JP7360386B2 - タンパク質の製造方法 - Google Patents
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(特許文献1)特開2015-39349号公報
(特許文献2)特表平11-512930号公報
(特許文献3)米国特許公開公報第2008/0199908号
(特許文献4)中国特許登録公報第101967501号
(非特許文献1)Appl. Environ. Microbiol., 63:1298-1306 (1997)
(非特許文献2)Curr. Genomics, 14:230-249 (2013)
(非特許文献3)Journal of Biotechnology, 104:155-172 (2003)
(非特許文献4)The Chinese Journal of Process Engineering, 11(3):492-496 (2011)
(非特許文献5)Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 48:319-384 (1990)
(非特許文献6)日本農芸化学会誌, 36:305-310 (1962)
(非特許文献7)Journal of Basic Microbiology, 23(5):303-312 (1983)
〔2〕好ましくは、前記微生物の培養がセルロース及びセロビオースからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で行われる、〔1〕記載の製造方法。
〔3〕好ましくは、前記微生物が、セルロース誘導性プロモーター又はセロビオース誘導性プロモーターを含み、
該プロモーターが、
好ましくは糸状菌セルラーゼ遺伝子プロモーター又は糸状菌キシラナーゼ遺伝子のプロモーターであり、
より好ましくはトリコデルマ属菌のセルラーゼ遺伝子プロモーター又はトリコデルマ属菌のキシラナーゼ遺伝子のプロモーターである、
〔2〕記載の製造方法。
〔4〕好ましくは、前記プロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子が連結されている、〔3〕記載の製造方法。
〔5〕好ましくは、前記プロモーターが糸状菌セルラーゼ遺伝子プロモーターであり、前記タンパク質が酵素である〔4〕記載の製造方法。
〔6〕前記タンパク質が、好ましくは酵素であり、好ましくは、バイオマス分解又はバイオマス糖化に関わる酵素であり、より好ましくはセルラーゼであり、
該バイオマス分解又はバイオマス糖化に関わる酵素が、好ましくは糸状菌由来の酵素であり、より好ましくはトリコデルマ属菌由来の酵素であり、さらに好ましくは糸状菌由来セルラーゼであり、さらに好ましくはトリコデルマ属菌由来セルラーゼである、
〔4〕又は〔5〕記載の製造方法。
〔7〕好ましくは、前記グリコシルアミンが初期培地に添加されている、〔1〕~〔6〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔8〕前記グリコシルアミンの添加量が、初期培地1Lあたり、好ましくは50g以下、より好ましくは30g以下、さらに好ましくは0.5~50g、さらに好ましくは0.5~30g、さらに好ましくは0.5~20g、さらに好ましくは1~10gである、〔7〕記載の製造方法。
〔9〕好ましくは、前記グリコシルアミンが培養物に流加される、〔1〕~〔8〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔10〕前記グリコシルアミンの流加量が、初期培地1Lあたり、好ましくは5g/hr以下、より好ましくは4g/hr以下、さらに好ましくは0.005~4g/hr、さらに好ましくは0.01~3g/hrである、〔9〕記載の製造方法。
〔11〕好ましくは、前記グリコシルアミンが、初期培地に添加され、かつ培養物に流加され、該培養物中のグリコシルアミンの含有量が、該培養物1Lあたり、好ましくは0.5~50g、より好ましくは0.5~20g、さらに好ましくは1~10gである、〔1〕~〔10〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔12〕好ましくは、前記グリコシルアミンを含む水溶液が流加され、該水溶液中におけるグリコシルアミンの含有量が、好ましくは2~90質量%、より好ましくは2~50質量%である、〔9〕~〔11〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔13〕好ましくは、グルコースとアンモニアとの混合物を流加しながら微生物を培養することを含む、〔12〕記載の製造方法。
〔14〕前記混合物を、該混合物に添加されたグルコースの量に換算して、初期培地1Lあたり、好ましくは8g/hr以下、より好ましくは6g/hr以下、さらに好ましくは0.05~8g/hr、さらに好ましくは0.1~6g/hrで流加する、〔13〕記載の製造方法。
〔15〕前記混合物の流加により、培養物のpHを、好ましくはpH3~7、より好ましくはpH3.5~6に調整する、〔13〕又は〔14〕記載の製造方法。
〔16〕前記混合物が、グルコースとアンモニアとを、質量比で好ましくは0.5~10:1、より好ましくは2~8:1で含む混合物である、〔13〕~〔15〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔17〕好ましくは、前記混合物が100mLあたり2~90gのグルコースを含む、〔13〕~〔16〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔18〕前記グリコシルアミンを含む水溶液又は前記グルコースとアンモニアとの混合物のpHが、25℃で、好ましくはアルカリ性、より好ましくはpH8以上、さらに好ましくはpH9以上、さらに好ましくはpH10以上であり、かつ好ましくはpH13以下である、〔12〕~〔17〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔19〕前記グリコシルアミンが、好ましくは、β-D-グルコピラノシルアミン、β-D-マンノピラノシルアミン、及びβ-D-ガラクトピラノシルアミンからなる群より選択される少なくとも1種であり、より好ましくはβ-D-グルコピラノシルアミンである、〔1〕~〔18〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔20〕前記培養において、培養物のpHを、好ましくはpH3~7、より好ましくはpH3.5~6に調整する、〔1〕~〔19〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔21〕前記微生物が糸状菌である、〔1〕~〔20〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔22〕前記糸状菌がトリコデルマ属菌である、〔21〕記載の製造方法。
〔23〕前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイである、〔22〕記載の製造方法。
〔24〕好ましくは、前記微生物が糸状菌であり、前記タンパク質が、好ましくはバイオマス分解又はバイオマス糖化に関わる酵素であり、より好ましくはセルラーゼである、〔2〕~〔23〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔25〕好ましくは、前記糸状菌がトリコデルマ属菌である、〔24〕記載の製造方法。
〔26〕前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイである、〔25〕記載の製造方法。
〔27〕好ましくは、前記培養物中におけるセルロース又はセロビオースの濃度が、セルロース及びセロビオースの合計濃度として1~15質量/容量%である、〔2〕~〔26〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔28〕好ましくは、前記微生物の培養物からタンパク質を回収することをさらに含む、〔1〕~〔27〕のいずれか1項記載の製造方法。
200mLのメタノールに80gのD-グルコースと2gの塩化アンモニウムを加え、13℃で溶解するまでアンモニアガスを吹き込んだ。溶解後4℃にて静置することで結晶を得た。得られた結晶をろ過にて回収後、メタノールにて洗浄後、乾燥させ、β-D-グルコピラノシルアミンを得た。得られたβ-D-グルコピラノシルアミンを以下の実施例で用いた。
トリコデルマ・リーセイX3AB1株(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,2012,174:1-9;以下、X3AB1株と呼ぶ)をセルロース含有培地で培養することで、セルラーゼを含むタンパク質を生産した。前培養として500mLフラスコに培地50mLを加え、1×105個/mLとなるようX3AB1株の胞子を植菌し、28℃、220rpm(PRECI社、PRXYg-98R)にて振とう培養した。培地組成は以下の通りである:1%グルコース、0.14% (NH4)2SO4、0.2% KH2PO4、0.03% CaCl2・2H2O、0.03%MgSO4・7H2O、0.1% Bacto Peptone(BD Difco)、0.05% Bacto Yeast extract(BD Difco)、0.1% Tween 80、0.1% Trace element、50mM酒石酸バッファー(pH4.0)。Trace elementの組成は以下の通りである:6mg H3BO3、26mg (NH4)6Mo7O24・4H2O、100mg FeCl3・6H2O、40mg CuSO4・5H2O、8mg MnCl2・4H2O、200mg ZnCl2を蒸留水にて100mLにメスアップ。
本培養の初期培地にβ-D-グルコピラノシルアミンを0.5%添加したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
本培養の培養中、β-D-グルコピラノシルアミンの8%水溶液を表1に示す条件で培地に流加(培地仕込み量あたり計0.2%のβ-D-グルコピラノシルアミンを流加)したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
比較例1、及び実施例1-2で得られた培養液を遠心分離し、次いでメンブレンフィルター25CS020AN(アドバンテック)にて菌体と上清を分離した。上清のタンパク質の濃度をbradford法にて測定した。bradford法に基づくQuick Startプロテインアッセイ(BioRad)を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質とした検量線をもとに上清のタンパク質濃度を計算し、タンパク質生産量とした。比較例1の培養3日目のタンパク質生産量を100%としたときの、比較例1、及び実施例1-2の培養2日目、3日目及び4日目の相対タンパク質生産量を図1に示す。実施例1では培養3日目において、実施例2では培養4日目において最大生産性を示し、いずれにおいても比較例1よりも20%以上高い生産性を示した。以上から、グリコシルアミンを培地原料として用いることで、培地成分に予め添加した場合においても、また培養中に流加した場合においても、タンパク質生産量が大きく向上することが明らかとなった。
本培養の培養中、40%グルコース水溶液を表2に示す条件で培養物に流加したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
本培養の培養中、38%グルコース/2%β-D-グルコピラノシルアミン水溶液を表2に示す条件で培養物に流加したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
本培養の培養中、35%グルコース/5%β-D-グルコピラノシルアミン水溶液を表2に示す条件で培養物に流加したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
本培養の培養中、40%グルコース水溶液を表3に示す条件で培養物に流加したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
本培養の培養中、38%グルコース/2%β-D-グルコピラノシルアミン水溶液を表3に示す条件で培養物に流加したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
本培養の培養中、35%グルコース/5%β-D-グルコピラノシルアミン水溶液を表3に示す条件で培養物に流加したこと以外は、比較例1と同様の手順で微生物の培養を行い、培養液をサンプリングした。
比較例2-3、及び実施例3-6で得られた培養液について、試験1と同様にタンパク質生産量を測定した。比較例1の培養3日目のタンパク質生産量を100%としたときの、比較例2-3、及び実施例3-6における最大生産時の相対タンパク質生産量を図2に示す。培養物中のβ-D-グルコピラノシルアミン添加量が高くなるにつれてタンパク質生産性が向上する傾向が確認された。また、流加液の流加開始のタイミングと流加速度が異なる比較例2、実施例3-4と比較例3、実施例5-6とを比較すると、早くから少量ずつ流加を開始した場合の方が高い生産性を示す傾向が確認された。以上から、培養物へのグリコシルアミンの添加は、グルコースなどの別の炭素源とともに添加した場合においても、タンパク質生産性を向上させることが明らかとなった。
Claims (14)
- グリコシルアミンの存在下で微生物を培養することを含む、タンパク質の製造方法であって、
該微生物がトリコデルマ属菌であり、
該グリコシルアミンが培養物に流加される、
タンパク質の製造法。 - 前記微生物の培養がセルロース及びセロビオースからなる群より選択される少なくとも1種の存在下で行われる、請求項1記載の製造方法。
- 前記微生物がセルロース誘導性プロモーター又はセロビオース誘導性プロモーターを含む、請求項2記載の製造方法。
- 前記プロモーターの下流に前記タンパク質をコードする遺伝子が連結されている、請求項3記載の製造方法。
- 前記プロモーターが糸状菌セルラーゼ遺伝子プロモーターであり、前記タンパク質が酵素である、請求項4記載の製造方法。
- 前記タンパク質がセルラーゼである、請求項5記載の製造方法。
- 前記グリコシルアミンがグルコースとともに培養物に流加される請求項1~6のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記グリコシルアミンの流加量が初期培地1Lあたり5g/hr以下である、請求項1~7のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記グリコシルアミンがβ-D-グルコピラノシルアミンである、請求項1~8のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記培養において、培養物のpHを3~7に調整する、請求項1~9のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項1~10のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記タンパク質がバイオマス分解又はバイオマス糖化に関わる酵素である、請求項1~11のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記微生物の培養物中におけるセルロース及びセロビオースからなる群より選択される少なくとも1種の合計濃度が1~15質量/容量%である、請求項2~12のいずれか1 項記載の製造方法。
- 前記微生物の培養物からタンパク質を回収することをさらに含む、請求項1~13のいずれか1項記載の製造方法。
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