KR102474010B1 - 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102474010B1
KR102474010B1 KR1020217004409A KR20217004409A KR102474010B1 KR 102474010 B1 KR102474010 B1 KR 102474010B1 KR 1020217004409 A KR1020217004409 A KR 1020217004409A KR 20217004409 A KR20217004409 A KR 20217004409A KR 102474010 B1 KR102474010 B1 KR 102474010B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
artificial sequence
zinc finger
target site
globin
Prior art date
Application number
KR1020217004409A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210020174A (ko
Inventor
그레고리 제이 코스트
필립 디 그레고리
드미트리 구스친
마이클 씨 홈즈
제프리 씨 밀러
데이비드 파숀
에드워드 제이 레바
안드레아스 레익
표도르 우르노프
레이 장
Original Assignee
상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority to KR1020227041988A priority Critical patent/KR20220164090A/ko
Publication of KR20210020174A publication Critical patent/KR20210020174A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102474010B1 publication Critical patent/KR102474010B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C07K2319/81—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor containing a Zn-finger domain for DNA binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

유전 질환의 치료 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF A GENETIC CONDITION}
관련 출원의 상호-참조
본원은 2012년 8월 29일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/694,693 (이의 기재가 전부 본원에 참조로 포함됨)의 이점을 청구한다.
기술분야
본원은, 특히 이상혈색소증 (hemoglobinopathy)을 치료하기 위한, 조혈 줄기 세포의 게놈 조작 (engineering) 분야에 관한 것이다.
유전자 요법은 사람 의약의 새로운 시대를 위한 막대한 잠재력을 갖고 있다. 이들 방법론은 종전에 표준 의료 행위로는 다룰 수 없었던 병태의 치료를 가능하게 할 것이다. 특히 유망한 하나의 분야는, 세포가 이 세포에서 이전에는 생산되지 않았던 생성물을 발현하도록, 세포를 유전자 조작하는 능력이다. 이러한 기술의 이용 예는 새로운 치료 단백질을 암호화하는 유전자의 삽입, 세포 또는 개체에서 결여되어 있는 단백질을 암호화하는 암호화 서열의 삽입, 돌연변이된 유전자 서열을 포함하는 세포에서 야생형 유전자의 삽입 및 구조적 핵산을 암호화하는 서열, 예컨대 microRNA 또는 siRNA의 삽입을 포함한다.
전이유전자 (transgene)는, 전이유전자가 세포 자신의 게놈으로 통합되고 게놈에서 유지되도록, 다양한 방식을 통해 세포로 전달될 수 있다. 최근에, 선택된 게놈 유전자자리 (locus)로 표적된 삽입을 위한 부위-특이적 뉴클레아제를 사용하는 절단을 이용하는 전이유전자 통합 (integration) 전략이 개발되었다 (예를 들어, 공동-소유의 미국 특허 7,888,121 참조). 표적 유전자에 특이적인 뉴클레아제는, 전이유전자 작제물이 상동성 유도된 복구 (homology directed repair: HDR)에 의하거나 비-상동성 말단 연결 (non-homologous end joining: NHEJ) 유도된 과정 동안 말단 포착 (capture)에 의해 삽입되도록 사용될 수 있다. 표적된 유전자자리는 "세이프 하버 (safe harbor)" 유전자자리, 예를 들어, CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C (AAVS1으로도 알려짐) 유전자, 알부민 유전자 또는 Rosa 유전자를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20080299580; 20080159996; 201000218264; 20110301073; 20130177983 및 20130177960 및 미국 가출원 번호 61/823,689를 참조한다. 뉴클레아제-매개된 통합은, 전이유전자의 무작위 통합에 의존하는 전형적 통합 접근법에 비해, 정확한 전이유전자 위치결정을 가능하게 하여 유전자 사일런싱 또는 근접 종양유전자의 활성화에 대한 위험을 최소화시키므로, 개선된 전이유전자 발현, 증가된 안전성 및 발현 지속력에 대한 전망을 제공한다.
적혈구 (Red Blood Cell: RBC 또는 erythrocyte)는 혈액의 주요한 세포 성분이다. 사실, RBC는 사람에서 세포의 1/4를 차지한다. 성숙한 RBC는 핵 및 사람에서의 많은 다른 소기관이 없으며, 조직으로 산소를 운반할 뿐만 아니라 조직밖으로 이산화탄소를 운반하고 제거를 위해 다시 폐로 돌아가게 하는 기능을 하는 RBC에서 발견되는 금속단백질인 헤모글로빈으로 가득차 있다. 상기 단백질은 RBC의 건조 중량의 약 97%를 구성하고, 혈액의 산소 운반 능력을 약 70배 증가시킨다. 헤모글로빈은 2개의 α형 글로빈 쇄 및 2개의 β형 글로빈 쇄 및 4개의 헴 그룹을 포함하는 헤테로사량체이다. 성체에서, α2β2 사량체는 헤모글로빈 A (HbA) 또는 성체 헤모글로빈으로 지칭된다. 전형적으로, 알파 및 베타 글로빈 쇄는 약 1:1 비율로 합성되며, 이러한 비율은 헤모글로빈 및 RBC의 안정화 측면에서 중요한 것으로 보인다. 사실, 글로빈 유전자의 일 유형이 부적절하게 발현되는 일부 경우에 (하기 참조), 글로빈의 다른 유형의 발현을 (예를 들어, 특정한 siRNA를 사용하여) 감소시켜 이러한 1:1 비율을 회복하는 것이 돌연변이체의 세포 표현형의 일부 측면을 완화시킨다 (참조: Voon 등 (2008) Haematologica 93(8):1288). 발달 중인 태아에서는, 산소가 모의 혈류를 통해 아기 시스템에 전달될 수 있도록 헤모글로빈 A보다 산소에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 상이한 형태의 헤모글로빈인 태아 헤모글로빈 (HbF)이 생성된다. 태아 헤모글로빈은 또한 α 글로빈 쇄를 포함하며, 성체 β-글로빈 쇄 대신에 2개의 태아 γ-글로빈 쇄를 갖는다 (즉, 태아 헤모글로빈은 α2γ2이다). 임신 약 30주에 태아에서의 γ 글로빈 합성은 감소되기 시작하며 β 글로빈의 생성은 증가된다. 비록 일부 HbF가 성년까지 지속되기는 하지만 (총 헤모글로빈의 약 1 내지 3%), 신생아의 헤모글로빈은 약 10개월쯤에는 거의 모두 α2β2이다. γ의 생성으로부터 β로의 스위치 조절은 상당히 복잡하며, 주로 β 글로빈 발현의 동시적 상향-조절과 함께 γ 글로빈의 발현 하향-조절을 수반한다.
헤모글로빈 쇄를 암호화하는 서열에서의 유전적 결함은 겸상 적혈구 빈혈 및 탈라세미아를 포함한 이상혈색소증으로 알려진 다수의 질환에 책임이 있다. 이상혈색소증을 갖는 환자의 대부분에서, γ 글로빈을 암호화하는 유전자가 여전히 존재하나, 상기된 바와 같이 분만 즈음에 발생하는 일반적인 유전자 억압 때문에, 발현은 비교적 낮다.
미국에 있는 5000명의 사람 중 1명이 겸상 적혈구 질환 (SCD)을 가지며, 대부분 사하라 사막 이남의 아프리카 혈통의 사람이다. 겸상 적혈구 이형접합성이 말라리아에 대한 보호에 이점이 있는 것으로 보이므로, 이러한 특성은 오랜 시간 동안 선택될 수 있었으며, 사하라 사막 이남의 아프리카에서는 인구의 1/3이 겸상 적혈구 특성을 갖는 것으로 추정된다. 겸상 적혈구 질환은 발린이 6번째 아미노산에 있는 글루타민 대신 치환된 (DNA 수준에서는 GAG가 GTG로 치환된) β 글로빈 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기되며, 생성된 헤모글로빈은 "헤모글로빈 S" 또는 "HbS"라 지칭된다. 낮은 산소 조건 하에서, HbS의 데옥시 형태에서의 입체형태 이동은 E와 F 나선 사이의 단백질 상에 소수성 패치 (patch)를 노출시킨다. 헤모글로빈의 베타 쇄의 위치 6에서의 발린의 소수성 잔기는 소수성 패치와 화합할 수 있으므로, HbS 분자가 응집되고 섬유성 침전물을 형성하게 한다. 결과적으로, 이들 응집체는 RBC의 기형 또는 "겸상"을 초래하여 세포의 유연성을 상실시킨다. 겸상 RBC는 더이상 모세혈관계로 밀어붙일 수 없어 겸상 적혈구 환자에서는 혈관이 막히는 위기가 생길 수 있다. 또한, 겸상 RBC는 정상적 RBC보다 더 취약하며, 용혈되는 경향이 있어 결국 환자에서 빈혈을 초래한다.
겸상 적혈구 환자의 치료 및 관리는 항생제 치료, 통증 관리 및 급성 에피소드 동안 수혈을 수반하는 평생 동안의 문제이다. 하나의 접근법은 부분적으로 γ 글로빈의 생성을 증가시킴으로써 효과를 발휘하는 하이드록시우레아를 사용하는 것이다. 그러나, 장기간에 걸친 하이드록시우레아 요법의 장기간 부작용은 아직 알려져 있지 않으며, 이 치료는 바람직스럽지 않은 부작용을 제공하고 환자마다 다양한 효능을 가질 수 있다. 겸상 적혈구 치료의 효능 증가에도 불구하고, 환자의 기대 수명은 여전히 단지 50대 중반 내지 후반이며, 질환의 관련된 병적 상태는 환자의 삶의 질에 지대한 영향을 끼친다.
탈라세미아도 또한 헤모글로빈과 관련된 질환이며, 전형적으로 글로빈 쇄의 감소된 발현과 연루된다. 이는 유전자 조절 영역의 돌연변이를 통해 발생하거나 현을 감소시키는 글로빈 암호화 서열의 돌연변이로부터 발생할 수 있다. 알파 탈라세미아는 서아프리카 및 남아시아 혈통의 사람들과 연관되며, 말라리아 내성을 부여할 수 있다. 베타 탈라세미아는 전형적으로 그리스 및 터키와 이탈리아 연안 지역으로부터의 지중해 혈통의 사람들과 연관된다. 탈라세미아의 치료는 보통 혈액 수혈 및 철 킬레이트화 요법을 수반한다. 적합한 도너가 확인될 수 있는 경우, 골수 이식이 또한 중증의 탈라세미아를 갖는 사람들의 치료에 사용될 수 있지만, 이러한 절차는 상당한 위험을 가질 수 있다.
지금껏 제안되어온 SCD 및 베타 탈라세미아 모두의 치료를 위한 하나의 접근법은 HbF가 이상 성체 헤모글로빈을 기능적으로 대체하게 할 목적으로 γ 글로빈의 발현을 증가시키는 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 하이드록시우레아로의 SCD 환자의 치료는 부분적으로 γ 글로빈 발현을 증가시키는 이의 영향에 기인하여 성공적인 것으로 생각된다. HbF 재활성화 활성에 영향을 끼치는 것으로 밝혀진 화합물의 제1 그룹은 세포독성 약물이다. 약리학적 조작에 의해 감마-글로빈을 드 노보 (de novo) 합성하는 능력이 처음으로 실험 동물에서 5-아자시티딘을 사용하여 밝혀졌다 (DeSimone (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79(14):4428-31). 후속 연구들은 β-탈라세미아 및 겸상 적혈구 질환을 갖는 환자에서 HbF를 증가시키는 5-아자시티딘의 능력을 입증하였다 (Ley, 등, (1982) N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475, 및 Ley, 등, (1983) Blood 62: 370-380). 또한, 단쇄 지방산 (예: 부티레이트 및 유도체)도 실험 시스템에서 HbF를 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (Constantoulakis 등, (1988) Blood 72(6):1961-1967). 또한, 상승된 양의 HbF가 성년에도 지속되는 '유전성 태아 헤모글로빈 지속' (Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin: HPFH)으로 알려진 상태를 갖는 일 부류의 인구도 있다 (HPFH 이형접합체 중 10 내지 40%) (참조: Thein 등 (2009) Hum. Mol. Genet 18 (R2): R216-R223). 이는 드문 상태이기는 하지만, 임의의 관련된 베타 글로빈 이상의 부재 하에서, 심지어 개체의 헤모글로빈의 100%가 HbF이더라도, 임의의 유의한 임상적 증상과 연관되지 않는다. 베타 탈라세미아를 갖는 개체가 또한 동시-발생 HPFH를 갖는 경우, HbF의 발현은 질환의 중증도를 완화시킬 수 있다. 또한, 겸상 적혈구 질환의 자연스런 경과의 중증도는 환자마다 상당히 상이할 수 있으며, 이러한 다양성은 부분적으로 보다 가벼운 질환을 갖는 일부 환자가 보다 높은 수준의 HbF를 발현한다는 사실로 추적될 수 있다.
HbF의 발현을 증가시키기 위한 하나의 접근법은 생성물이 γ 글로빈 발현에 중요한 역할을 하는 유전자의 확인을 포함한다. 하나의 이러한 유전자는 림프구 발달시 이의 역할 때문에 처음으로 확인된 BCL11A이다. BCL11A는 γ 글로빈 발현의 단계 특이적 조절에 수반되는 것으로 생각되는 징크 핑거 단백질을 암호화한다. BCL11A는 성체 적혈구 전구 (precursor) 세포에서 발현되며, 이의 발현의 하향-조절은 γ 글로빈 발현을 증가시킨다. 또한, BCL11A mRNA의 스플라이싱은 발달 중에 조절되는 것으로 보인다. 배아 세포에서는 BCL11A-S 및 BCL11A-XS로 알려진 보다 짧은 BCL11A mRNA 변이체가 주로 발현되고, 성체 세포에서는 보다 긴 BCL11A-L 및 BCL11A-XL mRNA 변이체가 주로 발현되는 것으로 보인다 (참조: Sankaran 등 (2008) Science 322 p. 1839). BCL11A 단백질은 β 글로빈 유전자자리와 상호작용하여 이의 입체형태를 변화시킴으로써 상이한 발달 단계에서 이의 발현을 변화시키는 것으로 보인다. 또한, 또 다른 조절 단백질 KLF1이 γ 글로빈 발현의 조절에 수반되는 것으로 보인다. KLF1 수준은 직접적으로 BCL11A 수준에 비례하고 둘 모두 γ 글로빈 수준에 반비례하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, HbF의 지속적 발현을 갖는 몰타 가족에서, 가족은 KLF1 유전자의 이형접합 돌연변이를 갖는다 (Borg 등 (2010) Nat Genet, 42(9):801-805). KLF1 유전자 생성물은 생체내에서 BCL11A 유전자에 직접적으로 결합하는 것으로 보이므로, 이의 상향조절에 책임이 있을 수 있다 (참조: Borg 등 상기 참조; Bieker (2010) Nat Genet 42(9): 733-734; Zhou 등 (2010) Nat Genet 42(9):742-744). 따라서, KLF1이 BCL11A 발현을 자극하는 경우, 유도된 BCL11A의 작용은 γ 글로빈 및 HbF 생성을 억제할 것이다. BCL11A 유전자에 표적되는 억제성 RNA의 이용이 제시되었으나 (예를 들어, 미국 특허 공개 20110182867 참조), 이러한 기술은 수개의 잠재적 결점을 갖는다 (즉, 완전한 녹다운이 달성될 수 없고, 이러한 RNA의 전달이 문제가 될 수 있으며, RNA가 지속적으로 존재해야 하므로 평생 다수의 치료를 필요로 한다).
알파 탈라세미아는 또한 인구, 특히 아시아에서 널리 퍼져있으며, 알파 글로빈 이상 중 일부 유형은 사람에서 가장 일반적인 유전 장애인 것으로 생각된다. 세계의 열대 및 아열대 지역에서, 알파 글로빈 장애는 인구의 80 내지 90%에서 발견된다 (참조: Harteveld 및 Higgs (2010) Orphanet Journal of Rare Diseases 5:13).
사람은 염색체 16에 2개 카피의 알파 글로빈 유전자를 앞뒤로 나란히 가지므로 (α1 및 α2), 정상적인 이배체 세포에서 4개의 카피가 모두 함께 존재한다. α2 유전자는 일반적으로 α1 유전자보다 α-글로빈 mRNA가 2 내지 3배 더 많다. 이들 2개의 유전자의 직렬 (tandem) 조직은 알파 탈라세미아 환자에서 알파 글로빈 유전자의 커다란 결실의 높은 횡행과 연관될 수 있으며, 일반적으로 비-기능성 알파 글로빈 유전자의 수는 임의의 알파 탈라세미아의 중증도와 직접적으로 관련된다 (참조: Chui 등 (2003) Blood 101(3):791). 하나의 카피의 결실은 상당히 흔한 것으로 보이며 (아프리카계 미국인의 30% 및 사우디아라비아, 인도 및 태국에 살고 있는 사람의 60 내지 80%), 유전적 시험이 수행되지 않는 한, 일반적으로 개체에서 명확하지 않다. 2개의 카피 [동일한 염색체 상에서의 카피 (cis) 또는 각각의 염색체로부터 하나의 카피 (trans)]의 결실은 병에 시달리는 사람들을 경증 빈혈을 갖게 할 수 있다. 3개의 α 글로빈 유전자가 결실되는 경우, 이러한 개체는 단지 하나의 작용성 α 글로빈 유전자를 갖고, 중등도의 빈혈이 발견되나, 더욱 중요하게는, 중요한 α 글로빈 대 β 글로빈 비율이 깨진다. 4개의 베타 글루빈 쇄를 포함하는 β4 사량체가 종종 HbH로 알려진 병태인 단지 하나의 기능성 알파 글로빈 유전자를 갖는 환자에서 관측된다. β4 사량체는 산소를 결합할 수는 있으나 이를 말초로 방출하지 않아 HbH 질환으로 알려진 질환을 야기시킨다. HbH 질환을 갖는 개체는 짧아진 반감기를 갖고 쉽게 용혈을 겪어 빈혈을 증가시키는 RBC를 갖는다. 4개의 α 글로빈 유전자 모두의 상실은 보통 자궁내에서 치명적이다.
따라서, 이상 유전자를 교정하거나 다른 유전자들의 발현을 변화시키기 위해, 예를 들어, 겸상 적혈구 질환 및 탈라세미아와 같은 이상혈색소증을 치료하기 위해, 게놈 편집 (editing)에 사용될 수 있는 추가의 방법 및 조성물이 필요하다.
요약
겸상 적혈구 질환 또는 탈라세미아와 같은 유전 질환에 연루되는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 변화시키거나 교정하기 위한 (예를 들어, 상기 질환에서 결여되거나, 결핍되거나, 비정상적인 단백질 및/또는 이들 단백질을 조절하는 단백질을 생성하기 위한) 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. 이러한 단백질의 변화는 이들 유전 질환을 치료할 수 있다. 특히, 게놈 편집은 비정상 유전자를 교정하거나, 야생형 유전자를 삽입하거나, 내인성 (endogenous) 유전자의 발현을 변화시키는데 이용된다. 비제한적 예로써, β 글로빈을 암호화하는 야생형 유전자가 결함이 있는 β 글로빈에 의해 야기되는 이상혈색소증에서 결여된 단백질을 생성하고/하거나 이를 치료하기 위해 세포로 삽입될 수 있다. 일부 예에서, 야생형 유전자는 세이프 하버 유전자자리로 또는 적혈구 세포 내의 β 글로빈 유전자자리와 같은 관심 조직 내에서 고도로 발현되는 것으로 알려진 유전자자리에서 삽입될 수 있다. 게놈 편집은 유사하게는 야생형 알파 글로빈 유전자를 세이프 하버로 삽입함으로써 알파 탈라세미아에서 결여된 단백질을 생성하는데 (따라서 이를 치료하는데) 사용될 수 있다. 또 다른 접근법은 결함이 있는 내인성 α 또는 β 글로빈 유전자가 표적되고 돌연변이 서열이 대체되는 유전자 보정을 이용하는 것을 포함한다. 대안적으로, γ 글로빈의 억제에 수반되는 조절 유전자가 (예를 들어, 억제 단백질을 불화성화시키고/시키거나 이의 양을 감소시킴으로써 γ 글로빈의 발현을 증가시키기 위해) 변화되거나 녹아웃될 수 있고/있거나 γ 글로빈 유전자 상부 또는 베타-글로빈 유전자자리의 다른 구역 내의 조절 결합 부위가 변화되어 조절자가 γ 글로빈 유전자자리에서 적절히 상호작용할 수 없고 HbF가 생성됨으로써 비정상 β 글로빈 유전자에 의해 초래되는 효과 (즉, SCD 또는 β-탈라세미아)를 제거할 수 있다. 일 접근법은 또한 줄기 세포 (예: 조혈 줄기 세포 또는 RBC 전구체)의 변형물을 사용하는 것을 포함하며, 이때 줄기 세포는 이상혈색소증을 치료하기 위해 환자에게 생착 (engraft)시키는데 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 게놈에 있는 관심 영역 (예: β 글로빈, α 글로빈 또는 세이프 하버 유전자, 또는 조절 유전자 또는 이의 DNA 표적물, 예컨대 BCL11A, γ 글로빈 또는 KLF1) 내의 표적 부위에 결합하는 징크-핑거 단백질 (ZFP)이 본원에 기재되며, 상기 ZFP는 하나 이상의 조작된 징크-핑거 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, ZFP는 관심의 표적 게놈 영역을 절단하는 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN)이며, 상기 ZFN은 하나 이상의 조작된 징크-핑거 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 반-도메인 (half-domain)을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 반-도메인은, 예를 들어, 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 귀소 (homing) 엔도뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 절단 반-도메인은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제 (예: Fok I)로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, 징크 핑거 도메인은 글로빈 또는 세이프 하버 유전자 내의 표적 부위를 인식한다. 특정 실시형태에서, 징크 핑거 도메인은 5개 또는 6개의 징크 핑거 도메인을 포함하고, 글로빈 유전자 내의 표적 부위를 인식한다 (예: 표 1a에 제시된 인식 나선 (recognition helix) 영역을 갖는 5 또는 6개의 핑거를 갖는 징크 핑거 단백질). 또 다른 실시형태에서, 징크 핑거 도메인은 BCL11A, KLF1, α, β 또는 γ 글로빈 유전자 또는 이들의 조절 요소 내의 표적 부위를 인식한다. 특정 실시형태에서, 징크 핑거 도메인은 5 또는 6개의 징크 핑거 도메인을 포함하고, BCL11A, KLF1, α, β 또는 γ 글로빈 유전자 내 또는 이들의 조절 요소 내의 표적 부위를 인식한다 (예: 표 1a에 제시된 인식 나선 영역을 갖는 5 또는 6개의 핑거를 갖는 징크 핑거 단백질).
또 다른 양태에서, 게놈에 있는 관심 영역 (예: α 또는 β 글로빈 또는 세이프 하버 유전자, 또는 조절 유전자 또는 이의 DNA 표적물, 예컨대 BCL11A, γ 글로빈 또는 KLF1) 내의 표적 부위에 결합하는 TALE 단백질이 본원에 기재되며, 상기 TALE는 하나 이상의 조작된 TALE 결합 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, TALE는 관심의 표적 게놈 영역을 절단하는 뉴클레아제 (TALEN)이며, 상기 TALEN은 하나 이상의 조작된 TALE DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 절단 도메인 또는 절단 반-도메인을 포함한다. 절단 도메인 및 절단 반-도메인은, 예를 들어, 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 귀소 엔도뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 절단 반-도메인은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제 (예: Fok I)로부터 유도된다. 특정 실시형태에서, TALE DNA 결합 도메인은 글로빈 또는 세이프 하버 유전자 내의 표적 부위를 인식한다. 다른 실시형태에서, TALE DNA 결합 도메인은 BCL11A, KLF1, α, β 또는 γ 글로빈 유전자 내 또는 이들의 조절 요소 내의 표적 부위를 인식한다 (예: 표 3에 예시된 TALEN 단백질).
또 다른 양태에서, 게놈에 있는 관심 영역 (예: 고도로 발현되는 유전자, 질환 연관 유전자 또는 세이프 하버 유전자) 내의 표적 부위에 결합하는 CRISPR/Cas 시스템이 본원에 기재되며, 상기 CRISPR/Cas 시스템은 CRIPSR/Cas 뉴클레아제 및 조작된 crRNA/tracrRNA (또는 단일 가이드 RNA)를 포함한다. 특정 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 고도로 발현되는 유전자, 질환 연관된 유전자 또는 세이프 하버 유전자 내의 표적 부위를 인식한다. 특정 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 글로빈, 알부민, CCR5, CXCR4, AAVS1, Rosa, 또는 HPRT 유전자 내의 표적물을 인식한다.
본원에 기재되는 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템은 유전자 내 또는 이에 인접한 암호화 또는 비-암호화 영역, 예컨대 리더 서열, 트레일러 (trailer) 서열 또는 인트론 내, 또는 암호화 영역의 상부 또는 하부의 비-전사 영역 내의 관심 영역에 결합하고/하거나 이를 절단할 수 있다. 특정 실시형태에서, ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템은 글로빈 유전자에 결합하고/하거나 이를 절단한다.다른 실시형태에서, ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템은 세이프-하버 유전자, 예를 들어, CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C (AAVS1으로도 알려짐) 유전자, 알부민 유전자 또는 Rosa 유전자에 결합하고/하거나 절단한다. 예를 들어, 문헌 (미국 특허 공개 번호 20080299580; 20080159996; 201000218264; 20110301073; 20130177983 및 20130177960 및 미국 가출원 번호 61/823,689)을 참조한다. 또한, 선별을 돕기 위해, HPRT 유전자자리가 사용될 수 있다. (참조: 미국 특허 공개 번호 20130122591). 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 징크-핑거 및/또는 TALE 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 시스템 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템은 BCL11A, KLF1, α, β 또는 γ 글로빈 유전자에 결합하고 이들을 절단하거나, 이들의 조절 요소를 절단한다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 징크-핑거, TALE 또는 Cas 뉴클레아제 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 기재된다. 상기 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있다 (예를 들어, Kormann 등, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157 참조).
또 다른 양태에서, 프로모터에 작동적으로 연결된 본원에 기재된 하나 이상의 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 발현 벡터가 본원에 기재된다. 하나의 실시형태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
하나의 양태에서, 표적 DNA를 절단하는데 사용되는 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 단백질이 본원에 기재된다.
다른 양태에서, 유전적으로 변형된 RBC 전구체 ("HSC"로 알려진 조혈 줄기 세포)는 골수 이식물에 투여되며, RBC는 생체내에서 분화하고 성숙된다. 일부 실시형태에서, HSC는 G-CSF-유도된 동원 후에 분리되고, 다른 면에서, 세포는 사람 골수 또는 탯줄로부터 분리된다. 일부 양태에서, HSC는 글로빈 발현 조절자 (예: BCL11A 또는 KLF1)를 녹아웃시키도록 디자인된 뉴클레아제로의 처리에 의해 편집된다. 다른 양태에서, HSC는 야생형 유전자 (예: 글로빈 유전자)가 삽입되고 발현되고/되거나 내인성 비정상 유전자가 교정되도록 조작된 뉴클레아제 및 도너 (donor) 핵산으로 변형된다. 일부 예에서, 삽입을 위한 야생형 유전자 서열은 야생형 β 글로빈 또는 야생형 α 글로빈을 암호화한다. 다른 예에서, 내인성 비정상 유전자는 β 글로빈 또는 α 글로빈 유전자이다. 일부 실시형태에서, 변형된 HSC는 가벼운 골수절제 (myeloablative) 프리-컨디셔닝 후 환자에게 투여된다. 다른 양태에서, HSC는 생착 후 100%의 조혈 세포가 변형된 HSC로부터 유도되도록 완전한 골수절제 후 투여된다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 내인성 유전자 내의 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템이 발현되고 하나 이상의 유전자가 절단되도록 하는 조건 하에서 RBC 전구 세포로 도입하는 단계를 포함하여, RBC 전구 세포에서 내인성 유전자 (불활성화로 감마 글로빈 발현이 증가되는 유전자, 예컨대 BCL11A 또는 KLF1)를 절단하는 방법이 본원에 기재된다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 BCL11A 또는 KLF1 유전자 내의 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 ZFN,TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템이 발현되고 하나 이상의 BCL11A 또는 KLF1 유전자가 절단되는 조건 하에서 세포에 도입하는 단계를 포함하여, 세포 내의 BCL11A 또는 KLF1 유전자를 절단하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시형태에서, 징크 핑거 도메인은 5 또는 6개의 징크 핑거 도메인을 포함하고, 글로빈 유전자 내의 표적 부위를 인식한다 (예: 표 1a에 제시된 인식 나선 영역을 갖는 5 또는 6개의 핑거를 갖는 징크 핑거 단백질). 다른 실시형태에서, TALEN은 β 글로빈, α-글로빈, 감마 글로빈, KLF 또는 BCL11A 서열 내의 표적 부위를 인식한다 (표 3에 예시됨). 다른 실시형태에서, CRIPSR/Cas 시스템은, 단일 가이드 RNA가 관심 표적 유전자 내의 목적하는 표적 부위를 인식하도록 조작되는, β 글로빈, α 글로빈, 감마 글로빈, KLF 또는 BCL11A 서열 내의 표적 부위를 인식한다. 절단된 유전자(들)은, 예를 들어, 생성물(들)이 유전자 (예: 글로빈 유전자)의 발현을 억제할 수 있는 하나 이상의 유전자의 녹아웃 또는 이러한 단백질에 대한 DNA 상의 조절 표적 부위의 파괴와 같이 불활성화 (녹아웃)된다. 일부 실시형태에서, 불활성화된 유전자(들) 또는 이들의 표적 서열은 태아 헤모글로빈의 발현을 억제하는데 연루되는 것들이다. 세포 (예: 줄기 세포)는 분화시 태아 헤모글로빈을 포함하고 필요시 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 글로빈 유전자가 녹아웃된다. 예를 들어, 베타 글로빈이 불충분하게 발현되는 경우 알파 글로빈 대 베타 글로빈의 비율을 회복하기 위해서 알파 글로빈 유전자가 녹아웃될 수 있거나, 베타 글로빈 유전자를 암호화하는 HbS가 야생형 베타 글로빈 삽입과 동시에 녹아웃될 수 있다. 세포 (예: 줄기 세포)는 분화시 HbA 헤모글로빈을 포함할 것이고, 필요시 환자에게 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 뉴클레아제를 사용하여 내인성 유전자를 절단하고 서열을 절단 부위로 삽입하는 단계를 포함하여, 세포 (예: 줄기 세포) 내의 내인성 유전자 (예: 베타 글로빈, 알파 글로빈 및/또는 세이프 하버 유전자)로 서열을 삽입하는 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 본원에 기재되는 바와 같은 ZFN 또는 TALEN 쌍, 또는 CRIPSR/Cas 시스템 (또는 상기 ZFN, TALEN 및/또는 CRIPSR/Cas 시스템을 암호화하는 벡터) 및 ZFN, TALEN 및/또는 CRIPSR/Cas 시스템으로 표적된 절단 후 유전자 내로 삽입되는 "도너" 서열 ("전이유전자"로도 알려짐)을 사용하여, 임의의 표적 유전자 내의 게놈 서열이 대체된다. 도너 서열은 별개의 벡터 (예: Ad, AAV 또는 LV 벡터) 내에 존재하는 ZFN 또는 TALEN 벡터 내에 존재할 수 있거나, 대안적으로, 상이한 핵산 전달 기작을 이용하여 세포로 도입될 수 있다. 도너 뉴클레오타이드 서열의 표적 유전자자리 (예: 글로빈 유전자, 다른 세이프-하버 유전자 등)로의 이러한 삽입으로 표적 유전자자리 (예: 글로빈)의 유전 조절 요소의 조절 하에 전이유전자가 발현된다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 비-암호화 RNA (예: shRNA)를 암호화한다. RBC 성숙 전 전이유전자의 발현으로 관심의 비-암호화 RNA를 포함하는 RBC가 될 것이다.
다른 실시형태에서, 전이유전자는 기능성 단백질, 예를 들어, 글로빈 (예: 야생형 베타 및/또는 야생형 감마) 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자 (예: 글로빈 유전자)로 관심 전이유전자를 삽입하면 온전한 외인성 (exogenous) 단백질 서열이 발현되며 내인성 유전자에 의해 암호화되는 임의의 서열이 결여된다. 다른 실시형태에서, 발현된 외인성 단백질은 융합 단백질이며, 전이유전자 및 글로빈 유전자 (예를 들어, 내인성 표적 유전자자리로부터의 것, 또는 대안적으로 전이유전자 상의 글로빈-암호화 서열로부터의 것)에 의해 암호화되는 아미노산을 포함한다. 일부 예에서, 글로빈 유전자는 베타 글로빈이며, 다른 예에서, 글로빈 유전자는 알파 글로빈이다. 다른 예에서, 글로빈 유전자는 감마 글로빈 유전자이다. 내인성 글로빈 서열은, 존재하는 경우, 외인성 단백질의 아미노 (N)-말단부 및/또는 외인성 단백질의 카복시 (C)-말단부에 존재할 수 있다. 글로빈 서열은 전장의 야생형 또는 돌연변이 글로빈 서열을 포함할 수 있거나 대안적으로 부분적인 글로빈 암호화 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 글로빈-전이유전자 융합물은 세포 내의 내인성 유전자자리에 위치되고, 다른 실시형태에서, 글로빈-전이유전자 암호화 서열은 게놈 내의 세이프 하버로 삽입된다. 일부 양태에서, 세이프 하버는 CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12C (AAVS1로도 알려짐) 유전자, 알부민 유전자 또는 Rosa 유전자로부터 선택된다. 예를 들어, 문헌 (미국 특허 공개 번호 20080299580; 20080159996; 201000218264; 20110301073; 20130177983 및 20130177960 및 미국 가출원 번호 61/823,689)을 참조한다. 또한, 선별을 돕고자 HPRT 유전자자리가 사용될 수 있다 (참조: 미국 특허 공개 번호 20130122591).
또 다른 양태에서, 세포주 및/또는 유전자전이 동물 모델 (시스템)이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자전이 세포 및/또는 동물은 사람 유전자를 암호화하는 전이유전자를 포함한다. 일부 예에서, 유전자전이 동물은 외인성 전이유전자에 상응하는 내인성 유전자자리에서의 녹아웃을 포함하며 (예를 들어, 마우스 글로빈 유전자가 녹아웃되고 사람 글로빈 유전자가 마우스로 삽입되며), 이로써 사람 단백질이 별개로 연구될 수 있는 생체내 시스템의 개발이 가능해진다. 이러한 유전자전이 모델은 관심의 사람 단백질과 상호작용하거나 이를 변형시킬 수 있는 소분자 또는 커다란 생물분자 또는 다른 실체를 확인하기 위한 스크리닝 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 전이유전자는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 수득되는 줄기 세포 (예: 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포 등) 또는 동물 배아 내의 선택된 유전자자리 (예: 글로빈 또는 세이프-하버)로 통합되며, 이어서 배아는 살아있는 동물이 탄생되도록 이식된다. 다른 양태에서, 줄기 세포는 내인성 유전자자리, 예컨대 BCL11A, KLF1 또는 γ 글로빈 유전자 또는 이의 조합에 게놈 변화를 포함함으로써 γ 글로빈 발현이 증가된다. 일부 실시형태에서, γ 글로빈 발현의 증가는 비편집된 줄기 세포와 비교하여 세포 내에서의 γ 글로빈 대 β 글로빈의 비율을 변화시킨다. 이 후, 동물은 성 성숙하게 되고 자손의 적어도 일부가 편집된 내인성 유전자 서열 또는 통합된 전이유전자를 포함하는 자손을 생산하게 된다.
추가의 양태에서, 염색체의 내인성 유전자자리 (예: 글로빈 또는 세이프 하버 유전자)로, 예를 들어, 배아의 염색체로 핵산 서열을 부위 특이적으로 통합하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 배아에 (i) 통합될 핵산 서열의 측면에 배치되는 상부 서열 및 하부 서열을 포함하는 적어도 하나의 DNA 벡터 및 (ii) 징크 핑거, TALE 또는 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 적어도 하나의 RNA 분자를 주사하는 것을 포함한다. Cas9 단백질을 사용하는 경우, 조작된 sgRNA가 또한 도입된다. 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 시스템은 표적 유전자자리 (예: 글로빈 또는 세이프 하버 유전자자리) 내의 표적 부위를 인식하며, 이후 (b) 배아는 징크 핑거 또는 TALE 뉴클레아제 및/또는 CRISPR/Cas 시스템을 발현시키도록 배양되며, 이때 이중 가닥 파괴가 징크 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 표적물로 도입된 후, 핵산 서열이 염색체 내로 통합되도록 DNA 벡터의 상동성 재조합을 통해 복구된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 방법에서, 징크 핑거 뉴클레아제(들), TALEN(들) 및/또는 CRIPSR/Cas 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 mRNA를 포함한다.
본 발명의 ZFP, TALEN 및/또는 CRIPSR/Cas 시스템을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 상기 키트는 ZFP, TALEN 또는 CRISPR/Cas 시스템을 암호화하는 핵산 (예: RNA 분자 또는 적합한 발현 벡터 내에 포함된 ZFP, TALEN 또는 Cas9 암호화 유전자) 및, 필요한 경우, 조작된 sgRNA, 또는 뉴클레아제 단백질의 일정 부분들, 도너 분자, 적합한 호스트 세포주, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서 등을 포함할 수 있다.
이들 양태 및 다른 양태들이 전체 기재에 비추어 당업자에게 쉽게 분명해질 것이다.
도 1은 (도면에 표시된) 겸상 적혈구 질환 돌연변이를 둘러싸는 영역 내의 β형 글로빈 유전자 서열에 대한 정렬을 도시한다. 상부 라인부터 하부 라인으로 겸상 적혈구 돌연변이를 갖는 헤모글로빈 베타 서열 (HBB-겸상, 서열번호 1); 헤모글로빈 베타 (HBB, 서열번호 2); 헤모글로빈 델타 (HBD, 서열번호 3); 베타 헤모글로빈 슈도 유전자 (HBBP1, 서열번호 4); 헤모글로빈 엡실론 (HBE1, 서열번호 5), 헤모글로빈 감마 1 (HBG1, 서열번호 6) 및 헤모글로빈 감마 2 (HBG2, 서열번호 7)이 도시된다. Cel I 활성 분석 결과가 표시된 5개의 ZFN 쌍에 대한 정렬 아래에 도시된다.
도 2a 및 도 2b는 CD34+ 세포에서 β 글로빈 도너에 의해 명시된 서열의 삽입을 도시하는 겔이다. 도 2a (RFLP)는 β 글로빈 도너에 의해 명시된 서열의 삽입을 도시하며, 이때 삽입은 도너 DNA 상에 존재하는 새로운 제한 부위의 존재에 의해 확인된다. 도 2b는 미스매치를 생성하는 새로운 서열의 존재를 입증하는 Cel-1 미스매치 검정 (SurveyorTM Transgenomic) 결과를 도시한다. 돌연변이를 갖는 대립유전자 (allele)의 백분율 (% NHEJ)은 겔의 우측 텍스트에 표시된다 (제1 컬럼은 겔 상의 레인 번호에 상응한다). 숫자들은 ZFN 조합; unt: 비형질감염된 대조군.
도 3은 KLF1 및 BCL11A가 β 및 감마 글로빈 유전자 발현 조절에서 수행하는 역할을 도시하는 그래프이다. KLF1의 발현은 BCL11a 및 β 글로빈 유전자 모두의 발현을 자극한다. BCL11A 단백질은 감마-글로빈 발현을 억제한다.
도 4a 내지 도 4e는 표시된 BCL11A- (도 4a), KLF1- (도 4c 및 4d) 또는 HPRT- (도 4b) 특이적 ZFN으로 HSC를 처리하고 형질도입된 세포를 간단한 저체온 쇼크 (30°)로 처리하거나 표준 조건 (37°) 하에서 처리한 후 상기 기재된 바와 같이 Cel 1 검정한 결과를 나타내는 겔을 도시한다. DNA는 형질감염 (transfection) 후 3일에 수거하였다. 도 4e는 HSC의 형질감염 후 3일 또는 적혈구 분화후 17일에 수거된 샘플로 수행된 동일한 유형의 Cel 1 분석을 도시한다. 돌연변이를 갖는 대립유전자의 백분율 (% NHEJ)이 레인 아래에 표시되고, 사용된 ZFN 쌍의 동일성가 각각의 도면에 표시된다.
도 5a 및 도 5b는, Taqman® 절차에 의해 분석되는, 분화 후 7일 또는 17일에서의 베타-글로빈과 비교되는 감마 글로빈의 발현 (도 5a) 또는 18s RNA 표준물로 교정된 감마 글로빈 mRNA (도 5b)를 도시한다. 감마+베타-글로빈 mRNA와 비교되는 감마 글로빈 mRNA의 백분율이 도 5a에서 각각의 바 위에 도시된다. 도 5b에서, 18s RNA에 의해 표준화되는 감마 글로빈의 상대적 수준은 바 위에 도시되며, 18S에 대한 감마 글로빈 mRNA의 수준이 BCL11A-특이적 ZFN로 처리된 세포에서 더욱 높다는 것을 입증한다.
도 6은, 세포의 유전형에 의존적인, HSC로부터 유도되는 메틸셀룰로즈 콜로니에서의 감마 글로빈 mRNA의 양을 도시한다. BCL11A 유전자 둘다 야생형 ("BB")인 세포는 단일 BCL11A 녹아웃 대립유전자를 갖거나 ("Bb") 녹아웃된 대립유전자 둘다를 갖는 ("녹아웃") 세포와 비교하여 최저량의 감마 글로빈 mRNA를 생성한다. 바 위의 숫자는 총 베타-글로빈으로부터 생성된 감마 글로빈의 백분율을 나타낸다.
도 7은 K562 세포에서 감마 글로빈 특이적 ZFN으로 처리한 후 감마 글로빈 유전자 상부 영역의 일련의 DNA 서열 (서열번호 140 내지 148)을 도시한다. 상기 서열은 HPFH와 연관된 사람 유전형 중 하나와 동일한 13 bp 결실 ("△13 bp")을 포함한 다수의 삽입 및 결실을 갖는다. 상단의 '참조' 서열은 감마 글로빈에 대한 야생형 5' 조절 영역의 서열이다. ZFN 쌍의 결합 부위는 붉게 강조되고, 천연 발생 13bp 결실은 밑줄로 표시된다.
도 8a 내지 도 8c는 감마-글로빈 프로모터 표적에 이어 메틸셀룰로즈 상에 콜로니를 도말한 후 ZFN으로 처리된 HSC로부터 유도되는 적혈구 콜로니의 Taqman 분석을 도시한다. 콜로니 번호는 유전형에서와 같이 각각의 바 아래에 표시된다. 도 8a는 상대적인 감마/베타-글로빈 mRNA 비율을 도시하고; 도 8b는 18s RNA 수준으로 교정된 감마-글로빈 mRNA 수준을 도시하고; 도 8c는 18s로 교정된 베타-글로빈 수준에 대한 상응하는 분석을 도시한다. 야생형 및 돌연변이된 콜로니에 대한 비율의 평균치 비교는 감마-글로빈 프로모터에 ZFN-유도된 돌연변이를 갖는 콜로니에서 감마-글로빈 수준이 증가된다는 것을 나타낸다.
도 9는 감마 글로빈 유전자의 프로모터 영역을 도시한다 (서열번호 149 내지 152). 2개의 감마 글로빈 대립유전자가 정렬되었다 (HBG1 및 HBG2). 2개의 대립유전자의 서열 차이가 회색 박스로 표시된다. 또한, HPFH와 연관된 돌연변이는 검은 윤곽으로 표시된다. 출발 ATG는 액손 1 경계와 같이 표시된다. 각각의 돌연변이와 연관된 태아 글로빈 수준의 증가가 이 위에 숫자로 표시된다.
도 10a 및 도 10b는 NHEJ의 양 (즉, 뉴클레아제-표적된 파괴의 NHEJ-기반 복구 사건으로부터 생기는 표적된 유전자자리 파괴) 및 표시된 징크 핑거 뉴클레아제 및 올리고뉴클레오타이드 도너를 사용하여 CD34+ 세포에서 베타 글로빈 유전자에 대해 검출된 유전자 보정을 도시한다.
도 11은 NHEJ의 양 및 CD34+ 세포에서 도너 뉴클레오타이드의 표적된 통합을 도시하며, 이때 도너 상의 상동성 아암은 다양하다.
도 12는 ZFN 및 올리고뉴클레오타이드 도너로 처리된 줄기 세포의 적혈구 유도체에서 유전자 편집의 지속을 도시한다. 유전자 변형은 분화로부터 생기는 4가지 유형의 세포군인 콜로니-형성 단위, 적혈구 ("CFU-E"), 버스트-형성 단위, 적혈구 ("BFU-E"), 콜로니-형성 단위, 과립구/대식구 ("CFU-GM") 및 콜로니-형성 단위, 과립구/적혈구/단핵구/대식구 ("CFU-GEMM")에서 분석되었다.
도 13은 시간 경과에 따른 베타 글로빈 유전자의 유전자 변형 안정성을 도시한다.
상세한 설명
유전 질환, 예컨대 이상혈색소증을 연구 및 치료하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. 본 발명은, 하나 이상의 글로빈 유전자의 발현에 유리한 변화가 있어 결국 치료가 필요한 피험자에서 이상혈색소증, 예컨대 겸상 적혈구 질환 또는 탈라세미아를 치료하는, 표적 세포의 게놈 편집을 기재한다. 글로빈 유전자의 유리한 변화는, 비제한적으로, 비정상 β 글로빈을 갖는 피험자에서 γ 글로빈 유전자의 제공; 및/또는 비정상 α 또는 β 글로빈 유전자 서열의 교정을 포함한다. 또한, 목적하는 단백질 생성물을 발현하도록 변화된 이식물에 변화된 조혈 줄기 세포의 전달은 이상혈색소증, 예컨대 겸상 적혈구 빈혈 또는 탈라세미아를 치료하는데 유리할 수 있다. 또한, 변화된 글로빈 발현을 갖는 세포주 및 동물이 기재된다.
따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 세포 (예: 적혈구 전구 세포)에서 하나 이상의 글로빈 유전자 (예: γ, α 및/또는 β)의 발현을 변화시키는데 사용될 수 있다. 이들 방법 및 조성물은 γ 글로빈 억제에 연루되는 유전자 (예: BCL11A 또는 KLF1)를 파괴하는데 이용될 수 있으므로, 세포는 편집 후 γ 글로빈을 더욱 높은 수준을 발현할 것이고 HbF가 생성될 수 있다. 대안적으로, 편집은 유전자 억제를 할 수 없도록 유전자 상의 결합 부위를 파괴 (예: 베타-글로빈 유전자자리에서 BCL11A 결합을 파괴, 감마-글로빈 프로모터에서 감마-글로빈 전사 억제제 결합을 파괴)하는데 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 이러한 변화에 추가하여, 상기 방법 및 조성물은 비정상 내인성 α 및/또는 β 글로빈 유전자를 교정하거나 세포의 게놈의 목적하는 위치에 (예를 들어, HSC로) 야생형 유전자를 삽입하는데 이용될 수 있다. 전구 세포는 어려움에 처한 피험자로부터 유도되고, 생체외에서 변형된 후, 골수 이식으로 피험자에게 다시 투여될 수 있다.
전반적 사항
본원에 기재되는 방법의 실시 및 조성물의 제조 및 이용은, 달리 명시되지 않는 한, 당해 분야의 기술에 속하는 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야의 통상의 기술을 이용한다. 이들 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 정기적 업데이트; 시리즈 METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며, 선형 또는 원형 구조로 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본원 기재의 목적상, 이 용어는 중합체의 길이를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 이 용어는 천연 뉴클레오타이드 및 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (예: 포스포로티오에이트 골격)가 변형된 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기-짝짓기 특이성을 지닌다; 즉, A의 유사체는 T와 염기-짝짓기를 할 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하도록 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 천연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 마크로분자 사이의 (예를 들어, 단백질과 핵산 사이의) 서열-특이적인 비-공유적 상호작용을 지칭한다. 전체적으로 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 (예를 들어, DNA 골격 내의 포스페이트 잔기와 접촉될) 필요는 없다. 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6　M-1 이하의 해리 상수 (Kd)로 특징지어진다. "친화도"는 결합 세기를 지칭하며; 증가된 결합 친화도는 낮은 Kd와 서로 관련된다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합될 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 결합 단백질은 (호모이량체, 호모삼량체 등을 형성하기 위해) 그 자신에 결합되고/되거나 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합될 수 있다. 결합 단백질은 하나 초과의 결합 활성 유형을 가질 수 있다. 예를 들어, 징크 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
"징크 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내 아미노산의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질 또는 커다른 단백질 내의 도메인이다. 이 용어는 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 단축된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복 도메인은 동족 (cognate) 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 수반된다. 단일 "반복 단위" ("반복물"로도 지칭됨)는 전형적으로 33 내지 35개 아미노산 길이이고, 천연 발생 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과 적어도 얼마간의 서열 상동성을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110301073을 참조한다.
징크 핑거 및 TALE 결합 도메인은, 예를 들어, 천연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작 (하나 이상의 아미노산의 변화)을 통해, 예정된 뉴클레오타이드 서열에 결합되도록 "조작"될 수있다. 따라서, 조작된 DNA 결합 단백질 (징크 핑거 또는 TALE)은 비-천연 발생 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하기 위한 방법의 비제한적 예는 디자인 및 선택이다. 디자인된 DNA 결합 단백질은 이의 디자인/조성이 주로 합리적 기준에서 비롯되는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 디자인을 위한 합리적 기준은 치환 규칙 및 기존 ZFP 및/또는 TALE 디자인의 정보를 보관하는 데이터베이스 및 결합 자료에 있는 정보를 프로세싱하기 위한 컴퓨터화된 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536 및 WO　03/016496 및 미국 공개 번호 20110301073을 참조한다.
"선택된" 징크 핑거 단백질 또는 TALE는 이의 생성이 주로 실험에 의거한 과정, 예컨대 파아지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택에서 비롯되는 자연에서는 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: US　5,789,538; US 5,925,523; US　6,007,988; US　6,013,453; US 6,200,759; WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970 WO　01/88197; WO　02/099084 및 미국 공개 번호 20110301073.
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 간의 유전 정보 교환 과정을 지칭한다. 이러한 기재의 목적상, "상동성 재조합" (HR)은, 예를 들어, 상동성-지시된 복구 기작을 통해 세포에서 이중-가닥 파괴의 복구 동안 일어나는 이러한 교환의 특수화된 형태를 지칭한다. 이러한 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중-가닥 파괴를 겪는 것)의 템플레이트 복구에 대한 "도너" 분자를 사용하며, "비-교차형 유전자 전환" 또는 "쇼트 트랙 (short tract) 유전자 전환"으로 다양하게 알려져 있으며, 이는 이러한 과정이 도너로부터 표적물로 유전 정보 전달을 이끌기 때문이다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 이러한 전달은 파괴된 표적물과 도너 사이에 형성되는 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 도너가 표적물의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는데 사용되는 "합성-의존적 가닥 어닐링", 및 관련 과정들을 포함할 수 있다. 이러한 특수화된 HR은 종종 도너 폴리뉴클레오타이드의 서열 중 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오타이드로 삽입되도록 표적 분자의 서열을 변화시킨다.
본원에 기재된 방법에서, 본원에 기재된 하나 이상의 표적된 뉴클레아제는 예정된 부위에 있는 표적 서열 (예: 세포 염색질)에서 이중-가닥을 파괴하며, 파괴 영역 내의 뉴클레오타이드 서열에 상동성을 갖는 "도너" 폴리뉴클레오타이드는 세포로 도입될 수 있다. 이중-가닥 파괴의 존재는 도너 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 도너 서열은 물리적으로 통합되거나, 대안적으로, 도너 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 통해 파괴물을 복구하기 위한 템플레이트로 사용됨으로써, 도너에서와 같은 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 부분이 세포 염색질로 도입된다. 따라서, 세포 염색질 내의 제1 서열이 변형될 수 있으며, 특정 실시형태에서, 도너 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, 용어 "대체하다" 또는 "대체"의 사용은 하나의 뉴클레오타이드 서열의 또 다른 뉴클레오타이드 서열로의 대체를 나타내는 것으로 이해될 수 있으며 (즉, 정보를 제공하는 의미에서 서열의 대체), 반드시 하나의 폴리뉴클레오타이드의 또 다른 폴리뉴클레오타이드로의 물리적 또는 화학적 대체를 필요로 하지는 않는다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 방법에서, 징크-핑거 또는 TALEN 단백질의 추가의 쌍이 세포 내의 추가의 표적 부위의 추가의 이중-가닥 절단에 사용될 수 있다. 또한, CRISPR/Cas 시스템이 유사하게 추가의 이중 가닥 파괴를 유도하는데 이용될 수 있다.
세포 염색질의 관심 영역 내 서열의 표적된 재조합 및/또는 대체 및/또는 변화를 위한 특정 실시형태에서, 염색체 서열은 외인성 "도너" 뉴클레오타이드 서열과 상동성 재조합에 의해 변화된다. 이러한 상동성 재조합은, 파괴물의 영역에 대해 상동성인 서열이 존재하는 경우, 세포 염색질 내의 이중-가닥 파괴물의 존재에 의해 자극된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 방법에서, 외인성 뉴클레오타이드 서열 ("도너 서열" 또는 "전이유전자")은 관심 영역 내의 게놈 서열에 대해 상동성인, 단 동일하지는 않은, 서열을 포함함으로써 상동성 재조합을 자극하여 관심 영역에 비-상동성 서열을 삽입할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 관심 영역 내 서열에 상동성인 도너 서열의 부분들은 대체되는 게놈 서열에 대해 약 80 내지 99% (또는 이들 사이의 임의의 정수) 서열 동일성을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 도너와 게놈 서열 간의 상동성은, 예를 들어, 100개 초과의 연속 염기쌍을 갖는 도너와 게놈 서열 사이에서 단지 1개의 뉴클레오타이드가 상이한 경우, 도너와 뉴클레오타이드 서열 사이의 상동성은 99% 보다 높다. 특정한 예에서, 도너 서열의 비-상동성 부분은 관심 영역 내에 존재하지 않는 서열을 포함할 수 있으므로, 새로운 서열이 관심 영역으로 도입된다. 이들 예에서, 비-상동성 서열은 일반적으로, 관심 영역 내의 서열에 상동성이거나 동일한, 50 내지 1,000개의 염기쌍 (또는 이들 사이의 임의의 정수값) 또는 1,000개 초과의 임의의 수의 염기쌍의 서열이 측면에 배치된다. 다른 실시형태에서, 도너 서열은 제1 서열에 대해 비-상동성이고, 비-상동성 재조합 기작에 의해 게놈으로 삽입된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 방법은 관심 유전자(들)의 발현을 파괴하는 도너 서열의 표적된 통합에 의한 세포 내의 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 불활성화에 이용될 수 있다. 또한, 부분적으로나 완전히 불활성화된 유전자를 갖는 세포주가 제공된다.
또한, 본원에 기재된 표적된 통합 방법은 하나 이상의 외인성 서열을 통합하는데 이용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은, 예를 들어, 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 임의의 유형의 암호화 또는 비-암호화 서열, 및 하나 이상의 조절 요소 (예: 프로모터)를 포함할 수 있다. 또한, 외인성 핵산은 하나 이상의 RNA 분자 (예: 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 억제 RNA (RNAi), microRNA (miRNA) 등)을 생성할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 골격의 파괴를 지칭한다. 절단은, 비제한적으로, 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함한 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단 모두가 가능하며, 이중-가닥 절단은 2개의 구별되는 단일-가닥 절단 사건의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단으로 무딘 말단 또는 엇갈림 말단이 생성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드가 표적된 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 반-도메인"은, 제2의 폴리펩타이드 (동일하거나 상이함)와 함께, 절단 활성 (바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 반-도메인", "+ 및 - 절단 반-도메인" 및 "우측 및 좌측 절단 반-도메인"은 이량체화하는 절단 반-도메인의 쌍을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
"조작된 절단 반-도메인"은 또 다른 절단 반-도메인 (예: 또 다른 조작된 절단 반-도메인)과 함께 절대 헤테로이량체를 형성하도록 변형된 절단 반-도메인이다. 또한, 미국 특허 공개 번호 2005/0064474, 2007/0218528,2008/0131962 및 2011/0201055 (본원에 이의 전문이 참조로 포함됨)를 참조한다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고; 선형, 원형 또는 분지될 수 있고; 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 용어 "도너 서열"은 게놈으로 삽입되는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 도너 서열은 2 내지 10,000개 뉴클레오타이드 서열 길이 (또는 이들 사이의 임의의 정수값 또는 그 이상), 바람직하게는 약 100 내지 약 1,000개 뉴클레오타이드 길이 (또는 이들 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는 약 200 내지 500개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
"질환 연관된 유전자"는 단일유전자 질환에서 일부 방식에 결함이 있는 유전자이다. 단일유전자 질환의 비제한적 예는 중증 복합형 면역부전증, 낭성 섬유증, 리소좀 저장병 (예: 고셔 (Gaucher), 헐러 (Hurler), 헌터 (Hunter), 파브리 (Fabry), 니이만-피크 (Neimann-Pick), 테이-사크 (Tay-Sach) 등의 질환), 겸상 적혈구 빈혈 및 탈라세미아를 포함한다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함한 단백질을 포함한다. 진핵생물 세포 염색질의 대부분은 뉴클레오좀의 형태로 존재하며, 뉴클레오좀 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 각각을 2개 포함하는 포함하는 옥타머와 관련된 약 150개 염기쌍의 DNA를 포함하며, (유기체에 의존적인 가변 길이의) 링커 DNA가 뉴클레오좀 코어 사이에 연장된다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로 링커 DNA와 관련된다. 본원 기재의 목적상, 용어 "염색질"은 모든 유형의 원핵생물 및 진핵생물 모두의 세포 핵단백질을 포함하고자 한다. 세포 염색질은 염색체 및 에피좀 염색질 모두를 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈 전체 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 집합인 핵형으로 특징지어진다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피좀"은 세포의 염색체 핵형 부분이 아닌 핵산을 포함하는 복제하는 핵산, 핵단백질 복합체 또는 기타 구조물이다. 에피좀의 예는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈을 포함한다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 경우 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다.
"외인성" 분자는 정상적으로는 세포에 존재하지 않으나 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에서의 정상적 존재"는 세포의 특정 발단 단계 및 환경 조건에서 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 유사하게, 열 쇼크에 의해 유도되는 분자는 비-열-쇼크처리되는 세포에 대해서 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 기능부전 내인성 분자의 기능 버젼 또는 정상-기능 내인성 분자의 기능부전 버젼을 포함할 수 있다.
외인성 분자는, 특히, 소분자, 예컨대 조합적 화학 과정에 의해 생성되는 것, 또는 마크로분자, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류 및 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 하나 이상의 상기 분자를 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산을 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 핵산 및 트리플렉스-형성 핵산을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251을 참조한다. 단백질은, 비제한적으로, DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 리컴비나제, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 (gyrase) 및 헬리카제를 포함한다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포로 도입되는 플라스미드 또는 에피좀, 또는 정상적으로는 세포에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포로 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 비제한적으로, 지질-매개된 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포좀), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 충격, 인산칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개된 전달 및 바이러스 벡터-매개된 전달을 포함한다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자이나 유도되는 세포와 상이한 종으로부터 유도되는 분자일 수 있다. 예를 들어, 사람 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유도되는 세포주로 도입될 수 있다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계의 특정 세포에 정상적으로 존재하는 것이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 소기관의 게놈 또는 천연-발생 에피좀 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 아단위 분자가 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자이다. 아단위 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 분자의 예는, 비제한적으로, 융합 단백질 (예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 하나 이상의 활성화 도메인 간의 융합물) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기 기재된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 제2 유형의 융합 분자의 예는, 비제한적으로, 트리플렉스-형성 핵산과 플리펩타이드 간의 융합물 및 좁은 홈 바인더와 핵산 사이의 융합물을 포함한다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 세포로 융합 단백질의 전달 또는, 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 전사물이 해독되어 융합 단백질을 생성하는, 세포로 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전달에서 비롯될 수 있다. 또한, 트랜스-스플라이싱, 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결합이 세포에서 단백질의 발현에 수반될 수 있다. 세포로의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달 방법이 본원의 다른 곳에서 제시된다.
본원 기재의 목적상 "유전자"는 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역 (하기 참조) 및 조절 서열이 암호화하는 및/또는 전사되는 서열에 인접하든 아니든 간에 유전자 생성물의 생성을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는, 비제한적으로, 프로모터 서열, 터미네이터, 해독 조절 서열, 예컨대 리보좀 결합 부위 및 내부 리보좀 도입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 인자, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자자리 조절 영역을 포함한다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함되는 정보의 유전자 생성물로의 전환을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자 ((예: mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA)의 직접적 전사 생성물 또는 mRNA의 해독에 의해 생성되는 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 과정, 예컨대 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집에 의해 변형되는 RNA 및, 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형되는 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "변형"은 유전자 활성의 변화를 지칭한다. 발현의 변형은, 비제한적으로, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다. 게놈 편집 (예: 절단, 변화, 불활성화, 무작위 돌연변이)를 이용하여 발현을 조절할 수 있다. 유전자 불활성화는 본원에 기재된 ZFP 또는 TALEN를 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현에서 임의의 감소를 지칭한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적이거나 완전할 수 있다.
"관심 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대, 예를 들어, 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 유전자 또는 유전자 내 또는 유전자에 인접한 비-암호화 서열이다. 결합은 표적된 DNA 절단 및/또는 표적된 재조합을 위한 것일 수 있다. 관심 영역은, 예를 들어, 염색체, 에피좀, 소기관 게놈 (예: 미토콘드리아, 엽록체) 또는 감염 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심 영역은 유전자의 암호화 영역 내, 전사되는 비-암호화 영역, 예컨대, 예를 들어, 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내, 또는 암호화 영역의 상부 또는 하부의 비-전사 영역 내에 존재할 수 있다. 관심 영역은 단일 뉴클레오타이드 쌍과 같이 작거나 2,000개 이하의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 또는 임의의 정수값의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다.
"진핵생물" 세포는, 비제한적으로, 진균 세포 (예: 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 사람 세포 (예: T-세포)를 포함한다.
"적혈구"(RBC 또는 erythrocyte)는 조혈 줄기 세포로부터 유도되는 말기 분화된 세포이다. 이들은 뉴클레아제 및 대부분의 세포 소기관이 없다. RBC는 폐로부터 말초 조직으로 산소를 운반하는 헤모글로빈을 포함한다. 사실, 각각의 RBC의 33%가 헤모글로빈이다. 이들은 또한 대사 동안 세포에 의해 생성된 CO2를 조직밖으로 운반하고 숨을 내쉬는 동안 방출을 위해 폐로 후진시킨다. RBC는 신장에 의한 에리트로포이에틴 (EPO)의 방출에 의해 매개되는 혈액 저산소증에 반응하여 골수에서 생성된다. EPO는 프로적혈구의 수를 증가시키고, 완전한 RBC 성숙에 필요한 시간을 단축시킨다. 약 120일 후, RBC는 핵 또는 임의의 다른 재생 능력을 포함하지 않으므로, 간, 비장 및 림프절에서 대식구의 포식작용에 의해 (약 90%) 또는 혈장에서 용혈에 의해 (약 10%) 순환으로부터 제거된다. 대식구 포식 후, RBC의 화학적 성분은 리소좀 효소의 작용으로 대식구의 액포 내에서 파괴된다.
"분비 조직"은 각각의 세포 밖의 생성물을 통상적으로 상피로부터 유도되는 일부 유형의 루멘으로 배출하는 동물 내 조직이다. 위장관에 위치되는 분비 조직의 예는 창자, 췌장 및 담낭을 라이닝하는 세포를 포함한다. 다른 분비 조직은 간, 눈 및 점막과 관련된 조직, 예컨대 타액선, 유선, 전립선, 뇌하수체 및 내분비 시스템의 다른 멤버를 포함한다. 또한, 분비 조직은 일 조직 유형의 배출할 수 있는 각각의 세포들을 포함한다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된"은 2개 이상의 성분 (예: 서열 요소)의 병렬에 대해 상호교환적으로 사용되며, 이때 상기 성분들은 양 성분이 정상적으로 기능하고 이들 성분들 중 적어도 하나가 다른 성분들 중의 적어도 하나에 영향을 미치는 기능을 매개할 수 있도록 배치된다. 설명을 위해, 전사 조절 서열, 예컨대 프모로터는, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 조절하는 경우, 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스로 작동적으로 연결되나, 이에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는, 비록 연속적이지는 않지만, 암호화 서열에 작동적으로 연결되는 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결된"은 각각의 성분이 다른 성분과 연결시 연결되지 않은 경우에서와 같이 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합되는 융합 폴리펩타이드와 관련하여, 융합 폴리펩타이드에서 ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있고 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향 조절할 수 있다면, ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인은 작동적으로 연결되어 있다. ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드의 경우, 융합 폴리펩타이드에서 ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있고 절단 도메인이 표적 부근의 DNA를 절단할 수 있다면, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 및 절단 도메인은 작동적으로 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능성 단편"은, 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 서열이 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는, 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능성 단편은 상응하는 천연 분자보다 많거나 적거나 동일한 수의 잔기를 가질 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 포함할 수 있다. 핵산의 기능 (예: 암호화 기능, 또 다른 핵산에 하이브리드화하는 능력)을 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 유사하게, 단백질 기능을 측정하는 방법도 널리 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어, 필터-결합, 전기영동적 이동-쉬프트 또는 면역침전 검정에 의해 측정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 검정될 수 있다. 문헌 (Ausubel 등, 상기 참조)을 참조한다. 또 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은, 예를 들어, 공동-면역침전, 투-하이브리드 검정 또는 상보성 (유전적 및 생화학적 모두)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Fields 등 (1989) Nature 340:245-246; 미국 특허 번호 5,585,245 및 PCT WO 98/44350)을 참조한다.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포에 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클 및 통합 벡터를 포함한다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은, 비록 일반적인 검정에서 반드시 그런 것은 아니지만, 쉽게 측정되는 단백질 생성물을 생성하는 임의의 서열을 지칭한다. 적합한 리포터 유전자는, 비제한적으로, 항생제 내성 (예: 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 푸로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 컬러 또는 형광 또는 발광 단백질 (예: 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제) 및 강화된 세포 성자 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예: 디하이드로폴레이트 리덕타제)를 암호화하는 서열을 포함한다. 에피토프 태그는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다. "발현 태그"는 관심 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 목적하는 유전자 서열에 작동적으로 연결될 수 있는 리포터를 암호화하는 서열을 포함한다.
용어 "피험자" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용되며, 포유동물, 예컨대 사람 환자 및 비-사람 영장류 및 실험 동물, 예컨대 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스 및 다른 동물들을 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "피험자" 또는 "환자"는 본 발명의 변화된 RBC (또는 줄기 세포)가 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자 또는 피험자를 의미한다. 본 발명의 피험자는, 예를 들어, 신경 독소를 포함한 하나 이상의 화학 독소에 노출된 피험자를 포함한다.
뉴클레아제
이상혈색소증을 갖는 사용하기 위한 유전자를 표적하는데 유용한 조성물, 특히 뉴클레아제가 본원에 기재된다. 특정 실시형태에서, 뉴클레아제는 천연 발생이다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 비-천연 발생으로, DNA-결합 도메인 및/또는 절단 도메인이 조작된다. 예를 들어, 천연-발생 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위에 결합되도록 변화될 수 있다 (예: 동족 결합 부위와는 다른 부위에 결합하도록 조작된 메가뉴클레아제). 다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 이종의 DNA-결합 및 절단 도메인 (예: 징크 핑거 뉴클레아제; TAL-이펙터 뉴클레아제; 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인과 이종 절단 도메인), 또는 특정 가이드 RNA에 의해 가이드되는 포괄적 뉴클레아제 (예: CRPISR/Cas)를 포함한다.
A. DNA-결합 도메인
특정 실시형태에서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제 (귀소 엔도뉴클레아제)이다. 천연-발생 메가뉴클레아제는 15 내지 40개 염기쌍의 절단 부위를 인식하고, 일반적으로 4개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cyst 박스 패밀리 및 HNH 패밀리. 귀소 엔도뉴클레아제의 예는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 이들의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; Belfort 등(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon 등 (1989) Gene 82:115-118; Perler 등(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble 등 (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등 (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카달로그.
특정 실시형태에서, 뉴클레아제는 조작된 (비-천연 발생) 귀소 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제)를 포함한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열은 공지되어 있다. 또한, 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; Belfort 등(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon 등 (1989) Gene 82:115-118; Perler 등(1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble 등 (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등 (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카달로그. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 표적 부위에 결합되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Chevalier 등 (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat 등(2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth 등 (2006) Nature 441:656-659; Paques 등 (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; 미국 특허 공개 번호 20070117128. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 뉴클레아제의 전후 사정 하에서 전부 변화될 수 있거나 (즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록), 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
다른 실시형태에서, DNA-결합 도메인은 천연 발생 또는 조작된 (비-천연 발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110301073 (전부 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 크산토모나스 (Xanthomonas) 속의 식물 병원성 세균이 중요한 농작물에서 많은 질환을 야기시키는 것으로 알려져 있다. 크산토모나스의 병원성은, 25개 이상의 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포로 주입하는, 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 기인한다. 이들 주입된 단백질 중에 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 전사체를 조절하는 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)가 있다 (참조: Kay 등 (2007) Science 318:648-651). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 포함한다. 가장 잘 특성화된 TALE 중의 하나는 크산토모나스 캄페스트그리스 pv. 베시카토리아 (Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (참조: Bonas 등 (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 및 WO2010079430). TALE는, 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 중요한, 직렬 반복물 (각각의 반복물은 약 34개의 아미노산을 포함)의 집중된 도메인을 포함한다. 또한, 이들은 핵 국소화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 포함한다. (참조: Schornack S, 등 (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). 또한, 식물병원성 세균인 랄스토니아 솔라나시룸 (Ralstonia solanacearum)에서, brg11 및 hpx17로 표시되는 2개의 유전자가 밝혀졌으며, 이들은 알. 솔라나시룸 생물변이형 1 스트레인 GMI1000 (R. solanacearum biovar 1 strain GMI1000) 및 생물변이형 4 스트레인 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리와 상동성이다 (참조: Heuer 등 (2007) Appl 및 Envir Micro 73(13): 4379-4384). 이들 유전자는 뉴클레오타이드 서열이 서로 98.9% 동일하나, hpx17의 반복 도메인에서 1,575 bp의 결실에 의해 차이가 난다. 그러나, 두 유전자 생성물 모두가 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 초과의 서열 동일을 갖는다.
따라서, 일부 실시형태에서, 표적 유전자자리 (글로빈 또는 세이프 하버) 내의 표적 부위에 결합하는 DNA 결합 도메인은 식물 병원체인 크산토모나스 (참조: Boch 등, (2009) Science 326: 1509-1512 및 Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326: 1501) 및 랄스토니아 (참조: Heuer 등 (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384; 미국 특허 번호 8,420,782 및 8,440,431 및 미국 특허 공개 번호 20110301073)로부터 유도되는 것들과 유사한 TAL 이펙터로부터의 조작된 도메인이다.
특정 실시형태에서, DNA 결합 도메인은 징크 핑거 단백질 (예: 글로빈 또는 세이프-하버 유전자 내의 표적 부위에 결합되는 징크 핑거 단백질)을 포함한다. 바람직하게는, 징크 핑거 단백질은 선택된 표적 부위에 결합되도록 조작되므로 비-천연 발생이다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국 특허 번호 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개 번호 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061 (이들 문헌 모두가 전부 참조로 본원에 포함된다).
조작된 징크 핑거 결합 또는 TALE 도메인은 천연-발생 징크 핑거 단백질과 비교하여 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은, 비제한적으로, 합리적인 디자인 및 다양한 유형의 선택을 포함한다. 합리적인 디자인은, 예를 들어, 삼중자 (또는 사중자) 뉴클레오타이드 서열 및 각각의 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하며, 이때 각각의 삼중자 또는 사중자 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중자 또는 사중자 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 공동-소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261 (전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
파아지 디스플레이 및 투-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선별 방법이 문헌 (미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237)에 기재되어 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성 증진이, 예를 들어, 공동-소유의 WO　02/077227에 기재되어 있다.
또한, 이들 문헌 및 다른 문헌에 기재되어 있는 바와 같이, DNA 도메인 (예: 다중-핑거의 징크 핑거 단백질 또는 TALE 도메인)은, 예를 들어, 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여, 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이를 갖는 예시적 링커 서열에 대해, 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 DNA 결합 단백질은 단백질의 각각의 징크 핑거 사이에 임의의 조합의 적합한 링커를 포함할 수 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성 증진은, 예를 들어, 공동-소유의 WO　02/077227에 기재되어 있다.
표적 부위; DNA-결합 도메인의 선택 및 융합 단백질 (및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 디자인 및 작제 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 문헌 (미국 특허 번호　6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970 WO　01/88197; WO　02/099084; WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536 및 WO　03/016496 및 미국 공개 번호 20110301073)에 상세히 기재되어 있다.
또한, 이들 문헌 및 다른 문헌에 기재되어 있는 바와 같이, DNA-결합 도메인 (예: 다중-핑거의 징크 핑거 단백질)은, 예를 들어, 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여, 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이를 갖는 예시적 링커 서열에 대해, 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 각각의 징크 핑거 사이에 임의의 조합의 적합한 링커를 포함할 수 있다.
B. 절단 도메인
임의의 적합한 절단 도메인은 뉴클레아제를 형성하도록 DNA-결합 도메인에 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인은 ZFN (이의 조작된 (ZFP) DNA 결합 도메인을 통해 의도된 핵산 표적물을 인식하고 DNA가 뉴클레아제 활성을 통해 ZFP 결합 부위에서 가까운 곳에서 절단되게 할 수 있는 기능적 실체)을 생성하도록 뉴클레아제 도메인에 융합되었다. 예를 들어, 문헌 (Kim 등 (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160)을 참조한다. 보다 최근에는, ZFN이 다양한 유기체에서 게놈 변형에 사용되었다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 번호 07/014275. 유사하게, TALE DNA-결합 도메인은 TALEN을 생성하도록 뉴클레아제 도메인에 융합되었다. 예를 들어, 미국 공개 번호 20110301073을 참조한다.
상기 주목되는 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어, 뉴클레아제로부터의 징크 핑거 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 절단 도메인, 또는 상이한 뉴클레아제로부터의 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 절단 도메인에서, DNA-결합 도메인에 대해 이종성일 수 있다. 이종성 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소 뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유도될 수 있는 예시적 엔도뉴클레아제는, 비제한적으로, 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하기를 참조한다: 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. DNA를 절단하는 추가의 효소들이 알려져 있다 (예: S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제) (참조: Linn 등 (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993). 이들 효소 (또는 이의 기능성 단편) 중 하나 이상은 절단 도메인 및 절단 반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 반-도메인은, 절단 활성에 이량체화를 필요로 하는, 상기 제시된 바와 같은 임의의 뉴클레아제 또는 이의 부분으로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 반-도메인을 포함하는 경우, 2개의 융합 단백질이 절단에 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)으로부터 유도될 수 있거나, 각각의 절단 반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능성 단편)으로부터 유도될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게는 2개의 융합 단백질이 각각의 표적 부위에 결합함으로써 절단 반-도메인이, 예를 들어, 이량체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성하는 공간 배향으로 위치되도록 서로에 대해 배치된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 표적 부위의 가까운 가장자리는 5 내지 8개의 뉴클레오타이드 또는 15 내지 18개의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 쌍 (예를 들어, 2 내지 50개의 뉴클레오타이드 쌍 또는 그 이상)이 2개의 표적 부위 사이에 끼어들 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 놓인다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에 존재하며, (인식 부위에서) DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있고 결합 부위에서 또는 가까이서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예: 유형 IIS)는 인식 부위로부터 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 갖는다. 예를 들어, 유형 IIS 효소 Fok　I은 한 가닥 상의 인식 부위로부터는 9개 뉴클레오타이드 및 또 다른 가닥 상의 인식 부위로부터는 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; Li 등(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등 (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등 (1994b) J. Biol. Chem.269:31,978-31,982. 따라서, 하나의 실시형태에서, 융합 단백질은, 조작되거나 조작되지 않을 수 있는, 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 반-도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적 유형 IIS 제한 효소는 Fok　I이다. 이러한 특정한 효소는 이량체로서 활성이다 (Bitinaite 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575). 따라서, 본원 기재의 목적상, 본원에 기재된 융합 단백질에 사용되는 Fok　I 효소의 부분은 절단 반-도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거-Fok　I 융합물을 사용하는 표적된 이중-가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적된 대체를 위해, 각각 FokI 절단 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, DNA 결합 도메인 및 2개의 Fok　I 절단 반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 분자도 또한 사용될 수 있다.
절단 도메인 또는 절단 반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 기능성 절단 도메인을 형성하도록 다량체화 (예: 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적 유형 IIS 제한 효소는 국제 공보 WO 07/014275 (본원에 이의 전문이 포함됨)에 기재되어 있다. 추가의 제한 효소는 또한 분리가능한 결합 및 절단 도메인을 포함하며, 이들은 본원의 기재에 의해 고려된다. 예를 들어, 문헌 (Roberts 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420)을 참조한다.
특정 실시형태에서, 절단 도메인은, 예를 들어, 문헌 (미국 특허 공개 번호 20050064474; 20060188987 및 20080131962, 이들 모두의 기술이 본원에 전부 참조로 포함됨)에 기재되어 있는 바와 같이, 호모이량체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 반-도메인 (이량체화 도메인 돌연변이체로도 지칭됨)을 포함한다. Fok I의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538에서의 아미노산 잔기가 Fok I 절단 반-도메인의 이량체화에 영향을 끼치는 모든 표적물이다.
완전 헤테로이량체를 형성하는 Fok I의 예시적인 조작된 절단 반-도메인은 제1 절단 반-도메인이 Fok I의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고 제2 절단 반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 하나의 양태에서, 490에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 대체시키고; 538에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체시키고; 486에서의 돌연변이는 Gln (Q)을 Glu (E)로 대체시키고; 499에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체시킨다. 구체적으로, 본원에 기재되는 조작된 절단 반-도메인은 하나의 절단 반-도메인에서 위치 490 (E→K) 및 538 (I→K)를 돌연변이시켜 "E490K:I538K"로 표시되는 조작된 절단 반-도메인을 생성하고 또 다른 절단 반-도메인에서 위치 486 (Q→E) 및 499 (I→L)를 돌연변이시켜 "Q486E:I499L"로 표시되는 조작된 절단 반-도메인을 생성함으로써 제조되었다. 본원에 기재된 조작된 절단 반-도메인은 비정상 절단을 최소화하거나 없앤 완전 헤테로이량체 돌연변이체이다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2008/0131962 (이의 기재가 모든 점에서 전부 참조로 포함됨)를 참조한다.
특정 실시형태에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 486, 499 및 496 (야생형 FokI에 대해 번호매김)에서 돌연변이, 예를 들어, 위치 486에서의 야생형 Gln (Q) 잔기를 Glu (E) 잔기로 대체시키고, 위치 499에서의 야생형 Iso (I) 잔기를 Leu (L) 잔기로 대체시키고, 위치 496에서의 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 대체시키는 (각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로 지칭됨) 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 490, 538 및 537 (야생형 FokI에 대해 번호매김)에서 돌연변이, 예를 들어, 위치 490에서의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로 대체시키고, 위치 538에서의 야생형 Iso (I) 잔기를 Lys (K) 잔기로 대체시키고, 위치 537에서의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 대체시키는 (각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로 지칭됨) 돌연변이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 조작된 절단 반-도메인은 위치 490 및 537 (야생형 FokI에 대해 번호매김)에서 돌연변이, 예를 들어, 위치 490에서의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로 대체시키고, 위치 537에서의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 대체시키는 (각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로 지칭됨) 돌연변이를 포함한다 (참조: 미국 특허 공개 번호20110201055, 본원에 참조로 포함됨). 본원에 기재된 조작된 절단 반-도메인은 적합한 방법, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20050064474; 20080131962; 및 20110201055에 기재되는 바와 같은 야생형 절단 반-도메인 (Fok I)의 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20090068164 참조)을 이용하여 핵산 표적 부위에서 생체내 조립될 수 있다. 이러한 분할 효소 성분은 분리된 발현 작제물 상에서 발현될 수 있거나 개개의 성분이, 예를 들어, 자가-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 개방 판독 프레임으로 연결될 수 있다. 성분들은 징크 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는, 예를 들어, WO 2009/042163 및 20090068164에 기재되는 바와 같은 효소-기반 염색체 시스템에서 사용하기 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제 발현 작제물은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 용이하게 디자인될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 번호 07/014275를 참조한다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어, 라피노즈 및/또는 갈락토즈의 존재 하에서 활성화 (탈-억제)되고 글루코즈의 존재 하에서 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템
진핵생물 RNAi 경로에 필적하는 것으로 가정된 원시세균류 (archaea) 및 많은 세균에서의 RNA-매개된 게놈 방어 경로의 존재에 대한 강력한 증거가 최근에 부상되었다 (참조: Godde and Bickerton, 2006. J. Mol. Evol. 62: 718-729; Lillestol 등, 2006. Archaea 2: 59-72; Makarova 등, 2006. Biol. Direct 1: 7.; Sorek 등, 2008. Nat. Rev. Microbiol. 6: 181-186). 2개의 진화론적으로 종종 물리적으로 연결된 유전자의 유전자자리: 시스템의 RNA 성분을 암호화하는 CRISPR (무리를 이뤄 규칙적으로 간격을 둔 짧은 팔린드롬 반복물) 유전자자리 및 단백질을 암호화하는 cas (CRISPR-연관된) 유전자자리로부터 발생하는 CRISPR-Cas 시스템 또는 원핵생물 RNAi (pRNAi)로 알려진 경로가 제시된다 (Jansen 등, 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova 등, 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova 등, 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft 등, 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60). 미생물 호스트에서의 CRISPR 유전자자리는 CRISPR-관련 (Cas) 유전자와 CRISPR-매개된 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-암호화 RNA 요소의 조합을 포함한다. 각각의 Cas 단백질은 진핵생물 RNAi 기구의 단백질 성분와 유의한 서열 유사성을 공유하지는 않지만, 유사한 예상된 기능 (예: RNA 결합, 뉴클레아제, 헬리카제 등)을 갖는다 (Makarova 등, 2006. Biol. Direct 1: 7). CRISPR-관련된 (cas) 유전자는 종종 CRISPR 반복-스페이서 어레이와 관련된다. 40개 초과의 상이한 Cas 단백질 패밀리가 기재되어 있다. 이들 단백질 패밀리 중에서 Cas1은 상이한 CRISPR/Cas 시스템 어디에나 존재하는 것으로 보인다. cas 유전자 및 반복 구조물의 특정 조합이 8개의 CRISPR 아유형 (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, and Mtube) (이중 일부는 반복물-관련된 미지의 단백질 (RAMP)을 암호화하는 추가의 유전자 모듈과 관련된다)을 규정하는데 사용되었다. 하나 초과의 CRISPR 아유형이 단일 게놈에서 발생할 수 있다. CRISPR/Cas 아유형의 산발적 분포는 시스템이 미생물 진화 동안 수평적 유전자 전달을 받는다는 것을 제시한다.
유형 II CRISPR (Cas9로 예시됨)은 가장 잘 특성화된 시스템 중의 하나이며, 4개의 연속 단계에서 표적된 DNA 이중-가닥 파괴를 수행한다. 먼저, 2개의 비-암호화 RNA, pre-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자자리로부터 전사된다. 두번째로, tracrRNA가 pre-crRNA의 반복 영역에 하이브리드화되고, pre-crRNA의 각각의 스페이서 서열을 포함하는 성숙 crRNA로의 프로세싱을 매개한다. 세번째로, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는, 표적물 인식에 대한 추가의 요건인 crRNA 상의 스페이서와 프로토스페이서 (protospacer) 인접 모티프 (PAM) 다음의 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 염기쌍을 통해 Cas9를 표적 DNA로 이끈다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 이중-가닥 파괴를 일으킨다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 3개의 단계: (i) 소위 '적응' 과정에서 미래의 공격을 방지하기 위해 이질적인 DNA 서열의 CRISPR 어레이로의 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현 및 어레이의 발현 및 프로세싱, 이어서 (iii) 이질적 핵산으로의 RNA-매개된 간섭을 포함한다. 따라서, 세균 세포에서, 소위 'Cas' 단백질 중 수개가 CRISPR/Cas 시스템의 자연적 기능과 연관된다.
CRISPR 유전자자리의 주요 생성물은 침입자 표적 서열을 포함하는 짧은 RNA인 것으로 보이며, 경로에서의 이들의 가정적 역할에 기초하여 가이드 RNA 또는 원핵생물 사일런싱 RNA (psiRNA)로 불린다 (Makarova 등(2006) Biol. Direct 1:7; Hale 등(2008) RNA14: 2572-2579). RNA 분석은 CRISPR 유전자자리 전사물이 반복 서열 내에서 절단되어 각각의 침입자 표적 서열 및 측면 배치의 반복 단편을 포함하는 약 60 내지 70-nt RNA 중간체를 방출시킨다 (Tang 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 7536-7541; Tang 등 (2005) Mol. Microbiol. 55:469-481; Lillestol 등 (2006) Archaea 2:59-72; Brouns 등 (2008) Science 321: 960-964; Hale 등 (2008) RNA 14:2572-2579). 원시세균 피로코쿠스푸리오수스 (Pyrococcusfuriosus)에서 이들 중간체 RNA는 풍부하고 안정한 "35- 내지 45-nt 성숙 psiRNA로 추가로 프로세싱된다 (Hale 등 (2008) RNA 14: 2572-2579).
Cas 단백질
"Cas1" 폴리펩타이드는 CRISPR 관련된 (Cas) 단백질1을 지칭한다. Cas1 (단백질 분류 시스템의 이종상동성 그룹 클러스터에서 COG1518)은 CRISPR-관련된 시스템 (CASS)의 최고 마커이다. 계통발생 비교에 기초하여, CRISPR-관련된 면역 시스템의 7개의 상이한 버젼이 확인되었다 (CASS1 내지 7).
본원에 기재되는 방법에 사용되는 Cas1 폴리펩타이드는 임의의 원핵생물에 존재하는 임의의 Cas1 폴리펩타이드일 수 있다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 원시세균의 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 유리원시세균의 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 크렌원시세균의 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 세균의 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 그람 음성 또는 그람 양성 세균의 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 슈도모나스 애루기노사 (Psudomonas aeruginosa)의 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 애퀴펙사에올리쿠스 (Aquifexaeolicus)의 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 CASS1 내지 7 중 하나의 일원인 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 CASS3의 일원인 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 CASS7의 일원인 Cas1 폴리펩타이드이다. 특정 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는 CASS3 또는 CASS7의 일원인 Cas1 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, Cas1 폴리펩타이드는, 예를 들어, GeneID 번호: 2781520, 1006874, 9001811, 947228, 3169280, 2650014, 1175302, 3993120, 4380485, 906625, 3165126, 905808, 1454460, 1445886, 1485099, 4274010, 888506, 3169526, 997745, 897836, 또는 1193018로 GenBank에서 제공되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고/되거나 이들 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산과 상동성 (예: 80% 초과, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한 90 내지 99%)을 나타내고 폴리펩타이드가 Cas1 폴리펩타이드와 같이 기능하는 아미노산 서열을 갖는다.
Cas6은 또 다른 Cas 폴리펩타이드이며, 엔도리보뉴클레아제 활성은 본원에서 Cas6 엔도리보뉴클레아제 활성으로 지칭된다. 적합한 Cas6 폴리펩타이드의 비-제한적 예가 Genbank 기탁 번호 AAL81255로 표시된다. Cas6 폴리펩타이드는 CRISPR 유전자자리 및 cas (CRISPR-관련된) 유전자자리를 갖는 미생물, 예컨대 피로코쿠스푸리오수스 (Pyrococcusfuriosus)로부터 농축되거나 분리되거나 정제될 수 있거나, 재조합 기술을 이용하여 생성되거나 통상의 방법을 이용하여 화학적으로 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 일부 양태에서, Cas6 폴리펩타이드는 CRISPR 유전자자리를 갖지 않는 미생물로부터 농축되거나 분리되거나 정제될 수 있다. Cas6 폴리펩타이드는 촉매작용에서 역할을 할 수 있는 적어도 하나의 잔기 또는 이의 보존적 치환체를 포함한다. Cas6 폴리펩타이드는 또한 촉매작용에서 역할을 할 수 있는 다른 잔기 또는 이의 보존적 치환체를 포함할 수 있다. 촉매작용에서 역할을 할 것으로 예측되는 잔기(들)는 단백질의 3D 구조에 Cas6 특징 모티프를 포함하는 G-농축 루프 근처에 위치될 수 있다. Cas6 폴리펩타이드는 기탁 번호 TIGR01877 및 PF01881으로 TIGRFAM 데이터베이스에 존재하는 도메인을 포함할 수 있다. TIGRFAM 데이터베이스는 기능이 보존되는 폴리펩타이드의 패밀리를 포함한다 (Haft 등 (2003) Nucl. Acids Res. 31:371-373, Bateman and Haft (2002) Briefings Bioinformatics, 3:236-245, 및 Haft 등 (2005) PLoS Computational Biol. 1(6):e60).
본원에 제공되는 Cas6 폴리펩타이드의 다른 예는 CRISPR 유전자자리 및 cas 유전자자리를 갖는 원핵 미생물에 존재하는 것들을 포함한다. Cas6 폴리펩타이드는 CRISPR 유전자자리를 포함하는 임의의 미생물에서 용이하게 확인될 수 있다. Cas6 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 영역은 전형적으로 CRISPR 유전자자리에 매우 근접하게 위치된 cas 유전자자리에 존재한다. 문헌 (Haft 등 (2005) PLoS Computational Biol. 1(6):e60))은 Cas 단백질 패밀리 및 CRISPR/Cas 시스템의 특정 아유형을 확인하기 위한 창작된 규칙을 검토하고 있다. 하프트 (Haft) 등은 Cas6 폴리펩타이드를 암호화하는 암호화 영역이 적어도 4개의 분리된 CRISPR/Cas 아유형 ((Tneap, Hmari, Apern 및 Mtube)과 관련하여 발견되며, 전형적으로 CRISPR 유전자자리에 대해 가장 멀리 위치되는 cas 암호화 영역인 것으로 기재하고 있다. Cas6 폴리펩타이드는 JCVI 종합적 미생물 자원 (Comprehensive Microbial Resource)에서 이용가능한 자원을 사용하여 확인될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법에 유용한 Cas6 폴리펩타이드는 통상의 방법으로 당업자에 의해 확인될 수 있다.
Cas6 폴리펩타이드를 암호화 하는 것으로 예측되는 암화화 영역을 포함하는 공지된 전체 게놈 서열을 갖는 원핵 미생물의 예는 테르모토가마리티마 (Thermotogamaritima) MSB8, 캄필로박터 페투스 아종 페투스 (Campylobacter fetus subsp. fetus) 82-40, 푸소박테리움누클레아툼 (Fusobacteriumnucleatum) ATCC 25586, 스트렙토코쿠스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus) LMG 18311, 써모아내로박테르텡콘젠시스 (Thermoanaerobactertengcongensis) MB4(T), 무렐라써모아세티카 (Moorellathermoacetica) ATCC 39073, 데술피토박테리움하프니세 (Desulfitobacteriumhafniense) Y51, 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani) E88, 클로스트리디움 페르프링겐스 (Clostridium perfringens) SM101, 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile) QCD-32g58, 클로스트리디움 보툴리눔 홀 A 생거 (Clostridium botulinum Hall A Sanger), 클로스트리디움 보툴리눔 F 랑겔란트 (Clostridium botulinum F Langeland), 클로스트리디움 보툴리눔 B1 스트레인 오크라 (Clostridium botulinum B1 strain Okra), 클로스트리디움 보툴리눔 A3 스트레인 로쉬 마리 (Clostridium botulinum A3 strain Loch Maree), 클로스트리디움 보툴리눔 A 홀 (Clostridium botulinum A Hall), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) A ATCC 19397, 카복시도써무스하이드로게노포르만스 (Carboxydothermushydrogenoformans) Z-2901, 타필로코쿠스 에피더미디스 (taphylococcus epidermidis) RP62A, 써무스써모필루스 (Thermusthermophilus) HB8, 써무스써모필루스 (Thermusthermophilus) HB27, 노스톡 종 (Nostoc sp.) PCC 7120, 아나배나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis) ATCC 29413, 시네초코쿠스 종 OS 타입 B 프라임 (Synechococccus sp. OS Type B prime), 시네초코쿠스 종 OS 타입 A (Synechococccus sp. OS Type A), 포르피로모나스긴기발리스 (Porphyromonasgingivalis) W83, 박테로이데스프라길리스 (Bacteroidesfragilis) YCH46, 박테로이데스프라길리스 (Bacteroidesfragilis) NCTC9343 , 애퀴펙사에올리쿠스 (Aquifexaeolicus) VF5, 루브로박테르크실라노필루스 (Rubrobacterxylanophilus) DSM 9941, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) H37Rv (랩 스트레인), 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) CDC1551, 미코박테리움 보비스 아종 보비스 (Mycobacterium bovis subsp. bovis) AF2122/97, 프란키아알니 (Frankiaalni) ACN14a, 써모플라스마볼카니움 (Thermoplasmavolcanium) GSS1, 피크로필루스토리두스 (Picrophilustorridus) DSM 9790, 써모코쿠스코다카렌시스 (Thermococcuskodakarensis) KOD1, 피로코쿠쇼리코시이신카즈 (Pyrococcushorikoshiishinkaj) OT3, 피로코쿠스푸리오수스 (Pyrococcusfuriosus) DSM 3638, 피로코쿠사비씨 (Pyrococcusabyssi) GE5, 메타노사르시나바르케리푸사로 (Methanosarcinabarkerifusaro), 메타노사르시나아세티보란스 (Methanosarcinaacetivorans) C2A, 메타노코코이데스부르토니 (Methanococcoidesburtonii) DSM 6242, 메타노코쿠스잔나쉬 (Methanococcusjannaschii) DSM2661, 메타노박테리움써모아우토트로피쿰 델타 (Methanobacteriumthermoautotrophicum delta) H, 할로아르쿨라마리스모르투이 (Haloarculamarismortui) ATCC 43049, 아르채오글로부스풀기두스 (Archaeoglobusfulgidus) DSM4304, 피로박쿨루매로필룸 (Pyrobaculumaerophilum) 1M2, 술폴로부스토코다이 스트레인 (Sulfolobustokodaii strain) 7, 술폴로부솔파타리쿠스 (Sulfolobussolfataricus) P2, 술폴로부사시도칼다리우스 (Sulfolobusacidocaldarius) DSM 639, 애로피룸페르닉스 (Aeropyrumpernix) K1을 포함한다. Cas6 폴리펩타이드의 다른 예, 예를 들어, COG1583 그룹의 폴리펩타이드의 멤버 (National Center for Biotechnology Information 인터넷 사이트를 통해 COG (the Clusters of Orthologous Groups of proteins) 웹 페이지에서 입수가능; 또한, Tatusov 등 (1997) Science 278:631-637 및 Tatusov 등 (2003) BMC Bioinformatics 4(1):41 참조), 기탁 번호 IPRO10156의 InterPro 패밀리의 멤버 (Makarova 등 (2002) Nuc. Acids Res. 30:482-496 및 Haft 등 (2005) PLoS Comput. Biol. 1(6):e60, 474-483))가 당업자에게 알려져 있다.
RNA 및 Cas 단백질을 모두 포함하는 3가지 유형의 CRISPR/Cas 시스템이 있다. 유형 I 및 III 모두, crRNA로 완전히 프로세싱되는 경우 crRNA에 상보적인 핵산을 절단할 수 있는 다중-Cas 단백질 복합체를 조립하는 pre-crRNA를 프로세싱하는 Cas 엔도뉴클레아제를 갖는다.
유형 II CRISPR/Cas 시스템에서, crRNA는 pre-crRNA에서의 반복 서열에 상보적인 트랜스-활성화 RNA (tracrRNA)가 Cas9 단백질의 존재 하에 이중 가닥-특이적 RNase III에 의한 프로세싱을 촉발하는 상이한 기작을 이용하여 생성된다. 이때, Cas9는 성숙 crRNA에 상보적인 표적 DNA를 절달할 수 있으나, Cas9에 의한 절단은 crRNA와 표적 DNA 사이의 염기-짝짓기 및 PAM 서열로 지칭되는 crRNA 내의 짧은 모티프 (프로토스페이서 인접 모티프)의 존재 모두에 의존적이다 (참조: Qi 등 (2013) Cell 152:1173). 또한, tracrRNA는 3' 말단에서 crRNA와 염기 짝지을 때 존재해야 하며, 이러한 화합은 Cas9 활성을 촉발시킨다.
Cas9 단백질은 적어도 2개의 뉴클레아제 도메인을 갖는다: 하나의 뉴클레아제 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 유사하고, 다른 뉴클레아제 도메인은 Ruv 엔도뉴클레아제 도메인과 유사하다. HNH형 도메인은 crRNA에 상보적인 DNA 가닥을 절단하는데 책임이 있는 것으로 보이고, Ruv 도메인은 비-상보적 가닥을 절단한다.
crRNA-tracrRNA 복합체의 요구는 일반적으로 crRNA 및 tracrRNA의 어닐링에 의해 형성되는 헤어핀을 포함하는 조작된 "단일-가이드 RNA" (sgRNA)의 사용에 의해 피해질 수 있다 (참조: Jinek 등 (2012) Science 337:816 및 Cong 등 (2013) Sciencexpress/10.1126/science.1231143). 에스. 피로게네스 (S. pyrogenes)에서, 조작된 tracrRNA:crRNA 융합 또는 sgRNA는, 이중 가닥 RNA:DNA 헤테로이성체가 Cas 관련 RNA와 표적 DNA 사이에 형성되는 경우, Cas9가 표적 DNA를 절단하도록 가이드한다. Cas9 단백질 및 PAM 서열을 포함하는 조작된 sgRNA를 포함하는 이러한 시스템은 RNA 가이드된 게놈 편집에 사용되었으며 (참조: Ramalingam, 상기 참조), ZFN 및 TALEN과 유사한 편집 효율로 생체내에서 제브라피시 배아 게놈 편집에 유용하였다 (참조: Hwang 등 (2013) Nature Biotechnology 31(3):227).
특정 실시형태에서, Cas 단백질은 천연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩타이드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩타이드와 마찬가지로 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는, 비제한적으로, 상응하는 천연 서열 폴리펩타이드와 공통적인 생물학적 활성을 갖는 한, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩타이드 및 이의 단편의 유도체를 포함한다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체, 공유적 변형물 및 이의 융합물 모두를 포함한다.
"Cas 폴리펩타이드"는 전장 Cas 폴리펩타이드, Cas 폴리펩타이드의 효소적 활성 단편 및 Cas 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 효소적 활성 유도체를 포함한다. Cas 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 적합한 유도체는, 비제한적으로, Cas 단백질 또는 이의 단편의 돌연변이체, 융합물, 공유적 변형물을 포함한다.
Cas 단백질 및 Cas 폴리펩타이드는 세포로부터 수득될 수 있거나 화학적으로 합성되거나 이들 두 절차의 조합으로 수득될 수 있다. 세포는 천연적으로 Cas 단백질을 생성하는 세포, 또는 내인성 Cas 단백질을 더욱 높은 발현 수준으로 생성하거나 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 암호화하는 외적으로 도입된 핵산으로부터의 Cas 단백질을 생성하도록 유전자 조적된 세포일 수 있다. 일부의 예에서, 세포는 천연적으로는 Cas 단백질을 생성하지 않고 Cas 단백질을 생성하도록 유전자 조작된다.
CRISPR/Cas 시스템은 또한 유전자 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 문헌 (Lei 등 (2013) Cell 152(5):1173-1183)은 엔도뉴클레아제 활성이 없는 촉매적으로 죽은 Cas9가 가이드 RNA와 함께 공동발현되는 경우 전사 연장, RNA 폴리머라제 결합 또는 전사 인자 결합을 특이적으로 방해할 수 있는 DNA 인식 복합체를 생성한다는 것을 제시하였다. CRISPR 간섭 (CRISPRi)이라 불리는 이러한 시스템은 표적 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
추가로, DSB를 유도할 수 없게 하고 대신에 표적 DNA로 닉을 도입하도록 절단 도메인에 돌연변이를 포함하는 Cas 단백질이 개발되었다 ("Cas9 닉화 (nicking) 효소", 참조: Cong 등, 상기 참조).
본 발명의 Cas 단백질은 기능을 변화시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 파아지 디스플레이 및 투-하이브리드 시스템을 포함한 예시적 선별 방법이 문헌 (미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237)에 기재되어 있다.
CRISPR/Cas의 RNA 성분
Cas9 관련 CRISPR/Cas 시스템은 2개의 RNA 비-암호화 성분: tracrRNA 및 동일한 직접적 반복물 (DR)에 의해 간격을 둔 뉴클레아제 가이드 서열 (스페이서)를 포함하는 pre-crRNA 어레이를 포함한다. 게놈 조작을 달성하는데 CRISPR/Cas 시스템을 사용하기 위해, 이들 RNA의 두 기능 모두가 존재해야 한다 (참조: Cong 등, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). 일부 실시형태에서, tracrRNA 및 pre-crRNA는 분리된 발현 작제물을 통해 또는 분리된 RNA로서 공급된다. 다른 실시형태에서, 조작된 성숙 crRNA (표적 특이성을 부여)가 키메릭 crRNA-tracrRNA 하이브리드 (단일 가이드 RNA로도 불림)를 생성하기 위해 tracrRNA (Cas9와의 상호작용을 공급)에 융합되는 키메릭 RNA가 작제된다 (참조: Jinek, 상기 참조 및 Cong, 상기 참조).
키메릭 또는 sgRNA는 임의의 목적하는 표적물에 상보적인 서열을 포함하도록 조작될 수 있다. RNA는 표적물 및 형태 G[n19]에 상보적인 22개 염기에 이어 형태 NGG의 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)을 포함한다. 따라서, 하나의 방법에서, sgRNA는 (i) (사람, 마우스 또는 특정한 식물 종의) 관련 게놈의 참조 서열과 함께 ZFN 헤테로이량체의 인식 서열을 정렬하고; (ii) ZFN 반-부위 사이의 스페이서 영역을 확인하고; (iii) 스페이서 영역과 가장 가까운 모티프 G[N20]GG의 위치를 확인하며 (하나 초과의 이러한 모티프가 스페이서와 겹치는 경우, 스페이서에 비해 중앙에 있는 모티프가 선택된다); (iv) 상기 모티프를 sgRNA의 코어로 사용함으로써 관심 유전자 내의 공지된 ZFN 표적물을 사용하여 디지인될 수 있다. 이러한 방법은 유리하게는 입증된 뉴클레아제 표적물에 의존한다. 대안적으로, sgRNA는 단순히 G[n20]GG 식을 따르는 적합한 표적 서열을 확인함으로써 관심물의 임의의 영역을 표적하도로 디자인될 수 있다.
표적 부위
상기에서 상세히 기재되는 바와 같이, DNA-결합 도메인은 유전자자리 내의 임의의 선택 서열, 예를 들어, 글로빈 또는 세이프-하버 유전자에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA-결합 도메인은 천연-발생 DNA-결합 도메인에 비해 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은, 비제한적으로, 합리적인 디자인 및 다양한 유형의 선택을 포함한다. 합리적 디자인은, 예를 들어, 삼중자 (또는 사중자) 뉴클레오타이드 서열 및 각각의 (예: 징크 핑거) 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 이때 각각의 삼중자 또는 사중자 뉴클레오타이드 서열은 특정한 삼중자 또는 사중자 서열에 결합하는 DNA 결합 도메인의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261 (이들의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 또한, TAL-이펙터 도메인의 합리적 디자인도 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110301073을 참조한다.
파아지 디스플레이 및 투-하이브리드 시스템을 포함한 DNA-결합 도메인에 적용 가능한 예시적 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237에 기재되어 있다.
표적 부위의 선택; 뉴클레아제 및 융합 단백질 (및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 디자인 및 작제 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허원 공개 번호 20050064474 및 20060188987 (이들의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 상세히 기재되어 있다.
또한, 이들 참조문 및 다른 참조문에 기재되어 있는 바와 같이, DNA-결합 도메인 (예: 다중-핑거의 징크 핑거 단백질)은, 예를 들어, 5개 이상의 아미노산의 링커를 포함한 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적 링커 서열에 대해 미국 특허 번호 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 각각의 DNA-결합 도메인 사이에 임의의 조합의 적합한 링커를 포함할 수 있다. 또한, 미국 특허 공개 번호 20110287512를 참조한다.
도너
상기 주목되는 바와 같이, 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 교정 또는 야생형 유전자의 증가된 발현을 위한, 외인성 서열 ("도너 서열" 또는 "도너" 또는 "전이유전자"로도 불림)의 삽입. 도너 서열은 일반적으로 이것이 위치되는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것은 너무나 자명할 것이다. 도너 서열은 목적 위치에서 효과적인 HDR을 감암하여 2개의 상동성 영역이 옆에 배치되는 비-상동성 서열을 포함할 수 있다. 또한, 도너 서열은 세포 염색질 내의 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 포함하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 도너 분자는 세포 염색질에 상동성인 수개의 불연속 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역 내에 정상적으로는 존재하지 않는 서열의 표적된 삽입을 위해, 상기 서열은 도너 핵산 분자에 존재할 수 있고 관심 영역의 서열에 대해 상동성인 영역이 옆에 배치될 수 있다.
선택된 위치로의 삽입을 위한 임의의 폴리뉴클레오타이드의 표적된 삽입 방법이 본원에 기재된다. 삽입을 위한 폴리뉴클레오타이드는 또한 "외인성" 폴리뉴클레오타이드, "도너" 폴리뉴클레오타이드 또는 분자 또는 "전이유전자"로 지칭될 수 있다. 도너 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 원형으로 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20100047805, 20110281361, 20110207221 및 U.S. 출원 번호 13/889,162를 참조한다. 도너 서열(들)은 원형 또는 선형으로 세포로 도입될 수 있는 DNA MC 내에 포함될 수 있다. 선형으로 도입되는 경우, 도너 서열의 말단은 당업자에게 공지된 방법으로 (예를 들어, 엑소뉴클레오리틱 (exonucleolytic) 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 첨가되며/되거나 자가-상보적 올리고뉴클레오타이드가 하나의 말단 또는 두 말단 모두에 결합된다. 예를 들어, 문헌 (Chang 등 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등 (1996) Science 272:886-889)을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오타이드를 보호하기 위한 추가의 방법은, 비제한적으로, 말단 아미노 그룹(들)의 추가 및 변형된 인터뉴클레오타이드 결합, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보즈 또는 데옥시리보즈 잔기의 사용을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 추가의 서열, 예컨대 복제 기원, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자를 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포로 도입될 수 있다. 또한, 도너 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 (naked) 핵산, 작용제와 복합체를 이룬 핵산, 예컨대 리포좀 또는 폴록사머로서 도입될 수 있거나, 바이러스 (예: 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스 (IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
특정 실시형태에서, 이중-가닥 도너는 1 kb 초과 길이, 예를 들어, 2 내지 200 kb, 2 내지 10 kb (또는 이들 사이의 임의의 값)의 서열 (예: 암호화 서열, 전이유전자로도 지칭됨)을 포함한다. 이중-가닥 도너는 또한 예를 들어 적어도 하나의 뉴클레아제 표적 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 도너는, 예를 들어, CRISPR/Cas와 함께 사용하기 위한 적어도 하나의 표적 부위 또는, 예를 들어, ZFN 또는 TALEN의 쌍을 위한 2개의 표적 부위를 포함한다. 전형적으로, 뉴클레아제 표적 부위는 전이유전자 서열의 외부, 예를 들어, 전이유전자의 절단을 위해 전이유전자 서열에 대해 5' 및/또는 3'이다. 뉴클레아제 절단 부위(들)은 임의의 뉴클레아제(들)에 대한 것일 수 있다. 특정 실시형태에서, 이중-가닥 도너에 포함되는 뉴클레아제 표적 부위(들)은 절단된 도너가 상동성-독립적 방법으로 통합되는 내인성 표적물을 절단하는데 사용되는 동일한 뉴클레아제(들)에 대한 것이다.
도너는 일반적으로 발현이 통합 부위에서의 내인성 프로모터, 즉 도너가 삽입되는 내인성 유전자 (예: 글로빈, AAVS1 등)의 발현을 이끄는 프로모터에 의해 유도되도록 삽입된다. 그러나, 도너가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어, 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다는 것이 분명할 것이다.
도너 분자는 내인성 유전자의 전부 또는 일부가 발현되거나 내인성 유전자가 발현되지 않도록 내인성 유전자로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재되는 전이유전자는 내인성 글로빈 서열의 일부가, 예를 들어, 전이유전자와의 융합물로서 발현되거나 내인성 글로빈 서열이 발현되지 않도록 글로빈 유전자자리로 삽입될 수 있다. 다른 실시형태에서, (예를 들어, 글로빈 암호화 서열을 갖거나 갖지 않는) 전이유전자는 임의의 내인성 유전자자리, 예를 들어, 세이프-하버 유전자자리로 통합된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20080299580; 20080159996 및 201000218264를 참조한다.
추가물 (예: 글로빈 서열, 전이유전자의 내인성 또는 일부)가 전이유전자와 함께 발현되는 경우, 추가로 (예: 글로빈) 서열은 전장 서열 (야생형 또는 돌연변이체) 또는 부분 서열일 수 있다. 바람직하게는, 추가의 서열은 기능성이다. 이들 전장 또는 부분적 추가 서열, 예를 들어, 글로빈-암호화 서열의 기능의 비제한적 예는 전이유저자 (예: 치료 유전자)에 의해 발현되는 폴리펩타이드의 혈청 반감기 증가 및/또는 캐리어로서의 작용을 포함한다.
또한, 비록 발현에 필요한 것은 아니지만, 외인성 서열은 또한 전사 또는 해독 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보좀 도입 부위, 2A 펩타이드 암호화 서열 및/또는 폴리아데닐화 시그널을 포함할 수 있다.
본원에 기재되는 도너 서열에 운반되는 전이유전자는 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예컨대 PCR을 이용하여 플라스미드, 세포 또는 다른 공급원으로부터 분리될 수 있다. 사용을 위한 도너는 원형의 슈퍼코일, 원형의 이완, 선형 등의 토폴로지를 포함한 다양한 유형의 토폴로지를 포함할 수 있다. 대안적으로, 이들은 표준 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 도너는 메틸화되거나 메틸화가 결여될 수 있다. 도너는 세균 또는 효모 인위적 염색체 (BAC 또는 YAC)의 형태일 수 있다.
본원에 기재되는 이중-가닥 도너 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 비-천연 염기 및/또는 골격을 포함할 수 있다. 특히, 메틸화된 시토신을 갖는 도너 분자의 삽입은 관심 영역에서 전사 정적 상태를 달성하기 위해 본원에 기재되는 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
외인성 (도너) 폴리뉴클레오타이드는 임의의 관심 서열 (외인성 서열)을 포함할 수 있다. 예시적 외인성 서열은, 비제한적으로, 임의의 폴리펩타이드 암호화 서열 (예: cDNA), 프로모터 서열, 인핸서 서열, 에피토프 태그, 마커 유전자, 절단 효소 인식 부위 및 다양한 유형의 발현 작제물을 포함한다. 마커 유전자는, 비제한적으로, 항생제 내성 (예: 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 푸로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 컬러 또는 형광 또는 발광 단백질 (예: 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제) 및 증강된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예: 디하이드로폴레이트 리덕타제)을 암호화하는 서열을 포함한다. 에프토프 태그는, 예를 들어, FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다.
바람직한 양태에서, 외인성 서열 (전이유전자)은, 비제한적으로, 항체, 항원, 효소, 수용체 (세포 표면 또는 핵), 호르몬, 림포카인, 사이토킨, 리포터 폴리펩타이드, 성장 인자 및 이들의 기능성 단편을 포함한, 세포에서의 발현이 바람직한 임의의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 암호화 서열은, 예를 들어, cDNA일 수 있다.
특정 실시형태에서, 외인성 서열은 표적된 통합을 겪는 세포의 선별을 가능하게 하는 마커 유전자 (상기 기재됨) 및 추가의 기능물을 암호화 하는 결합된 서열을 포함할 수 있다. 마커 유전자의 비-제한적 예는 GFP, 약물 선별 마커(들) 등을 포함한다.
삽입될 수 있는 추가의 유전자 서열은, 예를 들어, 돌연변이된 서열을 대체하기 위한 야생형 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 야생형 베타 글로빈 유전자 서열은 유전자의 내인성 카피가 돌연변이된 줄기 세포의 게놈으로 삽입될 수 있다. 야생형 카피는 내인성 유전자자리에 삽입될 수 있거나 대안적으로 세이프 하버 유전자자리로 표적될 수 있다.
본원의 교시에 따른 이러한 발현 카세트의 작제는 분자 생물학 분야에서 잘 알려진 방법을 이용한다 (예를 들어, Ausubel 또는 Maniatis 참조). 유전자전이 동물을 생성하기 위해 발현 카세트를 사용하기 전, 선택된 조절 요소와 관련된 스트레스-유도자에 대한 발현 카세트의 반응성은 발현 카세트를 적합한 세포주 (예: 일차 세포, 형질전환된 세포 또는 불멸화된 세포주)로 도입함으로써 시험될 수 있다.
또한, 비록 발현에 필요한 것은 아니지만, 외인성 서열은 또한 전사 또는 해독 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보좀 도입 부위, 2A 펩타이드를 암호화하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 시그널을 포함할 수 있다. 또한, 관심 유전자의 조절 요소는 키메릭 유전자 (예: 리포터 발현 카세트)를 생성하기 위해서 리포터 유전자에 작동적으로 연결될 수 있다.
또한, 비-암호화 핵산 서열의 표적된 삽입이 달성될 수 있다. 또한, 안티센스 RNA, RNAi, shRNA 및 microRNA (miRNA)를 암호화하는 서열이 표적 삽입에 사용될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 도너 핵산은 추가의 뉴클레아제 디자인을 위한 특정 표적 부위인 비-암호화 서열을 포함할 수 있다. 이어서, 추가의 뉴클레아제는 최초 도너 분자가 절단되고 또 다른 관심 도너 분자의 삽입에 의해 변형되도록 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방식으로, 특정 관심 유전자자리 또는 세이프 하버 유전자자리에서 특성 중첩을 가능하게 하는 도너 분자의 중첩적 통합이 일어날 수 있다.
전달
본원에 기재된 뉴클레아제, 이들 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 도너 폴리뉴클레오타이드 및 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 수단에 의해 생체내 또는 생체외로 전달될 수 있다.
본원에 기재된 뉴클레아제를 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824 (이들 모두의 기재가 전부 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
본원에 기재된 뉴클레아제 및/또는 도너 작제물은 또한 징크 핑거 또는 TALEN 단백질(들) 중 하나 이상을 암호화하는 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 비제한적으로, 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 포함한, 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824 (전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또한, 이들 벡터 중 임의의 벡터는 치료에 필요한 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레아제 및 도너 작제물이 세포로 도입되는 경우, 뉴클레아제 및/또는 도너 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터 상에서 운반될 수 있다. 다수의 벡터가 사용되는 경우, 각각의 벡터는 하나 또는 다수의 뉴클레아제 및/또는 도너 작제물을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
통상의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 세포 (예: 포유동물 세포) 및 표적 조직에 뉴클레아제 및 도너 작제물을 암호화하는 핵산을 도입하는데 이용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산 및 전달 비히클, 예를 들어, 리포좀 또는 폴록사머와 복합된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포로 전달 후 에피좀 또는 통합된 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차를 검토하기 위해, 하기 문헌을 참조한다: Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada 등, Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); 및 Yu 등, Gene Therapy 1:13-26 (1994).
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 마이크로주사, 바이오리스틱스 (biolistics), 비로좀 (virosome), 리포좀, 면역리포좀, 폴리양이온 또는 지질:핵산 컨주게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 작용제-증강된 DNA 흡수를 포함한다. 또한, 예를 들어, 소니트론 (Sonitron) 2000 시스템 (Rich-Mar)를 사용하는 소노포레이션 (sonoporation)도 핵산 전달에 이용될 수 있다.
추가의 예시적 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) 및 Copernicus Therapeutics Inc. (예를 들어, US6008336 참조)에 의해 제공되는 것들을 포함한다. 리포펙션은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,049,386; 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되며, 리포펙션 시약은 시판된다 (예: TransfectamTM 및 LipofectinTM). 폴리펩타이드의 효과적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner의 것들을 포함한다 (WO 91/17424, WO 91/16024).
표적된 리포좀, 예를 들어, 면역지질 복합체를 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese 등, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr 등, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy 등, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao 등, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad 등, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); U.S. Pat. Nos. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
추가의 전달 방법은 전달될 핵산을 EnGeneIC 전달 비히클 (EDV)로 포장하는 것을 이용하는 것을 포함한다. 이들 EDV는 항체의 하나의 아암이 표적 조직에 대해 특이성을 갖고 또 다른 아암이 EDV에 대해 특이성을 갖는 이특이적 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면에 이르게 한 후 EDV가 세포내섭취에 의해 세포 내에 이르게 한다 (참조: MacDiarmid 등 (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).
조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 이용은 바이러스를 신체 내 특정 세포로 표적하고 바이러스 페이로드 (payload)를 핵에 수송 (trafficking)하기 위한 고도로 진화된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 직접적으로 피험자에게 (생체내) 투여될 수 있거나, 시험관내에서 세포를 치료하는데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 피험자에게 (생체외) 투여된다. ZFP의 전달을 위한 통상의 바이러스 기반 시스템은, 비제한적으로, 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함한다. 호스트 게놈에의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하고, 종종 삽입된 전이유전자의 장기간 발현을 갖는다. 또한, 높은 형질도입 효율이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관측되었다.
레트로바이러스의 향성 (tropism)은 외래 외피 단백질을 삽입하고, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변화될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입시키거나 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터이며, 통상적으로 높은 바이러스 역가를 갖는다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존적이다. 레트로바이러스 벡터는 6 내지 10 kb 이하의 외래 서열에 대해 패키징 능력을 갖는 시스-작용의 긴 말단 반복물로 구성된다. 최소한의 시스-작용 LTR이 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 치료 유전자를 표적 세포에 통합시켜 영구적 전이유전자 발현을 제공하는데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스 (MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GaLV), 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV), 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 이들의 조합을 포함한다 (예를 들어, Buchscher 등, J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann 등, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt 등, Virol. 176:58-59 (1990); Wilson 등, J. Virol.63:2374-2378 (1989); Miller 등, J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700 참조).
일시적 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가질 수 있고, 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 달성되었다. 이러한 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생성될 수 있다. 아데노-관련 바이러스 ("AAV") 벡터는 또한, 예를 들어, 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생산으로 및 생체내 및 생체외 유전자 요법 절차를 위해, 세포를 표적 핵산으로 형질도입시키는데 사용된다 (예를 들어, West 등, Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 번호 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) 참조). 재조합 AAV 벡터의 작제는 문헌 (미국 특허 번호 5,173,414; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski 등, J. Virol. 63:03822-3828 (1989))을 포함한 다수의 공개문에 기재되어 있다.
적어도 6개의 바이러스 벡터 접근법이 임상 시험에서 유전자 전달에 대해 현재 이용가능하며, 이들은 형질도입제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주로 삽입되는 유전자에 의한 결함이 있는 벡터의 보완을 수반하는 접근법을 이용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에 사용되어온 레트로바이러스 벡터의 예시이다 (Dunbar 등, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn 등, Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech 등, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 요법 시험에 사용된 최초의 치료 벡터였다 (Blaese 등, Science 270:475-480 (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키징된 벡터에 대해 관측되었다 (Ellem 등, Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff 등, Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
재조합 아데노-관련 바이러스 벡터 (rAAV)는 결함이 있는 비병원성 파보바이러스 아데노-관련 유형 2 바이러스에 기초한 유망한 대체적인 유전자 절단 시스템이다. 모든 벡터는 단지 전이유전자 발현 카세트가 옆에 배치되는 AAV 145 bp 역 말단 반복물을 포함하는 플라스미드로부터 유도된다. 효과적인 유전자 전달 및 형질도입된 세포의 게놈으로의 통합에 기인한 안정한 전이유전자 전달이 이러한 벡터 시스템의 주요 특징이다 (Wagner 등, Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns 등, Gene Ther. 9:748-55 (1996)). 또한, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6,AAV8, AAV9 및 AAVrh10 및 이의 모든 변이체를 포함한 다른 AAV 혈청형도 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터 (Ad)는 높은 역가로 생성되고 다수의 상이한 세포 유형을 용이하게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 전이유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되며; 이어서 복제 결함 벡터는 결실된 유전자 기능을 트랜스로 공급하는 사람 293 세포에서 번식된다. Ad 벡터는 비-분열, 분화 세포, 예컨대 간, 신장 및 근육에서 발견되는 세포를 포함하는 다수 유형의 조직을 생체내에서 형질도입시킬 수 있다. 통상의 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 갖는다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 사용에 대한 예는 근육내 주사로 항-종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 요법을 포함한다 (Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용에 대한 추가의 예는 하기 문헌을 포함한다: Rosenecker 등, Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh 등, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez 등, Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf 등, Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).
세포 패키징은 호스트 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 이용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포 및 및 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 (적용가능한 경우) 호스트로의 후속 통합에 필요한 최소한의 바이러스 서열, 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 대체되는 다른 바이러스 서열을 포함한다. 결손 (missiing) 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 단지 패키징 및 호스트 게놈으로의 통합에 필요한 AaV 게놈으로부터의 역 말단 반복물 (ITR) 서열만을 갖는다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap는 암호화하나 ITR 서열은 결여된 헬퍼 플라스미드를 포함하는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서의 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복재 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열이 결여되므로 유의한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은, 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
많은 유전자 요법 적용에서, 유전자 요법 벡터는 특정 조직 유형에 대해 높은 특이성으로 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 리간드를 바이러스의 외부 표면 상의 바이러스 코트 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킴으로써 소정의 세포 유형에 대해 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심 세포 유형에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대해 친화성을 갖도록 선택된다. 예를 들어, 문헌 (Han 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995))은 몰로니 (Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 사람 헤레굴린 (heregulin)을 발현하도록 변형될 수 있고, 재조합 바이러스가 사람 상피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정 사람 유방암 세포를 감염시킨다고 보고하였다. 이러한 원리는 표적 세포가 수용체를 발현하고 바이러스가 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스-표적 세포 쌍에 대해 확대될 수 있다. 예를 들어, 섬유상 파아지는 실질적으로 임의의 선택된 세포 수용체에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 단편 (예: FAB 또는 Fv)을 디스플레이하도록 조작될 수 있다. 비록 상기 기재가 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리가 비-바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특정 표적 세포에 의한 흡수에 유리한 특정 흡수 서열을 포함하도록 조작될 수 있다.
유전자 요법 벡터는, 하기에 기재되는 바와 같이. 전형적으로 전신 투여 (예: 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해, 개개의 피험자에게 투여됨으로써 생체내 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 생체외에서 세포, 예컨대 개개 환자로부터 외식된 세포 (예: 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 일반적인 도너 조혈 줄기 세포에 전달되고, 보통 벡터 삽입된 세포에 대한 선별 후 환자에게 재이식될 수 있다.
뉴클레아제 및/또는 도너 작제물을 포함하는 벡터 (예: 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)는 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위한 유기체에 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는, 비제한적으로, 주사, 주입, 국소 투여 및 전기천공을 포함한 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적인 접촉으로 분자를 도입하는데 일반적으로 사용되는 경로 중 임의의 경로에 의한다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용가능하고 당업자에게 잘 알려져 있으며, 비록 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 이용될 수 있으나, 특정 경로가 종종 다른 경로보다 즉각적이고 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본원에 기재되는 폴리뉴클레오타이드의 도입에 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터 (IDLV)를 포함한다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다: Ory 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull 등 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zufferyet al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi 등 (2000) Nature Genetics 25:217-222; 미국 특허 공개 번호 2009/054985.
약제학적으로 허용가능한 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물 및 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 하기에 기재되는 바와 같이, 이용가능한 약제학적 조성물에 대한 매우 다양한 적합한 제형이 있다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조).
뉴클레아제-암호화 서열 및 도너 작제물은 동일하거나 상이한 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, 도너 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드에 의해 운반될 수 있고, 하나 이상의 뉴클레아제는 AAV 벡터에 의해 운반될 수 있다. 또한, 상이한 벡터는 동일하거나 상이한 경로 (근육내 주사, 꼬리 정맥 주사, 다른 정맥내 주사, 복강내 투여 및/또는 근육내 주사)로 투여될 수 있다. 벡터는 동시에 또는 임의의 순서로 전달될 수 있다.
따라서, 본원의 기재는 치료 단백질을 암호화하는 전이유전자를 삽입할 수 있는 질환 및 병태의 생체내 또는 생체외 치료, 예를 들어, 글로빈 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레아제-매개된 통합을 통한 이상혈색소증의 치료를 포함한다. 조성물은 혈청, 표적 기관 또는 세포에서 목적하는 농도의 치료 폴리펩타이드를 수득하기에 효과적인 양으로 사람 환자에게 투여된다. 투여는 폴리뉴클레오타이드가 목적하는 표적 세포에 전달되는 임의의 수단에 의할 수 있다. 예를 들어, 생체내 및 생체외 방법이 고려된다. 간문맥으로의 정맥내 주사가 바람직한 투여 방법이다. 다른 생체내 투여 모드는, 예를 들어, 간 또는 담관의 엽으로의 직접 주사 및 간 동맥을 통하는 것을 포함한 간에서 떨어진 정맥내 주사, 간 실질로의 직접 주사, 간 동맥을 통한 주사 및/또는 담도계를 통한 역행 주사를 포함한다. 생체외 투여 모드는 절제된 간세포 또는 간의 다른 세포의 시험관내 형질도입, 이어서 형질도입되고 절제된 간세포의 사람 환자의 문맥 혈관계, 간 실질 또는 담도계로의 재주입을 포함한다. 예를 들어, 문헌 (Grossman 등, (1994) Nature Genetics, 6:335-341)을 참조한다.
투여될 뉴클레아제(들) 및 도너의 유효량은 환자마다 관심 치료 폴리펩타이드에 따라 상이할 것이다. 따라서, 유효량은 조성물을 투여하는 의사에 의해 최선으로 결정될 수 있고, 적합한 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 통합 및 발현을 위한 충분한 시간 (전형적으로, 예를 들어, 4 내지 15일) 후, 치료 폴리펩타이드의 혈청 또는 다른 조직 수준의 분석 및 투여 전 초기 수준에 대한 비교는 투여되는 양이 적합한 범위 내에서 너무 낮거나 너무 높은지를 결정할 것이다. 또한, 초기 및 후속 투여에 적합한 요법은 다양할 수 있으나, 초기 투여 후 필요한 경우 후속 투여에 의해 대표된다. 후속 투여는 매일 투여하는 것으로부터 매년 내지 수년 마다 투여하는 것까지의 다양한 간격으로 투여될 수 있다. 당업자는 전달 벡터의 면역억제에 의한 형질도입의 억제 또는 차단을 피하기 위해 적합한 면역억제 기술이 권장될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 문헌 (Vilquin 등, (1995) Human GeneTher. 6:1391-1401)을 참조한다.
생체외 및 생체내 투여 모두를 위한 제형은 액체 또는 유화된 액체 중의 현탁물을 포함한다. 활성 성분은 종종 활성 성분과 약제학적으로 허용되고 적합한 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이의 배합물을 포함한다. 또한, 조성물은 미량의 보조 물질, 예컨대 습윤제, 유화제, pH 완충제, 안정화제 또는 약제학적 조성물의 효과를 증진시키는 다른 시약을 포함할 수 있다.
적용
본원에 기재된 방법 및 조성물은 단백질의 발현을 조절하거나, 유전 질환, 예컨대 겸상 적혈구 질환 또는 탈라세미아에서 발현되는 단백질을 암호화하는 비정상 유전자 서열을 교정하기 위한 것이다. 따라서, 상기 방법 및 조성물은 이러한 유전 질환의 치료 및/또는 예방을 제공한다. 예를 들어, 줄기 세포의 게놈 편집이 비정상 유전자를 교정하거나, 야생형 유전자를 삽입하거나, 내인성 유전자의 발현을 변화시키는데 이용된다. 비-제한적 예로써, 예를 들어, 적어도 하나의 글로빈 (예: α 및/또는 β 글로빈)을 암호화하는 야생형 유전자를 세포에 삽입하여 세포에 결핍되고/되거나 결여된 글로빈 단백질을 제공하고 이로써 결함이 있는 글로빈 발현에 의해 야기되는 유전 질환, 예를 들어, 이상혈색소증을 치료할 수 있다. 대안적으로 또는 추가하여, 적합한 도너의 투여와 함께 또는 투여 없이 게놈 편집으로, 예를 들어, 유전자의 발현을 회복하고/하거나 유전 질환, 예를 들어, 겸상 적혈구 질환을 치료하기 위해 α- 또는 β-헤모글로빈에서 포인트 돌연변이를 교정하고/하거나 임의의 직접적 또는 간접적 글로빈 조절 유전자를 녹아웃 또는 변화 (과발현 또는 억제) (예: γ 글로빈-조절 유전자 BCL11A 또는 BCL11A-조절자 KLF1의 불활성화)시킴으로써, 결함이 있는 내인성 유전자를 교정할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 RBC 및/또는 조혈 줄기 세포에서 치료제(들)가 생성되어 이들 세포로부터 유도되는 성숙 RBC가 치료제를 포함하도록 하나 이상의 치료제를 암호화하는 전이유전자를 공급하는 것이 요망되는 임의의 환경에서 사용될 수 있다.
하기 실시예는 뉴클레아제가 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 TALEN을 포함하는 본원 기재의 예시적 양태에 관한 것이다. 이는 단지 예시를 위한 것이며, 다른 뉴클레아제, 예를 들어, 조작된 DNA-결합 도메인을 갖는 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제) 및/또는 천연 발생 또는 조작된 귀소 엔도뉴클레아제 (메가뉴클레아제) DNA-결합 도메인과 이종의 절단 도메인의 융합물 및/또는 조작된 단일 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas 시스템이 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1: 징크 핑거 단백질 뉴클레아제 (ZFN)의 디자인, 작제 및 일반적 특성기술
징크 핑거 단백질을 본질적으로 문헌 (Urnov 등 (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez 등 (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816 및 미국 특허 번호 6,534,261)에 기재되어 있는 바와 같이 디자인하고 플라스미드, AAV 또는 아데노바이러스 벡터로 삽입하였다. 사람 베타 글로빈 유전자자리 및 사람 HPRT 유전자자리에 대해 특이적인 ZFN 및 TALEN을 위해, 공동-소유의 미국 특허 번호 7,888,121 및 미국 특허 공개 번호 20130137104 및 20130122591을 참조한다. 사람 AAVS1에 대히 특이적인 뉴클레아제에 대해, 공동-소유의 미국 특허 번호 8,110,379를 참조한다. CCR5에 특이적인 뉴클레아제에 대해, 공유 미국 특허 번호 7,951,925를 참조한다. 알부민에 특이적인 뉴클레아제에 대해, 미국 특허 공개 번호 20130177983 및 20139177968을 참조한다.
실시예 2: 글로빈-특이적 ZFN의 활성
사람 글로빈 유전자자리 또는 베타형 글로빈 유전자 발현의 조절자를 표적하는 ZFN 쌍을 사용하여 특정 표적 부위에서 DSB를 유도하는 이들 ZFN의 능력을 시험하였다. 표시된 ZFN의 각각의 핑거의 인식 나선 영역의 아미노산 서열이 전체 표적 부위 (DNA 표적 부위는 대문자로 나타내고; 비-접촉 뉴클레오타이드는 소문자로 나타냄)와 함께 하기 표 1a에 제시된다.
표 1A: 징크 핑거 뉴클라제
Figure 112021017950313-pat00001
Figure 112021017950313-pat00002
Figure 112021017950313-pat00003
Figure 112021017950313-pat00004
Figure 112021017950313-pat00005
문헌 (Perez 등 (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 및 Guschin 등 (2010) Methods Mol Biol. 649:247-56))에 기재되는 바와 같은 Cel-I 검정 (SurveyorTM, Transgenomics)을 이용하여 K562 또는 HSC에서 표적 유전자의 ZFN-유도된 변형을 검출하였다. 이러한 검정에서, 표적 부위의 PCR-증폭 후, DSB 빈도의 하한 추정치를 제공하는 미스매치 검출 효소 Cel-I (Yang 등 (2000) Biochemistry 39: 3533-3541)를 사용하여 삽입 및 결실 (indel)의 양을 정하였다. 표준 조건 (37℃)에서 또는 저체온 쇼크 (30℃, 공동-소유의 미국 특허 공개 번호 20110041195 참조)를 이용한 ZFN 발현 벡터의 형질감염 3일 후, 게놈 DNA를 DNeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 K562 세포로부터 분리하였다.
Cel-I 검정으로부터의 결과는, ZFN이 이들의 각각의 표적 부위에서 절단을 유도할 수 있었음을 입증하였다 (또한 공동-소유의 미국 가출원 번호 61/556,691 참조). 그 결과가 도 1에 나타나 있으며, 활성 단백질이 베타 글로빈 유전자 내의 표적 유전자자리 대부분에 대해 발견되었음을 보여준다.
실시예 3: 베타 글로빈 유전자자리의 편집
사람 베타 글로빈 유전자 (HBB) 특이적 ZFN (표 1)을 사용하여 하기와 같이 도너 DNA를 베타 글로빈 유전자자리로 도입하였다. 도너 DNA는, HBB 유전자 서열을 암호화하는 서열의 양 옆으로 베타 글로빈 유전자 내 ZFN 절단 부위를 둘러싸는 영역에 대해 상동성인 서열 (상동성 아암)이 배치되도록 디자인되었다. 상동성 아암은 약 500 내지 600개 염기쌍 길이이다. HBB 도너 서열은, 베타 글로빈 표적 부위에 삽입시 도너의 발현이 베타 글로빈 프로모터 및 임의의 다른 베타 글로빈 조절 서열에 의해 조절되도록, 어떠한 비-암호화 서열도 없다. 삽입시, HBB 도너는 내인성 글로빈 서열과 프레임 내에 융합되며, 융합 단백질이 된다. 또한, HBB 도너 올리고는 ZFN 처리 후 절단된 HBB 유전자로 포착되도록 디자인되었다. 올리고는, 올리고 삽입 후 새로운 제한 부위가 후속적으로 절단될 수 있는 HBB 유전자로 도입되도록, 제한 부위를 포함하였다.
도 2a에 도시되는 바와 같이, β 글로빈 올리고 도너는, 도너 DNA 상에 존재하는 새로운 제한 부위의 존재에 의해 입증되는 바와 같이, 적합한 유전자자리로 삽입되었다. 또한, 도 2b에 도시되는 바와 같이, Cel-I 분석은, 비록 올리고가 레인 8의 샘플에서만 존재하였지만, 수개의 ZFN 쌍이 DNA를 절단할 수 있었다는 것을 나타낸다.
유전자전이 CD34+ 세포를 성숙 RBC로 분화시키기 위해서, 당해 분야에 공지된 방법을 이용한다. 예를 들어, SCD CD34+ 세포를 Ficoll-Paque (GE Healthcare) 및 CD34+ 마이크로비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 정제한다. CD34+ 세포를 성장 인자의 존재 하에서 BIT 95000 (StemCell Technologies)을 갖는 이스코브 (Iscove)의 MDM에서 배양한다. 세포를 2-상 액체 배양 모델을 사용하여 적혈구 계통으로 분화시킨다. 처음 6일 동안 (제1 상), CD34+ 세포를 SCF (100 ng/ml), Flt3-L (100 ng/ml) 및 IL-3 (20 ng/ml)를 사용하여 증대시킨다. 이어서, 증대된 세포를 Epo (2 U/ml) 및 SCF (50 ng/ml)를 사용하여 적혈구 계통으로 수임 및 분화시킨다 (제2 상) (참조: Giarratana 등 (2011) Blood 118(19):5071-9).
실시예 4: 베타 글로빈 내 돌연변이의 유전자 보정
겸상 베타 글로빈 유전자 내 사람 겸상 적혈구 돌연변이를 교정하기 위해서, ZFN에 이어서 템플레이트로서 외인성의 교정 올리고뉴클레오타이드 ("도너 올리고")를 사용한 DNA 복구로 베타-글로빈 유전자리에서 이중-가닥 파괴를 수행하였다. 뉴클레아제가 교정된 글로빈 유전자 (도너 올리고가 내인성 HBB 유전자 내 겸상 돌연변이에 대해 지시된 교정을 갖는 교정된 글로빈 유전자)를 절단하는 가능성을 피하기 위해서, 도너 올리고는, 교정된 대립유전자에 ZFN 표적 서열들 중 하나가 없도록, HBB 암호화 서열 내로 해독적으로 침묵인 돌연변이를 공동-도입하도록 디자인되었다. 이러한 방식으로, 목적하는 유전자 보정된 대립유전자의 빈도 증가가 관측되었다. 최적 올리고뉴클레오타이드 도너를 디자인하기 위해서, 상동성 아암의 길이뿐만 아니라 ZFN 표적 서열에서의 수개의 돌연변이도 조사되었다.
하기에 겸상 돌연변이를 둘러싸는 서열이 제시되며, 다양한 돌연변이가 숫자와 함께 제시된다. 따라서, 돌연변이 1은 G의 A로의 변화이고, 돌연변이 2는 G의 A로의 변화이고, 돌연변이 3은 TCT의 AGC로의 변화이고, 돌연변이 4는 C의 T로의 변화이고, 돌연변이 5는 T의 G로의 변화이다. 다양한 돌연변이의 조합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 생성되었다. 야생형 서열 ("wt")은 위 (서열번호 231)에 표시되고, 돌연변이 ("mut")를 갖는 서열은 아래 (서열번호 232)에 표시된다.
뉴클레아제에 대한 표적 부위 ("표적물")은 굵은 선으로 표시되고, 겸상 돌연변이 부위는 박스로 표시된다. 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이에 따라 라벨링됨으로써, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 SMS1은 위치 1에 존재하는 유일한 침묵 돌연변이를 가지며, SMS 124는 위치 1, 2 및 4에 존재하는 침묵 돌연변이들을 갖는다.
Figure 112021017950313-pat00006
다양한 올리고가 '센스' 또는 전방 가닥 ('F'로 표시됨) 또는 '안티센스' 또는 역방 가닥 ('R'로 표시됨)과 같은 단일 가닥 분자로 CD34+ 세포로 전달되었다. 올리고는 뉴클레아제의 존재 또는 부재하에서 BTX ECM 830 스퀘어 웨이브 (Square Wave) 디바이스를 사용하여 형질감염을 통해 전달되었다. 달리 지시되지 않는 한, 3 μg의 뉴클레아제가 전달되었다. 유전자 편집은 HBB 유전자의 PCR 앰플리콘의 고처리량 DNA 서열분석으로 측정되었다. 비-상동성 말단 연결 ("NHEJ", ZFN-유도된 절단 후 DNA 내의 이중 가닥 파괴를 치유함으로써 초래됨)에 의한 유전자 변형율 (%) 또는 ZFN 절단 후 올리고의 표적된 통합 ("유전자 보정")이 표시된다 (도 9 참조). 그 결과, 돌연변이의 일부 조합이 20% 이하의 세포가 겸상 유전자자리에서 유전자 보정을 나타내도록 세포에서의 유전자 보정을 증진시킬 수 있었음을 나타낸다.
유전자 보정율 (%)에 대한 상동성 아암 길이의 효과를 조사하기 위해서, 겸상 돌연변이 부위의 어느 한 측에 대해 41 및 46개 뉴클레오타이드 상동성 (88 bp 도너 올리고) 또는 50 및 50개 뉴클레오타이드 상동성 (101 bp 도너 올리고)을 갖는 SMS12 및 SMS124 올리고를 사용하였다. 그 결과 (도 10 참조), 보다 긴 상동성 아암이 유전자 보정을 일으키는데 보다 효과적이었으며 40% 이하의 대립유전자가 상기 올리고에 의해 지정된 변화를 포함한다는 것을 나타내었다. 사용된 올리고가 하기에 제시된다:
SMS124, 88 bp, R (서열번호 233):
Figure 112021017950313-pat00007
SMS12, 88bp, R (서열번호 234):
Figure 112021017950313-pat00008
SMS124, 101bp, R (서열번호 235):
Figure 112021017950313-pat00009
분화능 및 CD34+ 세포 분화 동안 유전자 보정의 수명을 조사하기 위해, ZFN-변형된 CD34+ 세포의 푸울을 스템셀 테크놀로지즈 메쏘쿨트 (Stemcell Technologies' Methocult) 메틸셀룰로즈 배지를 사용하여 제조자의 지침에 따라 분화를 유도하였다. 분화는 메쏘쿨트-유도된 분화로부터 생기는 검정 오프 콜로니 유형 (assay off colony type): 콜로니-형성 단위, 적혈구 ("CFU-E"); 버스트 (burst)-형성 단위, 적혈구 ("BFU-E"); 콜로니-형성 단위, 과립구/대식구 ("CFU-GM") 및 콜로니-형성 단위; 과립구/적혈구/단핵구/대식구 ("CFU-GEMM")에 의해 분석하였다. 그 결과, ZFN-처리된 세포가 모의 (mock)-형질도입된 세포와 동일한 분화능을 보유한다는 것을 나타내었다. 개별 BFU-E 콜로니를 플레이트로부터 선택하고, HBB에서 유전형을 분석하였다. 그 결과, ZFN-유도된 변형이 콜로니 분화 동안 유지되었음을 나타내었다 (도 11). 또한, 변형된 BFU-E 콜로니의 빈도가 출발 푸울에서의 변형된 대립유전자의 빈도와 유사하였으며, 이는 BFU-E 형성 동안 편집된 세포에 대한 편향이 없음을 입증한다. 또한, 세포군 전체를 액체 배양의 시험관내 적혈구 분화 과정에 걸쳐서 유전자 변형에 대해 검정하였다. 변형은 적어도 18일의 적혈구 분화 과정에 걸쳐 안정하였다 (도 12 참조).
베타-탈라세미아와 연관된 베타 글로빈 유전자 내의 또 다른 일반적 돌연변이는 IVS1.1로 알려져 있다. 이러한 G->A 돌연변이는 베타 글로빈 유전자의 인트론 1의 제1 염기쌍 내에 위치되며, 유전자 내에서의 이의 존재는 베타 글로빈 pre-mRNA의 결함이 있는 스플라이싱을 초래한다. 따라서, 한쌍의 ZFN을 모델 목적으로 이러한 돌연변이를 필수적으로 반복하는 영역을 인식 및 절단하도록 조작하였다. 이들 ZFN의 시험은, 이들이 베타 글로빈 유전자 내의 상기 부위를 절단하여 CD34+ 세포에서 52.63 % NHEJ를 초래할 수 있었음을 밝혔다.
실시예 5: 베타-글로빈 도너의 세이프 하버 유전자자리로의 삽입
전이유전자로부터의 발현이 HSC에서 결핍된 베타 글로빈을 교정하도록 야생형 베타-글로빈 유전자를 세이프 하버 유전자자리로 삽입하기 위해서, 상기 세이퍼 하버 유전자자리에 특이적인 뉴클레아제를 도너 핵산과 함께 세포로 도입한다. HPRT (참조: 공동-소유의 미국 특허 공개 번호 20130137104 및 20130122591), AAVS1 (참조: 미국 특허 8,110,379), CCR5 (참조: 미국 특허 7,951,925) 또는 베타-글로빈 (참조: 표 1a)에 특이적인 뉴클레아제를 환자 유도된 CD34+ 줄기 세포로 도입한다. 도입은 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 mRNA 전기천공으로 수행될 수 있다. 도너 DNA는 전이유전자, 야생형 베타-글로빈, 및 HDR이 가능하도록 세이프 하버 표적물을 둘러싸는 영역과 충분한 상동성으로 전이유전자 양 옆에 배치된 상동성 영역 (전형적으로 각각의 측면에서 500 bp)를 포함하도록 디자인된다. 대안적으로, 도너 작제물은, 상동성 영역이 없거나 이를 포함하든간에, 말단-포착을 통해 ZFN 또는 TALEN-표적된 유전자자리로 통합된다 (참조: 미국 출원 번호 13/889,162). 도너는 ZFN의 도입 전, 동안 또는 후에 CD34+ 세포로 공동-도입된다. 변형된 CD34+ 세포는 환자로 재-도입되며, 생착 후, 치료학적으로 관련된 양의 헤모글로빈이 생성되도록 하기에 충분한 수준으로 베타 헤모글로빈을 생성한다.
실시예 6: BCL11A 및 KLF1의 불활성화
BCL11A 및 KLF1에 대해 특이적인 뉴클레아제 (예: 표 1a에 제시된 바와 같은 ZFN)를 감마 글로빈 발현을 상향 조절하도록 상기 기재된 바와 같이 HSC로 도입하고 (참조: 도 3), 세포의 게놈을 문헌 (Perez 등 (2008), 상기 참조)에 기재되는 바와 같이 Cel 1 검정으로 분석하였다.
도 4에 도시되는 바와 같이, 표시된 KLF1-특이적 ZFN으로 HSC 처리 후, ZFN은 KLF1 유전자자리를 성공적으로 변형시켰다 (도 4c 및 4d). 유사하게, BCL11A-특이적 ZFN은 BCL11A 유전자자리를 변형시켰다 (도 4a). HPRT 유전자자리를 표적하는 한 쌍의 ZFN 표적물 (참조: 공동-소유의 미국 가출원 61/552,309)을 대조군으로 사용하였으며, 또한 성공적인 절단을 입증하였다 (도 4b). CD34+ 세포 형질도입 후 3일째의 시그널을 분화 배양 17일째와 비교하여 (도 4e), 유전자 편집율 (%NHEJ)이 시간이 경과함예 따라 안정하다는 것을 입증하였다. 도 4e에 도시된 각각의 겔에서, 표시가 없는 레인은 음성 대조군이다.
BCL11A 엑손 2 또는 엑손 4를 표적하는 추가의 ZFN 쌍을 유사하게 시험하였다. 이들 연구를 위해, 후보 ZFN 쌍을 앞서 기재된 바와 같이 아막사 (Amaxa)에 의해 K562 세포로 도입하거나 CD34+ 세포로 도입하였다. CD34+ 형질도입을 위해, 2 mm 갭 큐벳이 장착된 BTX ECM830을 사용하였다. 세포로부터의 mRNA를 mMessageMachine T7 Ultra 키트 (#AM1345, Ambion)를 사용하여 제조하였다. 사람 CD34+ 세포를 비-조직 배양 처리된 플레이트에서 1xCC110 (Stem Cell Technology)를 갖는 x-vivo10 배지 (Lonza)에서 성장시켰다. 세포를 계수하고, 실온에서 10분 동안 1200 rpm에서 원심분리하여 수집하였다. 세포를 실온의 PBS로 1-2x 세척하였다. 200,000개의 세포를 각각의 형질감염에 대해 사용하고, 이들을 100 μL BTexpress 용액에 재현탁시켰다. 형질감염당 2 내지 4 μg mRNA를 첨가하고, 혼합물을 큐벳에 옮겼다. 옮긴 직후, 혼합물을 5 msec 동안 250V에서 전기천공하였다. 미리-가온된 배지를 큐벳에 첨가하고, 배지 + 세포를 48웰의 비-조직 배양 처리된 플레이트에 옮긴 후, 37℃에서 인큐베이션하였다.
명시된 일수 경과 후, 세포를 일루미나 (Illumina) MiSeq를 사용하여 게놈 분석하였다. 편집된 대립유전자의 백분율을 정량하기 위해, 관심의 게놈 영역을 표준 일루미나 서열분석 어댑터 서열을 첨가하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. 제2 그룹의 13 라운드 PCR을 수행하여 양쪽 말단에 바코드 및 브릿지 어댑터를 첨가하였다. 서열분석은 일루미나 MiSeq 상에서 앰플리콘 서열분석에 대한 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. MiSeq는 표준 정렬 소프트웨어를 사용하여 합쳐지고 어댑터-손질되는 쌍-말단 (paired-end) 판독물을 생성한다. 이어서, 판독물은 커스텀 스크립트 (custom script)를 이용하여 바코드 서열 쌍을 통해 샘플에 의해 디멀티플렉스화된다. 이어서, 앰플리콘 서열을 니들만-윈쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘의 이행을 통해 참조 서열에 대해 전체적으로 정렬하였다 (Needleman, Saul B.; 및 Wunsch, Christian D. (1970). Jour Mol Bio 48 (3): 443-53). 정렬 내의 갭 또는 삽입을 % NHEJ 이벤트로 계수하고, 비처리된 대조 샘플 서열과 비교하여 서열-특이적 배경 비율을 측정하였다.
표적된 통합을 계산하기 위해서, 앰플리콘 서열을 니들만-원쉬 알고리즘의 바이오파이썬 (biopython) 이행을 통해 참조 서열에 대해 전체적으로 정렬하였다 (Needleman, Saul B.; 및 Wunsch, Christian D. 상기 참조). 실험 처리를 통해 생성된 서열 변화를 조사하고, 계수하며, 대조군 샘플에서의 계수와 비교하였다. 공지된 단일 특징 다형성 (SFP)이 이러한 과정 동안 가려질 수 있으며, 추가의 계수로부터 배제될 수 있다 (예: ZFN 표적 부위에 가까운 1-bp 결실 SFP). NHEJ % (indel로도 지칭됨)는 삽입 또는 결실을 포함하는 서열의 백분율을 측정함으로써 계산되었다. GFP 벡터로만 처리되는 샘플을 사용하여 삽입 및 결실의 PCR 및 서열분석 에러 기반 배경 빈도를 평가하였다. 1% 미만의 배경 빈도가 관측되었다.
대표적인 자료 세트가 하기 표 1b에 제시되며, 이들 뉴클레아제 단백질들이 이들의 표적물들을 절단하는데 활성적임을 입증하였다. 또한, 감마 글로빈의 발현을 일부 뉴클레아제 처리된 세포에서 모니터링하였다. 이러한 분석을 수행하기 위해, 실시간 RT-qPCR ("Taqman")을 표준 절차에 따라 이용하였다 (하기 참조). 대표적인 자료 세트로부터의 결과는 GFP 처리된 대조군 세포와 비교하여 감마 글로빈 발현의 배수 (fold) 증가로 표현된다. 감마 값은 감마 글로빈 대 알파 글로빈의 비율로 계산되므로, 하기에 나타낸 임의의 관측치 증가는, GFP 벡터 처리된 세포에서의 감마 대 알파의 비율과 비교하여, 뉴클레아제 처리된 세포에서 감마 대 알파의 비율 증가를 나타낸다.
표 1B: BCL11A 엑손 2 및 엑손 4 ZFN 쌍의 활성
Figure 112021017950313-pat00010
또한, TALEN이 BCL11A의 엑손2 및 엑손4 영역 모두에 대해 제조되었다. TALEN은 기준 TALE 코드 및 '+17' TALEN 골격을 이용하여 앞서 기재된 바와 같이 작제되었다 (참조: 공동-소유의 미국 특허 공개 20110301073). 표 1c는 TALEN에 대한 표적 서열 및 NDA 결합 도메인 내의 RVD 서열을 나타낸다.
표 1C: BCL11A에 대한 TALEN 쌍
Figure 112021017950313-pat00011
상기 제시된 TALEN 쌍을 세포로 도입하고 절단 활성을 나타내었다. 쌍 101291/101292는 K562 세포에서 Cel-1 검정으로 측정시 0.8% indel 값을 나타내었다. TALEN 쌍 101301/101304는 CD34+ 세포에서 35.7% indel 형성 값을 제공하였으며, 상기 기재된 RT-PCR 검정에 의해 약 2.31배의 감마 글로빈 mRNA 발현 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
또한, ZFN 쌍이 BCL11A-XL 스프라이스 변이체의 'XL' 부분을 표적하도록 제조되었다. 이들 단백질들은 K562 세포에서 시험되었으며, 대표적인 자료 세트가 하기 표 1d에 제시된다. BCL11A의 'XL' 이소형은 3개의 추가의 천연 징크 핑거 (핑거 4 내지 6)를 포함하며, 따라서 실시된 접근법은 잠재적으로 징크 핑거 4, 5 및/또는 6 및 이들의 조합 (XL 영역 내에서 1번부터 3번)의 폴딩이 풀리도록 이러한 영역에서 BCL11A 유전자를 파괴하는 것을 수반한다. 또한, ZFN은 관련된 BCL11B 유전자 서열의 절단을 피하도록 조작되었다. 하나의 ZFN 쌍 44888/44889는 BCL11A의 4번째 징크 핑거를 표적하고, 2개의 쌍 44904/44905 및 44910/44911은 4번째 핑거 (XL 영역 내에서 1번)의 상부를 표적하고, 2개의 다른 쌍 44946/44947　및 44945/44944는 다섯 번째 핑거 (XL 영역 내의 2번)를 표적하였다.　 이들 단백질들은 K562 세포에서 시험되었으며, 대표적인 자료 세트가 하기 표 1D에 제시된다. 2개의 ZFN 쌍은 ZFP DNA 결합 도메인과 Fok1 뉴클레아제 도메인 사이에 새로운 링커 서열을 포함하였다. 44904/44905 쌍 모두는 L7a 링커 서열 (참조: 미국 특허 출원 번호 20090305419)을 포함하고, 44946/44947 쌍 모두는 L8p 링커 서열을 포함하며, 이 둘 모두 하기에 제시된다. 또한, 미국 가출원 번호 61/871,219를 참조한다:
L7a:　 HTKIHLRGSQLVKSKSEAAAR(서열번호 244)
L8p: HTKIHLRGSYAPMPPLALASP (서열번호 245).
표 1D: BCL11A XL에 특이적인 ZFN 쌍의 활성
Figure 112021017950313-pat00012
이어서, BCL11A XL 쌍을 CD34+ 세포에서 시험하였으며, 활성적이었다. 감마 글로빈 발현 측정은, BCL11A XL의 변형으로 알파 글로빈에 비해 감마 글로빈 발현이 증가된다는 것을 입증한다.
KLF1-특이적 ZFN의 추가의 쌍을 CD34+ 세포에서의 활성에 대해 시험하였으며, 이들 세포들을 감마 글로빈 발현에 있어서의 임의의 변화에 대해 분석하였다. 대표적인 자료 세트가 표 1e에 제시된다.
표 1E: KLF-특이적 ZFN 쌍의 활성
Figure 112021017950313-pat00013
HSC에서 BCL11A- 또는 KLF1 특이적 뉴클레아제 처리 후 γ 글로빈 및 β 글로빈을 암호화하는 mRNA의 비율을 태크만 (Taqman) 분석에 의해 ZFN 도입 후 17일까지 다양한 시점에서 측정하였으며, 베타형 글로빈 mRNA 수준을 또한 18S rRNA의 수준으로 표준화하였다. 감마 글로빈 발현 수준이 BCL11A 또는 KLF1 특이적 뉴클레아제로 처리된 세포에서 증가되었다 (도 5). 싱기 분석은 프로토콜 후 제조자 (Applied Biosystems)에 의해 공급되는 유전자 특이적 검정을 이용하여 표준 태크만 분석으로 수행하였다.
또한, BCL11A ZFN-변형된 세포를 분석하여 하나의 대립유전자가 ZFN에 의해 변형된 세포군 ("Bb"), 대립유전자 둘다가 ZFN에 의해 변형된 세포 ("녹아웃") 및 야생형 ("BB") 사이의 γ/β mRNA 비율을 측정하였다.
도 6에 도시되는 바와 같이, γ/β mRNA 비율은 BCL11A 녹아웃이 단지 하나의 대립유전자에서 발생한 세포 (Bb, 좌측부터 6번째 바부터 10번째 바까지) 또는 대립유전자 둘다 녹아웃된 세포 (녹아웃, 가장 우측의 5개 바, 좌측으로부터 11번째 바부터 15번째 바까지) 간에 상이하며, 두 세포 푸울 모두 야생형 (BB, 처음 5개 바)과 상이하다.
실시예 7: 감마 글로빈 유전자의 조절 영역의 변형
감마 글로빈의 발현을 증가시키기 위한 또 다른 접근법에서는, HPFH 돌연변이를 모방하기 위해 감마 글로빈 유전자의 조절 영역에 돌연변이를 가하였다 (참조: 도 9). 감마 글로빈 유전자의 ATG에 대해 -202부터 -102까지의 영역이 하기에 제시된다. 이러한 서열에는, HPFH와 연관된 것으로 밝혀진 부분을 나타내는 회색 박스, 및, 결실시, 또한 HPFH와 연관되는 밑줄친 서열이 있다 (참조: A Syllabus of Thalassemia Mutations (1997) by Titus H.J. Huisman, Marianne F.H. Carver, and Erol Baysal, published by The Sickle Cell Anemia Foundation in Augusta, GA, USA. Copyright ⓒ 1997 by Titus H.J. Huisman):
Figure 112021017950313-pat00014
야생형 영역에서 돌연변이가 유도되도록 이러한 HPFH 연관된 돌연변이 영역에서 결합하기 위한 뉴클레아제가 실시예 1에서 기재되고 표 1a에 제시되는 바와 같이 디자인되었다. Cel I 분석 (참조: Perez 등 (2008), 상기 참조)에 의해 K562 세포에서 검출된 편집된 대립유전자 백분율 (%NHEJ)이 하기 표 2에 제시된다. 추가로, 일부 쌍을 상기 기재된 바와 같이 CD34+ 세포에서 시험하였으며, 상기 기재된 바와 같은 MiSeq 서열분석으로 분석하였다. 일부 쌍에 대해서는, 세포를 감마 글로빈 발현에서의 임의의 변화에 대해 분석하였다. 하기 표 2는 대표적인 자료 세트를 나타낸다:
표 2: 감마 글로빈 특이적 ZFN 쌍에 의한 편집
Figure 112021017950313-pat00015
이러한 검정에서 시험된 처음 3개의 쌍은 감마 프로모터 영역 내의 -175 주변의 영역을 표적하였으며, 마지막 2개의 쌍은 감마 글로빈 프로모터 내의 -110 영역을 표적하였다.
편집된 K562 세포 내의 감마 프로모터 영역을 서열분석하여 생성된 돌연변이를 분석하였다. 이 영역을 먼저 PCR 증폭한 후, PCR 생성물을 서열분석하였으며, 결실 및 삽입을 포함한 다수의 상이한 돌연변이가 관측되었다 (도 8). 이러한 실험에서, 42%의 대립유전자가 돌연변이되었으며, 20%가 HPFH와 연관된 -114부터 -102까지 13bp 결실을 가졌다.
또한, 감마 글로빈 프로모터를 표적하는 2개 쌍의 ZFN을 HPFH를 갖는 피험자에서 가장 일반적인 돌연변이를 생성하도록 디자인된 올리고뉴클레오타이드 도너와 함께 세포를 처리하는데 사용하였다. 3 μL의 도너 올리고뉴클레오타이 100 μM 용액의 첨가와 함께, BTX 디바이스와 함께 사용하기 위한 상기 기재된 동일한 프로토콜을 따랐다. 올리고뉴클레오타이드 도너 서열이 하기에 제시된다. 대체로, 전방 올리고뉴클레오타이드 도너가 이들 실험에 사용되었으나, 역방 도너도 또한 사용되었다:
Figure 112021017950313-pat00016
도너의 존재하에서의 ZFN 쌍 34539/34574에 대해, 감마 글로빈 유전자로부터의 mRNA 생성은 GFP 벡터로 처리된 세포와 비교하여 6.38배 증가되었으며, ZFN 쌍 31160/34365에 대해서는 감마 mRNA가 GFP 벡터로 처리된 세포와 비교하여 6.13배 증가되었다.
뉴클레아제 처리된 HSC를 메틸셀룰로즈 상에 위치시켰다. PCR 서열분석으로 각각의 콜로니의 유전형을 분석한 후, RT-PCR에 의해 야생형 및 돌연변이된 콜로니에 대해 감마-글로빈, 베타-글로빈 및 18s rRNA 대조군에 대한 mRNA를 측정하였다 (도 8). 평균적으로, 감마 글로빈 프로모터 돌연변이체가 야생형 세포보다 높은 비율의 감마 글로빈 대 베타 글로빈 메시지를 가졌으며, 18s rRNA 시그널에 의한 교정은, 돌연변이된 콜로니에서의 감마-글로빈/베타-글로빈 비율 증가가 베타-글로빈 mRNA 수준의 감소보다 이들 콜로니에서의 감마-글로빈 mRNA 수준 증가에 의해 야기된다는 것을 나타내었다.
실시예 8: 감마 글로빈 프로모터에 표적되는 TALE 뉴클레아제
또한, TALE 뉴클레아제를 감마 글로빈 프로모터 영역의 -200 영역 또는 -110 영역 (상기 기재됨)을 표적하도록 제조하였다. TALEN은 표준 TALE 코드 및 '+17' TALEN 골격을 사용하여 앞서 기재된 바와 같이 작제되었다 (참조: 공동-소유의 미국 특허 공개 20110301073).
표 3: 감마 글로빈 프로모터 특이적 TALEN
Figure 112021017950313-pat00017
이어서, TALEN은 K562 세포에서 절단을 시험하기 위해 쌍으로 사용되고 앞서 기재된 바와 같은 Cel I 검정으로 검정되었으며, 쌍들의 결과가 하기 표 4에 제시된다. 또한, TALEN 쌍 102566/102568도 CD34+ 세포에 대해 시험되었으며, MiSeq 분석으로 측정시 51.39% NHEJ를 갖는 것으로 밝혀졌다.
또한, 2개 쌍의 TALEN이 감마 글로빈 대 알파 글로빈 mRNA의 비율로 측정되는 감마 글로빈 mRNA 발현에 대해 시험되었다. 쌍 102566/102568는 GFP 벡터로 처리된 CD34+ 세포와 비교하여 감마 글로빈 발현을 6.25배 증가시키는 것으로 밝혀졌으며, 쌍 102318/102314는 GFP 벡터로 처리된 CD34+ 세포와 비교하여 감마 글로빈을 2.14배 증가시켰다. 또한, 쌍 102566/102568도 상기 기재된 도너 올리고와 함께 시험되었으며, 생성된 세포는 GFP 벡터로 처리된 CD34+ 세포와 비교하여 9.13배의 감마 글로빈 증가를 갖는 것으로 밝혀졌다.
표 4: TALEN으로 감마 글로빈 프로모터 영역의 편집
Figure 112021017950313-pat00018
실시예 9: CD34+ 줄기 세포에서 감마 글로빈 편집
이어서, 감마 글로빈 프로모터 영역에 대해 특이적인 뉴클레아제를 환자에서 유도된 CD34+ 세포에 사용한다. 세포를 뉴클레아제로 처리한 후, Cel 1 분석에 의해 성공적인 편집에 대해 분석한다. 감마 글로빈 대 베타 글로빈의 비율을 조사하고 감마 글로빈의 증가된 발현을 입증하기 위해 세포를 더욱 분석한다. 증가된 감마 글로빈 발현에 대해 밝혀진 대표적인 자료가 상기 상이한 접근법에 대한 실험부에 위치된다.
실시예 10: 마우스에서 편집된 CD34+ 생착
뉴클레아제-처리된 CD34+ 세포 (사람 줄기 세포 전구체: HSPC)는 NOD/SCID/IL2rgamma(null) 마우스에서 생착하는 능력을 보유하였으며, 감마 글로빈의 조절에 수반되는 유전자가 영구히 파괴된 폴리클로날 다수-계통 자손을 생성한다 (참조: Holt 등, (2010) Nat Biotechnol. Aug;28(8):839-47). 유사하게, 돌연변이가 교정되거나 도너 베타 글로빈 유전자가 세이프 하버 유전자자리로 삽입되어 베타 글로빈 유전자자리가 편집되거나, 감마 글로빈의 발현을 변화시키기 위해 뉴클레아제로 처리된 CD34+ 또는 HSPC는 생착할 수 있으며, 목적하는 게놈 편집을 갖는 다수-계통 자손을 생성한다. 소수의 편집된 HSPC가 편집된 자손과 함께 동물에 정주할 수 있다는 입증은 이상혈색소증을 치료하기 위한 임상적 접근으로서 뉴클레아제-변형된 자가 조혈 줄기 세포의 사용을 지지한다.
본원에 기재된 모든 특허, 특허원 및 공개문은 모두 참조로 본원에 포함된다.
비록 명확한 이해를 위해 도해 및 예시를 통해 다소 상세히 기재되었지만, 당업자에게 있어 본 기재의 취지 또는 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형을 실시할 수 있음이 분명할 것이다. 따라서, 상기 기재 및 실시예는 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다.
<110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF A GENETIC CONDITION <130> 8325-0099.40 <140> PCT/US2013/057214 <141> 2013-08-29 <150> 61/694,693 <151> 2012-08-29 <160> 258 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cagacaccat ggtgcacctg actcctgtgg agaagtctgc cgttactgcc ctgtggggca 60 aggtgaacgt ggatgaagtt ggtggtgagg ccctgggcag gt 102 <210> 2 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cagacaccat ggtgcacctg actcctgagg agaagtctgc cgttactgcc ctgtggggca 60 aggtgaacgt ggatgaagtt ggtggtgagg ccctgggcag gt 102 <210> 3 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cagacaccat ggtgcatctg actcctgagg agaagactgc tgtcaatgcc ctgtggggca 60 aagtgaacgt ggatgcagtt ggtggtgagg ccctgggcag gt 102 <210> 4 <211> 101 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctgacactgt agtgcatttc actgctgaca agaaggctgc tgccaccagc ctgtgaagca 60 aggttaaggt gagaaggctg gaggtgagat tctgggcagg t 101 <210> 5 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctggcatcat ggtgcatttt actgctgagg agaaggctgc cgtcactagc ctgtggagca 60 agatgaatgt ggaagaggct ggaggtgaag ccttgggcag gt 102 <210> 6 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cagacgccat gggtcatttc acagaggagg acaaggctac tatcacaagc ctgtggggca 60 aggtgaatgt ggaagatgct ggaggagaaa ccctgggaag gt 102 <210> 7 <211> 102 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cagacgccat gggtcatttc acagaggagg acaaggctac tatcacaagc ctgtggggca 60 aggtgaatgt ggaagatgct ggaggagaaa ccctgggaag gt 102 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 gggcagtaac ggcagacttc tcctcagg 28 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Asp Arg Ser Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Gln Ser Ser Asp Leu Arg Arg 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Ala 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Gln Ser Gly Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Gln Ser Gly Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 tggggcaagg tgaacgtgga tgaagttg 28 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Gln Ser Ala His Arg Lys Asn 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Leu Lys His His Leu Thr Asp 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gln Arg Ser Asn Leu Val Arg 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Thr Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Gln Ser Asn His Leu Thr Glu 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Arg Ser His His Leu Lys Ala 1 5 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 agagtcaggt gcaccatggt gtctgttt 28 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Thr Asn Gln Asn Arg Ile Thr 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Asp Arg Ser Asn Arg Thr Thr 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Arg Asn Ala Ser Arg Thr Arg 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Glu 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Arg Ser Gln His Arg Lys Thr 1 5 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 gtggagaagt ctgccgttac tgccctgt 28 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Thr Ser Gly Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Asp Arg Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Asp Arg Ser Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Gln Ser Ser Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Gln Ser Gly His Leu Ser Arg 1 5 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 acaggagtca ggtgcaccat ggtgtctg 28 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Asp Gln Ser Asn Leu Arg Ala 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Arg Ser Asp His Leu Thr Gln 1 5 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 gagaagtctg ccgttactgc cctgtggg 28 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Ala Arg Ser Thr Arg Thr Asn 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Asp Arg Ser Ala Arg Thr Arg 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Gln Ser Gly Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 taacggcaga cttctccaca ggagtcag 28 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Ser Ser Ser Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gln Ser Ala Asp Arg Thr Lys 1 5 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 gccctgtggg gcaaggtgaa cgtggatg 28 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Leu Arg His His Leu Thr Arg 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Gln Ser Gly Asn Leu His Val 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Arg Ser Ala His Leu Ser Arg 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Arg Ser Asp Val Leu Ser Thr 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Arg Lys Gln Asp Leu Arg Thr 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Met Ser His His Leu Arg Asp 1 5 <210> 50 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 cacagggcag taacggcaga cttctcct 28 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Asp Arg Ser His Leu Thr Arg 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu 1 5 <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 ggcaaggtga acgtggatga agttggtg 28 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Gln Ser Gly His Leu Ala Arg 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Val Ser His His Leu Arg Asp 1 5 <210> 56 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 56 atcccatgga gaggtggctg ggaaggac 28 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Arg Ser Asp Val Leu Ser Glu 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Arg Asn Gln His Arg Lys Thr 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Arg Ser Asp His Leu Ser Ala 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Arg Ser Ala Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Arg Ser Asp Val Leu Ser Asn 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Asp Arg Ser Thr Arg Ile Thr 1 5 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 atattgcaga caataacccc tttaacct 28 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 His Arg Gln His Leu Val Thr 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Asp Arg Ser Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 His Arg Ser Ser Leu Leu Asn 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Arg Ser Asp His Leu Ser Thr 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Arg Ser Ala Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Gln 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Ala Ser Asn Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 71 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 gtgcagaata tgccccgcag ggtatttg 28 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Ala 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Arg Asn Asn Asp Arg Lys Thr 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Thr Ser Ser Asn Arg Thr Lys 1 5 <210> 75 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 gggaaggggc ccagggcggt cagtgtgc 28 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 76 Asp Arg Ser His Leu Ala Arg 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 77 Ala Ser Lys Thr Arg Lys Asn 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 78 Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 acacacagga tgacttcctc aaggtggg 28 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 80 Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Gln Ser Ala Ser Arg Lys Asn 1 5 <210> 82 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 82 cgccaccggg ctccgggccc gagaagtt 28 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Asp Ser Ser Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 84 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Glu 1 5 <210> 85 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 85 ccccagacct gcgctctggc gcccagcg 28 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 86 Arg Ser Asp Ser Leu Leu Arg 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Arg Leu Asp Trp Leu Pro Val 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Ala Ala Ser Asn Arg Ser Lys 1 5 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ggctcggggg ccggggctgg agccaggg 28 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 91 Gln Ser Ser His Leu Thr Arg 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 92 Gln Ser Ser Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 93 His Ser Arg Thr Arg Thr Lys 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 94 Arg Ser Asp His Leu Ser Arg 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Asp Arg Ser Ala Arg Asn Ser 1 5 <210> 96 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 aaggcgctgg cgctgcaacc ggtgtacc 28 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 97 Gln Ser His Asn Arg Thr Lys 1 5 <210> 98 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 ttgcagcgcc agcgccttgg gctcgggg 28 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 99 Arg Ser Asp His Leu Ser Gln 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 100 His Arg Ser Ser Leu Gly Asp 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 101 Arg Ser Asp Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 102 Gln Arg Ser Thr Leu Ser Ser 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 103 Arg Ser Ala Asp Leu Thr Arg 1 5 <210> 104 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 cggtgtaccc ggggcccggc gccggctc 28 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 105 Arg Ser Thr His Leu Val Arg 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 106 Arg Ser Asp Ser Leu Ser Thr 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 107 Asp Ser Ser Asp Arg Thr Lys 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 108 Arg Ser Ala Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 ttgcattgag atagtgtggg gaaggggc 28 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 110 Arg Ser Asp His Leu Ser Val 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 111 Arg Ser Asp Val Arg Lys Thr 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 112 Arg Ser Asp Tyr Leu Ser Lys 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 113 Thr Ser Ser Val Arg Thr Thr 1 5 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 114 Arg Pro Tyr Thr Leu Arg Leu 1 5 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 115 Gln Asn Ala Thr Arg Thr Lys 1 5 <210> 116 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 atctgtctga aacggtccct ggctaaac 28 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Arg Arg Asp Ile Leu His Gln 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 118 Leu Ala Tyr Asp Arg Arg Lys 1 5 <210> 119 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 tttgcattga gatagtgtgg ggaagggg 28 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 120 Gln Ser Cys Ala Arg Asn Val 1 5 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 121 Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 122 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 122 His Arg Asn Thr Leu Leu Gly 1 5 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 123 Met Arg Asn Arg Leu Asn Arg 1 5 <210> 124 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 ctgtctgaaa cggtccctgg ctaaactc 28 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 125 Arg Arg Asp Ala Leu Leu Met 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Gln Asn Ala His Arg Lys Thr 1 5 <210> 127 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 tatttgcatt gagatagtgt ggggaagg 28 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Leu Gln His His Leu Thr Asp 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Thr Ser Thr His Leu His Ile 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 His Lys Trp Val Leu Arg Gln 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 131 Arg Arg Asp Ala Leu Leu Met 1 5 <210> 132 <211> 97 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 cccttcccca cactatctca atgcaaatat gtctctgaaa cggtccctgg ctaaactcca 60 cccatgggtt ggccttgcct tgaccaatag ccttgac 97 <210> 133 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gtatcctctt gggggcc 17 <210> 134 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 atcctcttrr rrg 13 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 atatttgcat tgagatagtg t 21 <210> 136 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 atttrcattr aratart 17 <210> 137 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 atcctcttrr rrrc 14 <210> 138 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 atcctcttrr rrrcc 15 <210> 139 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 atttrcattr arat 14 <210> 140 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 ggccagcctt gccttgacca atagccttga caaggcaaac ttgaccaata g 51 <210> 141 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 ggccagcctt gccttgacca tagccttgac aaggcaaact tgaccaatag 50 <210> 142 <211> 47 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 ggccagcctt gccttaatag ccttgacaag gcaaacttga ccaatag 47 <210> 143 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 ggccagcctt gccttgaccc ttgacaaggc aaacttgacc aatag 45 <210> 144 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 ggccagcctt gccttgacca atagcaaggc aaacttgacc aatag 45 <210> 145 <211> 38 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 ggccagcctt gccttgacaa ggcaaacttg accaatag 38 <210> 146 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 ggccagcctt gccttgacca aatagccttg acaaggcaaa cttgaccaat a 51 <210> 147 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 ggccagcctt gccttgacca atagcagcct tgacaaggca aacttgacca a 51 <210> 148 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 ggccagcctt gccttgacca atagaatagc cttgacaagg caaacttgac c 51 <210> 149 <211> 196 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 tagctaaagg gaagaataaa ttagagaaaa actggaatga ctgaatcgga acaaggcaaa 60 ggctataaaa aaaattagca gtatcctctt gggggcccct tccccacact atctcaatgc 120 aaatatctgt ctgaaacggt ccctggctaa actccaccca tgggttggcc agccttgcct 180 tgaccaatag ccttga 196 <210> 150 <211> 200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 tagctaaagg gaagaataaa ttagagaaaa attggaatga ctgaatcgga acaaggcaaa 60 ggctataaaa aaaattaagc agcagtatcc tcttgggggc cccttcccca cactatctca 120 atgcaaatat ctgtctgaaa cggtccctgg ctaaactcca cccatgggtt ggccagcctt 180 gccttgacca atagccttga 200 <210> 151 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 caaggcaaac ttgaccaata gtcttagagt atccagtgag gccaggggcc ggcggctggc 60 tagggatgaa gaataaaagg aagcaccctt cagcagttcc acacactcgc ttctggaacg 120 tctgaggtta tcaataagct cctagtccag acgccatggg tcatttcaca gaggaggaca 180 aggctactat cacaagcctg tggggcaagg tgaatgtgga agatgctgga ggagaaaccc 240 tgggaaggta ggctctggtg accaggacaa gggagggaag gaaggaccct gtgcctggca 300 300 <210> 152 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 caaggcaaac ttgaccaata gtcttagagt atccagtgag gccaggggcc ggcggctggc 60 tagggatgaa gaataaaagg aagcaccctt cagcagttcc acacactcgc ttctggaacg 120 tctgaggtta tcaataagct cctagtccag acgccatggg tcatttcaca gaggaggaca 180 aggctactat cacaagcctg tggggcaagg tgaatgtgga agatgctgga ggagaaaccc 240 tgggaaggta ggctctggtg accaggacaa gggagggaag gaaggaccct gtgcctggca 300 300 <210> 153 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 153 Gln Ser Gly Thr Arg Lys Thr 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Thr 1 5 <210> 155 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 155 Asp Ser Ala Asn Arg Ile Lys 1 5 <210> 156 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 156 Ala Met Gln Thr Leu Arg Val 1 5 <210> 157 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 157 Arg Asn Ser Asp Arg Thr Lys 1 5 <210> 158 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 atcaaggtta caagacaggt ttaaggag 28 <210> 159 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 aatctgccca gggcctcacc accaactt 28 <210> 160 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 ctccagaagg ggatcatgac ctcctcac 28 <210> 161 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Leu Arg Gln Asn Leu Ile Met 1 5 <210> 162 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Thr Ser Ala Asn Leu Thr Val 1 5 <210> 163 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Gln Arg Asn Asp Arg Lys Ser 1 5 <210> 164 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 164 Leu Gln Ser Gln Leu Asn Arg 1 5 <210> 165 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 165 Asp Arg Ala Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 166 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 166 Thr Ser Ser Asn Arg Asn His 1 5 <210> 167 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 167 His Ser Gly Asn Leu Thr Lys 1 5 <210> 168 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 168 Gln Lys Val Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 169 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 169 Gln Ala Asn Asn Leu Lys Val 1 5 <210> 170 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 cccaacgggc cgtggtctgg ttcatcat 28 <210> 171 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 171 Arg Ser Asp Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 172 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 172 Asp Arg Ser Val Arg Thr Lys 1 5 <210> 173 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 173 Gln Arg Ser Asn Leu Lys Val 1 5 <210> 174 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 174 Arg Ser Asp His Leu Thr Thr 1 5 <210> 175 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 175 Trp Ala Thr Ala Arg Asp Arg 1 5 <210> 176 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 176 His Thr Lys Ser Leu Ser Arg 1 5 <210> 177 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 177 Arg Ser Ala His Leu Thr Gln 1 5 <210> 178 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 178 Asp Arg Ser Val Leu Arg Arg 1 5 <210> 179 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 atattgcaga caataacccc tttaacct 28 <210> 180 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 180 His Arg Trp Leu Arg Ser Asn 1 5 <210> 181 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 181 Asp Ser Ser His Arg Thr Arg 1 5 <210> 182 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 182 Gln Ser Ala His Leu Lys Ala 1 5 <210> 183 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 ctcactgtcc acaggagaag ccacacgg 28 <210> 184 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 184 Arg Ser Ala Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 185 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 185 Arg Leu Asp Asn Arg Thr Ala 1 5 <210> 186 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 186 Gln Ser Asn Asp Leu Asn Ser 1 5 <210> 187 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 187 Trp Arg Ser Ser Leu Lys Thr 1 5 <210> 188 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 188 Asp Arg Ser Asn Arg Lys Thr 1 5 <210> 189 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 ttgctacagt tcttgaagac tttcccac 28 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 190 Tyr Lys His Val Leu Ser Asp 1 5 <210> 191 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 191 Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 192 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 192 Leu Lys Asp Thr Leu Arg Arg 1 5 <210> 193 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 gagaagccac acgggcgaaa ggccttat 28 <210> 194 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 194 Gln Ser Gly Asn Leu Asp Ser 1 5 <210> 195 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 195 Gln Asn Ala Thr Arg Ile Asn 1 5 <210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 196 Trp Asn Ser Asp Leu Arg Lys 1 5 <210> 197 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 tggacagtga gattgctaca gttcttga 28 <210> 198 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 198 Tyr Lys Trp Thr Leu Arg Asn 1 5 <210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 199 Thr Ser Thr Lys Leu Arg Thr 1 5 <210> 200 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 gccacacggg cgaaaggcct tataaatg 28 <210> 201 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 201 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Thr 1 5 <210> 202 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 202 Asp Ser Ser Asn Arg Ile Asn 1 5 <210> 203 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 ctcctgtgga cagtgagatt gctacagt 28 <210> 204 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 204 Asn Asp Leu Phe Leu Tyr Leu 1 5 <210> 205 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 205 Arg Ser Asp Ser Leu Ser Val 1 5 <210> 206 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 206 His Asn Asp Ser Arg Lys Asn 1 5 <210> 207 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 aagctcacca ggcacatgaa aacgcatg 28 <210> 208 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 208 Cys Arg Gln Asn Leu Ala Asn 1 5 <210> 209 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 209 Tyr Gln Gly Val Leu Thr Arg 1 5 <210> 210 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 210 His Arg Ser Ser Leu Arg Arg 1 5 <210> 211 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 ctactctggg cacaggcata gttgcaca 28 <210> 212 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 212 Arg Ser Asp Ala Leu Ser Glu 1 5 <210> 213 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 ctcaccaggc acatgaaaac gcatggcc 28 <210> 214 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 214 Gly Ser Ser Ala Leu Thr Gln 1 5 <210> 215 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 215 Thr Ala Ser His Leu Lys Glu 1 5 <210> 216 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 216 Ser Ser Arg Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 217 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 217 Thr Ser Ala Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 218 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 ggtgaggagg agatccaggt cccaggtg 28 <210> 219 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 219 Asn Asn Arg Asp Leu Ile Asn 1 5 <210> 220 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 220 Thr Ser Ser Asn Leu Ser Arg 1 5 <210> 221 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 221 Gln Arg Thr His Leu Asn Ser 1 5 <210> 222 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 cttctcgggc ccggagcccg gtggcgcg 28 <210> 223 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 223 Arg Lys Ser Asp Arg Ile Lys 1 5 <210> 224 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 tggtcaaggc aaggctggcc aacccatg 28 <210> 225 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 gccttgacaa ggcaaacttg accaatag 28 <210> 226 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 226 Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 227 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 227 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Val 1 5 <210> 228 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 228 Leu Lys Phe Ala Leu Ala Asn 1 5 <210> 229 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 229 Asn Pro Ala Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 230 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 230 Asp Ser Ser Ala Arg Lys Lys 1 5 <210> 231 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 231 accatggtgc acctgactcc tgaggagaag tctgccgtt 39 <210> 232 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 accatggtgc atctgactcc tgaggaaaaa agcgctgtg 39 <210> 233 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 cgttcacctt gccccacagg gcagtaacag cagatttttc ctcaggagtc aggtgcacca 60 tggtgtctgt ttgaggttgc tagtgaac 88 <210> 234 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 cgttcacctt gccccacagg gcagtaacgg cagatttttc ctcaggagtc aggtgcacca 60 tggtgtctgt ttgaggttgc tagtgaac 88 <210> 235 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 235 cttcatccac gttcaccttg ccccacaggg cagtaacagc agatttttcc tcaggagtca 60 ggtgcaccat ggtgtctgtt tgaggttgct agtgaacaca g 101 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 ctgtgggcag tgccagatga 20 <210> 237 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 rtrrrcartr ccarat 16 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 ctcgataaaa ataagaatgt 20 <210> 239 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (16) <223> a, c, t or g <400> 239 crataaaaat aaraang 17 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 atgtccttcc cagccacctc t 21 <210> 241 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 rtccttccca rccacct 17 <210> 242 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 gttaaagggg ttattgtct 19 <210> 243 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 taaarrrrtt attrt 15 <210> 244 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 244 His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val Lys Ser Lys Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ala Arg 20 <210> 245 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 245 His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Tyr Ala Pro Met Pro Pro Leu 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ser Pro 20 <210> 246 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 246 acactatctc aatgcaaata tctgtctgaa acggtccctg gctaaactcc acccatgggt 60 tggccagcct tgccttgaca aggcaaactt gaccaatagt cttagagtat ccagtgaggc 120 cagg 124 <210> 247 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 247 cctggcctca ctggatactc taagactatt ggtcaagttt gccttgtcaa ggcaaggctg 60 gccaacccat gggtggagtt tagccaggga ccgtttcaga cagatatttg cattgagata 120 gtgt 124 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 gttggccagc cttgccttga c 21 <210> 249 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 trrccarcct trccttg 17 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 ttggtcaagt ttgccttgtc a 21 <210> 251 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 rrtcaarttt rccttrt 17 <210> 252 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: 'LAGLIDADG' family peptide <400> 252 Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly 1 5 <210> 253 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 catcccaggc gtggggatta gagctcca 28 <210> 254 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 gtatcctctt gggggccc 18 <210> 255 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 atatttgcat tgagatagt 19 <210> 256 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 gtatcctctt gggggcccc 19 <210> 257 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 atatttgcat tgagatag 18 <210> 258 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 atttrcattr arata 15

Claims (35)

  1. 이상혈색소증을 갖는 피험자에서 글로빈 생성을 증가시키는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 약제학적 조성물은 N-말단에서 C-말단으로 F1 내지 F5 또는 F1 내지 F6 으로서 순서대로 지칭되는 5 또는 6 개의 징크 핑거 도메인을 포함하는징크 핑거 단백질을 포함하고, F1 내지 F5 또는 F1 내지 F6 은 하기 인식 나선 영역 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물:
    (i) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: LRQNLIM (SEQ ID NO:161);
    F3: TSANLTV (SEQ ID NO:162);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QRNDRKS (SEQ ID NO:163), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (ii) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: LRQNLIM (SEQ ID NO:161);
    F3: LQSQLNR (SEQ ID NO:164);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QRNDRKS (SEQ ID NO:163), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (iii) F1: DRANLSR (SEQ ID NO:165);
    F2: LRQNLIM (SEQ ID NO:161);
    F3: LQSQLNR (SEQ ID NO:164);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QRNDRKS (SEQ ID NO:163), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (iv) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: TSSNRNH (SEQ ID NO:166);
    F3: HSGNLTK (SEQ ID NO:167);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QKVDLSR (SEQ ID NO:168), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (v) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: TSSNRNH (SEQ ID NO:166);
    F3: QANNLKV (SEQ ID NO:169);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QKVDLSR (SEQ ID NO:168), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (vi) F1: RSDHLSA (SEQ ID NO:59);
    F2: DRSALAR (SEQ ID NO:30);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (vii) F1: RSDHLTQ (SEQ ID NO:35);
    F2: DRSALAR (SEQ ID NO:30);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (viii) F1: RSDHLTT (SEQ ID NO:174);
    F2: DRSALAR (SEQ ID NO:30);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (ix) F1: RSDHLSA (SEQ ID NO:59);
    F2: WATARDR (SEQ ID NO:175);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: HTKSLSR (SEQ ID NO: 176);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173); 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (x) F1: RSAHLTQ (SEQ ID NO:177);
    F2: DRSVLRR (SEQ ID NO:178);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (xi) F1: RSDVLSE (SEQ ID NO:57);
    F2: RNQHRKT (SEQ ID NO:58);
    F3: RSDHLSA (SEQ ID NO:59);
    F4: RSANLTR (SEQ ID NO:60;
    F5: RSDVLSN (SEQ ID NO:61); 및
    F6: DRSTRIT (SEQ ID NO:62), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:56 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (xii) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: HRQHLVT (SEQ ID NO:64);
    F3: DRSNLTR (SEQ ID NO:65);
    F4: QSGDLTR (SEQ ID NO:13); 및
    F5: HRSSLLN (SEQ ID NO:66), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:63 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (xiii) F1: QSGHLSR (SEQ ID NO:32);
    F2: RSDHLST (SEQ ID NO:67);
    F3: RSADLSR (SEQ ID NO:68);
    F4: RSDNLSQ (SEQ ID NO:69); 및
    F5: ASNDRKK (SEQ ID NO:70), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:66 에 제시된 표적 부위에 결합함; 또는
    (xiv) F1: RSDNLSA (SEQ ID NO:72);
    F2: RNNDRKT (SEQ ID NO:73);
    F3: DRSDLSR (SEQ ID NO:29);
    F4: TSSNRTK (SEQ ID NO:74);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QSGDLTR (SEQ ID NO:13), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:71 에 제시된 표적 부위에 결합함.
  2. 이상혈색소증을 갖는 피험자에서 글로빈 생성을 증가시키는데 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 약제학적 조성물은 적어도 하나의 징크 핑거 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 징크 핑거 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 F1 내지 F5 또는 F1 내지 F6 으로서 순서대로 지칭되는 5 또는 6 개의 징크 핑거 도메인을 포함하고, F1 내지 F5 또는 F1 내지 F6 은 하기 인식 나선 영역 중 어느 하나를 포함하는 약제학적 조성물:
    (i) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: LRQNLIM (SEQ ID NO:161);
    F3: TSANLTV (SEQ ID NO:162);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QRNDRKS (SEQ ID NO:163), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (ii) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: LRQNLIM (SEQ ID NO:161);
    F3: LQSQLNR (SEQ ID NO:164);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QRNDRKS (SEQ ID NO:163), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (iii) F1: DRANLSR (SEQ ID NO:165);
    F2: LRQNLIM (SEQ ID NO:161);
    F3: LQSQLNR (SEQ ID NO:164);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QRNDRKS (SEQ ID NO:163), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (iv) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: TSSNRNH (SEQ ID NO:166);
    F3: HSGNLTK (SEQ ID NO:167);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QKVDLSR (SEQ ID NO:168), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (v) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: TSSNRNH (SEQ ID NO:166);
    F3: QANNLKV (SEQ ID NO:169);
    F4: RSDHLSR (SEQ ID NO:94);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QKVDLSR (SEQ ID NO:168), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:160 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (vi) F1: RSDHLSA (SEQ ID NO:59);
    F2: DRSALAR (SEQ ID NO:30);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (vii) F1: RSDHLTQ (SEQ ID NO:35);
    F2: DRSALAR (SEQ ID NO:30);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (viii) F1: RSDHLTT (SEQ ID NO:174);
    F2: DRSALAR (SEQ ID NO:30);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (ix) F1: RSDHLSA (SEQ ID NO:59);
    F2: WATARDR (SEQ ID NO:175);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: HTKSLSR (SEQ ID NO: 176);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173); 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (x) F1: RSAHLTQ (SEQ ID NO:177);
    F2: DRSVLRR (SEQ ID NO:178);
    F3: RSDSLSR (SEQ ID NO:171);
    F4: DRSVRTK (SEQ ID NO:172);
    F5: RSDHLSA (SEQ ID NO:59); 및
    F6: QRSNLKV (SEQ ID NO:173), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:170 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (xi) F1: RSDVLSE (SEQ ID NO:57);
    F2: RNQHRKT (SEQ ID NO:58);
    F3: RSDHLSA (SEQ ID NO:59);
    F4: RSANLTR (SEQ ID NO:60;
    F5: RSDVLSN (SEQ ID NO:61); 및
    F6: DRSTRIT (SEQ ID NO:62), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:56 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (xii) F1: DRSNLSR (SEQ ID NO:9);
    F2: HRQHLVT (SEQ ID NO:64);
    F3: DRSNLTR (SEQ ID NO:65);
    F4: QSGDLTR (SEQ ID NO:13); 및
    F5: HRSSLLN (SEQ ID NO:66), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:63 에 제시된 표적 부위에 결합함;
    (xiii) F1: QSGHLSR (SEQ ID NO:32);
    F2: RSDHLST (SEQ ID NO:67);
    F3: RSADLSR (SEQ ID NO:68);
    F4: RSDNLSQ (SEQ ID NO:69); 및
    F5: ASNDRKK (SEQ ID NO:70), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:66 에 제시된 표적 부위에 결합함; 또는
    (xiv) F1: RSDNLSA (SEQ ID NO:72);
    F2: RNNDRKT (SEQ ID NO:73);
    F3: DRSDLSR (SEQ ID NO:29);
    F4: TSSNRTK (SEQ ID NO:74);
    F5: QSGNLAR (SEQ ID NO:39); 및
    F6: QSGDLTR (SEQ ID NO:13), 여기서, 징크 핑거 단백질은 SEQ ID NO:71 에 제시된 표적 부위에 결합함.
  3. 제 1 항의 약제학적 조성물 또는 제 2 항의 약제학적 조성물을 포함하는 분리된 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 세포는 적혈구 전구 세포인 약제학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 세포는 적혈구 전구 세포의 자손인 적혈구 (RBC)인 약제학적 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서, 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포인 약제학적 조성물.
  7. 제 3 항에 있어서, 피험자는 사람 환자인 약제학적 조성물.
  8. 제 3 항에 있어서, 세포는 환자에게 주입되고, 세포가 피험자에서 생착(engraft), 분화 및 성숙되는 약제학적 조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 이상혈색소증은 β-탈라세미아 또는 겸상 적혈구 질환인 약제학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
KR1020217004409A 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물 KR102474010B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020227041988A KR20220164090A (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261694693P 2012-08-29 2012-08-29
US61/694,693 2012-08-29
PCT/US2013/057214 WO2014036219A2 (en) 2012-08-29 2013-08-29 Methods and compositions for treatment of a genetic condition
KR1020157004852A KR102218562B1 (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157004852A Division KR102218562B1 (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227041988A Division KR20220164090A (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210020174A KR20210020174A (ko) 2021-02-23
KR102474010B1 true KR102474010B1 (ko) 2022-12-02

Family

ID=50184630

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217004409A KR102474010B1 (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR1020227041988A KR20220164090A (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR1020157004852A KR102218562B1 (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227041988A KR20220164090A (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR1020157004852A KR102218562B1 (ko) 2012-08-29 2013-08-29 유전적 병태를 치료하기 위한 방법 및 조성물

Country Status (27)

Country Link
US (4) US9650648B2 (ko)
EP (1) EP2890780B8 (ko)
JP (4) JP2015533786A (ko)
KR (3) KR102474010B1 (ko)
CN (1) CN104704110B (ko)
AU (1) AU2013308770B2 (ko)
CA (2) CA3171494A1 (ko)
CL (1) CL2015000450A1 (ko)
DK (1) DK2890780T3 (ko)
EA (1) EA039384B1 (ko)
ES (1) ES2812599T3 (ko)
HK (1) HK1210502A1 (ko)
HR (1) HRP20201443T1 (ko)
HU (1) HUE050516T2 (ko)
IL (1) IL237050B (ko)
IN (1) IN2015DN01480A (ko)
LT (1) LT2890780T (ko)
MX (1) MX367081B (ko)
PH (2) PH12015500433A1 (ko)
PL (1) PL2890780T3 (ko)
PT (1) PT2890780T (ko)
RS (1) RS60838B1 (ko)
SG (2) SG10201701601WA (ko)
SI (1) SI2890780T1 (ko)
UA (1) UA118957C2 (ko)
WO (1) WO2014036219A2 (ko)
ZA (1) ZA201500900B (ko)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
RU2650811C2 (ru) * 2012-02-24 2018-04-17 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Композиции и способы лечения гемоглобинопатии
ES2960803T3 (es) 2012-05-25 2024-03-06 Univ California Métodos y composiciones para la modificación de ADN diana dirigida por RNA y para la modulación de la transcripción dirigida por RNA
ES2926021T3 (es) * 2012-10-23 2022-10-21 Toolgen Inc Composición para escindir un ADN objetivo que comprende un ARN guía específico para el ADN objetivo y ácido nucleico codificador de proteína Cas o proteína Cas, y uso de la misma
EP3617309A3 (en) 2012-12-06 2020-05-06 Sigma Aldrich Co. LLC Crispr-based genome modification and regulation
JP6491113B2 (ja) 2013-02-25 2019-03-27 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性遺伝子破壊を増強するための方法および組成物
AU2014235794A1 (en) 2013-03-14 2015-10-22 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
EP2981617B1 (en) 2013-04-04 2023-07-05 President and Fellows of Harvard College Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems
EP3730615A3 (en) 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
CA2914519A1 (en) * 2013-06-05 2014-12-11 Duke University Rna-guided gene editing and gene regulation
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
JP6588438B2 (ja) 2013-08-28 2019-10-09 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｄｎａ結合ドメインと切断ドメインとを連結するための組成物
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
WO2015070083A1 (en) 2013-11-07 2015-05-14 Editas Medicine,Inc. CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS
SI3068881T1 (sl) * 2013-11-13 2019-05-31 Children's Medical Center Corporation Z nukleazo posredovano uravnavanje izražanja genov
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
PL3102673T3 (pl) * 2014-02-03 2020-11-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje do leczenia talasemii beta
CA2939942A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
EP3114227B1 (en) 2014-03-05 2021-07-21 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
WO2015138510A1 (en) 2014-03-10 2015-09-17 Editas Medicine., Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
WO2015143046A2 (en) 2014-03-18 2015-09-24 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression
WO2015148860A1 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating beta-thalassemia
WO2015148863A2 (en) * 2014-03-26 2015-10-01 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
CN112063586A (zh) * 2014-03-26 2020-12-11 布里格姆及妇女医院股份有限公司 用于人造血干/祖细胞的离体扩增的组合物和方法
EP3177718B1 (en) 2014-07-30 2022-03-16 President and Fellows of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
ES2730378T3 (es) 2014-08-27 2019-11-11 Caribou Biosciences Inc Procedimientos para incrementar la eficiencia de la modificación mediada por Cas9
EP3878948A1 (en) * 2014-09-16 2021-09-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering and correction in hematopoietic stem cells
CN107429231A (zh) * 2014-11-24 2017-12-01 儿童医学中心公司 调节sh2b3以改善来自干细胞和/或祖细胞的红细胞的产生
WO2016094880A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
AU2016225179C1 (en) * 2015-02-23 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
US20180200387A1 (en) * 2015-02-23 2018-07-19 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
EP3910641B1 (en) 2015-04-13 2022-10-05 Invitae Corporation Methods, systems and processes of identifying genetic variation in highly similar genes
SG11201708653RA (en) 2015-04-24 2017-11-29 Editas Medicine Inc Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
SG10202112057QA (en) 2015-05-12 2021-12-30 Sangamo Therapeutics Inc Nuclease-mediated regulation of gene expression
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10676735B2 (en) * 2015-07-22 2020-06-09 Duke University High-throughput screening of regulatory element function with epigenome editing technologies
EP3352776A4 (en) * 2015-09-23 2019-03-13 Sangamo Therapeutics, Inc. HTT REPRESSORS AND USES THEREOF
CA2996326A1 (en) * 2015-10-20 2017-04-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for marker-free genome modification
EP3365356B1 (en) 2015-10-23 2023-06-28 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2017074526A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Sangamo Biosciences, Inc. Liver-specific constructs, factor viii expression cassettes and methods of use thereof
EP3371306B8 (en) * 2015-11-04 2023-02-22 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2017083852A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 MOORE, Tara Methods for the treatment of corneal dystrophies
IL297018A (en) 2015-12-18 2022-12-01 Sangamo Therapeutics Inc Directed cleavage of cell mhc receptor
US20190249172A1 (en) 2016-02-18 2019-08-15 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
KR102532663B1 (ko) * 2016-03-14 2023-05-16 에디타스 메디신, 인코포레이티드 베타 이상헤모글로빈증의 치료를 위한 crispr/cas-관련 방법 및 조성물
WO2017165862A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency
US11566263B2 (en) 2016-08-02 2023-01-31 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
GB2568182A (en) 2016-08-03 2019-05-08 Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR102594051B1 (ko) 2016-08-20 2023-10-26 아벨리노 랩 유에스에이, 인크. 단일 가이드 RNA, CRISPR/Cas9 시스템, 및 이의 사용방법
WO2020225754A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Mcmullen Tara Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
IL264639B2 (en) * 2016-08-24 2024-01-01 Sangamo Therapeutics Inc Regulation of globulin gene expression using transgenic nucleases with zinc neurites
BR112019003327A2 (pt) 2016-08-24 2019-07-02 Sangamo Therapeutics Inc nucleases manipuladas de alvo específico
US10960085B2 (en) 2016-09-07 2021-03-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
KR102622411B1 (ko) 2016-10-14 2024-01-10 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US20190330620A1 (en) * 2016-10-14 2019-10-31 Emendobio Inc. Rna compositions for genome editing
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
TWI829101B (zh) * 2017-01-09 2024-01-11 美商聖加莫治療股份有限公司 使用經工程改造之核酸酶調控基因表現
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
EP3601562A1 (en) 2017-03-23 2020-02-05 President and Fellows of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
EP3615664A4 (en) * 2017-04-24 2021-01-27 Seattle Children's Hospital (DBA Seattle Children's Research Institute) HOMOLOGY-BASED REPAIR COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES
EP3622070A2 (en) 2017-05-10 2020-03-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/rna-guided nuclease systems and methods
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US10961537B2 (en) 2017-07-18 2021-03-30 Csl Behring Gene Therapy, Inc. Compositions and methods for treating beta-hemoglobinopathies
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
EP3676376A2 (en) 2017-08-30 2020-07-08 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
KR20200121782A (ko) 2017-10-16 2020-10-26 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
EP3701029A1 (en) 2017-10-26 2020-09-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
EP3511412A1 (en) * 2018-01-12 2019-07-17 Genethon Genetically engineered hematopoietic stem cell as a platform for systemic protein expression
MA51788A (fr) 2018-02-05 2020-12-16 Vertex Pharma Substances et méthodes pour traiter des hémoglobinopathies
AU2019218118A1 (en) * 2018-02-08 2020-08-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific nucleases
EP3746153A4 (en) 2018-02-21 2021-11-10 Alcyone Lifesciences, Inc. FLUID DISTRIBUTION SYSTEMS AND METHODS
CA3110345A1 (en) 2018-08-27 2020-03-05 Alcyone Lifesciences, Inc. Fluid delivery systems and methods
BR112021018606A2 (pt) 2019-03-19 2021-11-23 Harvard College Métodos e composições para editar sequências de nucleotídeos
SG11202110776TA (en) 2019-04-02 2021-10-28 Sangamo Therapeutics Inc Methods for the treatment of beta-thalassemia
EP3952921A1 (en) * 2019-04-12 2022-02-16 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Correction of beta-thalassemia phenotype by genetically engineered hematopoietic stem cell
CN112391410B (zh) * 2020-02-17 2024-04-02 华东师范大学 一种sgRNA及其在修复内含子异常剪接中的应用
US20220280571A1 (en) * 2019-08-01 2022-09-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating alpha thalassemia
WO2021026336A2 (en) * 2019-08-07 2021-02-11 I Altius Institute For Biomedical Sciences Compositions and methods for modulation of gene expression
WO2021216623A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
WO2021216622A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
WO2023115039A2 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae fusion glycoproteins
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US789538A (en) 1904-11-11 1905-05-09 Colin E Ham Dumb-bell.
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5356802A (en) 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5487994A (en) 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6242568B1 (en) 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
JP4012243B2 (ja) 1994-01-18 2007-11-21 ザ スクリップス リサーチ インスティチュート 亜鉛フィンガータンパク質誘導体およびそのための方法
DE69535853D1 (de) 1994-03-23 2008-11-20 Univ Case Western Reserve Kompaktnukleinsäure und ihre verabreichung in zellen
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
AU698152B2 (en) 1994-08-20 1998-10-22 Gendaq Limited Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
US5925523A (en) 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
CA2321938C (en) 1998-03-02 2009-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
CO5070700A1 (es) 1998-06-05 2001-08-28 Basf Ag Genes novedosos de (adp-ribosa) polimerasa
US6140815A (en) 1998-06-17 2000-10-31 Dover Instrument Corporation High stability spin stand platform
US6532231B1 (en) 1998-08-29 2003-03-11 Lucent Technologies Inc. Arrangement for changing the destination of single link, single destination data messages
US6140081A (en) 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US7013219B2 (en) 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7070934B2 (en) 1999-01-12 2006-07-04 Sangamo Biosciences, Inc. Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
WO2000046386A2 (en) 1999-02-03 2000-08-10 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
US7030215B2 (en) 1999-03-24 2006-04-18 Sangamo Biosciences, Inc. Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
US6794136B1 (en) * 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
IL150069A0 (en) 1999-12-06 2002-12-01 Sangamo Biosciences Inc Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US6689558B2 (en) 2000-02-08 2004-02-10 Sangamo Biosciences, Inc. Cells for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
WO2001088197A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
US7067317B2 (en) 2000-12-07 2006-06-27 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
WO2003016496A2 (en) 2001-08-20 2003-02-27 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for cnn
US7262054B2 (en) 2002-01-22 2007-08-28 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants
CA2474486C (en) 2002-01-23 2013-05-14 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7361635B2 (en) 2002-08-29 2008-04-22 Sangamo Biosciences, Inc. Simultaneous modulation of multiple genes
AU2003298574B2 (en) 2002-09-05 2008-04-24 California Institute Of Technology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
ES2808687T3 (es) 2003-08-08 2021-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Métodos y composiciones para escisión dirigida y recombinación
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7972854B2 (en) 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
CA2561714A1 (en) 2004-04-08 2005-10-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for treating neuropathic and neurodegenerative conditions
JP2008506359A (ja) * 2004-04-08 2008-03-06 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド ジンクフィンガータンパク質による神経因性疼痛の処置
US20060063231A1 (en) 2004-09-16 2006-03-23 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
EP1869075B1 (en) 2005-02-28 2012-04-11 Sangamo BioSciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
US20090068164A1 (en) 2005-05-05 2009-03-12 The Ariz Bd Of Regents On Behald Of The Univ Of Az Sequence enabled reassembly (seer) - a novel method for visualizing specific dna sequences
JP2009502170A (ja) * 2005-07-26 2009-01-29 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 外来核酸配列の標的化された組込み及び発現
DK2662442T3 (en) 2005-10-18 2015-07-06 Prec Biosciences Rationally designed mechanuclease with altered dimer formation affinity
EP2447279B1 (en) 2006-05-25 2014-04-09 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for gene inactivation
JP5266210B2 (ja) 2006-05-25 2013-08-21 サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 改変開裂ハーフドメイン
ATE489465T1 (de) 2007-04-26 2010-12-15 Sangamo Biosciences Inc Gezielte integration in die ppp1r12c-position
US8790345B2 (en) 2007-08-21 2014-07-29 Zimmer, Inc. Titanium alloy with oxidized zirconium for a prosthetic implant
EP2188384B1 (en) 2007-09-27 2015-07-15 Sangamo BioSciences, Inc. Rapid in vivo identification of biologically active nucleases
WO2009054985A1 (en) 2007-10-25 2009-04-30 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted integration
BE1018531A4 (nl) 2007-10-31 2011-03-01 Gielen Cornelis Het gebruik van niet-pathogene bacterien in sporenvorm of in slapende vorm voor het verwijderen van huismijtuitwerpselen en organische allergieverwekkende materialen van alle soorten textiel.
DE102007056956B4 (de) 2007-11-27 2009-10-29 Moosbauer, Peter, Dipl.-Ing.(FH) Schaltung zur Regelung der Stromversorgung eines Verbrauchers und Verfahren zum Betrieb einer Schaltung
ES2459880T3 (es) 2008-04-14 2014-05-12 Sangamo Biosciences, Inc. Construcciones donantes lineales para integración dirigida
AU2009260888B2 (en) 2008-05-28 2014-09-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking DNA-binding domains and cleavage domains
KR20160015400A (ko) 2008-08-22 2016-02-12 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 표적화된 단일가닥 분할 및 표적화된 통합을 위한 방법 및 조성물
DK2334794T3 (en) 2008-09-15 2017-02-20 Children's Medical Center Corp MODULATION OF BCL11A FOR TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES
WO2010065123A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
KR102262704B1 (ko) 2009-08-11 2021-06-09 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체
PT2816112T (pt) 2009-12-10 2018-11-20 Univ Iowa State Res Found Inc Modificação do adn modificada pelo efector tal
WO2011090804A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Dow Agrosciences Llc Targeted genomic alteration
WO2011097036A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Sangamo Biosciences, Inc. Engineered cleavage half-domains
EP2534163B1 (en) 2010-02-09 2015-11-04 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
WO2011139349A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking zinc finger modules
CN103025344B (zh) 2010-05-17 2016-06-29 桑格摩生物科学股份有限公司 新型dna-结合蛋白及其用途
US20140127814A1 (en) 2010-08-10 2014-05-08 Srinivasan Chandrasegaran Generation and use of pluripotent stem cells
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
WO2012073047A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Genome Research Limited Compositions and methods
SG10201811736QA (en) 2011-09-21 2019-02-27 Sangamo Therapeutics Inc Methods and compositions for regulation of transgene expression
WO2013063315A2 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the hprt locus
RU2650811C2 (ru) * 2012-02-24 2018-04-17 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Композиции и способы лечения гемоглобинопатии
JP6559063B2 (ja) 2012-05-07 2019-08-14 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物
EP3730615A3 (en) 2013-05-15 2020-12-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Shimizu 등, Biochemistry, 제50권, 페이지 5033-5041 (2011.04.)*

Also Published As

Publication number Publication date
EP2890780A2 (en) 2015-07-08
JP6629917B2 (ja) 2020-01-15
UA118957C2 (uk) 2019-04-10
EA201590167A1 (ru) 2015-11-30
US20230416775A1 (en) 2023-12-28
CA2882499C (en) 2023-09-26
EP2890780A4 (en) 2016-08-31
CN104704110A (zh) 2015-06-10
IL237050B (en) 2020-04-30
ZA201500900B (en) 2017-09-27
ES2812599T3 (es) 2021-03-17
HK1210502A1 (en) 2016-04-22
CL2015000450A1 (es) 2015-07-10
EA039384B1 (ru) 2022-01-20
MX367081B (es) 2019-08-05
EP2890780B8 (en) 2020-08-19
HUE050516T2 (hu) 2020-12-28
AU2013308770A1 (en) 2015-03-05
JP2022001072A (ja) 2022-01-06
MX2015002409A (es) 2015-10-05
SI2890780T1 (sl) 2020-11-30
PH12015500433B1 (en) 2015-04-20
RS60838B1 (sr) 2020-10-30
AU2013308770B2 (en) 2019-01-17
EP2890780B1 (en) 2020-06-24
DK2890780T3 (da) 2020-09-21
JP2018121661A (ja) 2018-08-09
WO2014036219A3 (en) 2014-05-30
CA2882499A1 (en) 2014-03-06
US11492643B2 (en) 2022-11-08
CN104704110B (zh) 2018-06-01
PL2890780T3 (pl) 2021-02-08
KR20210020174A (ko) 2021-02-23
KR20220164090A (ko) 2022-12-12
KR102218562B1 (ko) 2021-02-19
SG10201701601WA (en) 2017-04-27
LT2890780T (lt) 2020-11-10
BR112015003815A2 (pt) 2017-08-08
PH12019502292A1 (en) 2021-03-15
US9650648B2 (en) 2017-05-16
US20140080216A1 (en) 2014-03-20
IN2015DN01480A (ko) 2015-07-03
CA3171494A1 (en) 2014-03-06
WO2014036219A2 (en) 2014-03-06
JP2017217012A (ja) 2017-12-14
KR20150047498A (ko) 2015-05-04
IL237050A0 (en) 2015-03-31
US9963715B2 (en) 2018-05-08
US20180223311A1 (en) 2018-08-09
HRP20201443T1 (hr) 2020-12-11
SG11201500852WA (en) 2015-04-29
PH12015500433A1 (en) 2015-04-20
PT2890780T (pt) 2020-08-03
US20140093913A1 (en) 2014-04-03
JP2015533786A (ja) 2015-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230416775A1 (en) Methods and compositions for treatment of a genetic condition
US20210348143A1 (en) Nuclease-mediated regulation of gene expression
AU2020213379B2 (en) Delivery Methods And Compositions For Nuclease-Mediated Genome Engineering
EP3102673B1 (en) Methods and compositions for treatment of a beta thalessemia
CA2926078C (en) Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
CA2852955C (en) Methods and compositions for modification of the hprt locus
BR112015003815B1 (pt) Proteína de dedo de zinco, proteína de fusão, usos das mesmas, e kit

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant