JP7495075B2 - 高血圧性心疾患治療剤 - Google Patents
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Description
[2]上記ピオグリタゾンがピオグリタゾン塩酸塩である、[1]に記載の高血圧性心疾患治療剤。
[3]上記間葉系幹細胞が、被験体に対して同種異系である、[1]もしくは[2]に記載の拡高血圧性心疾患治療剤。
[4]上記間葉系幹細胞が、脂肪由来、臍帯由来又は骨髄由来である、[1]から[3]のいずれかに記載の高血圧性心疾患治療剤。
[5]上記間葉系幹細胞が、凍結された細胞である、[1]から[4]のいずれかに記載の高血圧性心疾患治療剤。
[6]間葉系幹細胞及びピオグリタゾンを含有する、高血圧性心疾患における心肥大抑制剤。
[7][1]から[5]のいずれかに記載の高血圧性心疾患治療剤、[6]に記載の心肥大抑制剤、容器及びラベルを含む、高血圧性心疾患治療用キット。
本発明の高血圧性心疾患治療剤は、間葉系幹細胞及びピオグリタゾンを含有する。
本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系に属する細胞(骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など)への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間葉系幹細胞なる用語は、間質細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。間葉系幹細胞を含む組織としては、例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、胎盤、歯髄等が挙げられる。従って、例えば脂肪組織由来間葉系幹細胞とは、脂肪組織に含有される間葉系幹細胞を意味し、脂肪組織由来間質細胞と称してもよい。これらのうち、本発明の高血圧性心疾患治療剤の作用効果の観点、及び入手容易性の観点等から、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞がより好ましい。
当該間葉系幹細胞は、当業者に周知の方法により調製することができる。以下に、一つの例として、脂肪組織由来間葉系幹細胞の調製方法を説明する。脂肪組織由来間葉系幹細胞は、例えば米国特許第6,777,231号に記載の製造方法によって得られて良く、例えば、以下の工程(i)~(iii)を含む方法で製造することができる:
(i) 脂肪組織を酵素による消化により細胞懸濁物を得る工程;
(ii) 細胞を沈降させ、細胞を適切な培地に再懸濁する工程;ならびに
(iii) 細胞を固体表面で培養し、固体表面への結合を示さない細胞を除去する工程。
る間葉系幹細胞は、上述の通り調製することができるが、次の特性を持つ細胞として定義してもよい;
(1)標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す、
(2)表面抗原CD44、CD73、CD90が陽性であり、CD31、CD45、が陰性であり、及び
(3)培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能。
本発明における間葉系幹細胞は、疾患治療効果を備えていれば、適宜、凍結保存及び融解を繰り返した細胞であってもよい。本発明において、凍結保存は、当業者に周知の凍結保存液へ間葉系幹細胞を懸濁し、冷却することによって行い得る。懸濁は、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、凍結保存容器に移し、適宜、処理した後、凍結保存液を加えることによって行い得る。
本発明の間葉系幹細胞は、いずれの状態の細胞であってもよいが、例えば培養中の細胞を剥離して回収された細胞でもよいし、凍結保存液中に凍結された状態の細胞でもよい。拡大培養して得られる同ロットの細胞を小分けして凍結保存したものを使用すると、安定した作用効果が得られる点、取扱い性に優れる点等において好ましい。凍結保存状態の間葉系幹細胞は、使用直前に融解し、凍結保存液に懸濁したまま直接投与してもよいし、輸液もしくは培地に懸濁した後に、投与してもよい。また、遠心分離等の方法により凍結保存液を除去してから輸液もしくは培地に混合してもよい。
ピオグリタゾン(Pioglitazone)は、チアゾリジン系の経口血糖降下薬として知られている薬剤である。本発明においてピオグリタゾンは、薬学的に許容される塩であってもよく、例えばピオグリタゾン塩酸塩等が好ましい塩として挙げられる。
本発明の高血圧性心疾患治療剤は、それぞれの剤型に合わせて、常法に従って、間葉系幹細胞及びピオグリタゾンと、適切な細胞懸濁用液体等(薬学的に許容される担体や添加物を含む)とを混合することによりに得られる。また、間葉系幹細胞と、ピオグリタゾンとは、それぞれ常法に従って、別々に調製してもよい。
本発明は、間葉系幹細胞及びピオグリタゾンを含有する、高血圧性心疾患における心肥大抑制剤も含む。上述した本発明の高血圧性心疾患治療剤は、高血圧性心疾患における心肥大を特に効果的に抑制する効果を有することから、高血圧性心疾患における心肥大抑制剤としても有効である。なお、本発明の高血圧性心疾患における心肥大抑制剤が含有する間葉系幹細胞及びピオグリタゾン、その他の具体的な説明については、上述した高血圧性心疾患治療剤の説明を適用できる。
本発明は、上述した本発明の高血圧性心疾患治療剤又は心肥大抑制剤、容器及びラベルを含む高血圧性心疾患治療用のキットも含む。本発明のキットが含む適切な容器としては、特に限定されないが、例えば、間葉系幹細胞凍結用のクライオチューブ、間葉系幹細胞懸濁用溶液、ピオグリタゾン用のボトル、バイアル、試験管等が挙げられる。これらの容器は、ガラス、金属、プラスチック又はこれらの組み合わせ等の多様な材料から形成されていてもよい。これらの容器上のラベルには、内容物を説明する内容が記載されている。
(脂肪組織由来間葉系幹細胞の調製)
ヒトドナーから同意を得た後、脂肪吸引法で得た皮下脂肪組織を生理食塩液で洗浄した。細胞外基質の破壊、及び細胞の単離を達成するために、コラゲナーゼ(Roche社)(溶媒は生理食塩液)を添加し、37℃で90分間振倒し、分散した。続いて、この細胞を回収し、細胞懸濁液を800gで5分間、遠心分離して間質血管細胞群の沈殿を得た。上記細胞の沈殿に間葉系幹細胞用無血清培地(Rohto社)を加え、当該細胞懸濁液を400gで5分間遠心分離し、上清除去後に間葉系幹細胞用無血清培地(Rohto社)に再懸濁し、フラスコに細胞を播種した。細胞を37℃で数日間、5%CO2中で培養した。数日後に培養物をPBSで洗浄して、培養液中に含まれていた血球や脂肪組織の残存等を除去し、プラスチック容器に接着している脂肪組織由来間葉系幹細胞を得た。
得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を、トリプシンを用いて剥離し、遠沈管に移し、400gで5分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を除去した後、細胞凍結保存液(STEM-CELLBANKER(ゼノアック社))を適量加え懸濁した。当該細胞懸濁液を、クライオチューブに分注した後、フリーザー内で-80度にて保存後、液体窒素上の気相に移し、保存を継続した。
脂肪組織由来間葉系幹細胞上の種々の表面マーカーの評価は、フローサイトメトリーによって実施した。脂肪組織由来間葉系幹細胞を、FACS染色用バッファーに再懸濁した。FACS分析に用いた抗体は、FITC(蛍光イソシアニン)又はPE(フェコエリスリン)標識のマウス抗ヒト抗体CD11b、CD45、CD73、CD90、及び相当するマウスIgG1アイソタイプコントロール抗体であった。細胞は室温で30分間染色し、次に洗浄し、BD FACSCantoII(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いて解析した。データは、BD FACSDiva SoftwCre(BD Biosciences)を用いて分析した。その結果、脂肪組織由来間葉系幹細胞は、CD45は陰性、CD73、CD90は陽性であった。
高血圧性心疾患モデルである、圧負荷誘導性心不全モデルに対する脂肪組織由来間葉系幹細胞(以下「MSC」と言う)及びピオグリタゾンの治療効果の検討を行った。マウス(C57BL6J、雄性、9週齢)の心臓横大動脈狭窄(Exp Physiol. 2012 Jul;97(7):822-32)を行い、TACモデルマウス(以下「TACモデル」と言う)を作製した。ピオグリタゾン投与群には、心臓横大動脈狭窄及び偽手術前日から、0.5%W/Vメチルセルロースに懸濁したピオグリタゾンを50mg/kgを1日2回経口投与した。MSC投与群は心臓横大動脈狭窄及び偽手術後に、MSCをDMEM(Low Glucose、P/S、FBS(-))に懸濁して1.67×105cells/bodyで、尾静脈に1週間に3回、2週間(計6回)投与を行った。心臓横大動脈狭窄及び偽手術の2週間後における心臓機能の比較を超音波心エコー検査により行った(図1)。手術後2週間における左室駆出率(ejection fraction% (EF%))及び左室内径短縮率(fractional shortening% (FS%))は偽手術と比較して、ピオグリタゾン投与群でも、ピオグリタゾン非投与群でも心臓横大動脈狭窄により、著しく低下した。TACモデルに対してMSCを投与することにより、駆出率や分数短縮の低下が有意に抑えられた。さらに、TACモデルに対してピオグリタゾン及びMSCを投与することにより駆出率や分数短縮の低下が有意に抑えられた(図2、3)。
Claims (5)
- 脂肪由来間葉系幹細胞及びピオグリタゾンを含有する、高血圧性心疾患治療剤。
- 上記ピオグリタゾンがピオグリタゾン塩酸塩である、請求項1に記載の高血圧性心疾患治療剤。
- 上記脂肪由来間葉系幹細胞が、被験体に対して同種異系である、請求項1もしくは2に記載の高血圧性心疾患治療剤。
- 脂肪由来間葉系幹細胞及びピオグリタゾンを含有する、高血圧性心疾患における心肥大抑制剤。
- 請求項1から3のいずれかに記載の高血圧性心疾患治療剤、請求項4に記載の心肥大抑制剤、容器及びラベルを含む、高血圧性心疾患治療用キット。
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