JP7446089B2 - セルラーゼの製造方法 - Google Patents
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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Description
本発明は、微生物を用いたセルラーゼの製造方法に関する。
糸状菌は、多種のセルラーゼ及びキシラナーゼを生産することから、植物性多糖の分解菌として注目されている。なかでも、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）は、セルラーゼとキシラナーゼを同時に、かつ大量に生産することが可能であることから、セルラーゼ系バイオマス分解酵素の製造のための微生物として研究されている。
微生物の培養においては、従来、炭素源としてグルコースが汎用されている。また、微生物による酵素などタンパク質の生産には、炭素源に加えて、誘導物質が必要なことがある。例えば、アスペルギルス・オリゼのαアミラーゼ遺伝子の発現は、デンプンやマルトースなどに誘導される。
特許文献１には、バッチ相における、炭素質生育基質の存在下での菌の生育のための第１の工程と、流加相における、誘導炭素質基質の存在下での菌の生育及び酵素生産のための第２の工程を含む、糸状菌を用いたセルラーゼの生産方法、ならびに、該炭素質生育基質がラクトース、グルコース、キシロース、セルロース系バイオマスの酵素加水分解物の単量体糖のエタノール発酵後に得られる残渣、及びセルロース系バイオマスの前処理に由来する水溶性ペントースの粗抽出物から選択され、該誘導炭素質基質が、ラクトース、セロビオース、ソホロース、セルロース系バイオマスの酵素加水分解物の単量体糖のエタノール発酵後に得られる残渣、及びセルロース系バイオマスの前処理に由来する水溶性ペントースの粗抽出物から選択されることが開示されている。特許文献２には、トリコデルマ等の菌類によってセルロース又はヘミセルロース分解性酵素を生産する方法において、酵素生産のための炭素源及び誘導炭素源としてセルロース性又はリグノ－セルロース性材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣（グルコース、キシロース等を含む）を用いることが開示されている。特許文献３には、流加バッチ又は連続発酵培地において、培地に添加した炭素量と、消費した酸素量又は二酸化炭素へと消失した炭素量とに基づいて、発酵培地に対する炭素添加速度を制御する方法が開示され、また該方法を用いて微生物に酵素などのタンパク質を生産させることが開示されている。トリコデルマの主要なセルラーゼ遺伝子cbh1、cbh2、egl1及びegl2の発現は、セルロース、セロビオースなどにより誘導される（非特許文献１）。
Curr. Genomics, 14:230-249 (2013)
微生物により安価かつ効率よく酵素等のタンパク質を製造するための培養技術の開発が求められている。グルコース存在下では、カタボライト抑制と呼ばれる制御機構により、微生物による物質生産性の低下又は飽和が起こる。例えばトリコデルマ等の糸状菌でも、カタボライト抑制が報告されており、その機構解析が進められている。グルコースを繰り返し又は継続的に培養物に流加する流加培養により、カタボライト抑制が抑止され、微生物のタンパク質生産性が向上する可能性がある。しかし、グルコース流加培養によるタンパク質生産では、カタボライト抑制を防ぐため、培養物中のグルコース濃度の精密な制御が求められる。
本発明者らは、微生物を用いたセルラーゼ製造において、セルロース等のセルラーゼ生産を誘導する誘導炭素基質とグルコース等の非誘導炭素基質とを、それらの比率を微生物の呼吸活性の状態に依存して調整しながら培養培地に供給することによって、微生物のセルラーゼ生産性が向上することを見出した。
本発明は、セルラーゼの製造方法であって、
誘導炭素基質及び非誘導炭素基質の存在下で糸状菌を培養することを含み、
該糸状菌の呼吸活性の変化率が０．１以上である期間において、下記式Ａで表される比Ｒが１００以下である、
式Ａ：Ｒ＝非誘導炭素基質の供給速度／誘導炭素基質の供給速度
方法を提供する。
誘導炭素基質及び非誘導炭素基質の存在下で糸状菌を培養することを含み、
該糸状菌の呼吸活性の変化率が０．１以上である期間において、下記式Ａで表される比Ｒが１００以下である、
式Ａ：Ｒ＝非誘導炭素基質の供給速度／誘導炭素基質の供給速度
方法を提供する。
本発明は、微生物からのセルラーゼの収率を向上させることができる。
本発明は、微生物を用いたセルラーゼの製造方法を提供する。本発明によるセルラーゼの製造方法は、誘導炭素基質及び非誘導炭素基質の存在下でセルラーゼ生産性微生物を培養することを含む。
本発明の方法で培養されるセルラーゼ生産性微生物の例としては、細菌、酵母、糸状菌などが挙げられ、このうち糸状菌が好ましい。糸状菌としては、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌が挙げられ、このうち、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）が好ましい。セルラーゼの生産性、及び得られたセルラーゼのバイオマス糖化性能の観点からは、トリコデルマ属がより好ましく、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）及びその変異株がさらに好ましい。トリコデルマ・リーセイ及びその変異株の例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株、ＰＣ－３－７株、及びそれらの変異株が挙げられる。該変異株としては、遺伝子の突然変異、遺伝子組換え等の改変により生じた変異株が挙げられる。
当該微生物の培養に用いられる誘導炭素基質は、該微生物のセルラーゼ発現を誘導する炭素基質であればよい。該誘導炭素基質の例としては、微生物のセルラーゼ発現を誘導する糖類、例えばラクトース、セロビオース、ソホロース、ゲンチオビオース、及びセルロースからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。これらの誘導炭素基質は、一般に誘導酵素といわれているセルラーゼを培養生産するために、本発明の方法において必須の炭素基質である。セルラーゼ誘導性及びコストの観点から、好ましくは、該誘導炭素基質はセルロースである。セルロースは、結晶性セルロース、セルロース系バイオマス、又はそれらの粉砕物であってもよい。
当該微生物の培養に用いられる非誘導炭素基質は、該微生物のセルラーゼ発現を誘導せず、かつ一般に該微生物のカタボライト抑制（セルラーゼ発現停止）をもたらす炭素基質である。該非誘導炭素基質の例としては、微生物のセルラーゼ発現を誘導しない糖類、例えばグルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、及びマルトオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。このうち、微生物培養における汎用性及び資化性の観点からは、グルコース、マルトース、及びマルトオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
該誘導炭素基質は、好ましくは培養槽にバッチ添加される。より好ましくは、該誘導炭素基質は初期培地に添加される。培養槽における誘導炭素基質の初期濃度（例えば初期培地における誘導炭素基質の濃度）は、好ましくは１～１５質量／容量％である。一方、培養槽への非誘導炭素基質の添加は、微生物のカタボライト抑制を避ける観点からは連続添加（例えば流加）であることが好ましい。より好ましくは、該非誘導炭素基質は培養槽に流加される。例えば、該非誘導炭素基質の水溶液を培養槽に流加すればよい。流加される水溶液中における該非誘導炭素基質の濃度は、好ましくは２～９０質量／容量％、より好ましくは５～８０質量／容量％である。流加される水溶液中の非誘導炭素基質の濃度が低すぎると、培養物へ大量の水溶液を流加することになるため培養設備に負担がかかる。一方、該水溶液中の非誘導炭素基質の濃度が高すぎると、培養物への非誘導炭素基の流加量の制御が困難になる。
該培養に用いられる誘導炭素基質及び非誘導炭素基質は、滅菌されていることが好ましい。該炭素基質をバッチ添加する場合、初期培地等とともに培養槽に導入された後で滅菌されてもよく、又は予め滅菌された後で培養槽に添加されてもよい。該炭素基質を流加する場合、予め滅菌した後で培養槽に流加すればよい。該炭素基質の滅菌には、一般的には加熱滅菌、高圧蒸気滅菌器（オートクレーブ）による加圧加熱滅菌、飽和水蒸気の吹付けによる滅菌など、が採用され得る。滅菌条件としては、耐熱性菌であるGeobacillus stearothermophilusの芽胞数が１０-12倍まで減少する条件（例えば、１２０℃で２０分と同等）もしくはより過酷な条件が挙げられる。
本発明の方法の一例では、培養槽に、該誘導炭素基質を含有する初期培地を導入し、次いで該培養槽を滅菌する。該滅菌された培養槽に微生物を播種した後、該非誘導炭素基質の水溶液を流加しながら該微生物を培養する。
該培養に使用される初期培地は、培養される微生物に通常使用される培地であればよい。例えば、該初期培地は、上記誘導炭素基質を含む炭素源、窒素源、マグネシウム塩、亜鉛塩等の金属塩、硫酸塩、リン酸塩、ｐＨ調整剤、界面活性剤、消泡剤などの微生物の培地に一般的に含まれる各種成分を含有することができる。培地中の成分組成は適宜選択可能である。該初期培地は、合成培地、天然培地、半合成培地のいずれであってもよく、又は市販の培地であってもよい。該初期培地は、好ましくは液体培地である。
培養槽への非誘導炭素基質の流加は、通常の流加培養の手順に従って実施され得る。例えば、一般的なフィードコントローラなどを用いて流加量を制御しながら、非誘導炭素基質の水溶液を培養槽に流加すればよい。培養槽への非誘導炭素基質の流加は、培養開始とともに開始してもよく、又は後述する微生物の呼吸活性の変化率が一定値（例えば０．１以上）に達したのちに開始してもよい。培養開始とともに非誘導炭素基質の流加を開始すると簡便である。非誘導炭素基質の流加速度の初期値は、炭素濃度換算で、０．１５～０．５０ｇ／Ｌ－初期培地／ｈが好ましいが、誘導炭素基質濃度や菌体濃度に依存して調整可能である。
本発明の方法において、微生物培養中における該誘導炭素基質と該非誘導炭素基質の培養培地に対する供給量は、培養する微生物の呼吸活性の状態に依存して調整される。より詳細には、培養中の微生物の呼吸活性の変化率が０．１以上である期間において、該誘導炭素基質の供給速度に対する該非誘導炭素基質の供給速度の比Ｒ〔Ｒ＝非誘導炭素基質の供給速度／誘導炭素基質の供給速度〕は、１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは１０以下に調整される。他方、誘導炭素基質の消費を節減する観点からは、該誘導炭素基質の供給速度に対する該非誘導炭素基質の供給速度の比は、１以上であることが好ましい。
微生物の代謝制御の観点からは、本発明の方法においては、培養中の該微生物の呼吸活性の変化率が０．１以上である期間に続く、該微生物の呼吸活性の変化率が０．０１以上である期間において、上記比Ｒを１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは１０以下に調整することが好ましい。
微生物の代謝制御の観点からは、本発明の方法においては、培養中該微生物の呼吸活性の変化率が０．０１以上である期間に続く、該微生物の呼吸活性の変化率が０．００１以上である期間において、上記比Ｒを１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは１０以下に調整することがさらに好ましい。
本明細書において、微生物の呼吸活性は、菌体の呼吸に由来する培養物からのＣＯ2排出速度を、該培養物の菌体濃度で除することで算出される。例えば、微生物の呼吸活性は、下記式（１）に従って算出され得る。またＣＯ2排出速度は、該培養物の単位時間当たりＣＯ2総排出量［g-CO2］から、培養物の容量及び時間当たりのＣＯ2排出量の変化率を求めることによって算出され得る。例えば、培養物の単位時間当たりＣＯ2総排出量［g-CO2］は、培養物のＣＯ2濃度[vol%]と培養通気量に基づいて、下記式（２）に従って算出され得る。
呼吸活性［g-CO2/g-dry cell/h］
＝（CO2排出速度［g-CO2/L-培養物/h］）÷（菌体濃度［g-dry cell/L-培養物］） …(1)
ここで、
g-CO2 ＝（CO2濃度[vol%]÷100 × 培養通気量[L/min]×60[min]）
÷（[モル体積] × 44[CO2モル質量]） …(2)
ここで、CO2濃度[vol%]：培養物中CO2濃度（vol%）
g-dry cell：CO2濃度[vol%]計測時の培養物に含まれる菌体の乾燥質量（g）
L-培養物：CO2濃度[vol%]計測時の培養物量（L）
呼吸活性［g-CO2/g-dry cell/h］
＝（CO2排出速度［g-CO2/L-培養物/h］）÷（菌体濃度［g-dry cell/L-培養物］） …(1)
ここで、
g-CO2 ＝（CO2濃度[vol%]÷100 × 培養通気量[L/min]×60[min]）
÷（[モル体積] × 44[CO2モル質量]） …(2)
ここで、CO2濃度[vol%]：培養物中CO2濃度（vol%）
g-dry cell：CO2濃度[vol%]計測時の培養物に含まれる菌体の乾燥質量（g）
L-培養物：CO2濃度[vol%]計測時の培養物量（L）
培養物のＣＯ2濃度[vol%]は、培養槽用の排ガス分析装置により測定することができる。該排気ガス分析装置としては、非分散赤外線吸収方式の排気ガス分析装置（例えばＤＥＸ－１５６２Ａ；株式会社バイオット）などを用いることができるが、これに限定されない。培養物における培養通気量は、流量計（例えば、コフロック株式会社製フローメータ）により測定することができる。例えばバルブ付フローメータ（例えば、コフロック株式会社製）により、通気量を制御しつつ流量を測定することが好ましい。
本発明の方法において、微生物の呼吸活性は、上記式（１）及び（２）に従って毎時算出され得る。経時的に測定される呼吸活性から、該呼吸活性の変化率を求めることができる。すなわち、呼吸活性の変化率は、下記式（３）のとおり、連続する２つの測定時点で算出された呼吸活性の差分を、より早い時点で算出した呼吸活性で除すことにより算出される。
呼吸活性の変化率 ＝｛｜時間t2における呼吸活性 － 時間t1における呼吸活性｜
÷（時間t1における呼吸活性）｝（t2＞t1, ｜t1－t2｜ = 1）…(3)
呼吸活性の変化率 ＝｛｜時間t2における呼吸活性 － 時間t1における呼吸活性｜
÷（時間t1における呼吸活性）｝（t2＞t1, ｜t1－t2｜ = 1）…(3)
本発明において、バッチ添加される場合の誘導炭素基質の供給速度は、培養物中の誘導炭素基質由来の炭素の単位時間当たりの濃度変化（消失速度）として定義される。誘導炭素基質由来の炭素の消失速度は、例えば、以下の手順にて測定することができる：
（１）まず、サンプリングした培養物から遠心分離等で固形分を分取する。これにより培地に溶解する非誘導炭素基質は実質的に除去される。得られた固形分を乾燥させ、乾燥固形分の質量を測定する。次いで、該乾燥固形分を元素分析し、乾燥固形分中の全炭素量を求める。全炭素量から、微生物体由来の炭素量を差し引くことで、誘導炭素基質由来の炭素量を求める。すなわち、培養中の微生物体のＣ／Ｎ比は一定であると仮定して、種菌培養時の微生物体サンプルの測定により算出した菌体のＣ／Ｎ比と、該乾燥固形分中の窒素量から、該乾燥固形分中の微生物体由来の炭素量を算出する。乾燥固形分の全炭素量と微生物体由来の炭素量との差分が、誘導炭素基質由来の炭素量として算出され、これを培養物量で除することで、培養物中の誘導炭素基質由来の炭素濃度が求められる。
（２）次いで異なる２つの時点で算出された誘導炭素基質由来の炭素濃度の差分を求める。該差分値は、培養物中の誘導炭素基質由来の炭素濃度の該２つの時点間での濃度変化を反映する。よって、該差分値から単位時間当たりの濃度変化を算出することで、培養物に対する誘導炭素基質の供給速度[g-誘導炭素基質由来の炭素/L-培養液/h]を決定することができる。
（１）まず、サンプリングした培養物から遠心分離等で固形分を分取する。これにより培地に溶解する非誘導炭素基質は実質的に除去される。得られた固形分を乾燥させ、乾燥固形分の質量を測定する。次いで、該乾燥固形分を元素分析し、乾燥固形分中の全炭素量を求める。全炭素量から、微生物体由来の炭素量を差し引くことで、誘導炭素基質由来の炭素量を求める。すなわち、培養中の微生物体のＣ／Ｎ比は一定であると仮定して、種菌培養時の微生物体サンプルの測定により算出した菌体のＣ／Ｎ比と、該乾燥固形分中の窒素量から、該乾燥固形分中の微生物体由来の炭素量を算出する。乾燥固形分の全炭素量と微生物体由来の炭素量との差分が、誘導炭素基質由来の炭素量として算出され、これを培養物量で除することで、培養物中の誘導炭素基質由来の炭素濃度が求められる。
（２）次いで異なる２つの時点で算出された誘導炭素基質由来の炭素濃度の差分を求める。該差分値は、培養物中の誘導炭素基質由来の炭素濃度の該２つの時点間での濃度変化を反映する。よって、該差分値から単位時間当たりの濃度変化を算出することで、培養物に対する誘導炭素基質の供給速度[g-誘導炭素基質由来の炭素/L-培養液/h]を決定することができる。
本発明において、流加される非誘導炭素基質の供給速度は、単位時間当たりに培養物に流加される非誘導炭素基質由来の炭素の量として定義される。例えばフィードコントローラなどで設定された流加量と、流加される水溶液中の非誘導炭素基質濃度に基づいて、非誘導炭素基質の供給速度[g-非誘導炭素基質由来の炭素/L-培養液/h]を決定することができる。
あるいは本発明において、流加される場合の誘導炭素基質の供給速度は、単位時間当たりに培養物に流加される誘導炭素基質由来の炭素の量として定義される。また、本発明において、バッチ添加される非誘導炭素基質の供給速度は、培養物中の非誘導炭素基質由来の炭素の単位時間当たりの濃度変化（消失速度）として定義される。該流加及びバッチ添加される炭素基質の供給速度の具体的な算出手順は、上述したとおりである。
本発明の方法において、微生物の培養のための諸条件は、上述した炭素基質の供給速度以外は、該微生物の種や、培養のスケールなどに合わせて、常法に従って適宜設定することができる。例えば、培養に用いる培養槽は、従来公知のものを適宜採用することができる。具体的には、フラスコ、通気撹拌型培養槽、気泡塔型培養槽、及び流動床型培養槽等が挙げられ、好ましくは、通気撹拌型培養槽である。培養温度は、例えば微生物が糸状菌の場合、好ましくは２５～３５℃、より好ましくは２８±２℃である。培養物のｐＨは、例えば微生物が糸状菌の場合、好ましくはｐＨ３～７、より好ましくはｐＨ３．５～６に維持される。培養物のｐＨ調整は、アンモニア等の通常のｐＨ調整剤によって行われ得る。本発明における培養物のｐＨは、培養温度２８℃において測定された値をいう。培養物のｐＨは、培養槽に備え付けた電極で測定することができる。培養期間は、４～１０日間が好ましい。
培養後、培養物から目的のセルラーゼを回収する。糸状菌セルラーゼ等の分泌型セルラーゼの場合、培養上清からセルラーゼを回収することができる。セルラーゼが細胞中に含まれている場合、細胞を破壊してセルラーゼを含む画分を取り出し、セルラーゼを回収することができる。セルラーゼの回収は、当該分野で通常使用される方法、例えば、傾斜法、膜分離、遠心分離、電気透析法、イオン交換樹脂の利用、蒸留、塩析等、又はこれらの組み合わせにより、行うことができる。回収したセルラーゼを、さらに単離又は精製してもよい。
目的のセルラーゼが培養上清中に分泌される分泌型セルラーゼの場合、本発明でセルラーゼの製造に使用された微生物は、繰り返し使用することができる。すなわち、培養上清と分離した微生物細胞を回収し、これを新たな培地で誘導炭素基質と非誘導炭素基質の存在下で培養することで、再びセルラーゼを製造することができる。
本発明のセルラーゼの製造方法は、微生物の培養と、培養物に蓄積したセルラーゼの回収及び培地の入れ替えとを交互に行う回分式方法であってもよく、又は、一部の微生物と培地を断続的もしくは連続的に入れ替えながら微生物の培養とセルラーゼの回収とを並行して行う半回分式もしくは連続的な方法であってもよい。
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）培養条件
（菌種培養）
トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株をセルロース含有培地で培養することで、セルラーゼを生産した。種菌培養として５００ｍＬフラスコに培地５０ｍＬを加え、１×１０5個／ｍＬとなるようＰＣ－３－７株の胞子を植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）にて振とう培養した。培地組成は表１のとおりである。菌種培養は、２日間行った。
（菌種培養）
トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株をセルロース含有培地で培養することで、セルラーゼを生産した。種菌培養として５００ｍＬフラスコに培地５０ｍＬを加え、１×１０5個／ｍＬとなるようＰＣ－３－７株の胞子を植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍ（ＰＲＥＣＩ社、ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）にて振とう培養した。培地組成は表１のとおりである。菌種培養は、２日間行った。
（前培養）
初期培地は、粉末セルロース（ＫＣフロックＷ４００；日本製紙）２％、及び表２に示すその他の培地成分を含有した。該初期培地５００ｍＬを含む１Ｌ容ジャーファーメンターＢＭＺ－Ｐ（（株）バイオット）に、前記種菌培養液を１０％（ｖ／ｖ％）植菌して１日間培養して前培養液を得た。ジャーファーメンターの設定は以下のとおりとした：温度２８℃、通気量０．５ｖｖｍ、ｐＨ：４．５±０．１、撹拌数はＤＯ＝３．０ｐｐｍを保つよう変動。１０％（ｗ／ｗ％）のアンモニア水溶液により、培養液のｐＨが上記所定の範囲に維持されるように制御した。
初期培地は、粉末セルロース（ＫＣフロックＷ４００；日本製紙）２％、及び表２に示すその他の培地成分を含有した。該初期培地５００ｍＬを含む１Ｌ容ジャーファーメンターＢＭＺ－Ｐ（（株）バイオット）に、前記種菌培養液を１０％（ｖ／ｖ％）植菌して１日間培養して前培養液を得た。ジャーファーメンターの設定は以下のとおりとした：温度２８℃、通気量０．５ｖｖｍ、ｐＨ：４．５±０．１、撹拌数はＤＯ＝３．０ｐｐｍを保つよう変動。１０％（ｗ／ｗ％）のアンモニア水溶液により、培養液のｐＨが上記所定の範囲に維持されるように制御した。
（本培養）
初期培地は、粉末セルロース（ＫＣフックＷ４００；日本製紙）４％、及び表２に示すその他の培地成分を含有した。該初期培地１０００ｍＬを含む２Ｌ容ジャーファーメンターＢＭＺ－Ｐ（（株）バイオット）に、前記前培養液を１％（ｖ／ｖ％）植菌して７日間培養した。ジャーファーメンターの設定は以下のとおりとした：温度３０℃、通気量１．０ｖｖｍ、ｐＨ：４．５±０．１、撹拌数は可変で、ＤＯ＝２．０ｐｐｍを保つよう設定した。１０％（ｗ／ｗ％）のアンモニア水溶液により、培養液のｐＨが上記所定の範囲に維持されるように制御した。培養中、下記（２）～（３）の手順に従って、糸状菌の呼吸活性の変化率とセルロース供給速度を毎時測定した。フィードコントローラＤＦＲ（（株）バイオット）により、６０％（ｗ／ｗ％）グルコース水溶液量を流加した。グルコース水溶液の流加は、炭素濃度換算で０．１５～０．５０ｇ／Ｌ－初期培地／ｈで開始し、その後、セルロース供給速度に対するグルコース供給速度の比[グルコース（非誘導炭素）供給速度］／［セルロース（誘導炭素）供給速度]が下記表３の値になるように流加量を制御した（比較例１、実施例１～３）。
初期培地は、粉末セルロース（ＫＣフックＷ４００；日本製紙）４％、及び表２に示すその他の培地成分を含有した。該初期培地１０００ｍＬを含む２Ｌ容ジャーファーメンターＢＭＺ－Ｐ（（株）バイオット）に、前記前培養液を１％（ｖ／ｖ％）植菌して７日間培養した。ジャーファーメンターの設定は以下のとおりとした：温度３０℃、通気量１．０ｖｖｍ、ｐＨ：４．５±０．１、撹拌数は可変で、ＤＯ＝２．０ｐｐｍを保つよう設定した。１０％（ｗ／ｗ％）のアンモニア水溶液により、培養液のｐＨが上記所定の範囲に維持されるように制御した。培養中、下記（２）～（３）の手順に従って、糸状菌の呼吸活性の変化率とセルロース供給速度を毎時測定した。フィードコントローラＤＦＲ（（株）バイオット）により、６０％（ｗ／ｗ％）グルコース水溶液量を流加した。グルコース水溶液の流加は、炭素濃度換算で０．１５～０．５０ｇ／Ｌ－初期培地／ｈで開始し、その後、セルロース供給速度に対するグルコース供給速度の比[グルコース（非誘導炭素）供給速度］／［セルロース（誘導炭素）供給速度]が下記表３の値になるように流加量を制御した（比較例１、実施例１～３）。
（２）呼吸活性の測定
培養中、排ガス分析装置（ＤＥＸ－１５６２Ａ；株式会社バイオット）、及びバルブ付フローメータ（ＭＯＤＥＬ ＲＫ１２００；コフロック株式会社）により、培養液中のＣＯ２濃度（v/w%）と培養通気量（L/min）を毎時計測した。同時に培養液を５ｍＬ採取し、遠心分離（日立工機社製、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２、ローター型式：ＲＴ３Ｓ３、ローター設置アダプタ：５０ｍＬ ４×４本、チューブ寸法：直径３６．５ｍｍ、長さ１２０ｍｍ、３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により上清と固形分を分離した。上清は０．４５μｍのフィルター（材質：セルロースアセテート）により濾過後、後述のセルラーゼ生産性測定に供した。固形分は１５ｍＬのイオン交換水にて２回遠心分離にて洗浄し、凍結乾燥した。乾燥物の固形分量を計量し、培養液の乾燥固形分濃度を算出した。
培養中、排ガス分析装置（ＤＥＸ－１５６２Ａ；株式会社バイオット）、及びバルブ付フローメータ（ＭＯＤＥＬ ＲＫ１２００；コフロック株式会社）により、培養液中のＣＯ２濃度（v/w%）と培養通気量（L/min）を毎時計測した。同時に培養液を５ｍＬ採取し、遠心分離（日立工機社製、ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２、ローター型式：ＲＴ３Ｓ３、ローター設置アダプタ：５０ｍＬ ４×４本、チューブ寸法：直径３６．５ｍｍ、長さ１２０ｍｍ、３，０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により上清と固形分を分離した。上清は０．４５μｍのフィルター（材質：セルロースアセテート）により濾過後、後述のセルラーゼ生産性測定に供した。固形分は１５ｍＬのイオン交換水にて２回遠心分離にて洗浄し、凍結乾燥した。乾燥物の固形分量を計量し、培養液の乾燥固形分濃度を算出した。
培養液の乾燥固形分中の元素（窒素・炭素）量を、元素分析装置ｖａｒｉｏ ＥＬ ｃｕｂｅ（エレメンタール社）を用いて測定した。測定した窒素量及び炭素量を培養物量で除することで、それぞれ培養液中の全窒素濃度及び全炭素濃度を得た。同様に、種菌培養時の糸状菌体サンプルを元素分析し、菌体のＣ／Ｎ比を算出した。該算出したＣ／Ｎ比（Ｃ：４５％、Ｎ：７．９％、Ｃ／Ｎ比＝５．７）に該乾燥固形分中の窒素濃度を掛け算することで、該乾燥固形分中の菌体由来の炭素量を算出した（式（４））。次いで、式（５）に従ってセルロース由来炭素濃度を求めた。さらに、乾燥菌体中の炭素量を４５質量％として、式（６）により培養液中の菌体濃度（乾燥質量換算）を算出した。
菌体由来の炭素濃度[g-C/L]
＝ 乾燥固形分中のＮ濃度[g-N/L] × 5.7[菌体Ｃ／Ｎ比[g-C/g-N]] …(4)
セルロース由来炭素濃度[g-C/L]
＝ 乾燥固形分中全炭素濃度[g-C/L]－乾燥固形分中の菌体由来炭素濃度[g-C/L] …(5)
菌体濃度［g-dry cell/L-培養物］＝菌体由来の炭素濃度[g-C/L] ÷ ０．４５ …(6)
菌体由来の炭素濃度[g-C/L]
＝ 乾燥固形分中のＮ濃度[g-N/L] × 5.7[菌体Ｃ／Ｎ比[g-C/g-N]] …(4)
セルロース由来炭素濃度[g-C/L]
＝ 乾燥固形分中全炭素濃度[g-C/L]－乾燥固形分中の菌体由来炭素濃度[g-C/L] …(5)
菌体濃度［g-dry cell/L-培養物］＝菌体由来の炭素濃度[g-C/L] ÷ ０．４５ …(6)
下記式（１）’～（３）’に基づいて、糸状菌の呼吸活性の変化率を算出した。
呼吸活性［g-CO2/g-dry cell/h］
＝（CO2排出速度［g-CO2/L-培養物/h］）÷（菌体濃度［g-dry cell/L-培養物］ …(1)’
ここで、
g-CO2 ＝（CO2濃度[vol%]÷100 × 培養通気量[L/min]×60[min]）
÷（Vm × 44[CO2モル質量]） …(2)’
ここで、CO2濃度[vol%]：培養物中CO2濃度（vol%）
Vm：理想気体のモル体積＝22.4
L-培養物：培養物量（L）
呼吸活性の変化率 ＝｛｜時間t2における呼吸活性 － 時間t1における呼吸活性｜
÷（時間t1における呼吸活性）｝（t2＞t1, ｜t1－t2｜ = 1）…(3)’
呼吸活性［g-CO2/g-dry cell/h］
＝（CO2排出速度［g-CO2/L-培養物/h］）÷（菌体濃度［g-dry cell/L-培養物］ …(1)’
ここで、
g-CO2 ＝（CO2濃度[vol%]÷100 × 培養通気量[L/min]×60[min]）
÷（Vm × 44[CO2モル質量]） …(2)’
ここで、CO2濃度[vol%]：培養物中CO2濃度（vol%）
Vm：理想気体のモル体積＝22.4
L-培養物：培養物量（L）
呼吸活性の変化率 ＝｛｜時間t2における呼吸活性 － 時間t1における呼吸活性｜
÷（時間t1における呼吸活性）｝（t2＞t1, ｜t1－t2｜ = 1）…(3)’
（３）炭素基質供給速度の測定
続いて、式（５）で求めたセルロース由来の炭素濃度を用いて、式（７）に基づいて培養液に対するセルロース供給速度を算出した。
セルロース供給速度[g-誘導炭素基質由来の炭素/L-培養液/h]
＝ 時間t2におけるセルロース由来の炭素濃度 － 時間t1におけるセルロース由来の炭素濃度（t2＞t1, ｜t1－t2｜ = 1） …(7)
続いて、式（５）で求めたセルロース由来の炭素濃度を用いて、式（７）に基づいて培養液に対するセルロース供給速度を算出した。
セルロース供給速度[g-誘導炭素基質由来の炭素/L-培養液/h]
＝ 時間t2におけるセルロース由来の炭素濃度 － 時間t1におけるセルロース由来の炭素濃度（t2＞t1, ｜t1－t2｜ = 1） …(7)
グルコース供給速度は、フィードコントローラの設定値[グルコース水溶液/h]を基に算出した。水溶液中グルコース濃度を６０ｗ／ｗ％、グルコース中の炭素の質量割合を０．４（７２／１８０、ここでグルコースのモル質量１８０ｇ／ｍｏｌ、グルコース中の炭素のモル質量１２×６＝７２ｇ／ｍｏｌ）として、式（８）に基づいて培養液に対するグルコースの供給速度を算出した。
グルコース供給速度[g-非誘導炭素基質由来の炭素/L-培養物/h]
＝ フィードコントローラの設定値[g-グルコース水溶液/h]×水溶液中グルコース濃度(％)×グルコース中の炭素の質量割合÷培養物量[L]
＝ フィードコントローラの設定値[g/h]×0.6×0.4÷培養物量[L] …(8)
グルコース供給速度[g-非誘導炭素基質由来の炭素/L-培養物/h]
＝ フィードコントローラの設定値[g-グルコース水溶液/h]×水溶液中グルコース濃度(％)×グルコース中の炭素の質量割合÷培養物量[L]
＝ フィードコントローラの設定値[g/h]×0.6×0.4÷培養物量[L] …(8)
（４）セルラーゼ生産性測定
（２）で取得した培養上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて定量し、セルラーゼ濃度とした。定量では、０．１２５～０．７５ｍｇ／ｍＬのウシγグロブリン（ＢＧＧ）を標準物質とし、Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｓｓａｙ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＶｅｒｓａＭａｘ）にて５９５ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質濃度を計算した。得られた上清のタンパク質濃度［g-Protein/L］を、該上清のサンプリング時点までに供給された炭素濃度［g-C/L］で除することで糸状菌のセルラーゼ生産性［g-Protein/g-C］を算出した。比較例１の培養７日目のセルラーゼ生産性を１００％としたときの、培養１～７日での比較例１、実施例１、実施例２及び実施例３の相対セルラーゼ生産性を求めた。比較例１及び実施例１～３の菌体の呼吸活性変化率及び炭素基質の供給速度比の変化、ならびに培養７日目の相対セルラーゼ生産性を表３に示す。また培養１～７日目の相対セルラーゼ生産性を表４及び図１に示す。
（２）で取得した培養上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法にて定量し、セルラーゼ濃度とした。定量では、０．１２５～０．７５ｍｇ／ｍＬのウシγグロブリン（ＢＧＧ）を標準物質とし、Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｓｓａｙ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製、ＶｅｒｓａＭａｘ）にて５９５ｎｍの吸光度を測定し、タンパク質濃度を計算した。得られた上清のタンパク質濃度［g-Protein/L］を、該上清のサンプリング時点までに供給された炭素濃度［g-C/L］で除することで糸状菌のセルラーゼ生産性［g-Protein/g-C］を算出した。比較例１の培養７日目のセルラーゼ生産性を１００％としたときの、培養１～７日での比較例１、実施例１、実施例２及び実施例３の相対セルラーゼ生産性を求めた。比較例１及び実施例１～３の菌体の呼吸活性変化率及び炭素基質の供給速度比の変化、ならびに培養７日目の相対セルラーゼ生産性を表３に示す。また培養１～７日目の相対セルラーゼ生産性を表４及び図１に示す。
Claims (7)
- セルラーゼの製造方法であって、
セルロース及びグルコースの存在下でトリコデルマ菌を培養すること、及び
該トリコデルマ菌の呼吸活性を経時的に測定すること、
を含み、
該トリコデルマ菌の呼吸活性の変化率が０．１以上である期間において、下記式Ａで表される比Ｒが１００以下である、
式Ａ：Ｒ＝グルコースの供給速度／セルロースの供給速度
方法。 - 前記比Ｒが５０以下である、請求項１記載の方法。
- 前記比Ｒが１０以下である、請求項１記載の方法。
- 前記トリコデルマ菌の呼吸活性の変化率が０．１以上である期間に続く、該トリコデルマ菌の呼吸活性の変化率が０．０１以上である期間において、前記比Ｒが１００以下である、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
- 前記セルロースは培養槽にバッチ添加される、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
- 前記グルコースは培養槽に流加される、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
- 前記トリコデルマ菌がトリコデルマ・リーゼイ又はその変異株である、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP2019207894A JP7446089B2 (ja) | 2019-11-18 | 2019-11-18 | セルラーゼの製造方法 |
| BR112022009617A BR112022009617A2 (pt) | 2019-11-18 | 2020-11-18 | Método para produzir celulase |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JP2021078392A JP2021078392A (ja) | 2021-05-27 |
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| BR (1) | BR112022009617A2 (ja) |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2010536390A (ja) | 2007-08-30 | 2010-12-02 | アイオジェン エナジー コーポレイション | セルラーゼを生成するための方法 |
| JP2014521359A (ja) | 2011-08-19 | 2014-08-28 | イエフペ エネルジ ヌヴェル | 低い酸素移動容量係数ＫＬａを有する、発酵槽に適した糸状菌を用いるセルラーゼの生産方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5918987B2 (ja) * | 1980-03-10 | 1984-05-01 | 日立造船株式会社 | セルラ−ゼの生産方法 |
-
2019
- 2019-11-18 JP JP2019207894A patent/JP7446089B2/ja active Active
-
2020
- 2020-11-18 BR BR112022009617A patent/BR112022009617A2/pt unknown
- 2020-11-18 WO PCT/JP2020/042903 patent/WO2021100737A1/ja active Application Filing
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PLOS ONE，2018年，13(5), e0196984，p.1-15 |
| SZABO, I. J. et al.，Optimized cellulase production by phanerochaete chrysosporium: control of catabolite repression by f，Journal of Biotechnology，1996年，vol.48，p.221-230 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JP2021078392A (ja) | 2021-05-27 |
| BR112022009617A2 (pt) | 2022-08-02 |
| WO2021100737A1 (ja) | 2021-05-27 |
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