロースゲル
電気泳動、アガロースゲルからのDNAの抽出、アルカ
リホスファターゼ処理、フェノール処理、およびエタノ
ール沈澱の各操作は、いずれも、 ”Mo1ecul
ar C1oninHA Loboratory Ma
nual”(T、Maniatis、 E、F、Fr1
tSCtT+ J、Sambrook、 eds−Co
ld Spring Harbor Laborato
ry (1982)、以下。
文献1と呼ぶ。)に記載している方法に従って行った。
乾燥させたDNAを50μmのリガーゼ用反応液(10
mM Tris−HCI、 pH7,4,5mM Mg
Cl2.10 mMジチオトレイトール、5 mM A
TP)溶解後、5μmのDNAIを加え、これに1ユニ
ツトのT4−DNAリガーゼを加えて、15°Cで、4
時間DNAの連結反応を行わせた。この反応物を、形質
転換法(transformation method
、上記文献lに記載)に従って、大腸菌に取り込ませた
。この処理をした菌体を、50mg/Iのアンピシリン
ナトリウムおよび2mg/Iのトリメトプリムを含む栄
養寒天培地(培地11中に、2gのグルコース、1gの
リン酸2カリウムr5gのイーストエキス+5gのポリ
ペプトン。
mM Tris−HCI、 pH7,4,5mM Mg
Cl2.10 mMジチオトレイトール、5 mM A
TP)溶解後、5μmのDNAIを加え、これに1ユニ
ツトのT4−DNAリガーゼを加えて、15°Cで、4
時間DNAの連結反応を行わせた。この反応物を、形質
転換法(transformation method
、上記文献lに記載)に従って、大腸菌に取り込ませた
。この処理をした菌体を、50mg/Iのアンピシリン
ナトリウムおよび2mg/Iのトリメトプリムを含む栄
養寒天培地(培地11中に、2gのグルコース、1gの
リン酸2カリウムr5gのイーストエキス+5gのポリ
ペプトン。
158の寒天を含む。)上に塗布し、37’ Cで24
時間培養することにより、約50のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーから適当に20個選び、1
.5mlのYT+Ap培地(培地11中に。
時間培養することにより、約50のコロニーを得ること
ができた。これらのコロニーから適当に20個選び、1
.5mlのYT+Ap培地(培地11中に。
5gのNaC1,5gのイーストエキス、8gのトリプ
トン、50IT1gのアンピシリンナトリウムを含む。
トン、50IT1gのアンピシリンナトリウムを含む。
)で、37’ C,1晩、菌体を培養した。培養液を、
各々エッペンドルフ遠心管にとり、 12,000回転
回転下10分間遠心分雌し、菌体を沈澱として集めた。
各々エッペンドルフ遠心管にとり、 12,000回転
回転下10分間遠心分雌し、菌体を沈澱として集めた。
これに、0.1mlの電気泳動用サンプル調製液(0,
0625M(7)Tris−HCI、 pH6,8,2
$(7)ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、10χの
グリセリン。
0625M(7)Tris−HCI、 pH6,8,2
$(7)ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)、10χの
グリセリン。
5χの2−メルカプトエタノール、 0.001χのブ
ロムフェノールブルーを含む。)を加え、菌体を懸濁し
、これを沸騰水中に5分間保ち、菌体を溶かした。この
処理をしたサンプルを5DS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法(U、に、Lamm1i; Nature。
ロムフェノールブルーを含む。)を加え、菌体を懸濁し
、これを沸騰水中に5分間保ち、菌体を溶かした。この
処理をしたサンプルを5DS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法(U、に、Lamm1i; Nature。
vol、227. p、680−685(1970乃に
従って分析した。
従って分析した。
陽画に同様t4−処理をしたもの、および分子量マーカ
ーとしてラクトアルブミン(分子fi14,200)
、 )リブシンインヒビター(分子fi20,100)
、 )リブシノーゲン(分子量24,000) 、
カルボニックアンヒドラーゼ(分子ff129,000
) 、グリセロアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ
(分子ff136,000) 。
ーとしてラクトアルブミン(分子fi14,200)
、 )リブシンインヒビター(分子fi20,100)
、 )リブシノーゲン(分子量24,000) 、
カルボニックアンヒドラーゼ(分子ff129,000
) 、グリセロアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ
(分子ff136,000) 。
卵アルブミン(分子fit45,000) 、および牛
血清アルブミン(分子ff166.000)を含むサン
プルをポリアクリルアミド濃度の10から20%濃度勾
配ゲルで泳動した。その結果、20個のコロニーのうち
、2個ではpTP70−1のDHFRのバンドが消失し
、それより明らかに分子量が大きくなフたタンパク質(
分子量的24 、000と推定される。)を新たに生産
していること、残りの18個のコロニーは、pTP70
−1のDHFRとほぼ同じ大きさのタンパク質を生産す
ること、pTP70−1のDHFR(分子量18,37
9)は、この条件で分子量的21.000のタンパク質
として泳動することが明らかになった。また、このDH
FR−GRFI−29のタンパク質と考えられるタンパ
ク質のバンドは全タンパク質バンドの約20%程度であ
った。
血清アルブミン(分子ff166.000)を含むサン
プルをポリアクリルアミド濃度の10から20%濃度勾
配ゲルで泳動した。その結果、20個のコロニーのうち
、2個ではpTP70−1のDHFRのバンドが消失し
、それより明らかに分子量が大きくなフたタンパク質(
分子量的24 、000と推定される。)を新たに生産
していること、残りの18個のコロニーは、pTP70
−1のDHFRとほぼ同じ大きさのタンパク質を生産す
ること、pTP70−1のDHFR(分子量18,37
9)は、この条件で分子量的21.000のタンパク質
として泳動することが明らかになった。また、このDH
FR−GRFI−29のタンパク質と考えられるタンパ
ク質のバンドは全タンパク質バンドの約20%程度であ
った。
分子量の大きい新らたなタンパク質を生産するコロニー
のうちから適当に一つ選び、これをYT+Ap培地で培
養し、 Tanakaと−eisblumの方法(T。
のうちから適当に一つ選び、これをYT+Ap培地で培
養し、 Tanakaと−eisblumの方法(T。
Tanaka、 B、Weisblum; J、Bac
teriology、 vol、121゜p、354(
1975))に従って、プラスミドを調製した。
teriology、 vol、121゜p、354(
1975))に従って、プラスミドを調製した。
得られたプラスミドをpGRF2−15と名づけた。p
GRF2−15は、pTP70−1のBamH1部位に
合成りNAが挿入された構造をしているはずであるので
、pGRF2−15をEc。
GRF2−15は、pTP70−1のBamH1部位に
合成りNAが挿入された構造をしているはずであるので
、pGRF2−15をEc。
RIと5allによる切断によって得られる約400ヌ
クレオチド長のDNAについて2M13フアージを用い
たジデオキシ法(J 、Messing;Mehtod
sin Enzymology、 vol、10!、p
、20(1983))に従って塩基配列を決定した。そ
の結果、第1図に示すpGRF2−15の全塩基配列の
471番目から937番目の配列が明らかにされた。
クレオチド長のDNAについて2M13フアージを用い
たジデオキシ法(J 、Messing;Mehtod
sin Enzymology、 vol、10!、p
、20(1983))に従って塩基配列を決定した。そ
の結果、第1図に示すpGRF2−15の全塩基配列の
471番目から937番目の配列が明らかにされた。
pTP70−1の塩基配列は2本発明者らによって明ら
かにされている(特願 昭61−3120−1のEc6
−’RI−5allの配列に間にあるBamHI部位に
、107ヌクレオチドのDNA(GRFl−29を暗号
化する配列)が結合した配列であった。
かにされている(特願 昭61−3120−1のEc6
−’RI−5allの配列に間にあるBamHI部位に
、107ヌクレオチドのDNA(GRFl−29を暗号
化する配列)が結合した配列であった。
また、pGRF2−15のEcoRI−Sal■切断に
よって得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst
l、HindIII、Hpal。
よって得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst
l、HindIII、Hpal。
Aa t I I、 Pvu I I、 Bgl I
I、およびCJarを用いた制限酵素による切断実験
の結果。
I、およびCJarを用いた制限酵素による切断実験
の結果。
pTP70−1のEcoRI−SalI切断によって得
られる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であるこ
とが示された。
られる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であるこ
とが示された。
以上の結果から、pGRF2−15の全塩基配列が第1
図に示した配列であることが明らかである。
図に示した配列であることが明らかである。
発明の効果
上記のように、新規組換えプラスミドpGRF2−15
は、DHFR−GRFI−29を暗号化しており、かつ
pGRF2−15を有する大腸菌は、DHFR−GRF
I−29を大量に蓄積生産する。さらに、生成したDH
FR−GRFl−29は、DHFR酵素活性を示し、精
製を容易に行うことができると考えろる。このような性
質を有することから2本発明の新規組換えプラスミドp
GRF2−15およびそれを有する大腸菌は、DHFR
−GRFI−29の生産、およびそれを利用したGRF
I−29の生産に有益である。
は、DHFR−GRFI−29を暗号化しており、かつ
pGRF2−15を有する大腸菌は、DHFR−GRF
I−29を大量に蓄積生産する。さらに、生成したDH
FR−GRFl−29は、DHFR酵素活性を示し、精
製を容易に行うことができると考えろる。このような性
質を有することから2本発明の新規組換えプラスミドp
GRF2−15およびそれを有する大腸菌は、DHFR
−GRFI−29の生産、およびそれを利用したGRF
I−29の生産に有益である。
第1図は、pGRF2−15の全塩基配列を示した図で
あり、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、
5′末端から32末端の方向に記述している。図中符号
は、核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを
、Gはグアニンを。 Tはチミンを示している。図中番号は、pGRF2−1
5に2箇所存在する制限酵素C1al切断認識部位のう
ち制限酵素HindIII切断部位に近い方のC1al
切断認識部位の、5’ −ATCGAT−−3−’、の
最初の”A”を1番として数えた番号を示し+いる。 第2図は、pGRF2−15中に存在するDHFR−G
RF 1−29を暗号化する部分の塩基配列およびタン
パク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核
酸塩基およびアミノ酸を表し。 Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、T
はチミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、 Aspはアスパラギン
酸を、Cysはシスティンを。 Ginはグルタミンを、Gluはグルタミン酸を。 Glyはグリシンを、)(isはヒスチジンを、Ile
はイソロイシンを、Leuはロイシンを、Lysはリジ
ンを、Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニ
ンを、Proはプロリンを、Serはセリンを、Thr
はトレオニンを、Trpはトリプトファンを、Tyrは
チロシンを、 Valはバリンを示している。図中番
号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗合化する
ATGコドンの”A”を1番として数えた番号を示して
いATCGATGTTA ACAGATCTAA GC
TTAACTAAACTTCCATGA TCAGTC
TGAT TGCGGCGTTAllo
120 130CATGGAAAACGCC
ATGCCGT GGAACCTGCCAACGCAA
CACCTTAAATAAA CCCGTGATTAT
CAATCGGTCGTCCGTTGCCAGGACG
CAAAACCGGGTACG GACGATCGCG
TAACGTGGGTTCGCGGCGTG TGG
TGACGTA CCAGAAATCAGTTTATG
AACAGTTCTTGCCAAAAGCGCAACT
AACTCCGG AAAAGGAGGAGCGGTA
GATCGCGTTATCGGTGCCGATCTCG
CCTGGTTTATGGGCCGCCA TACCT
GGGAAAATATTATCCTCAGCAGTCA
GAAGTCGGTG GATGAAGCCATGGT
GATTGG CGGCGGTCGCAAACTGTA
TCTGACGCATATCGACGCAGAA GT
GGAAGGCG ACACCCATTTACTGGG
AATCGGTATTCAGCGAATTCCACGC
ACAGCTATG AGTTCGAAAT TCTG
GAGCGGCGCTGATGCT ATCTTCA
CCA ACTCG丁ACCGCGGCTCGTAA
ACTGCTGCAG GATATCATGAAAT
CGATGAT CCTCTACGCCGGACGCA
TCGACAGGTGCGG TTGCTGGCGCC
TATATCGCCTCGGGCTCGCCACTTC
GGGCTCATGAGCGC第 1 図 Q7− CCCGGATTACGAGCCGGATGATGCT
GATGCGCAGAACTCTCGGATCATCG
AAGGTCGTTATAAAGTTCTG GGT
CAGCTGTACCGTTAATG ATCCAGA
TCTTGGCCGGCAT CACCGGCGCCG
ACATCACCG ATGGGGAAGAの 1 TGGCAGGCCCGTGGCCGGGG GACT
GTTGGGCATTCCTTGCGGCGGCGGT
G CTCAACGGCCTTCCTAATGCAGG
AGTCGCA TAAGGGAGAGAGCCTTC
AACCCAGTCAGCT CCTTCCGGTGl
olo 1020 1030TCG
CCGCACT TATGACTGTCTTCTTTA
TCACCGGCAGCGCTCTGGGTCAT T
TTCGGCGAGlllo 1120
1130GACGATGATCGGCCTGTC
GCTTGCGGTATTCTCAAGCCTT CG
TCACTGGT CCCGCCACCAlつIn
1つつ0 1つつnCGCCA
TCTCCTTGCATGCACTCAACCTACT
ACTGGGCTGCCGTCGACCGA TGC
CCTTGAGGGCGCGGGGCATGACTAT
CGTGCAACTCGT AGGACAGGTGGA
CCGCTTTCGCTGGAGCGCCGGAATC
TTG CACGCCCTCGAACGTTTCGG
CGAGAAGCAG19An 1りr:%
n 謬ムーvILLuILJυ GCCATTATCG CCGGCATGGCGGCC
GACGCGGTTCGCGACG CGAGGCTG
GA TGGCCTTCCCCCGGCGGCAT C
GGGATGCCCGCGTTGCAGGGATGAC
GACCATCAGGGACA GCTTCAAGGA
CCTAACTTCG ATCACTGGACCGCT
GATCGT・CGGCGAGCACATGGAACG
GG TTGGCATGGACTTGTCTGCCTC
CCCGCGTT GCGTCGCGGT・第 l
図 CTGGGCTACG TCTTGCTGGCCATT
ATGATT CTTCTCGCTTCCATGCTG
TCCAGGCAGGTATCGCTCGCGG CT
CTTACCAGCACGGCGATT TATGCC
GCCTTTGTAGGCGCCGCCCTATACG
CATGGAGCCGGGCCACCTCの 2 AATTGGAGCCAATCAATTCT TGCG
GAGAAC“CTTGGCAGAA CATATCC
ATCGCGTCCGCCA ’CGCATCTCGG
GCAGCGTTGG GTCCTGGCCA +C
CTGTCGTTG AGGACCCGGCTAGGC
TGGCG (AGAATGAATCACCGATAC
GCGAGCGAACGT +ACGTCTGCGA
CCTGAGCAACAACATGAATG’<GTA
AAGTCTG GAAACGCGGA AGTCAG
CGCC1TCTGCATCGCAGGATGCTGC
TGGCTACCCT (7nln ’)
n’;’n ’)O30rGTGAATG
cG CAAACCAACCrCTCCAGCAG C
CGCACGCGG:GGGTGCGCA TGATC
GTGCTEGGTTGCCTT ACTGGTTAG
CEAAGCGACTG CTGCTGCAAA3TC
TTCGGTT TCCGTGTTTC:l:TGCA
CCATT ATGTTCCGGAETGGAACAC
CTACATCTGTATTAACGAAGCGCTG
GCATTG ACCCTGAGTG 7CATCCA
TACCGCCAGTTGTT TACCCTCACA
ノGTTCATCATCAGTAACCCGT ATC
GTGAGCA ”ATCATTACCCCCATGA
ACAG AAATTCCCCC−ACCAAACAG
G AAAAAACCGCCCTTAACATG (G
ACATTAACG CTTCTGGAGA AACT
CAACGA (CAGACATCTG TGAATC
GCTT CACGACCACG 1第 l 図 へTTTTTCTCT GGTCCCGCCGへCG
TTCCAGT AACCGGGCATrCCTCT
CTCG TTTCATCGGTrTACACGGAG
GCATCAAGTG3CCCGCTTTA TCA
GAAGCCA3CTGGACGCG GATGAAC
AGGCTGATGAGCT TTACCGCAGCの
3 CCCGGAGACG GTCACAGCTT GTC
TGTAAGCCCCGTCAGGG CGCGTCA
GCG GGTGTTGGCGACCCAGTCACG
TAGCGATAG CGGAGTGTATTCAGA
GCAGA TTGTACTGAG AGTGCACC
ATCAGATGCGTA AGGAGAAAAT A
CCGCATCAGTCACTGACTCGCTGCG
CTCG GTCGTTCGGCCACTCAAAGG
CGGTAATACG GTTATCCACAAAA
GAACATG TGAGCAAAAG GCCAGC
AAAA’)Qln ’)Q’)n
’)Q’2nGGATGCCGGG AGC
AGACAAGGGTGTCGGGG CGCAGCC
ATGACTGGCTTAA CTATGCGGCAA
TGCGGTGTG AAATACCGCAGCGCT
CTTCCGCTTCCTCGCTGCGGCGAGC
GGTATCAGCTGAATCAGGGG ATAA
CGCAGGGGCCAGGAACCGTAAAAAG
G2只71n 2只へn CCGCGTTGCT GGCGTTTTTCCATA
GGCTCCAAAAATCGACGCTCAAGTC
A GAGGTGGCGAATACCAGGCG TT
TCCCCCTG GAAGI:l、TCCCTCCC
TGCCGCT TACCGGATACCTGTCCG
CCTGCGCTTTCTCAATGCTCACG C
TGTAGGTATTCGCTCCAAG CTGGG
CTGTG TGCACGAACCGCGCCTTAT
CCGGTAACTAT CGTCTTGAGT第
1 図 の GCCCCCCTGA CGAGCATCACAACC
CGACAG GACTATAAAGCGTGCGCT
CT CCTGTTCCGATTCTCCCTTCGG
GAAGCGTGCTCAGTTCGG TGTAGG
TCGTCCCCGTTCAG CCCGACCGCT
CCAACCCGGT AAGACACGACAGGA
TTAGCA GAGCGAGGTATGTAGGCG
GT GCTACAGAGT TCTTGAAGTGC
TAGAAGGACAGTATTTGGT ATCTG
CGCTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCT
CTTGATCCGGCCGGTGGTTTT TTT
GTTTGCA AGCAGCAGATCTCAAGA
AGA TCCTTTGATCTTTTCTACGGG
AAAACTCACGTTAAGGGAT TTTGG
TCATGCACCTAGATCCTTTTAAATT
AAAAATGAAGTATATGAGTA AAC
TTGGTCT GACAGTTACC。 GTGGCCTAACTACGGCTACATGCTG
AAGCC−AGTTACCTTCAAACAAACC
A CCGCTGGTAGTACGCGCAGA AA
AAAAGGAT3440 3450 、
あり、2本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけを、
5′末端から32末端の方向に記述している。図中符号
は、核酸塩基を表し、Aはアデニンを、Cはシトシンを
、Gはグアニンを。 Tはチミンを示している。図中番号は、pGRF2−1
5に2箇所存在する制限酵素C1al切断認識部位のう
ち制限酵素HindIII切断部位に近い方のC1al
切断認識部位の、5’ −ATCGAT−−3−’、の
最初の”A”を1番として数えた番号を示し+いる。 第2図は、pGRF2−15中に存在するDHFR−G
RF 1−29を暗号化する部分の塩基配列およびタン
パク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核
酸塩基およびアミノ酸を表し。 Aはアデニンを、Cはシトシンを、Gはグアニンを、T
はチミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギニン
を、Asnはアスパラギンを、 Aspはアスパラギン
酸を、Cysはシスティンを。 Ginはグルタミンを、Gluはグルタミン酸を。 Glyはグリシンを、)(isはヒスチジンを、Ile
はイソロイシンを、Leuはロイシンを、Lysはリジ
ンを、Metはメチオニンを、Pheはフェニルアラニ
ンを、Proはプロリンを、Serはセリンを、Thr
はトレオニンを、Trpはトリプトファンを、Tyrは
チロシンを、 Valはバリンを示している。図中番
号は、1番目のアミノ酸であるメチオニンを暗合化する
ATGコドンの”A”を1番として数えた番号を示して
いATCGATGTTA ACAGATCTAA GC
TTAACTAAACTTCCATGA TCAGTC
TGAT TGCGGCGTTAllo
120 130CATGGAAAACGCC
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CAATCGGTCGTCCGTTGCCAGGACG
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AACAGTTCTTGCCAAAAGCGCAACT
AACTCCGG AAAAGGAGGAGCGGTA
GATCGCGTTATCGGTGCCGATCTCG
CCTGGTTTATGGGCCGCCA TACCT
GGGAAAATATTATCCTCAGCAGTCA
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GGAAGGCG ACACCCATTTACTGGG
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CCA ACTCG丁ACCGCGGCTCGTAA
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GGGCTCATGAGCGC第 1 図 Q7− CCCGGATTACGAGCCGGATGATGCT
GATGCGCAGAACTCTCGGATCATCG
AAGGTCGTTATAAAGTTCTG GGT
CAGCTGTACCGTTAATG ATCCAGA
TCTTGGCCGGCAT CACCGGCGCCG
ACATCACCG ATGGGGAAGAの 1 TGGCAGGCCCGTGGCCGGGG GACT
GTTGGGCATTCCTTGCGGCGGCGGT
G CTCAACGGCCTTCCTAATGCAGG
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CCGCACT TATGACTGTCTTCTTTA
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1130GACGATGATCGGCCTGTC
GCTTGCGGTATTCTCAAGCCTT CG
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TCTCCTTGCATGCACTCAACCTACT
ACTGGGCTGCCGTCGACCGA TGC
CCTTGAGGGCGCGGGGCATGACTAT
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TTG CACGCCCTCGAACGTTTCGG
CGAGAAGCAG19An 1りr:%
n 謬ムーvILLuILJυ GCCATTATCG CCGGCATGGCGGCC
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GA TGGCCTTCCCCCGGCGGCAT C
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GACCATCAGGGACA GCTTCAAGGA
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GATCGT・CGGCGAGCACATGGAACG
GG TTGGCATGGACTTGTCTGCCTC
CCCGCGTT GCGTCGCGGT・第 l
図 CTGGGCTACG TCTTGCTGGCCATT
ATGATT CTTCTCGCTTCCATGCTG
TCCAGGCAGGTATCGCTCGCGG CT
CTTACCAGCACGGCGATT TATGCC
GCCTTTGTAGGCGCCGCCCTATACG
CATGGAGCCGGGCCACCTCの 2 AATTGGAGCCAATCAATTCT TGCG
GAGAAC“CTTGGCAGAA CATATCC
ATCGCGTCCGCCA ’CGCATCTCGG
GCAGCGTTGG GTCCTGGCCA +C
CTGTCGTTG AGGACCCGGCTAGGC
TGGCG (AGAATGAATCACCGATAC
GCGAGCGAACGT +ACGTCTGCGA
CCTGAGCAACAACATGAATG’<GTA
AAGTCTG GAAACGCGGA AGTCAG
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n’;’n ’)O30rGTGAATG
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GTGCTEGGTTGCCTT ACTGGTTAG
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GCATTG ACCCTGAGTG 7CATCCA
TACCGCCAGTTGTT TACCCTCACA
ノGTTCATCATCAGTAACCCGT ATC
GTGAGCA ”ATCATTACCCCCATGA
ACAG AAATTCCCCC−ACCAAACAG
G AAAAAACCGCCCTTAACATG (G
ACATTAACG CTTCTGGAGA AACT
CAACGA (CAGACATCTG TGAATC
GCTT CACGACCACG 1第 l 図 へTTTTTCTCT GGTCCCGCCGへCG
TTCCAGT AACCGGGCATrCCTCT
CTCG TTTCATCGGTrTACACGGAG
GCATCAAGTG3CCCGCTTTA TCA
GAAGCCA3CTGGACGCG GATGAAC
AGGCTGATGAGCT TTACCGCAGCの
3 CCCGGAGACG GTCACAGCTT GTC
TGTAAGCCCCGTCAGGG CGCGTCA
GCG GGTGTTGGCGACCCAGTCACG
TAGCGATAG CGGAGTGTATTCAGA
GCAGA TTGTACTGAG AGTGCACC
ATCAGATGCGTA AGGAGAAAAT A
CCGCATCAGTCACTGACTCGCTGCG
CTCG GTCGTTCGGCCACTCAAAGG
CGGTAATACG GTTATCCACAAAA
GAACATG TGAGCAAAAG GCCAGC
AAAA’)Qln ’)Q’)n
’)Q’2nGGATGCCGGG AGC
AGACAAGGGTGTCGGGG CGCAGCC
ATGACTGGCTTAA CTATGCGGCAA
TGCGGTGTG AAATACCGCAGCGCT
CTTCCGCTTCCTCGCTGCGGCGAGC
GGTATCAGCTGAATCAGGGG ATAA
CGCAGGGGCCAGGAACCGTAAAAAG
G2只71n 2只へn CCGCGTTGCT GGCGTTTTTCCATA
GGCTCCAAAAATCGACGCTCAAGTC
A GAGGTGGCGAATACCAGGCG TT
TCCCCCTG GAAGI:l、TCCCTCCC
TGCCGCT TACCGGATACCTGTCCG
CCTGCGCTTTCTCAATGCTCACG C
TGTAGGTATTCGCTCCAAG CTGGG
CTGTG TGCACGAACCGCGCCTTAT
CCGGTAACTAT CGTCTTGAGT第
1 図 の GCCCCCCTGA CGAGCATCACAACC
CGACAG GACTATAAAGCGTGCGCT
CT CCTGTTCCGATTCTCCCTTCGG
GAAGCGTGCTCAGTTCGG TGTAGG
TCGTCCCCGTTCAG CCCGACCGCT
CCAACCCGGT AAGACACGACAGGA
TTAGCA GAGCGAGGTATGTAGGCG
GT GCTACAGAGT TCTTGAAGTGC
TAGAAGGACAGTATTTGGT ATCTG
CGCTCGGAAAAAGAG TTGGTAGCT
CTTGATCCGGCCGGTGGTTTT TTT
GTTTGCA AGCAGCAGATCTCAAGA
AGA TCCTTTGATCTTTTCTACGGG
AAAACTCACGTTAAGGGAT TTTGG
TCATGCACCTAGATCCTTTTAAATT
AAAAATGAAGTATATGAGTA AAC
TTGGTCT GACAGTTACC。 GTGGCCTAACTACGGCTACATGCTG
AAGCC−AGTTACCTTCAAACAAACC
A CCGCTGGTAGTACGCGCAGA AA
AAAAGGAT3440 3450 、
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
ことができ、トリメトプリム耐性を付与する遺伝子が大
腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子の3′末端側の配列
が改変されたことによりジヒドロ葉酸還元酵素−牛成長
ホルモン放出因子の1番目から29番目までのペプチド
フラグメントを含む融合タンパク質を暗号化し、471
5塩基対の大きさを有し、第1図において示されるDN
A配列を有する新規組換えプラスミドpGRF2−15
。 2、特許請求範囲第1項記載の新規組換えプラスミドp
GRF2−15を含有するE.coliC600株。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30215687A JPH01144978A (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 新規組換えプラスミドpGRF2−15 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30215687A JPH01144978A (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 新規組換えプラスミドpGRF2−15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01144978A true JPH01144978A (ja) | 1989-06-07 |
JPH0371113B2 JPH0371113B2 (ja) | 1991-11-12 |
Family
ID=17905589
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP30215687A Granted JPH01144978A (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 新規組換えプラスミドpGRF2−15 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01144978A (ja) |
-
1987
- 1987-11-30 JP JP30215687A patent/JPH01144978A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0371113B2 (ja) | 1991-11-12 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |