JP7393774B2 - Her2標的化剤 - Google Patents
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Description
[0] がん細胞上に発現するHER2に対して結合反応性を有する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
[1] 非がん細胞上に発現するHER2に対するよりも、がん細胞上に発現するHER2に対して強い結合反応性を有する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
[2] (i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、上記[0]または[1]に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
[3] (ii)配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、例えば、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614Aからなる点変異を有するペプチド、またはK615AもしくはF616Aからなる点変異を有するペプチドに対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い反応性を有する、上記[0]、[1]または[2]に記載の抗体またはその抗原結合性断片{上記において、HER2の細胞外ドメインの一部は配列番号:2に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号613~622の領域であってもよい}。
[4] (iii)配列番号:18のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:21のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:22のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:23のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
(iv)配列番号:24のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:25のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:26のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:28のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:29のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;または
上記(iii)または(iv)の一つ以上のCDRにおいて少なくとも1個の置換、付加もしくは欠失を有する、上記[0]、および[1]~[3]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
[5] (vii)配列番号:14のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および、
配列番号:15のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する;
(viii)配列番号:16のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および、
配列番号:17のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する;もしくは
上記(vii)または(viii)の各可変領域において少なくとも1個の置換、付加もしくは欠失を有する、上記[0]、および[1]~[4]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
[6] 神経膠芽腫細胞株のLN229細胞により産生されるペプチドであって、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して結合する、上記[0]、および[1]~[5]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
[7] がん細胞が、乳がん細胞株のSK-BR-3細胞であり、非がん細胞が、正常ヒト表皮角化細胞株のHaCaT細胞である、上記[0]、および[1]~[6]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
[8] 上記[0]、および[1]~[7]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を有するHER2標的化剤を有効成分として含む、医薬組成物。
[9] 細胞傷害剤がコンジュゲートされた上記[0]、および[1]~[7]のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片。
[10] 上記[9]に記載の抗体またはその抗原結合性断片を有効成分として含む、医薬組成物。
[11] がんを処置することに用いるための、上記[8]または[10]に記載の医薬組成物。
[12] 上記[0]、および[1]~[7]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を有効成分として含む、がんの処置剤。
[13] 上記[2]~[6]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸分子。
配列番号:19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:21のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:22のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:23のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
(iv)配列番号:24のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:25のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:26のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:28のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:29のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;もしくは
上記(iii)または(iv)の一つ以上のCDRにおいて少なくとも1個の置換、付加もしくは欠失を有する、HER2の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片。
[15] 非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る抗体またはその抗原結合性断片。
HER2もしくはその断片に結合する抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る抗体または抗体の抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
[17]抗体または抗体の抗原結合性断片を製造、選択または同定する方法であって、
HER2もしくはその断片に結合する抗体群または抗体の抗原結合性断片群から下記(i)~(iii)からなる群から選択される少なくとも1つを満たす抗体または抗体の抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
(i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する;および
(ii)配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、例えば、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614Aからなる点変異を有するペプチド、またはK615AもしくはF616Aからなる点変異を有するペプチドに対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い反応性を有する;並びに
(iii)非がん細胞上に発現するHER2に対するよりも、がん細胞上に発現するHER2に対して強い結合反応性を有する。
[18]抗体または抗体の抗原結合性断片を製造、選択または同定する方法であって、
下記(i)~(ii)からなる群から選択される少なくとも1つを満たす抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、HER2またはその断片に結合する抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
(i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する;および
(ii)配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するペプチドに対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い反応性を有する。
[19]得られた抗体または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る抗体または抗体の抗原結合性断片を製造、選択または同定することをさらに含む、上記[17]または[18]に記載の方法。
[20]抗体または抗体の抗原結合性断片を製造、選択または同定する方法であって、
(iii)、(iv)、および(xii)のいずれかと少なくとも1つのCDRにおいて、置換、付加、挿入、および欠失からなる群から選択される少なくとも1以上のアミノ酸の変異(例えば、1個~10個、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個など)を有する抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る抗体または抗体の抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
[21]上記[20]の方法により得られた抗体。
[22]抗体がモノクローナル抗体(例えば、単離されたモノクローナル抗体)である、上記[16]~[20]のいずれかに記載の方法。
[23]上記[1]~[7]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を有するHER2標的化剤を含む、医薬組成物。
[24]上記[9]に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
[25]がんを処置することに用いるための、上記[23]または[24]に記載の医薬組成物。
[102](xii)上記[0]、[1]~[3]、および[101]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、
配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:86に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:88に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:94に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:97に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:98に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:100に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:104に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:106に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:109に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:110に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:112に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:113に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:115に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:116に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:117に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:118に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:119に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:120に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:121に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:122に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:123に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:124に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:125に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:126に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:127に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:128に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:129に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:130に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:131に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:132に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:133に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:134に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:135に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:136に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:137に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:138に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:139に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:140に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:141に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:142に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:143に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:144に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:145に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:146に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:147に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:148に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:149に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:150に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:151に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:152に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:153に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:154に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:155に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:156に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:157に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:158に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:159に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:160に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:161に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:162に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:163に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:164に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:165に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:166に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:167に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:168に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:169に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:170に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:171に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:172に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:173に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:174に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:175に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:176に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:177に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:178に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:179に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:180に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:181に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:182に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:183に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:184に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:185に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:186に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:187に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:188に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:189に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:190に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:191に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:192に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:193に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:194に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:195に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:196に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:197に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:198に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:199に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:200に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:201に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:202に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:203に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:204に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:205に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:206に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する、抗体またはその抗原結合性断片。
[103](xiii)
(a)配列番号:39のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:40のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(b)配列番号:41のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:42のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(c)配列番号:43のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(d)配列番号:45のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:46のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(e)配列番号:47のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:48のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(f)配列番号:49のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:50のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(g)配列番号:51のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:52のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(h)配列番号:53のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:54のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(i)配列番号:55のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:56のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(j)配列番号:57のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:58のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(k)配列番号:59のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:60のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(l)配列番号:61のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:62のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(m)配列番号:63のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:64のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(n)配列番号:65のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:66のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(o)配列番号:67のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:68のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(p)配列番号:69のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:70のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(q)配列番号:71のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:72のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(r)配列番号:73のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:74のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(s)配列番号:75のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:76のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(t)配列番号:77のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:78のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(u)配列番号:79のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:80のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;もしくは
(xiv)上記(xiii)(a)~(u)のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合性断片の可変領域の少なくとも1以上においてそれぞれ少なくとも1個の置換、付加もしくは欠失を有する、上記[0]、[1]~[3]、[101]および[102]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
[104]抗体または抗体のその結合性断片を製造、選択または同定する方法であって、
HER2もしくはその断片に結合する抗体群またはその抗原結合性断片群から下記(xi)を満たす抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
[105]抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定する方法であって、
HER2もしくはその断片に結合する抗体群またはその抗原結合性断片群から下記(xii)を満たす抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
[106]抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定する方法であって、
HER2もしくはその断片に結合する抗体群またはその抗原結合性断片群から下記(xiii)を満たす抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
[107]抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定する方法であって、
HER2もしくはその断片に結合する抗体群またはその抗原結合性断片群から下記(xiv)を満たす抗体またはその抗原結合性断片を製造、選択または同定することを含む、方法。
[111]上記[104]~[107]のいずれかの方法により得られた抗体。
[112]抗体がモノクローナル抗体(例えば、単離されたモノクローナル抗体)である、上記[104]~[107]のいずれかに記載の方法。
[113]上記[101]~[103]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を有するHER2標的化剤を含む、医薬組成物。
[114]上記[101]~[103]のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
[115]がんを処置することに用いるための、上記[113]または[114]に記載の医薬組成物。
[121]HER2の断片が、配列番号:31~37に記載のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36に記載のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、上記[104]~[107]のいずれかに記載の方法。
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物であり得、好ましくは、ヒトを対象とする「患者」である。より好ましくは、腫瘍またはがんに罹患している、またはそのリスクがある「がん患者」であり得る。
可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域(complementarity-determining region:CDR)と呼ばれる。CDR以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク(framework region:FR)と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ3つのCDRが存在し、それぞれN末端側から順に、重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3と呼ばれる。抗体は、組換えタンパク質(組換え抗体)であってもよく、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)などの動物細胞に産生させることができる。抗体の由来は、特に限定されないが例えば、非ヒト動物の抗体、非ヒト哺乳動物の抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、およびヒト抗体が挙げられる。また、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト型抗体であってもよい。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。「キメラ抗体」とは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域に異なる種の重鎖定常領域および軽鎖定常領域がそれぞれ連結した抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖CDR1~3及び軽鎖CDR1~3を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ4つのフレームワーク領域(FR)を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、CDR移植抗体と呼ばれる場合もある。「ヒト化抗体」は、ヒトキメラ抗体を含む場合もある。「ヒトキメラ抗体」は、非ヒト由来の抗体において、非ヒト由来の抗体の定常領域がヒトの抗体の定常領域に置換されている抗体である。ヒトキメラ抗体では、ADCC活性を高める観点では、例えば、定常領域に用いるヒトの抗体のサブタイプはIgG1とすることができる。「完全ヒト型抗体」とは、FRおよびCDRからなる可変領域ならびに定常領域の両方ともにヒト抗体に由来する抗体を意味する。また、抗体の細胞傷害性を増強する目的で抗体を抗体-薬物複合体の形態とすることもできる。また、抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体、または三重特異性抗体であってもよい。抗体は、単離された抗体、または精製された抗体であり得る。
IHC法では、2018 ASCO/CAPガイドラインに基づいて発現量をスコア化することができる(Wolff AC, et al: J Clin Oncol 36 (20), 2018: 2105-2122参照)。2018 ASCO/CAPガイドラインでは、HER2の発現量を
3+:10%を超える腫瘍細胞に強い完全な全周性の膜染色がみられる、
2+:10%を超える腫瘍細胞に弱~中等度の全周性の膜染色がみられる、
1+:10%を超える腫瘍細胞にかすかな/かろうじて認識できる不完全な膜染色がみられる、
0:染色像がみられない、または、10%以下の腫瘍細胞に不完全なかすかな/かろうじて認識できる膜染色がみられる、
の4つの評点でスコア化することができる。
また、FISHでは、2007 ASCO/CAPガイドラインに基づいて遺伝子増幅の程度を評価することができる。HER2遺伝子は、17番染色体上に存在し、したがって、17番染色体のセントロメアの数に対するHER2遺伝子の比を測定することによって遺伝子増幅の程度を評価することができる。HER2の検査は、市販のキットを用いて実施することができる。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、HER2またはその断片に結合する抗体またはその抗原結合性断片である。本発明の抗体またはその抗原結合性断片には、1~数個のアミノ酸の挿入、欠失、付加および置換からなる群から選択される変異を有する抗体またはその抗原結合性断片が含まれ得る。ある実施態様において、本発明の抗体またはその抗原結合性断片における少なくとも1つのCDR、少なくとも2つ、少なくとも3つ、またはそれ以上のCDRと実質的に同一である、少なくとも1つのCDR、少なくとも2つ、少なくとも3つ、またはそれ以上のCDRを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。別の実施態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片における、または本発明の抗体またはその抗原結合性断片に由来する、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRと実質的に同一である少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRを有する抗体が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片における少なくとも1つ、2つ、または3つのCDRと、少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一である少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRが含まれる。ある実施態様において、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片における、または本発明の抗体またはその抗原結合性断片に由来する、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDRにおいて、少なくとも1つの挿入、欠失、付加または置換が含まれる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片には、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、抗体の抗原特異性を有する抗体またはその抗原結合性断片が含まれ得る。本発明の抗体またはその抗原結合性断片には、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のフレームワーク(FR)領域において1~数個のアミノ酸の挿入、欠失、付加および置換からなる群から選択される変異を有する抗体またはその抗原結合性断片が含まれ得る。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、好ましくは、HER2に特異的に結合する抗体であり得る。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、がん細胞上に発現するHER2に対して結合親和性(または反応性)を有する。したがって、がん細胞への標的化に用いることができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、より好ましくは、非がん細胞上に発現するHER2に対するよりも、がん細胞上に発現するHER2に対して強い結合親和性(または反応性)を有し得る。したがって、がん細胞への特異的な標的化に用いることができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、さらに好ましくは、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず(例えば、全く反応せず、または実質的な反応はなく)、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る。したがって、がん細胞への標的化(特に特異的な標的化)に用いることができる。
(i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片;または、
(ii)配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、例えば、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいて、W614Aからなる点変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体、F616Aからなる点変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体、W614AとF616Aの2つの点変異からなる変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体、またはK615AとF616Aの2つの点変異からなる変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、抗体もしくはその抗原結合性断片{上記において、HER2の細胞外ドメインの一部は配列番号:2に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号613~622の領域であってもよい}。ここで、W614Aは、配列番号2に記載のHER2のアミノ酸配列においてアミノ酸番号614のトリプトファン(W)に対応するアミノ酸残基がアラニン(A)に置換されていることを意味し、K615Aは、配列番号2に記載のHER2のアミノ酸配列においてアミノ酸番号615のリジン(K)に対応するアミノ酸残基がアラニン(A)に置換されていることを意味し、F616Aは、配列番号2に記載のHER2のアミノ酸配列においてアミノ酸番号616のフェニルアラニン(F)に対応するアミノ酸残基がアラニン(A)に置換されていることを意味する。上記ペプチドは、合成ポリペプチドであり得る。上記ペプチドは、ある好ましい態様では糖鎖修飾を受けていない。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片はいずれも、がん細胞(例えば、LN229細胞)上に発現したHER2に結合する。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、非がん細胞上に発現するHER2に対するよりも、がん細胞上に発現するHER2に対して強い結合反応性を有することが好ましい。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、ある態様では、がん細胞(例えば、LN229細胞)上に発現したHER2に結合し、非がん細胞(例えば、正常細胞)上に発現したHER2には有意な結合を示さないことがより好ましい。
(i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列の部分ペプチドであり得る。配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列の部分ペプチドであり、10~20アミノ酸長、11~19アミノ酸長、12~18アミノ酸長、13~17アミノ酸長、14~16アミノ酸長、または約15アミノ酸長であり得る。配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。この領域は、がん細胞膜上に発現したHER2において抗体がアクセス可能な立体配置を有すると考えられ、したがって、この領域を標的とする抗体は、がん細胞に対して非がん細胞に対するよりも強い結合親和性(または反応性)を持って結合し得る。ある好ましい態様では、この領域を標的とする抗体は、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る。ペプチド自体が糖鎖修飾を有する必要は無く、ペプチドは、糖鎖修飾を有しなくてよい。
ここで、上記ペプチドは、特に限定されないが、好ましくは、合成ペプチドであり得る。
(ii) 配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る、または、
配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614Aからなる点変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体またはK615AとF616Aの2つの点変異からなる変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る、もしくは
配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてK615Aからなる点変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体ペプチド、もしくはF616Aからなる点変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体ペプチド、もしくはW614AとF616Aの2つの点変異からなる変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体ペプチドに対するよりも、配列番号3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。この領域またはその周辺に結合する抗体は、がん細胞に対して非がん細胞に対するよりも強い結合親和性(または反応性)を持って結合し得る。上記において、HER2の細胞外ドメインの一部は配列番号:2に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号613~622の領域であってもよい。
ここで、前記細胞外ドメインは、非がん細胞もしくはがん細胞に発現させたペプチドまたは合成ペプチドであってもよい。前記細胞外ドメインは、好ましくは、合成ペプチドであり得る。また、これらの抗体は、HER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドへの結合に関して相互に競合してもよい。また、これらの抗体は、がん細胞(例えば、LN229細胞)上に発現したHER2への結合に関して相互に競合してもよい。
(iii)配列番号:18のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:19のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:21のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:22のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:23のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(iv)配列番号:24のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:25のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:26のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:28のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:29のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(v)上記(iii)の抗体とHER2との結合に関して競合する抗体もしくはその抗原結合性断片;または
(vi)上記(iv)の抗体とHER2との結合に関して競合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。本発明の抗体またはその抗原結合性断片はまた、上記(iii)または(iv)の少なくとも1つのCDRにおいて、置換、付加、挿入、および欠失からなる群から選択される少なくとも1以上(例えば、数個、例えば、2個、3個、4個、または5個)のアミノ酸の変異を有する本発明の抗体またはその抗原結合性断片であり得る。これらの抗体またはその抗原結合性断片は、がん細胞に対して非がん細胞に対するよりも強い結合親和性を持って結合し得る。これらの抗体またはその抗原結合性断片は、好ましくは、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、非ヒト動物抗体またはその抗原結合性断片であり得る。非ヒト動物は、例えば、齧歯類、例えば、マウスであり得る。本発明の抗体またはその抗原結合性断片はまた、好ましくは、キメラ抗体またはヒトキメラ抗体であり得る。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、より好ましくは、ヒト化抗体またはヒト化抗体の抗原結合性断片であり得る。
(vii)配列番号:14の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:15の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(viii)配列番号:16の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:17の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(ix)上記(vii)の抗体とHER2{例えば、HER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチド、またはLN229細胞に発現したHER2}との結合に関して競合する抗体もしくはその抗原結合性断片;または
(x)上記(viii)の抗体とHER2{例えば、HER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチド、またはLN229細胞に発現したHER2}との結合に関して競合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片はまた、上記(vii)または(viii)の各可変領域において少なくとも1つの置換、付加、挿入、および欠失からなる群から選択される少なくとも1以上(例えば、数個)のアミノ酸の変異を有する本発明の抗体またはその抗原結合性断片であり得る。ある態様において、各可変領域における置換、付加、挿入、および欠失からなる群から選択される少なくとも1以上(例えば、数個)のアミノ酸の変異はCDR以外の変異であり得る。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、
(xi)配列番号:37のアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、
(xii)配列番号:81に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:83に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:84に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:85に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:86に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:88に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:89に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:90に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:91に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:93に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:94に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:95に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:96に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:97に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:98に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:99に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:100に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:101に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:102に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:103に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:104に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:105に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:106に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:107に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:108に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:109に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:110に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:111に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:112に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:113に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:114に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:115に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:116に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:117に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:118に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:119に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:120に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:121に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:122に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:123に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:124に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:125に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:126に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:127に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:128に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:129に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:130に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:131に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:132に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:133に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:134に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:135に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:136に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:137に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:138に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:139に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:140に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:141に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:142に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:143に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:144に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:145に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:146に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:147に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:148に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:149に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:150に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:151に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:152に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:153に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:154に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:155に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:156に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:157に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:158に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:159に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:160に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:161に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:162に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:163に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:164に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:165に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:166に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:167に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:168に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:169に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:170に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:171に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:172に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:173に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:174に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:175に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:176に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:177に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:178に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:179に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:180に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:181に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:182に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:183に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:184に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:185に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:186に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:187に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:188に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:189に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:190に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:191に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:192に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:193に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:194に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:195に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:196に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:197に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:198に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:199に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:200に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する;
配列番号:201に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:202に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:203に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:204に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:205に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:206に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する、抗体またはその抗原結合性断片であり得る。
本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、
(xiii)(a)配列番号:39の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:40の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(b)配列番号:41の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:42の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(c)配列番号:43の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:44の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(d)配列番号:45の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:46の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(e)配列番号:47の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:48の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(f)配列番号:49の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:50の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(g)配列番号:51の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:52の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(h)配列番号:53の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:54の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(i)配列番号:55の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:56の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(j)配列番号:57の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:58の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(k)配列番号:59の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:60の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(l)配列番号:61の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:62の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(m)配列番号:63の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:64の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(n)配列番号:65の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:66の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(o)配列番号:67の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:68の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(p)配列番号:69の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:70の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(q)配列番号:71の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:72の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(r)配列番号:73の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:74の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(s)配列番号:75の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:76の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(t)配列番号:77の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:78の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;
(u)配列番号:79の重鎖可変領域のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号:80の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体もしくはその抗原結合性断片;または
(xiv)上記(xii)(a)~(u)の各抗体とHER2{例えば、HER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチド、またはLN229細胞に発現したHER2}との結合に関して競合する抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。
上記(xi)~(xiv)の抗体もしくはその抗原結合性断片には、当業者であれば明らかな通り、後記する本発明の抗体またはその抗原結合性断片の説明等を適用し得る。
上記(i)~(xiv)のいずれか1以上を満たす、抗体またはその抗原結合性断片であり得る。
この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(i)または(ii)のいずれか1以上のプロファイルを有するものであってもよい。さらに、具体的には、上記(i)のみ、上記(ii)のみ、または上記(i)および(ii)のプロファイルを有するものであってもよい。
この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(v)、(vi)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)、および(xiv)からなる群から選択される1以上と上記(i)を満たし得る。この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(v)、(vi)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)、および(xiv)からなる群から選択される1以上と上記(ii)を満たし得る。この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(v)、(vi)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)、および(xiv)からなる群から選択される1以上と上記(i)および(ii)を満たし得る。これらの抗体またはその抗原結合性断片は、がん細胞に対して非がん細胞に対するよりも強い結合親和性(または反応性)を持って結合し得る。これらの抗体またはその抗原結合性断片は、好ましくは、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る。
この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(i)および(ii)のいずれか1以上のプロファイルを有するものであってもよい。さらに、具体的には、上記(i)のみ、上記(ii)のみ、または上記(i)および(ii)のプロファイルを有するものであってもよい。これらの抗体またはその抗原結合性断片は、がん細胞に対して非がん細胞に対するよりも強い結合親和性(または反応性)を持って結合し得る。これらの抗体またはその抗原結合性断片は、好ましくは、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的に反応し得る。
この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(v)、(vi)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)、および(xiv)からなる群から選択される1以上と上記(i)を満たし得る。この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(v)、(vi)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)、および(xiv)からなる群から選択される1以上と上記(ii)を満たし得る。この態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、上記(v)、(vi)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)、および(xiv)からなる群から選択される1以上と上記(i)および(ii)を満たし得る。
ADCC活性は、HER2を発現している標的細胞(がん細胞、例えば、LN229細胞やSK-BR-3細胞)とエフェクター細胞と本発明の抗体を混合し、ADCCの程度を測定することによって評価することができる。エフェクター細胞としては、例えば、マウス脾細胞、ヒト末梢血や骨髄から分離した単球核を利用することができる。標的細胞としては、例えばHER2陽性乳がん細胞を用いることができる。標的細胞をあらかじめ51Cr等で標識し、これに本発明の抗体を加えてインキュベーションし、その後標的細胞に対して適切な比のエフェクター細胞(エフェクター細胞は活性化されていてもよい)を加えてインキュベーションを行う。インキュベーション後、上清を採取し、上清中の上記標識をカウントすることにより、測定することが可能である。CDC活性とは、補体系による細胞障害活性を意味する。CDC活性は、ADCC活性の試験において、エフェクター細胞に代えて補体を用いることにより測定することができる。
本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントと薬物との複合体(抗体-薬物複合体;ADC)が提供される。本発明のADCでは、抗体またはその抗原結合フラグメントと薬物(例えば、細胞を傷害する特性を有する成分であり、例えば、細胞傷害剤である)とはリンカーを介して連結し得る。本発明のADCでは、細胞傷害剤としては、化学療法剤(例えば、市販の抗がん剤などの抗がん剤、例えば、アウリスタチン(アウリスタチンE、アウリスタチンFフェニレンジアミン(AFP)、モノメチルアウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンFとそれらの誘導体)、メイタンシノイドDM1およびDM4とそれらの誘導体)、カンプトテシン(SN-38、トポテカンおよびエキソテカンとそれらの誘導体)、DNA副溝結合剤(エネジイン、レキシトロプシン、デュオカルマイシンとそれらの誘導体)、タキサン(パクリタキセルおよびドセタキセルとそれらの誘導体)、ポリケチド(ディスコデルモライドとその誘導体)、アントラキノン系(ミトキサントロンとその誘導体)、ベンゾジアゼピン(ピロロベンゾジアゼピン、インドリノベンゾジアゼピン、およびオキサゾリジノベンゾジアゼピンとそれらの誘導体)、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンとそれらの誘導体)、ドキソルビシン類(ドキソルビシン、モルホリノ-ドキソルビシン、およびシアノモルホリノ-ドキソルビシンとそれらの誘導体)、強心配糖体(ジギトキシンやその誘導体)、カレキアマイシン、エポチロン、クリプトフィシン、セマドチン、セマドチン、リゾキシン、ネトロプシン、コンブレタスタチン、エリュテロビン、エトポシド、T67(チュラリク)、およびノコダゾール)、放射性同位体(例えば、32P、60C、90Y、111In、131I、125I、153Sm、186Re、188Re、および212Bi)、および毒素(例えば、ジフテリアトキシンA、シュードモナスエンドトキシン、リシン、サポリン等)が挙げられ、本発明のADCにおける細胞傷害剤として用いることができる。細胞傷害剤はいずれも、がんの処置に用いられるものを用いることができる。
本発明のある態様では、マレイミド基-PEG-Val-Citにより抗体と細胞傷害剤を連結することができる。本発明のある態様では、本願実施例で用いたリンカー(例えば、マレイミド基-PEG-Val-Cit-PABA-細胞傷害剤)を用いることができる。
また、リンカーと細胞傷害剤との間には、スペーサーを介在させてもよい。
本発明の抗体は、(i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれか1以上のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号:31のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号:32のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号:33のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号:34のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号:35のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。ある態様では、本発明の抗体は、配列番号:36のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。またさらに、本発明の抗体は、配列番号:37のアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原として動物に投与することによって得られ得る。ペプチドは、合成ペプチドであり得る。
例えば、本発明によれば、抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、LN229細胞により産生されたHER2ecタンパク質に結合することができる抗体群またはその抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体またはその抗原結合性断片を選択または同定することを含む方法が提供される。
本発明によればまた、抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)のいずれかからなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合することができる抗体群またはその抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体またはその抗原結合性断片を選択または同定することを含む方法が提供される。
本発明によればさらに、抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、抗体群またはその抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体またはその抗原結合性断片を選択または同定することを含む方法が提供される。
本発明によればさらにまた、抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614Aからなる点変異を有するペプチド、またはK615AもしくはF616Aからなる点変異を有するペプチドに対するよりも、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドに対して強い反応性を有する抗体群またはその抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体またはその抗原結合性断片を選択または同定することを含む方法が提供される。
本発明によればさらにまた、抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてF616Aからなる点変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体、W614AとF616Aの2つの点変異からなる変異を有するペプチドに対するよりも、配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドに対して強い反応性を有する抗体群またはその抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体またはその抗原結合性断片を選択または同定することを含む方法が提供される。
HER2(例えば、LN229細胞に発現したHER2)またはその断片に結合することができる抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定することを含む、方法が提供され得る。
HER2またはその断片に結合する抗体群または抗体の抗原結合性断片群から上記(i)または(ii)から選択される少なくとも1つを満たす抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定することを含む、方法が提供される:
(i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する;または
(ii)配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、もしくは
配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614Aからなる点変異を有するペプチド、またはK615AもしくはF616Aからなる点変異を有するペプチドに対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い反応性を有する。
本発明によればさらに、抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、
上記(i)または(ii)から選択される少なくとも1つを満たす抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、HER2またはその断片に結合する抗体またはその抗原結合性断片を選択または同定することを含む、方法が提供される:
(i)配列番号:31~37のアミノ酸配列(例えば、配列番号:31~36のアミノ酸配列)からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドに結合する;または
(ii)配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614A、K615A、およびF616Aからなる群から選択される1以上のアミノ酸変異を有するHER2の細胞外ドメインの変異体に対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い結合親和性(または反応性)を有する、もしくは
配列番号:2に記載のHER2の細胞外ドメインの一部(アミノ酸番号603~622の領域)からなるペプチドにおいてW614Aからなる点変異を有するペプチド、またはK615AもしくはF616Aからなる点変異を有するペプチドに対するよりも、配列番号:3に記載のHER2の細胞外ドメインからなるペプチドに対して強い反応性を有する。
これらの態様において、本発明は、得られた抗体または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定することをさらに含んでいてもよい。
抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、
上記(iii)または(iv)のいずれかと少なくとも1つのCDRにおいて、置換、付加、挿入、および欠失からなる群から選択される少なくとも1以上のアミノ酸の変異を有する抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定することを含む、方法が提供される。
抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、
上記(vii)または(viii)のいずれかと少なくとも1つの可変領域において、置換、付加、挿入、および欠失からなる群から選択される少なくとも1以上のアミノ酸の変異を有する抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定することを含む、方法が提供される。
抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定する方法であって、
上記(xii)または(xiii)のいずれかと少なくとも1つのCDRまたは可変領域において、置換、付加、挿入、および欠失からなる群から選択される少なくとも1以上のアミノ酸の変異を有する抗体群または抗体の抗原結合性断片群から、非がん細胞上に発現するHER2には有意には反応せず、がん細胞上に発現するHER2に対して特異的な反応性を有する抗体または抗体の抗原結合性断片を選択または同定することを含む、方法が提供される。
本発明によれば、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片と薬学的に許容できる担体や添加物を含んでいてもよい。担体及び添加物の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、界面活性剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明によれば、対象から得られたがん試料中でHER2陽性のがん細胞を検出する方法であって、前記がん試料と本発明の抗体または抗体またはその抗原結合性断片とを接触させることを含む、方法が提供される。この方法では、生体試料中のHER2と抗HER2抗体またはその抗原結合性断片とが複合体を形成したときには、HER2陽性のがん細胞が検出されたと決定することができる。本発明によればまた、本発明の抗体または抗体またはその抗原結合性断片を含むHER2標的化剤によるHER2標的化療法の有効性を決定する方法であって、対象から得られた生体試料と抗HER2抗体またはその抗原結合性断片(好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片)とを接触させることと、生体試料中のHER2と抗HER2抗体またはその抗原結合性断片とが複合体を形成したときには、当該対象に対してはHER2標的化療法が有効であると決定することとを含む、方法が提供され得る。本発明によればまた、本発明の抗体または抗体またはその抗原結合性断片を含むHER2標的化剤によるHER2標的化療法の有効性を決定する方法であって、対象から得られた生体試料と抗HER2抗体またはその抗原結合性断片(好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合性断片)とを接触させ、生体試料中のHER2と抗HER2抗体またはその抗原結合性断片との複合体を形成させることと、当該複合体を検出することとを含み、当該複合体の検出は、当該対象に対してはHER2標的化療法が有効であることを示す、方法が提供される。ここで、複合体形成は、生体試料が生検である場合には、生体試料が生検試料に結合したことに基づいて検出でき、生体試料が液体試料である場合には、ELISAなどの当業者に周知の方法により決定することができる。この態様では、方法は、インビトロの方法であり得る。また、この態様では、方法は、産業上利用可能な方法である。この態様では、方法は、診断の工程を含まないことができる。本発明によれば、この方法において用いるための、本発明のHER2抗体またはその抗原結合性断片を含む診断薬、または診断キットが提供され得る。本発明のHER2抗体またはその抗原結合性断片は標識され、これにより本発明のHER2抗体またはその抗原結合性断片を検出してもよいし、または、本発明のHER2抗体またはその抗原結合性断片を認識する標識二次抗体により、本発明のHER2抗体またはその抗原結合性断片を検出してもよい。したがって、診断キットは、本発明のHER2抗体またはその抗原結合性断片を認識する標識二次抗体をさらに含み得る。標識は、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素標識法において用いられる標識であり得、これらに対する発色基質を用いて標識の存在を検出することができる。したがって、診断キットは、発色基質をさらに含んでいてもよい。
(1)細胞
ヒト膠芽腫細胞株LN229、ヒト乳がん細胞株SK-BR-3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1、およびマウス骨髄腫細胞株P3U1はAmerican type culture collection(ATCC)から購入した。正常ヒト表皮角化細胞株HaCaTはコスモバイオから購入した。HER2としては、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトHER2を用いた。HER2ecとしては、配列番号:3のアミノ酸配列を有するヒトHER2の細胞外ドメイン(分泌型HER2)を用いた。CHO-K1にLipofectamineLTX(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を用いてN末にPAタグ(Protein Expr Purif., 95, 240-247, 2014)、C末にRAPタグ(Fujii et al., Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother. Apr;36(2):68-71, 2017)、およびMAPタグ(Fujii et al., Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., 35(6), 293-299. 2016)を付加したHER2タンパク質の発現プラスミド(pCAG/PA-HER2-RAP-MAP;上記のFujii et al.,2016;図1A参照)をトランスフェクションし、HER2発現細胞を抗PAタグ抗体(Protein Expr Purif., 95, 240-247, 2014)でソーティングした後に薬剤選択下で安定発現細胞株CHO/HER2を樹立した。また、LN229にはNeon transfection system(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を用いてN末にPAタグ、C末にRAPタグ、およびMAPタグを付加したHER2タンパク質(PA-HER2-RAP-MAP)またはN末にPAタグ、C末にRAPタグ、およびMAPタグを付加したHER2ec(PA-HER2ec-RAP-MAP;上記のFujii et al.,2016;図1B参照)の発現プラスミド(pCAG/PA-HER2-RAP-MAPまたはpCAG/PA-HER2ec-RAP-MAP)をそれぞれ導入した。PA-HER2-RAP-MAP発現細胞を抗PAタグ抗体でソーティングした後に薬剤選択下で安定発現細胞株LN229/HER2を作製した。また、HER2ecの高発現細胞株については、RAPタグに対する抗体(PMab-2)とPAタグに対する抗体(NZ-1)のサンドイッチELISAにより、培養上清のスクリーニングを行い、LN229/HER2ec(分泌型)を作製した。CHO-K1、CHO/HER2およびP3U1は基礎培地としてRPMI 1640培地(ナカライテスク株式会社)を使用した。LN229、LN229/HER2ec、LN229/HER2、SK-BR-3およびHaCaTは基礎培地としてダルベッコ改変イーグル培地(ナカライテスク株式会社)を用いた。培地には10%ウシ胎子血清(Thermo Fisher Scientific, Inc.)、ペニシリン(100units/mL)、ストレプトマイシン(100units/mL)およびアンホテリシンB(0.25mg/mL)を添加し、37℃、5%CO2下で培養した。
免疫動物として使用したBALB/cマウス(4週齢、メス)は、日本クレアから購入した。抗体はCasMab法(Kato and Kaneko, Sci. Rep., 4: 5924, 2014)を用いて作製した。LN229細胞により産生されたHER2ecタンパク質を抗MAPタグ抗体(上記のFujii et al., 2016)でアフィニティ精製した。その後、BALB/cマウスに100μgのHER2ecタンパク質をImjectTM Alum(Thermo Fisher Scientific, Inc.)と混合し、初回免疫を行なった。追加免疫(合計3回)として、LN229/HER2ecから精製した100μgのHER2ecタンパク質を毎週腹腔内投与した。その後、脾臓摘出の2日前に最終免疫として100μgのHER2ecを投与した。摘出した脾臓から調製した脾細胞を、PEG1500(Roche Diagnostics)を用いてP3U1と細胞融合させた。細胞融合後はヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン(Thermo Fisher Scientific, Inc.)添加RPMI 1640で培養し、HER2ecを用いて後記するELISA法で培養上清の1次スクリーニングを行った。1次スクリーニングで陽性となったハイブリドーマは限界希釈法によってクローニングを実施した。モノクローナル抗体の調製には無血清培地(Hybridoma-SFM; Thermo Fisher Scientific, Inc.)で培養したハイブリドーマ上清を用い、Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare UK Ltd)を使用して精製した。また次いで後記の通り、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色を実施した。結果として対照抗体のH2Mab-119抗体を含む約250個のクローンから、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、および免疫組織化学染色による絞り込みを経て、がん特異的なHER2を認識すると考えられるがん特異的抗体のクローンが複数得られた。以下、2つのクローンについて、それぞれ、H2Mab-214、およびH2Mab-250(以下、合わせて本発明の抗体と略記することがある。)と命名した。当該クローンから得られた抗体をそれぞれH2Mab-214抗体およびH2Mab-250抗体と呼ぶ。
HER2ec(リン酸緩衝食塩水(PBS)で希釈)を96wellプレートに、1μg/mlの濃度で、37℃で30分、固相化した。1%ウシ血清アルブミン(BSA)/0.05% Tween20 in PBS(PBST)を37℃で30分反応させ、ブロッキングを行った。その後、培養上清を、37℃で30分反応させた後、0.05% PBSTを使用して3回の洗浄を行った。さらに、二次抗体(1/2000希釈;Agilent Technologies, Inc.)を37℃で30分反応させ、0.05%PBSTを使用して3回の洗浄を行った。最後に1-Step Ultra TMB-ELISA(Thermo Fisher Scientific, Inc.)で発色させ、マイクロプレートリーダーのOD655nmで吸光度の測定を行った。
0.25% トリプシン/1mM EDTA(ナカライテスク株式会社)を用いて各種接着細胞を回収し、0.1%BSA/PBSで洗浄後、4℃下、上記(2)で作製した抗体(1μg/mL)と反応させた。細胞を0.1% BSA/PBSで洗浄後、オレゴングリーン標識抗マウスIgG抗体(1000倍希釈;Thermo Fisher Scientific, Inc.)と30分反応させた。蛍光強度はEC800 cell Analyzer(Sony Corp.)で測定した。
2-メルカプトエタノールを含むSDSサンプルバッファー(ナカライテスク株式会社)で調整した細胞可溶化液を5-20%ポリアクリルアミドゲル(富士フィルム和光純薬株式会社)で電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Merck KGaA)上に転写した。4%スキムミルク加PBSTで、ポリフッ化ビニリデンPDVF膜をブロッキング後、上記(2)で作製した抗体(5μg/mL)または抗b-アクチン抗体(clone AC-15;Sigma-Aldrich Corp.)と反応させた。その後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(1000希釈;Agilent Technologies, Inc.)と反応させた。検出には化学発光試薬 (ImmunoStar LD;富士フィルム和光純薬株式会社)を使用し、Sayaca-Imager(DRC株式会社)でシグナルを検出した。
BioChain社から購入した乳がん組織(カタログ番号:B904111)とBioChain Institute, Inc.から購入した正常乳腺組織(カタログ番号:B803077)を用いた。組織切片をキシレンで脱パラフィン、脱水しクエン酸緩衝液(pH 6.0;Agilent Technologies, Inc.)に浸漬して20分間オートクレーブ処理を行った。次いで上記(2)で作製した抗体(1μg/mL)で室温下において1時間反応させ、その後Envision+ kit,mouse(Agilent Technologies, Inc.)で30分処理した。3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩で2分処理し発色させ、ヘマトキシリンで対比染色を行なった。染色強度は、上記した2018 ASCO/CAPガイドラインに基づいて0、1+、2+、および3+で評価した。
(1)H2Mab-214抗体、およびH2Mab-250抗体のアミノ酸配列及び塩基配列の決定
H2Mab-214ハイブリドーマ細胞およびH2Mab-250ハイブリドーマ細胞1×106からRNeasy Plus mini kit(QIAGEN)を使用してトータルRNAを抽出した。トータルRNA5μgから、SuperScript IV cDNA Syntheses System(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を使用してcDNA合成を行った。以下の実験にcDNAを鋳型として使用した。
重鎖(H鎖)の増幅に以下のプライマーを使用した。
InF.HindIII-H2-214H(配列番号4)
InF.HindIII-H2-250H(配列番号5)
InFr.IgG1terNotI(配列番号6)
InF.HindIII-H2-214L(配列番号7)
InF.HindIII-H2-250L(配列番号8)
InF.mIgCKterNotI(配列番号9)
その結果、H2Mab-214抗体のH鎖をコードするDNAの塩基配列は配列番号:10に、H2Mab-214抗体のL鎖をコードするDNAの塩基配列は配列番号:11に示すとおりであった。同様に、H2Mab-250抗体のH鎖をコードするDNAの塩基配列は配列番号:12に、H2Mab-250抗体のL鎖をコードするDNAの塩基配列は配列番号:13に示すとおりであった。
上記(1)で決定した塩基配列より以下のURLのホームページ(abYsis; http://www.abysis.org/abysis/index.html)に提供されているイムノグロブリンの配列予測ソフト(Kabatナンバリング)にてCDRの部位を特定した。
(1)フローサイトメトリー
正常ヒト表皮角化細胞株HaCaT(コスモバイオ)、および乳がん細胞株SK-BR-3(ATCC)に対し、以下の方法でフローサイトメトリー解析を行った。
0.25%トリプシン/1mM EDTA(ナカライテスク株式会社)を用いて各種接着細胞を回収し、0.1%BSA/PBSで洗浄後、4℃下で各種抗HER2モノクローナル抗体(対照抗体(H2Mab-119抗体;Monoclon. Antib. Immunodiagn. Immunother., vol.36(6), 287-290, 2017参照)、H2Mab-214抗体、およびH2Mab-250抗体、各培養上清)と反応させた。細胞を0.1%BSA/PBSで洗浄後、オレゴングリーン標識抗マウスIgG抗体(1000倍希釈;Thermo Fisher Scientific, Inc.)と30分反応させた。蛍光強度はEC800 cell Analyzer(Sony Corp.)で測定した。
その結果、図2で示すように、対照抗体(H2Mab-119抗体)は、がん細胞株であるSK-BR-3に反応するだけでなく、正常細胞株であるHaCaTに中程度の反応性を示した。一方、本発明の抗体は、がん細胞株であるSK-BR-3には中程度の反応性を示したが、正常細胞株であるHaCaTには全く反応しなかった。このことから、本発明の抗体は、がん特異性があることが示された。
BioChain社より入手したHER2陰性乳がんの組織マイクロアレイ(カタログ番号:B904111)に対し、以下の方法で免疫組織化学染色を行った。
組織切片をキシレンで脱パラフィン、脱水しクエン酸緩衝液(pH 6.0; Agilent Technologies, Inc.)に浸漬して20分間オートクレーブ処理を行った。次いで本発明の抗体(1μg/mL)で室温下において1時間反応させ、その後Envision+kit(Agilent Technologies, Inc.)で30分処理した。3,3’-ジアミノベンジジン四塩酸塩で2分処理し発色させ、ヘマトキシリンで対比染色を行なった。染色強度は、上述の通りに0、1+、2+、3+で評価した。
その結果、下記図3に示すように、対照抗体(H2Mab-119抗体)は、免疫組織化学染色法(IHC)を用いてがん細胞のHER2発現状況を調べる診断薬にてHER2陰性と判定された乳がん(HER2陰性乳がん)組織に対し、陰性を示す一方、本発明の抗体は、HER2陰性乳がん組織に対し、1+~3+の陽性像を示すコアが存在した。このことから、本発明の抗体は、免疫組織染色において高い感度を示すことがわかった。
本発明の抗体は常法により作製した欠失変異体(WT-dN23(ヒトHER2(配列番号:2)のN末からアミノ酸番号22までの領域を欠失させた変異体)、dN200(ヒトHER2(配列番号:2)のN末からアミノ酸番号199までの領域を欠失させた変異体)、dN300(ヒトHER2(配列番号:2)のN末からアミノ酸番号299までの領域を欠失させた変異体)、dN400(ヒトHER2(配列番号:2)のN末からアミノ酸番号399までの領域を欠失させた変異体)、dN500(ヒトHER2(配列番号:2)のN末からアミノ酸番号499までの領域を欠失させた変異体)およびdN600(ヒトHER2(配列番号:2)のN末からアミノ酸番号599までの領域を欠失させた変異体))のすべてに反応したことから、ヒトHER2(配列番号:2)のアミノ酸番号600-652のアミノ酸配列(配列番号:30)を認識しているものと予想された。一方、対照抗体(H2Mab-119抗体)はWT-dN23には反応し、dN200、dN300、dN400、dN500およびdN600には反応しなかったことから、ヒトHER2のアミノ酸番号23-199までのアミノ酸領域を認識しているものと予想された。なお、本実施例および以降の実施例におけるアミノ酸番号は、配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸の位置として示される。
また、H2Mab-250抗体に関して、ヒトHER2のW614をアラニンに置換したW614Aペプチド対する反応性が野生型HER2ペプチドに対する反応性よりも弱かったことから、W614のアミノ酸およびその周辺がH2Mab-250抗体のエピトープであることがわかった。
(1)フローサイトメトリー
アラニン置換変異体を用いたフローサイトメトリー(FACS)解析にて、H2Mab-214抗体またはH2Mab-250抗体のエピトープ解析を行った。目的の位置のアミノ酸をアラニンに置換したHER2(配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトHER2)遺伝子は、QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Inc.)を使用して作製し、塩基配列の決定により変異導入の確認を行った。目的のアラニン置換変異の入ったHER2遺伝子は、野生型HER2遺伝子と同様に、N末にPAタグ、C末にRAPタグおよびMAPタグを付加し、発現ベクターに組み込んだ(実施例1参照)。このプラスミドをNeon Transfection system(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を用いてCHO-K1細胞に遺伝子導入し、抗PA抗体によるセルソーティング(セルソーターSA3800、Sony Corp.)と、その後、ゼオシン(0.5 mg/mL、InVivogen社)による薬剤選択により安定発現細胞株を樹立した。
Biacore X100 (Cytiva)を用いて、H2Mab-214抗体またはH2Mab-250抗体と各種ペプチドとの相互作用解析を行った。ペプチドはヒトHER2の603~622番目のアミノ酸配列(p603-622)、p603-622の1アミノ酸をアラニンに置換したもの(G603A、V604A、K605A、P606A、D607A、L608A、S609A、Y610A、M611A、P612A、I613A、W614A、K615A、F616A、P617A、D618A、E619A、E620A、G621A)、p603-622の1アミノ酸をグリシンに置換したもの(A622G)、p603-622のアミノ酸の一部分を欠損したHER2の部分ペプチド(p614-619、p614-620、p614-621、p614-622、p613-618、p613-619、p613-620、p613-621、p613-622、p612-618、p612-619、p612-620、p612-621、p612-622、p611-618、p611-619、p611-620、p611-621、p611-622、p610-618、p610-619、p610-620、p610-621、p610-622、p609-618、p609-619、p609-620、p609-621、p609-622)を用いた。上記ペプチドそれぞれをH2Mab-214抗体またH2Mab-250抗体を酢酸バッファー(pH4.0)で希釈し、アミンカップリング法によってCM5チップに固定化した。未反応のNHSエステルはエタノールアミンによってブロッキングした。H2Mab-214抗体またはH2Mab-250抗体を固定化したCM5チップに各種ペプチドを添加することで相互作用を測定した。ランニングバッファーは0.005% (v/v) Tween 20を含むPBS、または0.005% (v/v) Tween 20および1.19% DMSOを含むPBS、再生バッファーはグリシン-HCl(pH1.5)を用いた。すべての測定は25℃で行った。測定データはBIAevaluation software (Cytiva)の1:1 bindingモデルを用いて解析を行い、結合速度定数(ka)、解離速度定数(kd)および解離定数(KD)を求めた。kaまたはkdが決定できなかったものに関してはBIAevaluation software (Cytiva)の平衡値解析法を用いてKDを求めた。
本実施例では、更なる抗HER2抗体の取得を試みた。
マウス
6週齢のBALB/cマウスを日本クレアから購入した。
免疫原として、HER2の604-622アミノ酸(19アミノ酸)のC末にCysを加えた20アミノ酸(HER2_604-622C;NH2-VKPDLSYMPIWKFPDEEGAC-COOH;配列番号37)を合成し(ユーロフィン)、常法によりKLHを付加した。ペプチドの精製純度は90%以上とした。
HER2_604-622Cを100 μg/mouse(100 μl)とImjectAlum (Thermo Fisher Scientific, Inc.)100 μlを混ぜ、1回目の免疫を行なった。その後、2回目、3回目、4回目、5回目の免疫として、100 μg/マウス(100 μl)を毎週実施した(ImjectAlumなし)。5回目の免疫の2日後に、マウスから摘出した脾臓から脾細胞を常法により分離し、脾細胞:マウスミエローマ細胞(P3U1)=10:1の割合で細胞融合を行なった。細胞融合については、常法によりPEG1500(Roche Diagnostics)を用いて行なった。
HAT(Thermo Fisher Scientific, Inc.)を入れた10% FBS(Thermo Fisher Scientific, Inc.) in RPMI(ナカライテスク株式会社)を用い、96 well plateにハイブリドーマを播種した。
6日後、ELISAによりスクリーニングを行なった。ELISAは以下の通りに実施した。HER2p604-622CはDMSOで10 mg/mLに溶解した後、PBSで希釈した(1 μg/ml)。ペプチドの固相化は、HER2p604-622Cを50 ng/well (50 μL/well)をプレートに加え、30分、37℃でインキュベートした。ブロッキングは、1% BSA/PBS-Tween(0.05%)を100 μL/wellで加え、30分、37℃でインキュベートした。ハイブリドーマの培養上清を50 μlずつ加え、30分、37℃でインキュベートした。2次抗体は、anti-mouse Immunoglobulins/HRP (Agilent, 1% BSA/PBS-0.05% Tweenで1/2000希釈)を50 μlずつ加え、30分、37℃でインキュベートした。発色は、ELISA POD基質TMBキット(ナカライテスク株式会社)を50 μlずつ加え、10分、室温でインキュベートした。測定は、15分、iMarkMicroplate Reader (OD 655 nm)で行なった。
陽性wellについて、シングルセルクローニングを行なった。目視によりクローンを確認し、ELISAにより陽性クローンを樹立した。クローン名をH2Mab-279~299と命名した。
常法によりサブクラスを決定した(H2Mab-214,250と同様)。
実施例2に記載されるように抗体遺伝子クローニング、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の推定、およびCDR推定を実施した。リコンビナント抗体の活性はFACSにより確認できた。
配列番号2:ヒトc-erb-B-2(HER2)アミノ酸配列(UniprotKB ID:P04626)
配列番号3:ヒトc-erb-B-2(HER2)ec(細胞外ドメイン分泌型)アミノ酸配列(23-652aa)
配列番号4:プライマー(InF.HindIII-H2-214H)
配列番号5:プライマー(InF.HindIII-H2-250H)
配列番号6:プライマー(InFr.IgG1terNotI)
配列番号7:プライマー(InF.HindIII-H2-214L)
配列番号8:プライマー(InF.HindIII-H2-250L)
配列番号9:プライマー(InF.mIgCKterNotI)
配列番号10:H2Mab-214抗体のH鎖をコードするDNAの塩基配列
配列番号11:H2Mab-214抗体のL鎖をコードするDNAの塩基配列
配列番号12:H2Mab-250抗体のH鎖をコードするDNAの塩基配列
配列番号13:H2Mab-250抗体のL鎖をコードするDNAの塩基配列
配列番号14:H2Mab-214抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号15:H2Mab-214抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号16:H2Mab-250抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号17:H2Mab-250抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号18:H2Mab-214抗体のH鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号19:H2Mab-214抗体のH鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号20:H2Mab-214抗体のH鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号21:H2Mab-214抗体のL鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号22:H2Mab-214抗体のL鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号23:H2Mab-214抗体のL鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号24:H2Mab-250抗体のH鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号25:H2Mab-250抗体のH鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号26:H2Mab-250抗体のH鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号27:H2Mab-250抗体のL鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号28:H2Mab-250抗体のL鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号29:H2Mab-250抗体のL鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号30:配列番号2のヒトHER2のアミノ酸番号600~652のアミノ酸配列
配列番号31:配列番号2のヒトHER2のアミノ酸番号603~622のアミノ酸配列
配列番号32:配列番号2のヒトHER2のアミノ酸番号613~632のアミノ酸配列
配列番号33:配列番号2のヒトHER2のアミノ酸番号613~622のアミノ酸配列
配列番号34:配列番号2のヒトHER2のアミノ酸番号611~618のアミノ酸配列
配列番号35:配列番号2のヒトHER2のアミノ酸番号612~618のアミノ酸配列
配列番号36:配列番号2のヒトHER2のアミノ酸番号613~619のアミノ酸配列
配列番号37:HER2p604-622Cのアミノ酸配列
配列番号38:scFvで用いられるリンカーの一例
配列番号39:H2Mab-279抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号40:H2Mab-279抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号41:H2Mab-280抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号42:H2Mab-280抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号43:H2Mab-281抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号44:H2Mab-281抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号45:H2Mab-282抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号46:H2Mab-282抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号47:H2Mab-283抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号48:H2Mab-283抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号49:H2Mab-284抗体のH鎖アミノ酸配列
配列番号50:H2Mab-284抗体のL鎖アミノ酸配列
配列番号51:H2Mab-285抗体のH鎖アミノ酸配列
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配列番号206:H2Mab-299抗体のL鎖CDR3のアミノ酸配列
Claims (6)
- 配列番号:24のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、
配列番号:25のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、および
配列番号:26のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を有する重鎖可変領域、ならびに
配列番号:27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、
配列番号:28のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、および
配列番号:29のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を有する軽鎖可変領域を有する、HER2に特異的に結合する単離された抗体、または、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(単鎖Fv)、ダイアボディー、scDb、タンデムscFv、ロイシンジッパー型、およびsc(Fv)2(単鎖(Fv)2)からなる群から選択される、その抗原結合性断片。 - scFvである、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
- 請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含むHER2標的化剤を有効成分として含む、医薬組成物。
- がんを処置することに用いるための、請求項3に記載の医薬組成物。
- 請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合性断片を有効成分として含む、がんの処置剤。
- 請求項1または2に記載の抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸分子。
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