JPH01105160A - 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット - Google Patents
異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキットInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、生体内又は輸液等に存在する形質転換細胞に
対し、異常応答を起こしているリンパ球の検出方法並び
にこれに利用される検出試薬及び検出用キットに関する
。
対し、異常応答を起こしているリンパ球の検出方法並び
にこれに利用される検出試薬及び検出用キットに関する
。
生体内細胞が何らかの原因によフて形質転換された場合
、重篤な疾患が引き起こされることが知られている0例
えば癌遺伝子により形質転換された組繊細胞は癌細胞と
なって癌を惹起し、また、HIVウィルスにより形質転
換されたT4細胞は後天性免疫不全症候群(AIDS)
の原因となる。更に、肝炎もウィルスにより肝細胞が形
質転換されることが原因とされている。
、重篤な疾患が引き起こされることが知られている0例
えば癌遺伝子により形質転換された組繊細胞は癌細胞と
なって癌を惹起し、また、HIVウィルスにより形質転
換されたT4細胞は後天性免疫不全症候群(AIDS)
の原因となる。更に、肝炎もウィルスにより肝細胞が形
質転換されることが原因とされている。
従って、生体内に存在する形質転換細胞の存在及びその
量を測定することは、上記疾病及びその進行程度を判断
する上で極めて重要なことである。
量を測定することは、上記疾病及びその進行程度を判断
する上で極めて重要なことである。
しかしながら、従来、これら形質転換細胞の存在により
て生じる疾病の診断は、それぞれの疾病に起因する特有
の変化を生化学的、血液学的若しくは免疫学的に検出す
ることにより行われており、疾病の早期の段階では診断
が難しい場合も多く、また進行程度が判断しにくいとい
う欠点があった。更に各疾病毎にその診断に適した試薬
を準備しなければならないという問題点もあフな。
て生じる疾病の診断は、それぞれの疾病に起因する特有
の変化を生化学的、血液学的若しくは免疫学的に検出す
ることにより行われており、疾病の早期の段階では診断
が難しい場合も多く、また進行程度が判断しにくいとい
う欠点があった。更に各疾病毎にその診断に適した試薬
を準備しなければならないという問題点もあフな。
本発明者等は、癌やウィルス感染による各疾病を早期に
検出、診断する方法を開発すべく鋭意研究を行っていた
ところ、形質転換された細胞の存在下において異常応答
を起こしているリンパ球には共通の特徴があることを見
出した。
検出、診断する方法を開発すべく鋭意研究を行っていた
ところ、形質転換された細胞の存在下において異常応答
を起こしているリンパ球には共通の特徴があることを見
出した。
すなわち、本発明者等の研究によれば、HrVに感染し
たT細胞には、癌細胞において表現されている糖鎖の一
つが表現されていること、更に、この糖鎖は、これら形
質転換細胞に対し異常応答しているリンパ球にも表現さ
れていることを見出した。そして、異常応答リンパ球上
の糖鎖の表現は形質転換細胞より強く、このリンパ球上
の*t*を検出することにより、該リンパ球が形質転換
細胞に対し異常応答を起こしていることが容易に判断で
きる事を見出した。
たT細胞には、癌細胞において表現されている糖鎖の一
つが表現されていること、更に、この糖鎖は、これら形
質転換細胞に対し異常応答しているリンパ球にも表現さ
れていることを見出した。そして、異常応答リンパ球上
の糖鎖の表現は形質転換細胞より強く、このリンパ球上
の*t*を検出することにより、該リンパ球が形質転換
細胞に対し異常応答を起こしていることが容易に判断で
きる事を見出した。
従って本発明は、リンパ球を含有する検体に次の式(I
) Fuc a 1−b2Gauβ1 →4GAcNAcβ
1=3Gaiβ1 ”4Gj!cβ1−+ICert
(I) Fucα1 で示される糖鎖を認識する抗体を作用させ、この抗体と
結合したリンパ球を検出することを特徴とする形質転換
細胞による異常応答リンパ球の検出方法並びに当該方法
に用いる試薬及びキットを提供するものである。
) Fuc a 1−b2Gauβ1 →4GAcNAcβ
1=3Gaiβ1 ”4Gj!cβ1−+ICert
(I) Fucα1 で示される糖鎖を認識する抗体を作用させ、この抗体と
結合したリンパ球を検出することを特徴とする形質転換
細胞による異常応答リンパ球の検出方法並びに当該方法
に用いる試薬及びキットを提供するものである。
本発明の抗体が特異的に認識する糖鎖(I)はり、?抗
原として公知のものであり(Hakomori。
原として公知のものであり(Hakomori。
S、、 Nudelman、 E、、 Levery、
S、B、、 and Kan−nagi、 R,:
J、Biol、Chem、、 259.4872〜46
80゜1984) 、従って、本発明で用いる抗体とし
て例えば常法によって、動物をり、Y抗原で免疫し、該
動物の抗体産生1m胞から細胞融合の手段によってバイ
プリドーマを得、これから製造したモノクローナル抗体
を利用することもできる。また、本発明の抗体は粗製抗
体液、即ち、例えばり、″′抗体産生バイプリドーマ培
養上清液、あるいはマウス腹水のまま使用することもで
きるし、さらには硫酸アンモニウム分画やイオン交換ク
ロマトグラフィー、あるいはプロティンAや抗原カラム
などによるアフィニティクロマトグラフィーにより精製
して使用することも可能である。
S、B、、 and Kan−nagi、 R,:
J、Biol、Chem、、 259.4872〜46
80゜1984) 、従って、本発明で用いる抗体とし
て例えば常法によって、動物をり、Y抗原で免疫し、該
動物の抗体産生1m胞から細胞融合の手段によってバイ
プリドーマを得、これから製造したモノクローナル抗体
を利用することもできる。また、本発明の抗体は粗製抗
体液、即ち、例えばり、″′抗体産生バイプリドーマ培
養上清液、あるいはマウス腹水のまま使用することもで
きるし、さらには硫酸アンモニウム分画やイオン交換ク
ロマトグラフィー、あるいはプロティンAや抗原カラム
などによるアフィニティクロマトグラフィーにより精製
して使用することも可能である。
容易に入手できる抗体の一例としてはBM−1として既
に公知の抗体(Abe、 K、、 Mckibbin。
に公知の抗体(Abe、 K、、 Mckibbin。
J、M、、 and Hakomori、 S、: J
、Biol、Chem、、258゜11793〜117
97.1983)が挙げられる。
、Biol、Chem、、258゜11793〜117
97.1983)が挙げられる。
リンパ球を含有する検体としては、例えば血液、細胞組
織液、リンパ液、腹水、羊水、髄液等を使用することが
できる。血液を使用する場合は、血液0.1〜10mj
2を採取し、通常血清、血漿、またはリンパ液として使
用するのが好ましい。
織液、リンパ液、腹水、羊水、髄液等を使用することが
できる。血液を使用する場合は、血液0.1〜10mj
2を採取し、通常血清、血漿、またはリンパ液として使
用するのが好ましい。
本発明方法において、前記抗体と結合したリンパ球は、
公知の方法により検出することができる。例えば、通常
の免疫学的測定方法である競合法によるラジオイムノア
ッセイ法(RIA)、酵素免疫測定法(ErA)、また
は蛍光抗体法(FAT)により行うのが好ましい。これ
ら方法の操作、手順も通常の方法によって実施すること
ができる。より具体的には、通常の方法によって検体か
らT細胞を分離し、これをスライドに塗布し、この上に
本発明の抗体を滴下し、洗浄後、蛍光法、あるいは酵素
法により二次抗体で染色する方法が挙げられる。
公知の方法により検出することができる。例えば、通常
の免疫学的測定方法である競合法によるラジオイムノア
ッセイ法(RIA)、酵素免疫測定法(ErA)、また
は蛍光抗体法(FAT)により行うのが好ましい。これ
ら方法の操作、手順も通常の方法によって実施すること
ができる。より具体的には、通常の方法によって検体か
らT細胞を分離し、これをスライドに塗布し、この上に
本発明の抗体を滴下し、洗浄後、蛍光法、あるいは酵素
法により二次抗体で染色する方法が挙げられる。
更に血清、血漿に存在し、生体細胞を形質転換せしめる
ウィルス等の検出法としては、培養株化T細胞(H−9
、TALL−1)を被検血清または血漿に晒し、血清ま
たは血漿に存在するウィルス等を感染せしめ、上記同様
にして被検血清または血漿中に存在するウィルス等を検
出することができる。
ウィルス等の検出法としては、培養株化T細胞(H−9
、TALL−1)を被検血清または血漿に晒し、血清ま
たは血漿に存在するウィルス等を感染せしめ、上記同様
にして被検血清または血漿中に存在するウィルス等を検
出することができる。
本発明抗体に標識として酵素をつける方法は蛋白質・核
酸・酵素、且、 (11) 、1007〜1013゜(
1975)に記載の方法に準じて行えばよい。抗体に蛍
光標識をつける方法には基礎生化学実験法6(生化学的
測定)、167頁に記載の方法に準じて行えばよい。こ
こで使用される二次抗体は抗体と結合力を持つ抗体であ
れば何でもよい。
酸・酵素、且、 (11) 、1007〜1013゜(
1975)に記載の方法に準じて行えばよい。抗体に蛍
光標識をつける方法には基礎生化学実験法6(生化学的
測定)、167頁に記載の方法に準じて行えばよい。こ
こで使用される二次抗体は抗体と結合力を持つ抗体であ
れば何でもよい。
例えば、キットに使用する一次抗体としての抗体で、ウ
サギ、ヤギ、マウスなど人以外の動物を免疫して血清や
腹水から得ることもできるし、各アイソタイプごとに、
前記の抗体に特異的に結合する抗体を購入して使用する
ことも可能である。また酵素標識あるいは蛍光標識のつ
いた二次抗体は上記方法で作成してもよいし、市販のも
のを購入してもよい。酵素基質液は抗体に担持された酵
素の種類によって適宜選択される。すなわち酵素がホー
スラデイツシュペルオキシダーゼであれば、3’ 、3
’ −ジアミノベンジチン溶液、9−アミノ−9−エチ
ルカルバミゾール溶液など、アルカリフォスファターゼ
であれば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフ
ォスフェートP−トルイジン塩溶液などである。
サギ、ヤギ、マウスなど人以外の動物を免疫して血清や
腹水から得ることもできるし、各アイソタイプごとに、
前記の抗体に特異的に結合する抗体を購入して使用する
ことも可能である。また酵素標識あるいは蛍光標識のつ
いた二次抗体は上記方法で作成してもよいし、市販のも
のを購入してもよい。酵素基質液は抗体に担持された酵
素の種類によって適宜選択される。すなわち酵素がホー
スラデイツシュペルオキシダーゼであれば、3’ 、3
’ −ジアミノベンジチン溶液、9−アミノ−9−エチ
ルカルバミゾール溶液など、アルカリフォスファターゼ
であれば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフ
ォスフェートP−トルイジン塩溶液などである。
発色剤も酵素によって適宜選択され、酵素がホースラデ
イツシュペルオキシダーゼであれば、5−アミノサリシ
リックアシッド、o−フェニレンジアミンなど、アルカ
リフォスファターゼであれば、p−ニトロフェニルフォ
スフェートなどである。
イツシュペルオキシダーゼであれば、5−アミノサリシ
リックアシッド、o−フェニレンジアミンなど、アルカ
リフォスファターゼであれば、p−ニトロフェニルフォ
スフェートなどである。
直接法は抗体自体を蛍光標識あるいは酵素標識し、これ
を用いるもので、二次抗体を用いる間接法に比べ染色の
ステップが少なくてすむが、バックグランドが高いとい
う欠点もある。
を用いるもので、二次抗体を用いる間接法に比べ染色の
ステップが少なくてすむが、バックグランドが高いとい
う欠点もある。
蛍光標識を用いる蛍光抗体法はステップが少なく簡便で
ある。
ある。
本発明方法は、式(I)のW娘を特異的に認識する抗体
を含有する試薬を用いることにより容易に実施されるが
、更に(1)蛍光標識をつけた本発明の抗体からなる直
接蛍光抗体法のキット、(2)本発明の抗体と該抗体と
結合し得る蛍光標識を担持する二次抗体からなる間接蛍
光抗体法のキット、(3)酵素標識をつけた本発明抗体
からなる直接酵素抗体法用のキット、及び(4)本発明
抗体と該抗体と結合し得る酵素標識を担持する二次抗体
からなる間接酵素抗体法用のキット等を利用することに
より、より容易かつ簡便に実施することができる。
を含有する試薬を用いることにより容易に実施されるが
、更に(1)蛍光標識をつけた本発明の抗体からなる直
接蛍光抗体法のキット、(2)本発明の抗体と該抗体と
結合し得る蛍光標識を担持する二次抗体からなる間接蛍
光抗体法のキット、(3)酵素標識をつけた本発明抗体
からなる直接酵素抗体法用のキット、及び(4)本発明
抗体と該抗体と結合し得る酵素標識を担持する二次抗体
からなる間接酵素抗体法用のキット等を利用することに
より、より容易かつ簡便に実施することができる。
キットには本発明抗体及び二次抗体を含有させる。また
このキットには、例えばグリセロールや牛血清蛋白等の
安定化剤及び/又は保存剤を添加することができる。こ
の抗体試薬は、凍結乾燥してもよく、該キットには水溶
性−もしくは水と混和し得る溶媒を含有させることがで
きる。更に抗体試薬には、再構成された試薬系を一定の
pHに保つために緩衝液及び/又は試料が悪化するのを
防止するための保存剤及び/又は安定化剤を配合するこ
ともできる。緩衝液はキット試薬の必須成分ではないが
、本発明測定法を実施する際に、pHを5.0〜9.0
程度とするものを用いるのが好ましい。また再構成剤は
、好ましくは水を含んだものであるが、水の一部又は全
部を水と混和し得る溶媒で置き換えることもできる。こ
の水と混和し得る溶媒としては、よく知られている例え
ばグリセリン、アルコール類、グリコールエーテル類等
を例示できる。
このキットには、例えばグリセロールや牛血清蛋白等の
安定化剤及び/又は保存剤を添加することができる。こ
の抗体試薬は、凍結乾燥してもよく、該キットには水溶
性−もしくは水と混和し得る溶媒を含有させることがで
きる。更に抗体試薬には、再構成された試薬系を一定の
pHに保つために緩衝液及び/又は試料が悪化するのを
防止するための保存剤及び/又は安定化剤を配合するこ
ともできる。緩衝液はキット試薬の必須成分ではないが
、本発明測定法を実施する際に、pHを5.0〜9.0
程度とするものを用いるのが好ましい。また再構成剤は
、好ましくは水を含んだものであるが、水の一部又は全
部を水と混和し得る溶媒で置き換えることもできる。こ
の水と混和し得る溶媒としては、よく知られている例え
ばグリセリン、アルコール類、グリコールエーテル類等
を例示できる。
本発明方法により検出される異常応答を起こしたリンパ
球は、形質転換細胞の存在を反映するものである。ここ
で形質転換細胞は、細胞のウィルス感染、癌化等により
生じるものであり、例えば各種癌、エイズ、肝炎等のば
か一部精神疾患、自己免疫疾患の原因となるものである
。
球は、形質転換細胞の存在を反映するものである。ここ
で形質転換細胞は、細胞のウィルス感染、癌化等により
生じるものであり、例えば各種癌、エイズ、肝炎等のば
か一部精神疾患、自己免疫疾患の原因となるものである
。
しかしながら、本発明で検出されるリンパ球は形質転換
された細胞そのものでないことは、後記実施例から明ら
かである。すなわち、例えばHIVに感染するリンパ球
は、T4細胞でありT8細胞ではないが、L、Y抗原に
対し最も強く反応するのは、HIVに感染しないT6細
胞であることが示されている。
された細胞そのものでないことは、後記実施例から明ら
かである。すなわち、例えばHIVに感染するリンパ球
は、T4細胞でありT8細胞ではないが、L、Y抗原に
対し最も強く反応するのは、HIVに感染しないT6細
胞であることが示されている。
本発明によれば、形質転換細胞に対するリンパ球の異常
応答を直接検出することができるので、各疾病の診断の
ほか疾病の進行程度等を直接に判断することができる。
応答を直接検出することができるので、各疾病の診断の
ほか疾病の進行程度等を直接に判断することができる。
また、形質転換細胞そのものでなくこれに対し異常応答
したリンパ球を検出するものであるので、血液等の体液
を利用することができ、試験も容易なものである。
したリンパ球を検出するものであるので、血液等の体液
を利用することができ、試験も容易なものである。
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。
実施例1゜
健常人及び形質転換細胞の存在が原因とされ若しくは原
因と疑われている各種疾患患者の末梢血を取り、二重染
色フローサイトメトリーを行い、T細胞上のり、Y抗原
の存在を調べた。被験者は健常人(27例)、癌患者(
10例)、HIV患者(ao例)、精神***病患者(3
1例)、肝炎患者(13例)、ギランバレー症候群患者
(1例)、セザリー症候群患者(1例)であり、結果を
表1にまとめた。
因と疑われている各種疾患患者の末梢血を取り、二重染
色フローサイトメトリーを行い、T細胞上のり、Y抗原
の存在を調べた。被験者は健常人(27例)、癌患者(
10例)、HIV患者(ao例)、精神***病患者(3
1例)、肝炎患者(13例)、ギランバレー症候群患者
(1例)、セザリー症候群患者(1例)であり、結果を
表1にまとめた。
なお、二重染色フローサイトメトリーは、被検者静脈か
らヘバリナイズした血液10mftを採血し、これにK
AC−2(5%シリカ懸濁液、日本抗体研究所)を1
mft加え、責食細胞除去のため、37℃で1時間反
応させた後、この血液をフィコールハイバーク勾配遠心
分離を行い、単核細胞画分を得た。次いで、このリンパ
球(5〜10xlO’cell/100μfL)にBM
−1抗体5μg/mlLのものを100μL加えて1時
間反応させた後、生理食塩水含有リン酸緩衝液(PBS
)で1回洗浄した。次いでFITC標識した抗マウスI
gM (Tago社製)15μs/ml!の濃度の溶
液をiooμL加えて30分間反応させた後、PBSで
1回洗浄した。次いでT細胞マーカー(Becton
DickInson社製)のCD 3 (Pan−Tマ
ーカー)、またはCD4(ヘルパー/インデュサーTマ
ーカー)、またはCD8(サプレッサー/キラーエマ−
カー)を10μ℃加え、30分間反応し、Pusで1回
洗浄した。洗浄後、1.5%のホルマリンPBSを1
mL加え、氷冷水中で15分間固定後、PBSで1回洗
浄した。これに300μmのPBSを加えて細胞懸濁液
を調製し、測定に供した。測定はFITC標識BM−1
抗体を検出するためには励起波長4881m、蛍光波長
520nmで蛍光強度を測定した。また、フィコエリシ
ン(Phycoerythin)で直接標識されたTm
mママ−カー測定は励起波長488nm、蛍光波長58
0 nmで蛍光強度を測定することにより行った。
らヘバリナイズした血液10mftを採血し、これにK
AC−2(5%シリカ懸濁液、日本抗体研究所)を1
mft加え、責食細胞除去のため、37℃で1時間反
応させた後、この血液をフィコールハイバーク勾配遠心
分離を行い、単核細胞画分を得た。次いで、このリンパ
球(5〜10xlO’cell/100μfL)にBM
−1抗体5μg/mlLのものを100μL加えて1時
間反応させた後、生理食塩水含有リン酸緩衝液(PBS
)で1回洗浄した。次いでFITC標識した抗マウスI
gM (Tago社製)15μs/ml!の濃度の溶
液をiooμL加えて30分間反応させた後、PBSで
1回洗浄した。次いでT細胞マーカー(Becton
DickInson社製)のCD 3 (Pan−Tマ
ーカー)、またはCD4(ヘルパー/インデュサーTマ
ーカー)、またはCD8(サプレッサー/キラーエマ−
カー)を10μ℃加え、30分間反応し、Pusで1回
洗浄した。洗浄後、1.5%のホルマリンPBSを1
mL加え、氷冷水中で15分間固定後、PBSで1回洗
浄した。これに300μmのPBSを加えて細胞懸濁液
を調製し、測定に供した。測定はFITC標識BM−1
抗体を検出するためには励起波長4881m、蛍光波長
520nmで蛍光強度を測定した。また、フィコエリシ
ン(Phycoerythin)で直接標識されたTm
mママ−カー測定は励起波長488nm、蛍光波長58
0 nmで蛍光強度を測定することにより行った。
[結 果コ
表1
* P、S、(Performance 5tatu
s)** CDC: 米国防疫センター(CDC)による)IIV感染症の分
類X−線、あるいはCT画像上1らかに癌を認められる
進行癌患者10例(P、5.3及び4の患者5例、p、
s、o 、 i及び2の患者5例)について、BM−
1と各種T−cellマーカーとの組合わせによる測定
を行った結果、T−cellのサブセットであるCD4
(ヘルパー/インデューサーTe1f) 、[:D8
(サプレッサー/キラーT cell)上にり、Yの発
現が認められ、特にp、s、の大き・)−症例について
はCDa上に強い発現が認められた。
s)** CDC: 米国防疫センター(CDC)による)IIV感染症の分
類X−線、あるいはCT画像上1らかに癌を認められる
進行癌患者10例(P、5.3及び4の患者5例、p、
s、o 、 i及び2の患者5例)について、BM−
1と各種T−cellマーカーとの組合わせによる測定
を行った結果、T−cellのサブセットであるCD4
(ヘルパー/インデューサーTe1f) 、[:D8
(サプレッサー/キラーT cell)上にり、Yの発
現が認められ、特にp、s、の大き・)−症例について
はCDa上に強い発現が認められた。
またHIVの場合キャリアーと言われるCDCl!、あ
るいは持続的な全身性リンパ節腫張のCD CIIIに
対し、臨床症状に現れ発症したCDCrVではり、Yの
発現が強く認められた。
るいは持続的な全身性リンパ節腫張のCD CIIIに
対し、臨床症状に現れ発症したCDCrVではり、Yの
発現が強く認められた。
HBVに感染した貴石を認める急性期の肝炎患者及び慢
性期の肝炎患者についても同様に解析した。その結果急
性期肝炎患者において:D8上に特に強いり、Yの発現
が認められ、近年aytojOXlc T細胞(CD8
陽性細胞)が劇症肝炎の病因とする考えがあり、この結
果は非常に興味深いものと言える。
性期の肝炎患者についても同様に解析した。その結果急
性期肝炎患者において:D8上に特に強いり、Yの発現
が認められ、近年aytojOXlc T細胞(CD8
陽性細胞)が劇症肝炎の病因とする考えがあり、この結
果は非常に興味深いものと言える。
更に、精神***病についても活動期及び静止期患者の末
梢リンパ球の解析の結果、活動期患者末梢リンパ球は異
常な染色パターンを示し、T細胞に高いり、Yの発現を
認めた。一方静止期患者末梢リンパ球も異常なパターン
は示すものの、L、Yの発現率については正常人のそれ
とは有位差が認められなかった。
梢リンパ球の解析の結果、活動期患者末梢リンパ球は異
常な染色パターンを示し、T細胞に高いり、Yの発現を
認めた。一方静止期患者末梢リンパ球も異常なパターン
は示すものの、L、Yの発現率については正常人のそれ
とは有位差が認められなかった。
更にまた、発症時の1例のギランバレー症候群患者リン
パ球についての染色結果は異常な染色パターンを示し、
T細胞に高いり、Yの発現を認め、また、未知のウィル
スの感染が疑われ、ヘルパーT細胞の機能先進等が報告
され、一種の白血病に分類されるセザリー症候群患者に
ついてもヘルパーT細胞のマーカーCD4陽性細胞にり
、Yの異常な染色像を認めた。
パ球についての染色結果は異常な染色パターンを示し、
T細胞に高いり、Yの発現を認め、また、未知のウィル
スの感染が疑われ、ヘルパーT細胞の機能先進等が報告
され、一種の白血病に分類されるセザリー症候群患者に
ついてもヘルパーT細胞のマーカーCD4陽性細胞にり
、Yの異常な染色像を認めた。
これらの結果から、ウィルス感染又は癌化細胞(形質転
換細胞)の存在によって異常応答したリンパ球がり、Y
抗原を発現し、この抗原の検出により各種疾病患者の発
症予知、症状の把握が可能であることが示された。
換細胞)の存在によって異常応答したリンパ球がり、Y
抗原を発現し、この抗原の検出により各種疾病患者の発
症予知、症状の把握が可能であることが示された。
実施例2゜
HIV感染細胞の抗原発現の時間経過:50μg7mJ
lのゲンタマイシンを含む、10%熱不活化牛脂児血清
を添加したRPMI−1640で培養したTALL−1
細胞3X10’個/m℃に1μg/mj2のポリブレン
(Sigma Chemical (:am−pany
、 St、 Louts、MO)を含むHIV (リバ
ース・トランスクリブターゼ活性として58000cp
m/mfL)を第1図の矢印で示す1,3.6日目に加
えた。次いで、細胞表面に表現されてくるHIV抗原を
測定した。
lのゲンタマイシンを含む、10%熱不活化牛脂児血清
を添加したRPMI−1640で培養したTALL−1
細胞3X10’個/m℃に1μg/mj2のポリブレン
(Sigma Chemical (:am−pany
、 St、 Louts、MO)を含むHIV (リバ
ース・トランスクリブターゼ活性として58000cp
m/mfL)を第1図の矢印で示す1,3.6日目に加
えた。次いで、細胞表面に表現されてくるHIV抗原を
測定した。
測定は抗p24モノクローナル抗体、AIDS患者血清
、及びBM−1抗体を用い、サイトフローメトリーによ
って、陽性細胞の割合を出した。
、及びBM−1抗体を用い、サイトフローメトリーによ
って、陽性細胞の割合を出した。
図中・□・はBM−1抗体との反応性、O−一一一〇は
患者血清との反応性、△・・・・・△は抗p24との反
応性をそれぞれ示す。
患者血清との反応性、△・・・・・△は抗p24との反
応性をそれぞれ示す。
コノ結果、TALL−1細胞はHIV感染後、18日目
からBM−1抗体と強く反応する陽性細胞に転すること
が判った。
からBM−1抗体と強く反応する陽性細胞に転すること
が判った。
実施例3゜
膜抗原のサイトフルオロメトリック分析:HIV感染及
び未感染(7)H−9、又はTALL−1細胞の5X1
0’個に各種の精製抗体100μLを混合し、4℃で6
0分間反応させた後、RPMI−1840培地で2回洗
浄する。次いで、FITC結合−抗マウス−1gM 、
又はIgG (Tago、 Inc、。
び未感染(7)H−9、又はTALL−1細胞の5X1
0’個に各種の精製抗体100μLを混合し、4℃で6
0分間反応させた後、RPMI−1840培地で2回洗
浄する。次いで、FITC結合−抗マウス−1gM 、
又はIgG (Tago、 Inc、。
Code No、4352)ヤギF (ab) 2フラ
グメントの35倍希釈液の100μmを加えて、4℃で
30分間反応後、細胞をRPMI培地で2回洗浄し、1
.5%フォルマリン−PBSで固定した。精製したマウ
スIgM (Coulter Corporatio
n )を対照群の第一抗体として用いた。サイトフロー
メトリーはEPIC5−C(Coulter Elec
tronics )を用いた。その結果を第2図に示す
。
グメントの35倍希釈液の100μmを加えて、4℃で
30分間反応後、細胞をRPMI培地で2回洗浄し、1
.5%フォルマリン−PBSで固定した。精製したマウ
スIgM (Coulter Corporatio
n )を対照群の第一抗体として用いた。サイトフロー
メトリーはEPIC5−C(Coulter Elec
tronics )を用いた。その結果を第2図に示す
。
図中IaはHIV未感染H−9細胞をマウスIgM 子
処理、IbはHIV感染H−9細胞をマウスIgMで処
理、II aはHIV未感・染H−9細胞をモノクロー
ナル抗体BM−1で処理、II bはHIV感染H−9
細胞をモノクローナル抗体BM−1で処理した結果を示
す。m aはHIV未感染TALL−1細胞をマウスI
gMで処理、m bはHIV感染TALL−1細胞をマ
ウスIgMで処理、IVaはHIV未感染TALL−1
細胞をモノクローナル抗体BM−1で処理、rVbはH
IV感染TALL−1細胞をモノクローナル抗体BM−
1で処理した結果をそれぞれ示している。
処理、IbはHIV感染H−9細胞をマウスIgMで処
理、II aはHIV未感・染H−9細胞をモノクロー
ナル抗体BM−1で処理、II bはHIV感染H−9
細胞をモノクローナル抗体BM−1で処理した結果を示
す。m aはHIV未感染TALL−1細胞をマウスI
gMで処理、m bはHIV感染TALL−1細胞をマ
ウスIgMで処理、IVaはHIV未感染TALL−1
細胞をモノクローナル抗体BM−1で処理、rVbはH
IV感染TALL−1細胞をモノクローナル抗体BM−
1で処理した結果をそれぞれ示している。
この結果、Il b 、及びIVbの2群が蛍光強度の
強いところに現れている。即ち、H−9、TALL−1
細胞共に、HIV感染後、モノクローナル抗体BM−1
で処理した群で蛍光強度の増加が認められた。
強いところに現れている。即ち、H−9、TALL−1
細胞共に、HIV感染後、モノクローナル抗体BM−1
で処理した群で蛍光強度の増加が認められた。
実施例4゜
更に、)IIV感染前と感染後の各種抗体に対する反応
性の割合を調べた結果を第3図に示す、ここに示す様に
株化T−細胞(H−9゜TA、LL−1)はHIVで感
染した時のみ、抗体BM−1と強く反応することが判る
。
性の割合を調べた結果を第3図に示す、ここに示す様に
株化T−細胞(H−9゜TA、LL−1)はHIVで感
染した時のみ、抗体BM−1と強く反応することが判る
。
ここで使用した抗体は次の文献により調製した。
FH−2(Fukushi、 Y、、 et at、、
J、Biol、Chem、。
J、Biol、Chem、。
259.4681〜4685.1984 )All:F
H−18(Fukushi、 Y、、 et at、、
J、Blol。
H−18(Fukushi、 Y、、 et at、、
J、Blol。
Chem、、259.4681〜4685.1984
)FH−6(Fukushi、 Y、、 et al、
、 J、Biol、Chem、。
)FH−6(Fukushi、 Y、、 et al、
、 J、Biol、Chem、。
259.10501〜10517.1984)に■−1
(にaizu、 T、、 et al、、 J、Bio
l、Chem、。
(にaizu、 T、、 et al、、 J、Bio
l、Chem、。
21i1,11254 〜11258.1986)実施
例5゜ ヒト末梢血リンパ球の分離と免疫蛍光染色:AIDS、
又はARC患者静脈からヘバリナイズした血液10mA
を採取し、これにKAC−2(5%5ilica 5u
spension、Japan Immunorese
archLaboratories)を2 rnll加
え、寅食細胞除去後、37℃で1時間反応させる。KA
C−2処理した血液をフィコールハイバーク勾配遠心分
離を行い単核細胞画分を得た。このリンパ球を各種の抗
体を用いて免疫蛍光染色を行った。この結果を第4図に
示す。
例5゜ ヒト末梢血リンパ球の分離と免疫蛍光染色:AIDS、
又はARC患者静脈からヘバリナイズした血液10mA
を採取し、これにKAC−2(5%5ilica 5u
spension、Japan Immunorese
archLaboratories)を2 rnll加
え、寅食細胞除去後、37℃で1時間反応させる。KA
C−2処理した血液をフィコールハイバーク勾配遠心分
離を行い単核細胞画分を得た。このリンパ球を各種の抗
体を用いて免疫蛍光染色を行った。この結果を第4図に
示す。
図中AはAIDS患者のT細胞の光学顕微鏡写真を、B
は蛍光顕微鏡写真である。また、CはARC患者のT細
胞の光学顕微鏡写真を、Dはその蛍光顕微鏡写真を示す
。
は蛍光顕微鏡写真である。また、CはARC患者のT細
胞の光学顕微鏡写真を、Dはその蛍光顕微鏡写真を示す
。
第4図Bに示すようにAIDS患者のリンパ球は抗体B
M−1と強く反応するが、ARC患者のリンパ球は第4
図りに示すようにAIDS患者に比較して、その蛍光染
色の度合は弱かった。
M−1と強く反応するが、ARC患者のリンパ球は第4
図りに示すようにAIDS患者に比較して、その蛍光染
色の度合は弱かった。
第1図は、HIV感染感染脳細胞養日数と陽転 率の
関係を示す図面である。 第2図は、HIV感染及び未感染T細胞について、各種
の精製抗体を用いて行ったサイトフルオロメトリック分
析の結果を示す図面である。 第3図は、各種抗体とT細胞との反応性を示す図面であ
る。 第4図は、生物であるヒト末梢血リンパ球の免疫蛍光染
色の結果を示す図面である。 以 上 第1図 HIV感染後の培養日数 第2図 対数螢光強度→ く−←
関係を示す図面である。 第2図は、HIV感染及び未感染T細胞について、各種
の精製抗体を用いて行ったサイトフルオロメトリック分
析の結果を示す図面である。 第3図は、各種抗体とT細胞との反応性を示す図面であ
る。 第4図は、生物であるヒト末梢血リンパ球の免疫蛍光染
色の結果を示す図面である。 以 上 第1図 HIV感染後の培養日数 第2図 対数螢光強度→ く−←
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、リンパ球を含有する検体に、次の式( I )▲数式
、化学式、表等があります▼( I ) で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を作用させ、こ
の抗体と結合したリンパ球を検出することを特徴とする
形質転換細胞による異常応答リンパ球の検出方法。 2、次の式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を含有する形質
転換自己細胞による異常応答リンパ球検出試薬。 3、(1)標識化合物を結合した、次の式( I )▲数
式、化学式、表等があります▼( I ) で示される糖鎖を特異的に認識する抗体、 (2)シリカ懸濁液及び (3)リンパ球固定液 を含有する形質転換自己細胞による異常応答リンパ球検
出用キット。 4、リンパ球を含有する検体に次の式( I )▲数式、
化学式、表等があります▼( I ) で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を作用させ、こ
の抗体と結合したT_4細胞を検出することを特徴とす
るHIV感染T細胞の検出方法。 5、次の式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を含有するHI
V感染T細胞の検出試薬。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63182632A JPH083487B2 (ja) | 1987-07-31 | 1988-07-21 | 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット |
CA000573148A CA1307461C (en) | 1987-07-31 | 1988-07-27 | Detection method of abnormally-responding lymphocytes as well as detection reagent and kit therefor |
US07/224,712 US5236823A (en) | 1987-07-31 | 1988-07-27 | Detection method of abnormally-responding lymphocytes as well as detection reagent and kit therefor |
DE8888112242T DE3870359D1 (de) | 1987-07-31 | 1988-07-28 | Verfahren zum nachweis anormal reagierender lymphozythen sowie reagens und zusammensetzung dafuer. |
EP88112242A EP0304663B1 (en) | 1987-07-31 | 1988-07-28 | Detection method of abnormally responding lymphocytes as well as detection reagent and kit therefor |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP62-192338 | 1987-07-31 | ||
JP19233887 | 1987-07-31 | ||
JP63182632A JPH083487B2 (ja) | 1987-07-31 | 1988-07-21 | 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01105160A true JPH01105160A (ja) | 1989-04-21 |
JPH083487B2 JPH083487B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=26501362
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63182632A Expired - Lifetime JPH083487B2 (ja) | 1987-07-31 | 1988-07-21 | 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5236823A (ja) |
EP (1) | EP0304663B1 (ja) |
JP (1) | JPH083487B2 (ja) |
CA (1) | CA1307461C (ja) |
DE (1) | DE3870359D1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020516892A (ja) * | 2017-04-14 | 2020-06-11 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 細胞表面グリコシル化を評価するための方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU653141B2 (en) * | 1990-01-26 | 1994-09-22 | Bay Development Corporation Sa | Medicaments and methods for treating acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and aids-related complex (ARC) employing anti-carbohydrate antibodies and carbohydrate antigens |
DE4025499A1 (de) * | 1990-08-11 | 1992-02-13 | Sandoz Ag | Verwendung der antikoerper br55-2, deren derivate, konjugate und fragmente zur bekaempfung von hiv-infektionen |
US5648222A (en) * | 1994-07-27 | 1997-07-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for preserving cells, and uses of said method |
EP1491633B1 (en) * | 2002-03-19 | 2008-08-27 | Mitsubishi Chemical Corporation | Novel carbonyl reductase, gene encoding it and process for producing optically active alcohols using the same |
EP1664784A1 (en) * | 2003-09-17 | 2006-06-07 | Guava Technologies, Inc. | Compositions and methods for analysis of target analytes |
US20100279279A1 (en) * | 2003-09-17 | 2010-11-04 | Robert Danielzadeh | Compositions and methods for analysis of target analytes |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3988115A (en) * | 1975-09-18 | 1976-10-26 | Modabber Farrokh Z | Diagnostic method for determining pathological condition by antigen-combining capacity of lymphocytes |
JPS60214737A (ja) * | 1984-04-06 | 1985-10-28 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | 糖鎖関連抗原の製造法 |
US4886743A (en) * | 1985-04-24 | 1989-12-12 | California Institute Of Technology | Diagnostic reagents based on unique sequences within the variable region of the T cell receptor and uses thereof |
US4873188A (en) * | 1985-05-28 | 1989-10-10 | Oncogen | Method, monoclonal antibody, and monoclonal antibody fragments for detecting human non-small cell lung carcinomas and cell line for producing such antibodies |
US4917998A (en) * | 1986-05-06 | 1990-04-17 | Epitope, Inc. | Method of detecting AIDS virus infection |
US4904581A (en) * | 1986-05-06 | 1990-02-27 | Epitope, Inc. | Method of detecting AIDS virus infection |
-
1988
- 1988-07-21 JP JP63182632A patent/JPH083487B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-27 US US07/224,712 patent/US5236823A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-27 CA CA000573148A patent/CA1307461C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-28 EP EP88112242A patent/EP0304663B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-28 DE DE8888112242T patent/DE3870359D1/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J.BIOL.CHEM.=1983 * |
J.BIOL.CHEM.=1984 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020516892A (ja) * | 2017-04-14 | 2020-06-11 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 細胞表面グリコシル化を評価するための方法 |
US11796534B2 (en) | 2017-04-14 | 2023-10-24 | Juno Therapeutics, Inc. | Methods for assessing cell surface glycosylation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0304663B1 (en) | 1992-04-22 |
DE3870359D1 (de) | 1992-05-27 |
EP0304663A1 (en) | 1989-03-01 |
JPH083487B2 (ja) | 1996-01-17 |
CA1307461C (en) | 1992-09-15 |
US5236823A (en) | 1993-08-17 |
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