JP7418485B2 - ファブリー病の治療のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本願は、2016年10月20日に出願された米国仮出願第62/410,543号、2017年1月9日に出願された米国仮出願第62/444,093号、2017年2月13日に出願された米国仮出願第62/458,324号、2017年5月5日に出願された米国仮出願第62/502,058号、2017年6月7日に出願された米国仮出願第62/516,373号、および2017年8月31日に出願された米国仮出願第62/552,792号の利益を主張し、これらの開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
さらに、α-GalA調製物で治療した被験体における抗α-GalA抗体の発生などの免疫反応を含む、有害反応が、ERTと関連する。実際、アガルシダーゼアルファで治療した男性の50%およびアガルシダーゼベータで治療した男性の88%が、α-GalA抗体を発生させた。重要なことに、それらの抗体のかなりの割合が中和抗体であり、したがって療法の治療効果を低減する(Meghdariら(2015年)PLoS One、10巻(2号):e0118341頁、Doi:10.1371/journal.pone.0118341)。さらに、ERTは、すべての患者において疾患の進行を停止させるとは限らない。
したがって、例えば発現される導入遺伝子によってコードされる遺伝子産物を治療的に適切なレベルで送達するための、ファブリー病を治療するために使用することができる、ゲノム編集を通しての治療を含むERT以外の方法および組成物の必要性がまだある。
方法の実践、ならびに本明細書に開示の組成物の調製および使用は、別途示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNA、および当分野の技術の範囲内の関連分野における従来の技法を用いる。これらの技法は、文献内で十分に説明される。例えば、Sambrookら MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989およびThird edition,2001;Ausubelら,CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987および定期的最新版;METHODS
IN ENZYMOLOGYのシリーズ,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,編),Academic Press,San Diego,1999;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Beckerら)Humana Press,Totowa,1999を参照されたい。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用され、線状または環状構造であり、かつ一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的であると解釈されるべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基部分、糖部分、および/またはリン酸部分において修飾されるヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート骨格)を包含することができる。概して、特定のヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対合する。
導入遺伝子が標的化された形式でゲノムに組み込まれるように、細胞のゲノムの切断のための導入遺伝子およびヌクレアーゼを有するドナー分子のインビボ切断のために有益である、少なくとも1つのZFN、TALEN、ホーミングエンドヌクレアーゼならびにCRISPR/Casおよび/またはTtagoガイドRNAを含む系を限定されずに含む、任意のヌクレアーゼを本発明の実施において使用することができる。したがって、本明細書において、選択された遺伝子を切断する1つまたは複数のヌクレアーゼを含む組成物が記載され、その切断は、遺伝子のゲノム改変をもたらす(例えば、切断される遺伝子に対する挿入および/または欠失)。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼの1つまたは複数は、天然に存在する。他の実施形態では、ヌクレアーゼの1つまたは複数は天然に存在しない、すなわち、DNA結合性分子(DNA結合性ドメインとも呼ばれる)および/または切断ドメインにおいて操作される。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのDNA結合性ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更することができる(例えば、選択された標的部位に結合するように操作されるZFP、TALEおよび/またはCRISPR/CasのsgRNA)。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種のDNA結合性ドメインおよび切断ドメインを含む(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ;TAL-エフェクタードメインDNA結合性タンパク質;異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼDNA結合性ドメイン)。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ttago系のCRISPR/Casなどの系を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ドナー分子への結合および/または細胞のゲノム中の目的領域への結合のために、メガヌクレアーゼ(ホーミングエンドヌクレアーゼ)DNA結合性ドメインを用いる。天然に存在するメガヌクレアーゼは15~40塩基対の切断部位を認識し、4つのファミリー:LAGLIDADGファミリー、GIY-YIGファミリー、His-CystボックスファミリーおよびHNHファミリーに一般的に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevIIおよびI-TevIIIが含まれる。それらの認識配列は、公知である。米国特許第5,420,032号;米国特許第6,833,252号;Belfortら(1997年)Nucleic AcidsRes.、25巻:3379~3388頁;Dujonら(1989年)Gene、82巻:115~118頁;Perlerら(1994年)Nucleic Acids Res.、22巻、1125~1127頁;Jasin(1996年)Trends Genet.、12巻:224~228頁;Gimbleら(1996年)J. Mol. Biol.、263巻:163~180頁;Argastら(1998年)J. Mol. Biol.、280巻:345~353頁およびNew England Biolabsカタログも参照。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのDNA結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Chevalierら(2002年)Molec. Cell、10巻:895~905頁;Epinatら(2003年)Nucleic Acids Res.、31巻:2952~2962頁;Ashworthら(2006年)Nature、441巻:656~659頁;Paquesら(2007年)Current Gene Therapy、7巻:49~66頁;米国特許出願公開第20070117128号を参照。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのDNA結合性ドメインは、ヌクレアーゼ全体との関連で変更することができ(すなわち、ヌクレアーゼが同族切断ドメインを含むように)、または異種切断ドメインに融合することができる。
Gen Genet、218巻:127~136頁および国際公開WO第2010079430号を参照)。TALエフェクターはタンデムリピートの集中化ドメインを含有し、各反復配列は概ね34アミノ酸を含有し、それらはこれらのタンパク質のDNA結合特異性の鍵である。さらに、それらは核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する(レビューについては、Schornack Sら(2006年)J Plant Physiol、163巻(3号):256~272頁を参照)。さらに、植物病原細菌Ralstonia solanacearumでは、R.solanacearum次亜種1菌株GMI1000および次亜種4菌株RS1000において、XanthomonasのAvrBs3ファミリーに相同である、brg11およびhpx17と呼ばれる2つの遺伝子が見出された(Heuerら(2007年)Appl and Envir Micro、73巻(13号):4379~4384頁を参照)。これらの遺伝子はヌクレオチド配列がお互いと98.9%同一であるが、hpx17の反復配列ドメインの中の1,575bpが欠失している点で異なる。しかし、両遺伝子産物は、XanthomonasのAvrBs3ファミリータンパク質と40%未満の配列同一性を有する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,586,526号を参照。
Bio、16巻:251頁を参照)。Cas9とCpf1タンパク質との間の主な差は、Cpf1がtracrRNAを利用せず、したがってcrRNAだけを必要とすることである。FnCpf1 crRNAは長さが42~44ヌクレオチド(19ヌクレオチド反復配列および23~25ヌクレオチドスペーサー)であり、単一のステム-ループを含有し、それは二次構造を保持する配列変化を許容する。さらに、Cpf1 crRNAは、Cas9によって必要とされる約100ヌクレオチドの操作されたsgRNAよりかなり短く、FnCpflのPAM要件は置換された鎖の上の5’-TTN-3’および5’-CTA-3’である。Cas9およびCpf1は標的DNAにおいて二本鎖切断を形成するが、Cas9はガイドRNAのシード配列の中で平滑末端切断を形成するためにそのRuvC-およびHNH様ドメインを使用し、一方Cpf1は、シードの外で互い違いの切断(staggered cut)を形成するためにRuvC様ドメインを使用する。Cpf1は重要なシード領域から離れて互い違いの切断を形成するので、NHEJは標的部位を破壊せず、したがって、所望のHDR組換え事象が起こるまで、Cpf1が同じ部位を切断し続けることができることを確実にする。したがって、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Cas」は、Cas9およびCfp1タンパク質の両方を含むものと理解される。したがって、本明細書で使用される場合、「CRISPR/Cas系」は、ヌクレアーゼおよび/または転写因子系の両方を含む、CRISPR/Casおよび/またはCRISPR/Cfp1系の両方を指す。
任意の適する切断ドメインは、DNA結合性ドメインに作用的に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ZFP DNA結合性ドメインはヌクレアーゼドメインに融合されて、ZFN-その操作された(ZFP)DNA結合性ドメインを通してその意図した核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性によりZFP結合部位の近くでDNAを切断させることができる機能的実体-を形成した。例えば、Kimら(1996年)Proc Natl Acad Sci USA、93巻(3号):1156~1160頁を参照。用語「ZFN」は、標的遺伝子を切断するために二量体化するZFNの対を含む。より近年、ZFNは様々な生物体におけるゲノム改変のために使用されている。例えば、米国特許出願公開第20030232410号;同第20050208489号;同第20050026157号;同第20050064474号;同第20060188987号;同第20060063231号;および国際公開第WO07/014275号を参照。同様に、TALE DNA結合性ドメインは、TALENを形成するために、ヌクレアーゼドメインに融合された。例えば、米国特許第8,586,526号を参照。DNAに結合し、切断ドメイン(例えば、Casドメイン)に会合して標的化切断を誘導する単一ガイドRNA(sgRNA)を含むCRISPR/Casヌクレアーゼ系も、記載されている。例えば、米国特許第8,697,359号および同第8,932,814号および米国特許出願公開第20150056705号を参照。
Biolabs、Beverly、MA;およびBelfortら(1997年)Nucleic Acids Res.、25巻:3379~3388頁を参照。DNAを切断するさらなる酵素が公知である(例えば、S1ヌクレアーゼ;リョクトウヌクレアーゼ;膵臓のDNase I;ミクロコッカルヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linnら(編)Nucleases、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1993年、も参照)。これらの酵素の1つまたは複数(または、その機能的断片)は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
90:2764-2768、Kimら(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887、Kimら(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも1つのIIS型制限酵素由来の切断ドメイン(または切断ハーフドメイン)および1つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン(操作され得るか否かに関わらず)を含む。
上で詳細に記載されるように、DNAドメインは、遺伝子座、例えば、アルブミンまたはセーフハーバー遺伝子における任意の選択した配列に結合するように操作され得る。操作されたDNA結合ドメインは、天然に存在するDNA結合ドメインと比較して新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。合理的設計は、例えば、三重鎖(または四重鎖)ヌクレオチド配列および個々の(例えば、ジンクフィンガー)アミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するDNA結合ドメインの1つ以上のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、共有の米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号を参照されたい。TALエフェクタードメインの合理的設計も実行され得る。例えば、米国特許公開第20110301073号を参照されたい。
上記のように、例えば、変異遺伝子の補正のための、またはファブリー病において欠いているかまたは欠損しているタンパク質(例えば、α-GalA)をコードする遺伝子の発現増加のための、外因性配列(「ドナー配列」または「ドナー」とも呼ばれる)の挿入が提供される。ドナー配列はそれが置かれるゲノム配列と一般的に同一でないことは、容易に明らかになる。ドナー配列は、目的の位置で効率的なHDRを可能にするために、2つの相同領域(「相同アーム」)が隣接した非相同配列を含有することができる。さらに、ドナー配列は、細胞クロマチンにおいて目的領域に相同性でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンに相同性のいくつかの不連続な領域を含有することができる。例えば、通常は目的領域に存在しない配列の標的化挿入のために、前記配列はドナーの核酸分子に存在することができ、目的領域の配列に相同性の領域が隣接することができる。
本明細書において、遺伝子改変細胞、例えば、本明細書に記載される方法によって産生される細胞を含む、α-GalAタンパク質をコードする導入遺伝子を含む肝臓細胞または幹細胞も提供される。GLA導入遺伝子は、完全長であるか改変されてもよく、染色体外に発現させることができ、または1つまたは複数のヌクレアーゼを使用して細胞のゲノムの中に標的化された形式で組み込むことができる。ランダム組み込みと異なって、ヌクレアーゼ媒介標的化組み込みは、導入遺伝子が指定された遺伝子に組み込まれることを確実にする。導入遺伝子は、標的遺伝子の中の任意の場所に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子はヌクレアーゼ結合性および/または切断部位にまたはその近くに、例えば、切断部位および/または結合部位から1~300塩基対(または、その間の任意の数の塩基対)上流または下流の範囲内に、より好ましくは切断および/または結合部位のいずれの側から1~100塩基対(または、その間の任意の数の塩基対)の範囲内に、さらにより好ましくは切断および/または結合部位のいずれの側から1~50塩基対(または、その間の任意の数の塩基対)の範囲内に組み込まれる。ある特定の実施形態では、組み込まれる配列は、いかなるベクター配列(例えば、ウイルスベクター配列)も含まない。
本明細書に記載されるヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドおよび/または組成物(例えば、細胞、タンパク質、ポリヌクレオチド等)は、任意の適する手段によってインビボまたはエクスビボで送達することができる。
Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm(編)(1995)、およびYuら,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照されたい。
本発明の方法は、ファブリー病(例えばリソソーム蓄積症)の治療および/または予防を企図する。治療は、必要とされる酵素の発現および血流への放出のための、細胞中のセーフハーバー遺伝子座(例えばアルブミン)における修正疾患関連GLA導入遺伝子の挿入を含むことができる。修正α-GalAをコードする導入遺伝子は、野生型または改変されたタンパク質をコードすることができ;および/または、コドン最適化GLA導入遺伝子;および/またはタンパク質を機能的に変更することなくエピトープを除去することができる導入遺伝子を含むことができる。一部の場合、本方法は、必要とされる酵素の発現および血流への放出のために、細胞へのα-GalAをコードする導入遺伝子を発現するエピソームの挿入を含む。血流への産物の放出のための肝臓細胞などの分泌細胞への挿入は、特に有益である。本発明の方法および組成物は、それらの細胞に由来する(それから発生した)成熟した細胞(例えば、RBC)が治療的なα-GalAタンパク質を含有するように、造血幹細胞に1つまたは複数の治療薬をコードするGLA導入遺伝子を供給することが所望される任意の状況において使用することもできる。これらの幹細胞はインビトロまたはインビボで分化させることができ、すべての患者のために使用することができる汎用性のドナー細胞型に由来することができる。さらに、細胞は、体内に細胞を運ぶために膜貫通タンパク質を含有することができる。治療は治療用導入遺伝子を含有する患者細胞の使用を含むこともでき、ここで、細胞はエクスビボで成長させられ、その後患者に導入して戻される。例えば、適するα-GalAコード導入遺伝子を含有するHSCは、骨髄移植を通して患者に挿入することができる。あるいは、α-GalAコード導入遺伝子を使用して編集された筋肉幹細胞またはiPSCなどの幹細胞を、筋肉組織に注入することもできる。
GLA導入遺伝子の発現のため、2つの手法を採用した。1つの手法はIn Vivo
Protein Replacement Platform(登録商標)(「IVPRP」)と呼ばれ、発現がアルブミンプロモーターによって駆動されるように、導入遺伝子をアルブミン遺伝子座に挿入するように操作されたヌクレアーゼを利用する(米国特許第9,394,545号および第9,150,847号を参照されたい)。第2の手法は、導入遺伝子のcDNAコピーを含むAAVによる細胞の形質導入を伴い、ここで、cDNAはプロモーターおよびその他の調節配列をさらに含む。これら2つの手法のためのGLA導入遺伝子発現カセットの設計を図1に示す。
HepG2/C3aおよびK562細胞の形質導入
cDNAおよびIVPRP(登録商標)系の両方で、標準的な技術を使用してHepG2細胞を形質導入した。
cDNA手法は、hAATプロモーター(Okuyamaら(1996年)Hum Gene Ther 7巻(5号):637~45頁)、HBB-IGGイントロン(ヒトベータ-グロビン遺伝子の第1のイントロン由来の5’-ドナー部位、および免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の分岐部および3’-受容部位から構成されるキメライントロン)、シグナルペプチド、コード配列(コード配列は任意選択でコドン最適化されている)およびウシ成長ホルモン(bGH)ポリAシグナル配列に連結したAPOEエンハンサーを含む、AAVにより送達される発現構築物の使用を含み得る。
ファブリーIVPRP(登録商標)には3つの成分がある:ヒトアルブミンイントロン1の特定の遺伝子座を切断するように設計されたZFN SBS47171およびSBS47898をコードする2つのrAAV2/6ベクター、ならびにhGLAドナー鋳型をコードする1つのrAAV2/6ベクター。ドナーhGLA鋳型は、ヒトアルブミンへのドナーの相同性誘導修復(HDR)組み込みを促進するための相同アームに隣接した、hGLA cDNAのコドン最適化バージョンである。
合成基質4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシド(4MU-α-Gal、Sigma)を使用して、蛍光定量アッセイでα-GalA活性を評価した。
Gb3およびリゾ-Gb3基質定量および分析:
質量分析により、選択されたマウス血漿および組織においてファブリー基質グロボトリアオシルセラミド(Gb3)を測定した。簡単に説明すると、組織を秤量し、組織破壊液(5%MeOH、95%水および0.1%酢酸(ascetic acid))で、組織1mgあたり液5mlの比で機械的に破壊した。次いで血漿または組織スラリー10μlを、シリコン処理したチューブ中の沈殿溶媒(溶液に添加された内部標準N-トリコサノイルセラミドトリヘキソシド(C23:0、Matreya)含有MeOH)90μlに添加し、ボルテックスし、振盪プレートに室温で30分間配置した。次いで試料を遠心分離し、試料10μlをガラスLC-MSバイアル中の単一のブランクマトリックス(DMSO/MeOH1:1+0.1%FA)90μlに添加した。GLAKOマウスに存在する主要なGb3種であるGb3鎖長24:0について試料を分析し、セラミドトリヘキソシド(Gb3、Matreya)から構成される標準曲線に対して測定した。
MiSeqシステム(Illumina、San Diego CA)を使用して、ZFN標的部位を配列分析に供した。ヒトアルブミン遺伝子座またはマウスアルブミン遺伝子座のZFN標的部位をまたぐ194bp断片の増幅のため、および2回目の増幅用の結合配列を導入するための一対のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このPCR増幅の産物を精製し、アンプリコンに特異的な識別子配列(「バーコード」)、およびシーケンシングオリゴヌクレオチドプライマーを結合させるために設計された末端領域を導入するように設計されたオリゴヌクレオチドを用いて2回目のPCRに供した。次いで、バーコード化アンプリコンの混合集団を、単一のアッセイチップで数千の試料の平行分析が可能な固相シーケンシング手順であるMiSeq分析に供した。
ファブリー病の動物モデルにおけるこれらの治療薬の効果を実証するため、HepG2細胞に使用したものと同一のAAV2/6 GLA cDNA構築物でGLAKOマウスを形質導入した。その他のGLAKOマウスを、マウスアルブミンを切断するように設計されたZFN SB-48641およびSB-31523をコードする2つのrAAV2/8ベクター、ならびにマウス相同アームとともにhGLA cDNAドナー鋳型をコードする1つのrAAV2/8ベクターからなるファブリーIVPRPのマウスバージョンで形質導入した。対照として、さらなるGLAKOマウスおよび野生型マウスに、ベクター粒子を含有しないAAVベクター製剤緩衝液(PBS、35nM NaCl、1%スクロース、0.05%プルロニックF-68、pH7.1)を注射した。動物には、AAV注射の前日から開始して2週間ごとにシクロホスファミド50mg/kgを投与した。マウスはすべて注射時点で4~12週齢であった。血漿α-GalA活性を測定するため毎週または隔週で顎下穿刺により血漿を採取しながら、2~3ヶ月間マウスをモニタリングした。実験終了時にマウスを安楽死させ、上述のように血漿、肝臓、腎臓、心臓および脾臓においてα-GalA活性を測定した。質量分析により、血漿、肝臓、腎臓、心臓および脾臓においてGb3およびリゾ-Gb3基質レベルを測定した。ファブリーIVPRPで処理したマウスについては、上述のようにMiSeqによって、肝臓組織におけるindelを測定した。
マウス肝臓を0.1Mクエン酸/0.2Mリン酸緩衝液、pH4.6中でホモジェナイズした。肝臓ホモジェネートを10分間煮沸し、次いで各試料のアリコートを、PNGase F(New England Biolabs、NEB)で、NEBプロトコールに従って1時間処理することにより脱グリコシル化した。
IVPRP(登録商標)手法:方法は実施例2で先に記載している。簡単に説明すると、各ZFNについては100k vg/細胞およびGLAドナーについては200k vg/細胞の用量、またはZFNおよびドナーについて300k/600kの用量のAAV2/6ZFNおよびhGLAドナーベクターで、それぞれHepG2/C3a細胞を形質導入した。
次に、2種類の手法(cDNAおよびIVPRP(登録商標))をインビボで試験した。構築物をAAV2/6またはAAV2/8にパッケージングし、次いでGLAノックアウト(GLAKO)マウスに静脈内注射した。これはファブリー病のマウスモデルである(Bangariら(2015年)Am J Pathol. 185巻(3号):651~65頁)。投与レジメン(表3)とともに、試験物品を以下(表2)に示す。
図4に示すように、cDNA処理した群のGLAKOマウスは、早くもAAV投与後7日目には血漿において超生理学的なα-GalA活性を示した。個々のマウスの結果を図に示す。血漿α-GalA活性を毎週測定し、高い、用量依存性の活性レベルが試験期間を通して持続した。血漿活性は、低用量(2.0e12vg/kg)群では野生型の最大6×、高用量(2.0e13vg/kg)群では野生型の280×に到達した。2ヶ月後にマウスを安楽死させ、肝臓および二次的な遠位組織でのα-GalA活性およびGb3蓄積について分析した。
90日の期間にわたって、IVPRP(登録商標)手法で投与されたGALKOマウスについて血漿レベルを計測した。データ(図6A)は、α-Glaタンパク質活性が、野生型マウスで見られた活性の約25~30%のレベルで血清において検出されたことを示している。この実験では、細胞の1群に軽度の免疫抑制レジメン(2週間ごとにシクロホスファミド50mg/kg)を与えた。肝臓におけるZFN活性(Indel)の測定により、軽度の免疫抑制で処理した動物はわずかに高いレベルのindelを有していた(図6B)が、両群が予期された範囲の存在するindelを有していたことが判明した。
また、GLAコード領域の設計を最適化し、シグナルペプチドを最適化するためのIVPRP(登録商標)手法についてドナー設計を検討した。始めに、GLAコード配列の前にα-Gal A(GLA)シグナルペプチド(配列:MQLRNPELHLGCALALRFLALVSWDIPGARA、配列番号1)を導入するようにドナー設計を変化させ、アルブミンシグナルペプチドとは別に新しい翻訳事象を引き起こすように、α-Gal Aシグナルペプチドの前にKozak配列(配列:GCCACCATG、配列番号2)を挿入した(図10を参照されたい、例は改変体#A、改変体#B)。さらに、代替のIDSシグナルペプチド(配列:MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALG、配列番号3)の使用について分析し(図10、改変体#H)、翻訳中にシグナルペプチドの5’側配列を除去するための、T.asigna由来の2A様配列(「T2A」)(Lukeら(2008年) J Gen Virol. 89巻(第4部):1036~1042頁)の使用についても分析した。新しい構築物を、これまでに記載されたようにHepG2/C3A細胞で試験した。
cDNA手法用のGLA導入遺伝子カセットも最適化した。α-Gal Aペプチド、IDS遺伝子(イズロン酸2-スルファターゼ)用シグナルペプチド、FIX遺伝子(第IX因子、(配列:MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAEC、配列番号4))およびアルブミン(配列:MKWVTFISLLFLFSSAYS、配列番号5)シグナルペプチドを含む様々なシグナルペプチドをコードする配列に導入遺伝子を連結させた(図13B)。さらに、GLA導入遺伝子を、代替の最適化されたcDNA発現ベクター(図13A、米国公開第20170119906号も)に挿入した。すべての構築物が、上述のようにインビトロでHepG2/C3A細胞において、1細胞あたりウイルスベクターコピー30~600千(K)の範囲の用量で試験され、IDSおよびFIX(F9)リーダー配列が、GLAまたはALB(アルブミン)リーダー配列の使用よりも高いα-GalA活性をもたらすことを示した(図14A)。cDNA改変体#4、#5および#6(図13)についてのデータを図14Bに示す。
IVPRP(登録商標)手法またはcDNA手法のいずれかで処理したマウス由来の血漿を、実施例2に記載されるようにα-GalAタンパク質の存在について分析した。さらに、試料をPNGaseFでも処理して、脱グリコシル化を引き起こした。
Hep2G細胞をAAV GLA cDNA改変体#4で形質導入し、5日後に上清を収集し、α-Gal A活性について試験し、実施例2に記載されるように上清をK562細胞の培養に使用した。
cDNA改変体#4(図13を参照されたい)または初期cDNA構築物(図13B)を含むAAV5.0e10VG(2.0e12VG/kg)を含有する製剤緩衝液200μLでGLAKOマウスを静脈内処理し、2ヶ月の期間にわたり血漿α-GalA活性を分析した。改変体#4で処理したGLAKOマウスの血漿におけるα-GalA活性は、初期cDNA構築物で観察された活性の約10×であった(図18A)。上述のように、2つの処理群について肝臓、心臓、腎臓および脾臓でも活性を測定し、図18Bに示す。さらに、処理したマウスの肝臓においてα-Gal Aタンパク質を分析し、上記で論じたようにPNGase FまたはEndo Hによる処理後の分子量の変化を観察した(図18C)。さらに、図32に示すように、初期および改変体#4cDNAで処理したGLAKOマウスはともに、試験した組織すべてにおいてファブリー基質濃度の低下を示した。
1.25e11VG/kg~5.0e12VG/kgの範囲の用量の、初期cDNA構築物(図13B)を含むAAVでGLAKOマウスを静脈内処理し、実施例4および5に記載されるように、6ヶ月の期間にわたり血漿α-GalA活性を分析した。
ZFNおよび様々な例示的なhGLAドナー構築物でGLAKOマウスを処理し、ゲノム改変、インビボでのGLA活性、およびインビボでのファブリー基質の減少について上述のように評価した。実施例5を参照されたい。
野生型アンプリコン(挿入なし):
野生型アンプリコン(挿入なし):
野生型アンプリコン(挿入なし):
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
細胞において少なくとも1つのαガラクトシダーゼA(α-Gal A)タンパク質を発現させる方法であって、前記α-Gal Aタンパク質が前記細胞において発現されるように少なくとも1つの前記α-Gal Aタンパク質をコードするGLA導入遺伝子を前記細胞に投与することを含む、方法。
(項目2)
前記細胞がファブリー病の被験体中にある、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記導入遺伝子がcDNAを含む、項目1または項目2に記載の方法。
(項目4)
前記導入遺伝子が前記被験体の肝臓に投与される、項目2に記載の方法。
(項目5)
前記導入遺伝子がアルブミン遺伝子に組み込まれ、それから発現されるように、被験体の肝臓細胞において内因性アルブミン遺伝子を切断する1つまたは複数のヌクレアーゼを投与することをさらに含む、項目1から4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記導入遺伝子から発現される前記α-Gal Aタンパク質が前記被験体においてグリコスフィンゴリピドの量を2分の1以下に低下させる、項目1から5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記導入遺伝子が野生型GLA配列またはコドン最適化GLA配列を含む、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記導入遺伝子がシグナルペプチドをさらにコードする、項目1から7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
項目1から8のいずれかに記載の方法によって作製される、外因性GLA導入遺伝子を含む遺伝子改変細胞。
(項目10)
幹細胞または前駆細胞である、項目9に記載の遺伝子改変細胞。
(項目11)
前記細胞が肝臓細胞または筋細胞である、項目9または項目10に記載の遺伝子改変細胞。
(項目12)
前記GLA導入遺伝子が前記細胞のゲノムに組み込まれている、項目9から11のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
(項目13)
前記GLA導入遺伝子が前記細胞のゲノムに組み込まれていない、項目9から11のいずれかに記載の遺伝子改変細胞。
(項目14)
ファブリー病の治療のための、少なくとも1つのα-Gal Aタンパク質をコードするGLA導入遺伝子の使用。
(項目15)
ファブリー病の治療のための、少なくとも1つのα-Gal Aタンパク質をコードするGLA導入遺伝子を含む薬学的に許容される組成物。
(項目16)
ファブリー病の治療のためのα-Gal Aタンパク質を産生する方法であって、項目1から8のいずれかに記載の方法に従って単離細胞において前記α-Gal Aタンパク質を発現させること、および前記細胞によって産生される前記α-Gal Aタンパク質を単離することを含む、方法。
(項目17)
項目1から8のいずれかに記載の方法で使用するための、GLA導入遺伝子を含むベクター。
(項目18)
ウイルスベクターまたは脂質ナノ粒子(LNP)である、項目17に記載のベクター。
Claims (12)
- アルファ1-アンチトリプシン(hAAT)プロモーターに連結したアポリポタンパク質E(APOE)エンハンサー、ヒトヘモグロビンベータ(HBB)-IGGイントロン、シグナルペプチドをコードする配列、少なくとも1つのα-Gal Aタンパク質をコードするcDNA導入遺伝子、及びポリAシグナル配列を含む、アデノ随伴ウイルス(AAV)発現構築物。
- 前記シグナルペプチドが、α-Gal Aシグナルペプチドである、請求項1に記載のAAV発現構築物。
- 前記ポリAシグナル配列が、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列である、請求項1又は2に記載のAAV発現構築物。
- 前記導入遺伝子が、野生型α-Gal A配列又はコドン最適化α-Gal A配列を含む、請求項1から3のいずれか1項に記載のAAV発現構築物。
- 前記AAV発現構築物が、それを必要とする被験体において前記導入遺伝子から、少なくとも1つのα-Gal Aタンパク質を発現することができる、請求項1から4のいずれか1項に記載のAAV発現構築物。
- 前記導入遺伝子から発現される前記少なくとも1つのα-Gal Aタンパク質が、前記被験体において、グリコスフィンゴリピドの量を少なくとも2分の1に減少させる、請求項5に記載のAAV発現構築物。
- 前記導入遺伝子から発現される前記少なくとも1つのα-Gal Aタンパク質が、前記被験体において、グリコスフィンゴリピドの量を、1/2から1/100に、1/100から1/500に、又は1/500から1/1000に減少させる、請求項5に記載のAAV発現構築物。
- 前記導入遺伝子から発現される前記少なくとも1つのα-Gal Aタンパク質が、前記被験体において、グリコスフィンゴリピドの量を、1/10、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、又は1/100に減少させる、請求項5に記載のAAV発現構築物。
- 前記被験体が、ファブリー病を有する、請求項5から8のいずれか1項に記載のAAV発現構築物。
- 前記AAV発現構築物が、非経口的に投与される、請求項5から9のいずれか1項に記載のAAV発現構築物。
- 前記AAV発現構築物が、静脈内に投与される、請求項5から10のいずれか1項に記載のAAV発現構築物。
- それを必要とする被験体において少なくとも1つのαガラクトシダーゼA(α-Gal A)タンパク質を発現するための組成物であって、請求項1~11のいずれか1項に記載のAAV発現構築物を含む、組成物。
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