JP7365367B2 - 褐色脂肪細胞の産生 - Google Patents
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Description
又はその塩若しくは誘導体である。
又はその塩若しくは誘導体である。
又はその塩若しくは誘導体である。
(a)細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の存在下で第1の期間にわたって培養する工程と、
(b)工程(a)によって提供された細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の非存在下で第2の期間にわたって培養する工程と、を含む。
(a)細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の存在下で約1~15日、好ましくは約6~10日、培養する工程と、
(b)工程(a)によって提供された細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の非存在下で約20~50日、好ましくは約15~30日、培養する工程と、を含む。
特に好ましい実施形態では、方法は、
(a)細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の存在下で約1~15日、好ましくは約6~10日、培養する工程と、
(b)工程(a)によって提供された細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の非存在下で約20~50日、好ましくは約15~30日、培養する工程と、を含む。
(c)工程(b)によって提供された細胞の集団を、凝集褐色脂肪細胞の形成に好適な条件下で培養する工程であって、好ましくは、培養が、回転浮遊培養である、培養する工程、を含む。
(a)褐色脂肪細胞の集団を、本発明の方法を用いて準備する工程と、
(b)褐色脂肪細胞の集団をインビトロで分析する工程、又は褐色脂肪細胞の集団を動物モデルに移植する工程と、を含む、方法を提供する。
(a)褐色脂肪細胞の集団を、本発明の方法を用いて準備する工程と、
(b)褐色脂肪細胞の集団を対象に移植する工程と、を含む、方法を提供する。
褐色脂肪としても知られる褐色脂肪組織(BAT)は、白色脂肪組織(白色脂肪)とともに臓器としての脂肪を形成する。BATは、特に、新生児及び冬眠する哺乳動物において広く見られる。BATは成人のヒトにも存在し、代謝的に活性であるが、その保有率はヒトが老化するにつれて減少する。
サーモゲニンとしても知られるミトコンドリア脱共役タンパク質(UCP1)は、BATのミトコンドリアにて見られる脱共役タンパク質である。
MGGLTASDVHPTLGVQLFSAGIAACLADVITFPLDTAKVRLQVQGECPTSSVIRYKGVLGTITAVVKTEGRMKLYSGLPAGLQRQISSASLRIGLYDTVQEFLTAGKETAPSLGSKILAGLTTGGVAVFIGQPTEVVKVRLQAQSHLHGIKPRYTGTYNAYRIIATTEGLTGLWKGTTPNLMRSVIINCTELVTYDLMKEAFVKNNILADDVPCHLVSALIAGFCATAMSSPVDVVKTRFINSPPGQYKSVPNCAMKVFTNEGPTAFFKGLVPSFLRLGSWNVIMFVCFEQLKRELSKSRQTMDCAT
(配列番号1)。
中胚葉は、全ての左右相称動物における初期胚に見られる3つの一次胚葉のうちの1つ(外胚葉及び内胚葉に加えて)である。中胚葉は、外胚葉と内胚葉との間に形成される中間層である。
トランスフォーミング増殖因子ベータ1(TGF-β1)は、サイトカインのトランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーの一員であり、細胞成長、細胞増殖、細胞分化、及びアポトーシスの制御を含む、多数の機能を果たす分泌タンパク質である。
又はその塩若しくは誘導体である。
UCP-1活性化因子を使用して、褐色脂肪細胞の機能を試験することができる。
又はその塩若しくは誘導体である。
本発明の剤は、塩、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在することができる。
本発明はまた、適宜、剤の全てのエナンチオマー及び互変異性体を含む。対応するエナンチオマー及び/又は互変異性体は、当該技術分野において既知の方法によって単離/調製することができる。
本発明の剤のうちのいくつかは、立体異性体及び/又は幾何異性体として存在することができる。例えば、それらは、1つ以上の不斉中心及び/又は幾何学的中心を有することができるので、2つ以上の立体異性体及び/又は幾何学的形態で存在し得る。本発明は、これらの剤の全ての個々の立体異性体及び幾何異性体、並びにこれらの混合物の使用を企図する。特許請求の範囲において使用される用語は、適切な機能的活性を保持する(ただし、必ずしも同じ程度ではない)のであれば、これらの形態を包含する。
本発明はまた、本発明の剤の溶媒和物形態を含む。特許請求の範囲において使用される用語は、これらの形態を包含する。
本発明はまた、様々な結晶形態、多形形態、及び(無水)水和形態の本発明の剤にも関する。このような化合物の合成による調製において用いられる溶媒の精製及び/又は単離方法をわずかに変更することによって、化学的化合物をこのような形態のいずれかで単離することができ、これは医薬業界において十分に確立されている。
本発明の褐色脂肪細胞は、前駆細胞、例えば幹細胞及び/又は中胚葉細胞から産生することができる。
(a)細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の存在下で第1の期間にわたって培養する工程と、
(b)工程(a)によって提供された細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の非存在下で第2の期間にわたって培養する工程と、を含む。
(a)細胞の集団、好ましくは中胚葉細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の存在下で約1~15日、好ましくは約6~10日、培養する工程と、
(b)工程(a)によって提供された細胞の集団を、TGB-βシグナル伝達阻害剤の非存在下で約20~50日、好ましくは約15~30日、培養する工程と、を含む。
(c)工程(b)によって提供された細胞の集団を、凝集褐色脂肪細胞の形成に好適な条件下で培養する工程であって、好ましくは、培養が、回転浮遊培養である、培養する工程、を含む。
(a)約36~38℃又は36.5~37.5℃、好ましくは約37℃で培養する工程、
(b)約4~6%又は4.5~5.5%のCO2、好ましくは約5%のCO2で培養する工程、及び/又は
(c)少なくとも約95%、96%、97%、98%、又は99%の湿度、好ましくは約100%の湿度で培養する工程を含む。
本発明の褐色脂肪細胞を、幹細胞から(例えば、インビトロで)産生することができる。
本発明の褐色脂肪細胞は、長期間にわたり血糖濃度が高いことを特徴とする疾患の治療又は予防に使用することができる。このような病態としては、インスリン抵抗性、境界型糖尿病、1型又は2型糖尿病、代謝症候群、及び肥満関連の病態が挙げられる。
一態様では、本発明は、褐色脂肪細胞を分析する方法を提供する。
一態様では、本発明は、手術及び/又は治療における使用のための、例えば糖尿病の治療又は予防における使用のための、本発明の褐色脂肪細胞の集団を提供する。
用語「移植(transplant)」及び「移植(implant)」は、本明細書において互換的に用いられる。
本発明の細胞は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤とともに対象に投与するために配合することができる。好適な担体及び希釈剤は、等張生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水を含み、場合によりヒト血清アルブミンを含有する。
材料及び方法
細胞培養及び分化
グルタミン不含有のDMEM/F-12(Corning(Corning,NY))に1:200希釈したGeltrex LDEV-Free hESC qualified reduced growth factor basement membrane matrix(Thermo-Fisher(Waltham,MA))でコーティングしたポリスチレン培養プレート(Thermo-Fisher(Waltham,MA))上に、ヒト多能性幹細胞(PSC)を50,000個/cm2播種した。PSCの維持、スフィア形成、沿軸中胚葉、及び褐色脂肪細胞分化のための培地は、化学的に規定した基本培地(DBM)に特定の要素を添加して作製した。DBMは、グルタミン不含有のDMEM/F-12に、2%のプロブミンProbumin(EMD Milipore(Billerica,MA))、1×抗生物質-抗真菌物質(Corning(Corning,NY))、1×MEM非必須アミノ酸(Corning(Corning,NY))、1× Trace Elements A(Corning(Corning,NY))、1× Trace Elements B(Corning(Corning,NY))、1× Trace Elements C(Corning(Corning,NY))、50μg/mLのアスコルビン酸(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))、10μg/mLのトランスフェリン(Athens Research and Technology(Athens,GA))、0.1mMの2-メルカプトエタノール(Thermo-Fisher(Waltham,MA))、及び1×Glutagro(Corning(Corning,NY))を添加したものからなった。PSC維持培地(MM)は、完全に規定された培地(CDM)を構成するよう、8ng/mLのヒト塩基性FGF(R&D Systems(Minneapolis,MN))、200ng/mLのLONG(登録商標)R3ヒトIGF-I(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))、10ng/mLのアクチビンA(R&D Systems(Minneapolis,MN))、及び10ng/mLのヒトヘレグリンβ-1(Peprotech(Rocky Hill,NJ))を添加したDBMからなった。24時間毎に培地を交換し、最大90%コンフルエントとして、4日間、37℃のインキュベータ内で5%のCO2にて、ヒトPSCをCDMで培養した。継代のため、Accutase(登録商標)(Innovative Cell Technologies(San Diego,CA))を使用して室温(RT)で5~10分間、ヒトPSCを培養プレートか剥がした。1000rpmで室温にて4分間遠心分離した後、Accutaseを吸引し、細胞ペレットをCDMに再懸濁し、次いで血球計数器を用いて細胞数を定量した。上記のようにgeltrexをコーティングしたプレート上に細胞を再播種した。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)によりOCT3/4、SOX2、及びNANOGの発現が陽性であったこと並びに免疫蛍光法から、細胞同一性を確認した。
回転浮遊培養を用い、3ステッププロセスにおいて、沿軸中胚葉(PM)細胞を生成した。最初に、1×106個/mLのhPSCを含む単細胞懸濁液を、5.5mLのスフィア形成培地(SFM)体積にて、6ウェル懸濁プレート(Greiner Bio-One(Monroe,NC))に播種した。次いでこのプレートを、5%のCO2、37℃のインキュベータ内の、97RPMに設定したInnova2000プラットフォームシェーカー(New Brunswick Scientific(Edison,NJ))上に置いた。スフィア形成培地を、10μMのY-27632二塩酸塩(Tocris,Minneapolis(MN))を24時間かけて添加したhPSC MMで構成した。スフィア及び培地をピペットによりコニカルチューブに移し、スフィアを最大10分間重力沈降させることにより使用済み培地を除去した。使用済み培地は、慎重に、沈降したスフィアを乱さないように吸引した。SFMにて24時間後、更に24時間培地をhPSC MMのみのものに交換して、スフィアを懸濁プレートに戻し、オービタルシェーカーに戻した。MMにて24時間後、培地を、上記の培地交換法により沿軸中胚葉培地1(PMM1)と交換した。PMM1は、以下の最終濃度で、要素、すなわち、10ng/mLのBMP4(R&D Systems(Minneapolis,MN))、20ng/mLのbFGF(R&D Systems(Minneapolis,MN))、200ng/mLのLONG(登録商標)R3 IGF-I(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))、及び250nMのラパマイシン(Tocris(Minneapolis,MN))を添加したDBMから構成された。24時間後、新たなPMM1を、使用済みPMM1と更に24時間交換した。PMM1にて合計48時間後、培地をDBMと交換して、細胞を洗浄した。細胞を再沈降させ、DBMを吸引し、スフィアをPMM2に更に96時間再懸濁し、上記のように24時間毎に培地交換した。前述のように、スフィアを、プラットフォームシェーカー上の懸濁プレートに保持した。PMM2は、以下の最終濃度で、要素、すなわち、20ng/mLのbFGF(R&D Systems(Minneapolis,MN))、200ng/mLのLONG(登録商標)R3 IGF-I(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))、250nMのラパマイシン(Tocris(Minneapolis,MN))、25ng/mLのWnt3a、50ng/mLのNoggin(R&D Systems(Minneapolis,MN))、2μMのBIO(Tocris(Minneapolis,MN))、及び5μMのフォルスコリン(Tocris(Minneapolis,MN))を添加したDBMで構成された。
BAD1及びBAD2と表記される一連の2つの培地配合物を使用して、褐色脂肪細胞(BA)の分化を実施した。最初にPMスフィアを単細胞懸濁液に分散させることによって、BAを誘導した。簡潔に述べると、PMスフィアを懸濁プレートから取り出し、コニカルチューブ内で重力沈降させた。培地を慎重に吸引し、カルシウムもマグネシウムも不含有の過剰量のDPBSで、スフィアを穏やかに1回洗浄した。スフィアを沈降させ、DPBSを吸引した。スフィアを、5mLのRT Accumax(登録商標)(Innovative Cell Technologies(San Diego,CA))に再懸濁し、単細胞懸濁液が得られるまで、シングルの高速回転ミキサー上に20~30分間置いた。続いて、細胞を、100μmのフィルタ(ThermoFisher(Waltham,MA))を通して50mLのコニカルチューブに濾過し、DPBSで洗浄し、200×gにて4分間、室温で遠心分離し、得られた上清を吸引し、血球計数器による計数のため細胞をBAD1培地に再懸濁した。BAD1を、以下の最終濃度で、要素、すなわち、8ng/mLのbFGF(R&D Systems(Minneapolis,MN))、100ng/mLのBMP7(R&D Systems(Minneapolis,MN))、200ng/mLのLONG(登録商標)R3 IGF-I(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))、10μMのY-27632二塩酸塩(Tocris(Minneapolis,MN))、2μMのロシグリタゾン(Tocris(Minneapolis,MN))、1μMのデキサメタゾン(Tocris(Minneapolis,MN))、1nMのLT-3(3,3’,5-トリヨード-L-サイロニンナトリウム塩)(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))、500μMのIBMX(3-イソブチル-1-メチルキサンチン)(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))、及び10μMのSB431542を添加した、DBMで構成した。次いで、グルタミン(Corning(Corning,NY))不含有のDMEM/F-12に1:200希釈したGeltrex LDEV-Free hESC qualified reduced growth factor basement membrane matrix(Thermo-Fisher(Waltham,MA))でコーティングしたポリスチレン培養プレート(Thermo-Fisher(Waltham,MA))上に、細胞を90,000個/cm2の密度で播種した。細胞を、BAD1で100%コンフルエントまで(8~10日間)培養し、培地を24時間毎に交換した。8~10日後、BAD1をBAD2に切り替えた。BAD2を、SB431542を除いてBAD1と同じように配合し、1:500のChemically Defined Lipid Concentrate(Thermo-Fisher(Waltham,MA))を添加した。更なる使用(例えば、移植又は更にインビトロ分析)のためにアッセイ又は再凝集するまで、細胞をBAD2で維持した。BAD2培地は毎日交換した。最初に使用済みBAD2培地を吸引し、BAプレートをDBPSで洗浄することによって、再凝集をもたらし、この細胞を、コラゲナーゼI、II、III、及びIV(Thermo-Fisher(Waltham,MA))を各々400ユニット含有するコラゲナーゼ混合物を使用して分離させ、カルシウム及びマグネシウム不含有のHBSS(Corning(Corning NY))に希釈した。コラゲナーゼ混合物に、0.5mMのCaCl2 +(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))を添加し、酵素活性を高めた。ほぼシート状のBA細胞の、プレートへの接着がゆるくなるまで(約20~30分間)、当該細胞を37℃にてコラゲナーゼ混合物中でインキュベートした。細胞及びコラゲナーゼを含有するプレートを、同等の体積のEDTA分散溶液(Beers et al,2012)ですすぎ、コニカルチューブに移し、200×gにてRTで4分間、遠心分離した。上清を除去し、次いで、細胞を5mLのAccumax(登録商標)(Innovative Cell Technologies(San Diego,CA))に再懸濁し、単細胞懸濁液が得られるまで、シングルの高速章動ミキサー上に20~30分間置いた。続いて、細胞を、100μmのフィルタ(ThermoFisher(Waltham,MA))を通して50mLのコニカルチューブに濾過し、DPBSで洗浄し、200×gにて4分間、室温で遠心分離し、得られた上清を吸引し、細胞をBAD2培地に再懸濁し、6ウェル懸濁プレート(Greiner Bio-One(Monroe,NC))に5.5mL/ウェルの体積で入れた。概して、分散、濾過、洗浄、及び細胞死の間で数が減るので、10cmのBAプレート1枚からは、再凝集に際し、6ウェルプレートのうちの2つのウェルに対して十分な細胞が得られることになる。懸濁プレートを、5%のCO2、37℃のインキュベータ内の、97RPMに設定したInnova2000プラットフォームシェーカー(New Brunswick Scientific(Edison,NJ))上に置き、BAD2を、上記の重力沈降培地交換法によって1日おきに交換した。
DBPS洗浄後に、2-メルカプトエタノールを添加したTRK溶解緩衝液(Omega Bio-Tek(Norcross,GA))を使用して、細胞をディッシュ内で直接溶解し、氷上で採取した。E.Z.N.A RNA単離キット(Omega Bio-Tek(Norcross,GA))を用いて、製造元のプロトコルにしたがってRNAを単離し、Biotek Synergy2プレートリーダーでRNAを定量した。1μgのRNAを使用し、製造元のプロトコルにしたがって、Iscript cDNA合成キット(Bio-Rad(Hercules,CA))によりcDNAを合成した。次いで、cRNAを、分子グレードの水で最終体積500μLまで希釈した。ViiA7リアルタイムPCRシステム(Life Technologies(Carlsbad,California))を用い、384ウェルプレートにて、5μLのTaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG(appliedbiosystems)、0.5μLのTaqManプライマー(Life Technologies)、0.5μLの分子グレードの水、及び用いたTaqman(登録商標)プローブのための4μLのcDNA、を反応させて、ΔΔCt qRT-PCR分析を行った。各転写産物の発現を、18Sリボソームに対し正規化し、3回行って平均±標準誤差としてプロットした。
ヒト多能性幹細胞を、50,000個/cm2の密度でLabtek4ウェルチャンバスライド(Thermo-Fisher(Waltham,MA))にて培養した。脂肪細胞由来幹細胞を、10,000個/cm2で播種した。8つのLabtekスライドに、褐色脂肪細胞の再凝集体として、再凝集体15個/cm2、又は6ウェル懸濁プレートのうちのおよそ1ウェルを播種した。重力沈降(10分)を用いて、沿軸中胚葉スフィアを15mLのファルコンチューブに回収し、使用済みの培地を吸引し、スフィアを、Ca2+もMg2+も不含有の過剰量の1×DPBSで1回洗浄し、再度沈降させ、上清を吸引し、次いで固定した。Mito Tracker(登録商標)染料を含めるには、生細胞が適切なミトコンドリア膜電位を有していることが必要とされる。したがって、含める場合、Mito Tracker Deep Red染料を、増殖培地に200nMで30~45分間添加した後、固定した。全ての細胞を、室温にて4%のパラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences(Hatfield,PA))で30分間固定した。固定したスフィアを、Ca2+もMg2+も不含有の過剰量の1×DPBSで1回洗浄し、沈降させた。洗浄液を除去し、スフィアを覆うのに十分な体積まで15%スクロースの溶液を添加した。次いで、凍結防止剤として、このスクロース及びスフィアの全量を、2mLの体積の30%スクロース溶液の表面に、4℃で終夜載せた。スクロースで終夜脱水した後、スフィアを、200μLのピペットチップの広い穴を介して取り出し、Tissue-Tek(登録商標)O.C.T.Compound(Sakura Finetek(USA))で充填したクリオモルドに移した。次いで、クリオモルドを、5分間の瞬間凍結のために、液体窒素ガス相に移した。凍結したクリオモルドを-80℃で保管した後、Lecia CM3050Sクリオコート(Leica Biosystems(Buffalo Grove,IL))を用いて、顕微鏡スライド上に7μmの厚さの切片を作製し、-80℃で保管した。
それぞれの種類の細胞の正常な分散のために、上記の方法を用いて細胞を分散させ、滅菌DPBSで洗浄し、200×gで4分間かけてペレット化した。細胞を、0.5mLのフローサイトメトリー固定緩衝液(R&D Systems(Minneapolis,MN))に再懸濁し、室温で15分間、インキュベートした。固定後、細胞をDPBSで2回洗浄し、ペレット化し、200μLのフローサイトメトリー透過処理/洗浄緩衝液(R&D Systems(Minneapolis,MN))に再懸濁した。固定した細胞と一次抗体(表2)を、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、必要に応じて、二次抗体とともに4℃で30分間インキュベートした。含める場合、二次抗体添加後に、DPBSに1:200希釈したLipidTox Green/Red染料を30分間添加した。分析はBeckmann Coulter CyAnで行い、結果を分析してFlowJo v10を用いてプロットした。
沿軸中胚葉、BA、及び白色脂肪細胞(WA)を、通常の培養条件にてSeahorse XFe24細胞培養マイクロプレート(Agilent(Santa Clara,CA))に蒔いた。簡潔に述べると、Y-27632二塩酸塩(Tocris(Minneapolis,MN))を添加したPMM2培地に、PM細胞を120,000個/cm2の密度で24時間蒔き、次いで、更に48時間PMM2単独に切り替えた後、フラックス分析を行った。褐色脂肪細胞を、凝集体15個/cm2の密度で再凝集体として蒔き、BAD2で21日間培養した。白色脂肪細胞フラックス分析の場合、hADSCを10,000個/cm2の密度でMesenPRO(商標)RS(ThermoFisher(Waltham,MA))培地に4日間蒔き、次いで、StemPRO(登録商標)脂肪生成分化培地(ThermoFisher(Waltham,MA))に21日間切り替えた。BA細胞の場合、培地を1日おきに交換した。hADSCの場合、蒔いた初日に新鮮なMesenPROを添加し、交換しなかった。WA分化中、StemPRO(登録商標)脂肪生成分化培地を、3日毎に交換した。
ヒト多能性幹細胞(PSC)、褐色脂肪(BA)細胞、及び多能性ヒト脂肪由来間質/幹細胞(hDSC)を、12ウェルファルコンプレート(Fisher Scientific(Hampton,NH))に蒔いた。ヒトPSCを50,000個/cm2で播種し、MMにて4日間、コンフルエントになるまで培養した。ヒトADSCを10,000個/cm2で播種し、最初にMesenPRO(商標)RS(Thermo-Fisher(Waltham,MA))にて4日間、コンフルエントになるまで培養した。次いで、培地を、StemPRO(登録商標)脂肪生成分化培地(Thermo-Fisher(Waltham,MA))に、21日間切り替えた。褐色脂肪細胞凝集体を、凝集体15個/cm2で12ウェルファルコンプレート(Fisher Scientific(Hampton,NH))に蒔き、BAD2培地にて21日間培養した。製造元の使用説明書にしたがって遊離グリセロール試薬(Sigma-Aldrich(St.Louis,MO))を使用し、細胞培養培地へのグリセロール放出によって脂肪分解を測定した。アッセイの前に、それぞれの種類の細胞から増殖培地を除去し、細胞を、2%のFAフリーBSA(Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX))を添加した脂肪分解性基本培地[DMEM(Corning(Corning,NY))により3回洗浄して、残留脂肪酸をウェルから除去した。「ゼロ」時の時点で、10μMのフォルスコリン(Tocris,Minneapolis(MN))を脂肪分解基本培地に添加にして脂肪分解を刺激し、4時間及び8時間の時点でサンプリングした。トリアクシンC(5μM)を基本培地に添加して、アシル-CoAシンセターゼを阻害し、続いて、グリセロール及び遊離脂肪酸の再エステル化を阻害した。脂肪分解のデータを、タンパク質含有量に対して正規化した。
2群のマウスの皮下に、本発明の方法により産生し、デバイスに封入したヒト褐色脂肪細胞(hiPSC由来BA細胞)を移植した。一方の群では、マウスにフォルスコリン(FSK)を注入して、褐色脂肪細胞を刺激した。他方の群では、褐色脂肪細胞を移植したマウスにFSKによる刺激を行わなかった。マウスの対照群には、空のデバイスを移植した。全ての群について、移植の3週間後に、インビボでのPET-SCANイメージング及び移植したデバイスのエクスビボでのPET-SCANイメージングについて評価した。エクスビボでのPET-SCANイメージングによって分析したとき、FSKによって刺激した褐色脂肪細胞を移植した群では、褐色脂肪細胞は移植したがFSKによる刺激は行わなかった群よりも標識されたグルコースのシグナルが増加した。空のデバイスを移植したマウスでは、シグナルは示されなかった。
さらなる実施形態は以下のとおりである。
[実施形態1]
インビトロで褐色脂肪細胞の集団を産生するための、TGF-β阻害剤の使用。
[実施形態2]
前記TGF-β阻害剤が、SMAD2及びSMAD3阻害剤、並びに/又はアクチビンシグナル伝達阻害剤である、実施形態1に記載の使用。
[実施形態3]
前記TGF-β阻害剤が、上記[化1]又はその塩若しくは誘導体である、実施形態1又は2に記載の使用。
[実施形態4]
前記褐色脂肪細胞の集団が、幹細胞の集団及び/若しくは中胚葉細胞の集団からインビトロで産生され、好ましくは前記幹細胞が、人工多能性幹細胞であり、並びに/又は、好ましくは前記中胚葉細胞が、沿軸中胚葉細胞である、実施形態1~3のいずれか1つに記載の使用。
[実施形態5]
前記褐色脂肪細胞の集団が、FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1、及び/又はTBX6を発現する細胞の集団からインビトロで産生される、実施形態1~4のいずれか1つに記載の使用。
[実施形態6]
前記褐色脂肪細胞が、PGC1-α、PPARγ、ADIPOQ、PRDM16、ENDRB、CIDEA、DIO2、及び/又はEBF2を発現する、実施形態1~5のいずれか1つに記載の使用。
[実施形態7]
前記褐色脂肪細胞が、UCP1を発現する、実施形態6に記載の使用。
[実施形態8]
細胞の集団をTGF-β阻害剤と接触させる工程を含む、褐色脂肪細胞の集団を産生する方法。
[実施形態9]
前記TGF-β阻害剤が、SMAD2及びSMAD3阻害剤、並びに/又はアクチビン阻害剤である、実施形態8に記載の方法。
[実施形態10]
前記TGF-β阻害剤が、上記[化2]又はその塩若しくは誘導体である、実施形態8又は9に記載の方法。
[実施形態11]
前記TGF-β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、中胚葉細胞の集団であり、好ましくは前記中胚葉細胞が、沿軸中胚葉細胞である、実施形態8~10のいずれか1つに記載の方法。
[実施形態12]
前記TGF-β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX3、PAX7、PRRX1、SIX1、及び/又はTBX6を発現する細胞の集団である、実施形態8~11のいずれか1つに記載の方法。
[実施形態13]
前記TGF-β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、幹細胞の集団から、好ましくは3D細胞培養を用いて産生され、並びに/又は、好ましくは前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、実施形態8~12のいずれか1つに記載の方法。
[実施形態14]
中胚葉細胞の集団を、前記TGF-β阻害剤の存在下で約1~15日、好ましくは約6~10日、培養する工程と、
工程(a)によって提供された前記細胞の集団を、前記TGF-β阻害剤の非存在下で約20~50日、好ましくは約15~30日、培養する工程と、
を含む、実施形態8~13のいずれか1つに記載の方法。
[実施形態15]
工程(a)及び(b)の前記培養が、接着培養である、実施形態14に記載の方法。
[実施形態16]
工程(b)によって提供された前記細胞の集団を、凝集褐色脂肪細胞の形成に好適な条件下で培養する工程であって、好ましくは、前記培養が回転浮遊培養である、工程を更に含む、実施形態14又は15に記載の方法。
[実施形態17]
褐色脂肪細胞を分析する方法であって、
実施形態8~16のいずれか1つに記載の方法を用いて、褐色脂肪細胞の集団を準備する工程と、
前記褐色脂肪細胞の集団を、インビトロで分析する工程、又は前記褐色脂肪細胞の集団を動物モデルに移植する工程と、
を含む、方法。
[実施形態18]
TGF-β阻害剤を使用してインビトロで得ることができる、褐色脂肪細胞の集団。
[実施形態19]
実施形態8~17のいずれか1つに記載の方法によって産生された、褐色脂肪細胞の集団。
[実施形態20]
手術及び/又は治療における使用のための、実施形態8~17のいずれか1つに記載の方法によって産生された、褐色脂肪細胞の集団。
[実施形態21]
糖尿病の治療又は予防における使用のための、実施形態20に記載の褐色脂肪細胞の集団。
[実施形態22]
褐色脂肪細胞を対象に移植する方法であって、
実施形態8~17のいずれか1つに記載の方法を用いて、褐色脂肪細胞の集団を準備する工程と、
前記褐色脂肪細胞の集団を前記対象に移植する工程と、
を含む、方法。
Claims (6)
- 細胞の集団をTGF-β阻害剤と接触させる工程を含む、褐色脂肪細胞の集団を産生する方法であって、
前記TGF-β阻害剤が、アクチビン阻害剤であり、
前記TGF-β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、沿軸中胚葉細胞の集団であり、
前記細胞の集団を、前記TGF-β阻害剤の存在下で1~15日、培養する工程(a)と、
工程(a)によって提供された前記細胞の集団を、前記TGF-β阻害剤の非存在下で15~30日、培養する工程(b)と、
を含む、方法。 - 前記TGF-β阻害剤が、
- 前記TGF-β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、FOXC1、FOXC2、MRF4、MSGN1、MYF5、PAX7、PRRX1、SIX1、及び/又はTBX6を発現する細胞の集団である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記TGF-β阻害剤と接触させる前記細胞の集団が、幹細胞の集団から、3D細胞培養を用いて産生され、並びに/又は、前記幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)及び(b)の前記培養が、接着培養である、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)によって提供された前記細胞の集団を、凝集褐色脂肪細胞の形成に好適な条件下で培養する工程であって、前記培養が回転浮遊培養である工程を更に含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
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