WO2021100631A1 - 変異糸状菌、及びそれを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents

変異糸状菌、及びそれを用いたタンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2021100631A1
WO2021100631A1 PCT/JP2020/042489 JP2020042489W WO2021100631A1 WO 2021100631 A1 WO2021100631 A1 WO 2021100631A1 JP 2020042489 W JP2020042489 W JP 2020042489W WO 2021100631 A1 WO2021100631 A1 WO 2021100631A1
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amino acid
seq
xyr1
tyr
cellulase
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俊陽 新井
桜子 一瀬
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花王株式会社
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Definitions

  • the present invention relates to a mutant filamentous fungus and a method for producing a protein using the mutant filamentous fungus.
  • Filamentous fungi are attracting attention as degrading bacteria of plant polysaccharides because they produce various types of cellulase and hemicellulase.
  • Trichoderma is attracting attention as a microorganism for producing cellulase-based biomass-degrading enzymes because it can produce cellulase and hemicellulase in large quantities at the same time.
  • Inducing substances may be required for protein production such as enzymes by microorganisms.
  • enzymes by microorganisms For example, in Trichoderma, the expression of major cellulase genes cbh1, cbh2, egl1 and egl2 is induced by cellulose, cellobiose, etc., and an inducer is essential for cellulase production (Non-Patent Document 2).
  • microcrystalline cellulose such as Abyssel is used as an inducer for cellulase production.
  • cellulose substrates are expensive and often insoluble, they impose a burden on industrial processes and are therefore difficult to use in industrial applications in terms of cost and equipment.
  • Cellulase production method using soluble lactose without using cellulose as an inducer (Patent Document 3), or reaction of glucose with trichoderma-derived cellulase (including ⁇ -glucosidase, endoglucanase, cellobiohydrolase) at high temperature. So, a method for synthesizing inducible sugars such as sophorose and gentiobiose from glucose (Patent Document 4) is disclosed.
  • cellulase production using inducible sugars still has disadvantages in terms of cost and process load.
  • Non-Patent Document 3 It has been reported that shortening the C-terminal 140 amino acid of XYR1 causes loss of cellulase productivity of trichoderma, and that trichoderma having an A824V mutation of XYR1 causes deregulation of xylanase and increases cellulase production (non-patent). Documents 3 and 4).
  • Non-Patent Document 5 reports that by combining the V821F mutation of XYR1 with the enhanced expression of ACE2 in the Trichoderma strain, the protein productivity in a medium using glucose or sucrose as a carbon source was improved.
  • the gene sequence of XYR1 has an intron for 20 amino acid regions upstream of the coding region of the fungal-specific transcription factor domain (Non-Patent Document 6). Therefore, A824 and V821 of XYR1 disclosed in the above document have been once corrected to A804 and V801, respectively.
  • the 20 amino acid region is translated into amino acids instead of introns. Recently, the latter finding is considered correct (eg, Non-Patent Documents 5 and 7), in which case A824 and V821 disclosed in the above document represent the correct amino acid number on the sequence of XYR1. It is regarded.
  • Non-Patent Document 8 suggests that ACE3 and XYR1 interact to regulate the cellulase gene expression of Trichoderma lysei.
  • Patent Document 5 discloses a method for increasing or decreasing the productivity of cellulase or the like by increasing or decreasing the expression of the tre77513 (ACE3) gene in Trichoderma lysei.
  • ACE3 tre77513
  • Patent Document 6 and Non-Patent Document 9 filamentous fungi that retain all 6 cysteines of the N-side Zn (II) 2 Cys type 6 DNA-binding domain and improve and express modified ACE3 lacking the C-terminal amino acid.
  • II N-side Zn
  • Non-Patent Document 9 also describes a filamentous fungus that improves and expresses the C-terminal deficient ACE3 and further co-expresses a wild-type of XYR1 or an A824V mutant, provided that the filamentous fungus co-expresses the XYR1. Although the effect of the drug on cellulase expression was slightly observed in the presence of the inducer, it was not observed in the absence of the inducer.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-39349
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-512930
  • Patent Document 3 Japanese Patent No. 6169077
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 5366286 (Patent Document 5) US Pat. No. 9512415 (Patent Document 6) International Publication No.
  • Non-Patent Document 1 Appl Environ Microbiol, 1997, 63: 1298-1306
  • Non-Patent Document 2 Curr Genomics, 2013, 14: 230-249
  • Non-Patent Document 3 BMC Genomics, 2015, 16: 326
  • Biotech Biofuels, 2013, 6:62 (Non-Patent Document 5) Biotech Biofuels, 2017, 10:30 (Non-Patent Document 6) NCBI Reference Sequence: XP_006966092.1 [www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_006966092.1]
  • Non-Patent Document 7 Biotech Biofuels, 2020, 13:93
  • Non-Patent Document 8 J Biol Chem, 2019, doi: 10.1074 / jbc.RA119.008497
  • Non-Patent Document 9 Biotech Biofuels, 2020, 13: 137
  • the present invention is a method for producing a mutant filamentous fungus.
  • Including modifying XYR1 and ACE3 expression in parent filamentous fungi The modification of XYR1 corresponds to positions 810 to 833 of SEQ ID NO: 1 with respect to a polypeptide consisting of SEQ ID NO: 1 or at least 90% sequence-identical amino acid sequence and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase. Substitution, deletion, insertion or addition of at least one amino acid residue in the region
  • the modification of ACE3 expression is enhancement of expression of a polypeptide consisting of the amino acid sequence at positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having at least 90% sequence identical thereto. Providing a method.
  • Relative protein productivity of mutant filamentous strains Protein composition analysis of mutant filamentous strain cultures: gel electrophoresis image. Relative productivity of various proteins in mutant filamentous strains. Relative productivity of various proteins in mutant filamentous strains.
  • the identity of the amino acid sequence and the nucleotide sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, the homology analysis (Search homology) program of the genetic information processing software Genetyx-Win (Ver.5.1.1; software development) is used, and the analysis is performed with Unit size to homology (ktup) set to 2. Is calculated by.
  • amino acid sequence and a nucleotide sequence means 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 94% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 96. % Or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more identity.
  • the term "one or several" used with respect to the deletion, substitution, addition or insertion of amino acids and nucleotides in amino acid and nucleotide sequences is, for example, 1 to 20, preferably 1. It can mean ⁇ 16, more preferably 1-12, even more preferably 1-8, even more preferably 1-4.
  • “addition" of an amino acid or nucleotide includes the addition of one or several amino acids or nucleotides to one or both ends of the sequence.
  • "insertion" of an amino acid or nucleotide includes insertion of an amino acid or nucleotide into the 5'side or 3'side of a predetermined position.
  • the "corresponding position" or “corresponding region” on an amino acid sequence or nucleotide sequence provides maximum homology between the target sequence and the reference sequence (eg, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1). It can be determined by aligning with. Alignment of amino acid sequences or nucleotide sequences can be performed using known algorithms, the procedure of which is known to those of skill in the art. For example, alignment can be performed by using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) with default settings.
  • Clustal W is, for example, the European Institute for Bioinformatics (European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www. It can be used on the website of ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]).
  • EBI European Institute for Bioinformatics Institute
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan
  • the position of the target sequence aligned to any position in the reference sequence by the above alignment is considered to be the "corresponding position" to that arbitrary position.
  • the area sandwiched by the corresponding positions or the area consisting of the corresponding motifs is regarded as the corresponding area.
  • the similarity of amino acid sequences means the ratio (%) of the number of positions where the same or similar amino acid residues are present in both sequences when two amino acid sequences are aligned to the total number of amino acid residues. ..
  • a similar amino acid residue means an amino acid residue that has properties similar to each other in terms of polarity and charge among the 20 types of amino acid residues that make up a protein and causes so-called conservative substitution. To do.
  • Groups of such similar amino acid residues are well known to those skilled in the art, including, for example, arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; leucine and isoleucine, respectively. , Not limited to these.
  • amino acid residue refers to 20 kinds of amino acid residues constituting a protein, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), aspartic acid (Asn or N), aspartic acid (Asp or).
  • cysteine Cys or C
  • glutamine Gln or Q
  • glutamic acid Glu or E
  • glycine Gly or G
  • histidine His or H
  • isoleucine Ile or I
  • leucine Leu or L
  • Lysine Lys or K
  • methionine Met or M
  • phenylalanine Phe or F
  • proline Pro or P
  • serine Ser or S
  • threonine Thr or T
  • tryptophan Trp or W
  • Tyrosine Tyr or Y
  • valine Val or V
  • a regulatory region such as a promoter and a "operable linkage" of a gene means that the gene and the regulatory region are linked so that the gene can be expressed under the control of the regulatory region.
  • Procedures for "operable linkage" between genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene mean upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • a gene located downstream of a promoter means that the gene is present on the 3'side of the promoter in the DNA sense strand, and upstream of the gene means 5'of the gene in the DNA sense strand. Means the area on the side.
  • the term "original” used for a cell function, property, or trait is used to indicate that the function, property, or trait originally exists in the cell.
  • the term “foreign” is used to describe a function, property, or trait that is not originally present in the cell but is introduced from the outside.
  • a “foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that has been externally introduced into a cell.
  • the foreign gene or polynucleotide may be of the same species as the cell into which it was introduced, or of a heterologous organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
  • the present invention relates to a mutant filamentous fungus, a method for producing the same, and a method for producing a protein using the mutant filamentous fungus.
  • the present invention relates to improving the protein productivity of filamentous fungi. Conventionally, when filamentous fungi are cultured in the presence of glucose, protein production may be suppressed by catabolite repression.
  • cellulase-based biomass-degrading enzymes such as cellulase and hemicellulase in filamentous fungi
  • a cellulase-inducing substance such as cellulose, sophorose, and cellooligosaccharide (cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose, cellohexaose, etc.)
  • cellooligosaccharide cellobiose, cellotriose, cellotetraose, cellopentaose, cellohexaose, etc.
  • the present inventors highly produce proteins such as cellulase and hemicellulase without using inducers conventionally essential for the production of cellulase and hemicellulase by mutant filamentous fungi modified by combining XYR1 and ACE3 expression. I found out to do.
  • the filamentous fungus by making predetermined modifications to cellulase and XYR1 and ACE3, which are transcriptional activators of hemicellulase, to the filamentous fungus, the filamentous fungus is subjected to cellulase and hemi without a cellulase-inducing substance such as cellulose.
  • the filamentous fungus provided by the present invention can efficiently produce a protein even in an environment in which a cellulase non-inducible carbon source such as glucose is used as a main carbon source.
  • the filamentous fungus can efficiently produce proteins such as cellulase and hemicellulase without using an expensive cellulase-inducing substance. According to the present invention, it is possible to improve the efficiency and reduce the cost of protein production using filamentous fungi.
  • the present invention provides a mutant filamentous fungus and a method for producing the same.
  • the method for producing a mutant filamentous fungus of the present invention includes modifying XYR1 and ACE3 expression in the parent filamentous fungus.
  • the order of modifying XYR1 and ACE3 expression is not limited as long as each modification is achieved.
  • mycorrhizal fungi used in the present invention include, but are not limited to, filamentous fungi belonging to the phylum Omycota and the phylum Oomycota. More detailed examples include the genus Trichoderma, the genus Aspergillus, the genus Penicillium, the genus Neurospora, the genus Fusarium, the genus Chrysosporium, and the genus Chrysosporium.
  • Genus Emericella, Hypocreata, Acremonium, Chrysosporium, Myceliophthora, Mycelliophthora, Pyromyces, Pyromaces
  • filamentous fungi such as the genus Thermoascus and the genus Thielavia. Of these, Trichoderma filamentous fungi are preferred.
  • filamentous fungi of the genus Trichoderma examples include Trichoderma reesei, Trichoderma longibraciatum, Trichoderma harzianmi, Trichoderma harzianum, and Trichoderma harzianum.
  • examples include trichoderma lycee and variants thereof.
  • Trichoderma Riesei QM9414 strain and its variants preferably Trichoderma Riesei PC-3-7 strain (ATCC66589), Trichoderma Riesei PCD-10 strain (FERM P-8172), Trichoderma Riesei JN13 strain, or them.
  • a mutant strain of Trichoderma can be preferably used as the trichoderma.
  • XYR1 (Xylanase regulator 1) is a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase in filamentous fungi.
  • XYR1 is a major factor in controlling xylanase gene expression with Zn (II) 2 Cys 6 yeast domein, and is a major factor in controlling the expression of xylanase genes, such as Trichoderma (XYR1), Fusarium (XYR1), Neurospora (XYR1), and Alpergillus (XLNR). Widely conserved in Ascomycetes except yeast.
  • Trichoderma Riesei's XYR1 controls all of the xylanase / xylose metabolism genes and cellulase genes. Trichoderma Riesay's XYR1 is registered in the ncbi database (www.ncbi.nlm.nih.gov/]) as NCBI Reference Sequence: XP_0069660992.1.
  • XYR1 of XP_00696609.21 consists of an amino acid sequence having a length of 920 amino acids (SEQ ID NO: 51), and is defined as a polypeptide encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. ..
  • XYR1 has a 320 to 339 amino acid region encoded by the 1024 to 1083 nucleotide region of SEQ ID NO: 2, and has a total length of 940 amino acids.
  • the amino acid sequence of XYR1 disclosed in the present specification is represented by SEQ ID NO: 1 having a length of 940 amino acids, and the number of the amino acid residue of XYR1 (position on the amino acid sequence). ) Is represented by the number (position) of the residue in the sequence of SEQ ID NO: 1. Further, in consideration of the above circumstances, in the present specification, the amino acid residue after position 340 in SEQ ID NO: 1 is interpreted as the amino acid residue at position [position-20 in SEQ ID NO: 1] in SEQ ID NO: 51. Should be.
  • positions 810 to 833 in SEQ ID NO: 1 are positions 790 to 813 in SEQ ID NO: 51, that is, positions 810 in SEQ ID NO: 1 are positions 790 in SEQ ID NO: 51, and positions 833 in SEQ ID NO: 1 are SEQ ID NOs.
  • the 813th position in 51, the 821th and 824th positions in SEQ ID NO: 1, are the 801st and 804th positions in SEQ ID NO: 51, respectively, and the same applies to other positions.
  • an example of XYR1 (parent XYR1) modified in the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another example of the parent XYR1 is a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and that functions as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • An example of an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the modification of the XYR1 according to the present invention is to add a mutation of at least one amino acid residue to a region presumed to be an ⁇ -helix in the active activation domain of the parent XYR1. More specifically, the modification of XYR1 is a polypeptide consisting of the parent XYR1, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence at least 90% identical to the amino acid sequence, and which functions as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase. It is carried out by mutation (ie, substitution, deletion, insertion or addition) of at least one amino acid residue in the region corresponding to positions 771 to 865 of SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment, the at least one amino acid residue to be mutated is located in the region corresponding to positions 810 to 833 of SEQ ID NO: 1.
  • amino acid residue described above is substituted.
  • the amino acid residue to be substituted is at least one selected from the group consisting of Val, Ile, Leu, Ala, Gly, Thr, and Glu, and more preferably, the following (1) and (2) :( At least one selected from the group consisting of 1) Val, Ile or Leu, (2) Ala or Gly, or at least one selected from the group consisting of Val, Ala, Thr, and Glu. Yes, more preferably at least one selected from the group consisting of Val and Ala.
  • each of these amino acid residues is replaced with Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp, or Tyr.
  • Preferred examples of the substitution of Val, Ile, Leu, Ala, Gly, Thr, and Glu include: Replacement of Val with Lys, Ph, Trp or Tyr; Replacement of Ile with Ph, Trp or Tyr; Replacement of Leu with Ph, Trp or Tyr; Substitution of Ala for Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr; Replacement of Gly with Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr; Replacement of Thr with Tyr; and replacement of Glu with Tyr.
  • the substitution of the amino acid residue is at least one selected from the group consisting of: Substitution of Gly with Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at the position corresponding to position 812 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Val with Ph, Trp or Tyr at the position corresponding to position 814 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Ala for Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at the position corresponding to position 816 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Thr with Tyr at the position corresponding to position 817 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Ala for Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at the position corresponding to position 820 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Val with Lys, Ph, Trp or Tyr at the position corresponding to position 821 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Ala for Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at position corresponding to position 823 of SEQ
  • the modification of XYR1 according to the present invention is at least one selected from the group consisting of positions corresponding to positions 817, 821, 824, 825 and 826 of SEQ ID NO: 1 with respect to parent XYR1. This is done by substituting amino acid residues at the positions. The amino acid residues substituted at the positions corresponding to the 817, 821, 824, 825 and 826 positions are as described above, respectively.
  • the modification of XYR1 according to the invention is the substitution of an amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 821 and 824 of SEQ ID NO: 1 with respect to parent XYR1. Is done by.
  • the amino acid residue substituted at the position corresponding to the 821 position is preferably Lys, Ph, Trp or Tyr, more preferably Ph, and even more preferably Lys or Tyr.
  • the amino acid residue substituted at the position corresponding to the 824 position is preferably Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr, more preferably Val, still more preferably Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr.
  • the modification of XYR1 according to the invention is the amino acid residue at at least one position selected from the group consisting of positions corresponding to positions 817, 825 and 826 of SEQ ID NO: 1 with respect to parent XYR1. It is done by substituting the group.
  • the amino acid residue substituted at the position corresponding to the 817 position is preferably Tyr.
  • the amino acid residue substituted at the position corresponding to the 825 position is preferably Tyr.
  • the amino acid residue substituted at the position corresponding to the 826 position is preferably Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr, and more preferably Val or Trp.
  • the amino acid residues at positions corresponding to positions 817, 821, 824, 825, and 826 of SEQ ID NO: 1 in the parent XYR1 are not the amino acid residues after the substitution described above, respectively.
  • the amino acid residues at positions corresponding to positions 817, 821, 824, 825, and 826 of SEQ ID NO: 1 in the parent XYR1 are located at positions 817, 821, and 824 of SEQ ID NO: 1, respectively. It is the same as the amino acid residues at positions 825 and 826.
  • the amino acid residue at the position corresponding to position 831 is not the amino acid residue after the substitution described above.
  • the SEQ ID NOs: 1 are 812, 814, 816, 817, 820, 821, 823, 824, 825, 826, 827, 830, and 831.
  • amino acid residues at the corresponding positions are at positions 812, 814, 816, 817, 820, 821, 823, 824, 825, 926, 827, and 830, respectively, of SEQ ID NO: 1.
  • amino acid residue at position 831 is the same as positions 810 to 833 of SEQ ID NO: 1.
  • mutagenesis techniques known in the art can be used.
  • a polynucleotide encoding an amino acid sequence to be mutated (hereinafter, also referred to as a parent gene) is a polynucleotide encoding a mutated amino acid sequence (hereinafter, also referred to as a mutated gene). It is possible to express a polypeptide having the desired mutation (modified XYR1) from the mutant gene.
  • a method for introducing the desired mutation into the parent gene for example, a method using homologous recombination can be mentioned.
  • a parent gene in the genome of a filamentous fungus can be replaced with a mutated gene by homologous recombination.
  • a specific method of homologous recombination first, a DNA construct for homologous recombination containing a mutated gene and, if necessary, a drug resistance gene or an auxotrophic gene is constructed, and this is converted into a parent filamentous fungus by a conventional method. Introduce. Next, a transformant in which the homologous recombination construct is incorporated on the genome is selected using drug resistance or auxotrophy as an index. If necessary, it may be confirmed by genome analysis or enzyme activity analysis that the obtained transformant has the desired mutation.
  • a DNA construct for homologous recombination can be constructed by introducing a site-specific mutation into an isolated parent gene.
  • Site-specific mutagenesis can be carried out by conventional methods in the art such as inverse PCR method, annealing method, SOE (splicing by averlap extension) -PCR (Gene, 1989, 77 (1): p61-68). it can.
  • a commercially available site-directed mutagentage kit for example, Stratage II Site-Directed Mutagesis Kit, QuickChange Multi Site-Directed Mutagesis Kit, etc. can also be used.
  • a vector generally used for transformation such as a plasmid can be used.
  • a usual method such as a protoplast method, a protoplast PEG method, or a competent cell method can be used.
  • the parent gene can be isolated by a conventional method from a filamentous strain or the like of the same species as the parent filamentous fungus. Alternatively, it may be chemically synthesized based on the nucleotide sequence of the parent gene. If necessary, the parent gene may be codon-optimized for the host (parent filamentous fungus) into which it is introduced. Information on codons used by various organisms can be obtained from Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
  • the parent gene is a poly encoding the above-mentioned parent XYR1, that is, a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% sequence identical thereto and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase. It may be a nucleotide. Examples of such polynucleotides include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence that is at least 90% identical in sequence.
  • Site-specific mutagenesis into the parent gene can most generally be performed using a mutagenizing primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • the mutation primer is annealed to the region containing the sequence encoding the amino acid residue to be mutated in the parent gene, and the amino acid residue after mutation is replaced with the sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated. It may be designed to include a sequence (codon) encoding. Sequences (codons) encoding amino acid residues before and after mutation can be appropriately recognized and selected by those skilled in the art based on ordinary textbooks and the like.
  • site-specific mutation introduction involves ligating the upstream and downstream DNA fragments of the target region containing the nucleotide mutation to be introduced, each amplified using two sets of primers, into one by SOE-PCR. Can be done with.
  • Mutation primers can be prepared by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4seaarch, 1989, 17: 7059-7071).
  • the parent filamentous fungus can be subjected to mutation treatment, and then a strain having the desired mutation can be selected by genome analysis or enzyme activity analysis.
  • mutation treatment include N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethylnitrosourea, and irradiation with ultraviolet rays or radiation.
  • NTG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine
  • ethylnitrosourea ethylnitrosourea
  • irradiation with ultraviolet rays or radiation irradiation with ultraviolet rays or radiation.
  • various alkylating agents and carcinogens can also be used as mutagens.
  • ACE3 is a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase in filamentous fungi. ACE3 is essential for transcription of the cellulase gene and some xylanase genes during lactose induction. ACE3 is also partially involved in the transcriptional regulation of xyr1.
  • Tricoderma leesei's ACE3 is registered as NCBI Reference Sequence: QEM2493.1 in the ncbi database (www.ncbi.nlm.nih.gov/]), where ACE3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • positions 523 to 734 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are presumed to interact with XYR1, and positions 391 to 522 are presumed to be filamentous fungus-specific transcription factor domains.
  • the regions 120 to 160 are presumed to be Zn (II) 2 Cys type 6 DNA binding domains.
  • examples of ACE3 or a partial polypeptide thereof whose expression is enhanced in the present invention include a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or a partial polypeptide thereof.
  • Another example of ACE3 or a partial polypeptide thereof is a polypeptide having an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and that functions as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase, or a portion thereof.
  • Polypeptides can be mentioned.
  • An example of an amino acid sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the expression of the full-length polypeptide of ACE3 may be enhanced, but the expression of a partial polypeptide thereof, preferably a polypeptide containing at least the region corresponding to positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3 is enhanced. do it. Therefore, examples of the ACE3 whose expression is enhanced in the present invention include a polypeptide consisting of the amino acid sequence at positions 1 to 734 of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having at least 90% of the same sequence as the amino acid sequence thereof, and a partial polypoly of ACE3. Examples of the peptide include a polypeptide consisting of the amino acid sequence at positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having at least 90% of the same amino acid sequence.
  • the expression-enhanced ACE3 or its partial polypeptide in the present invention is the amino acid residue of the 7th to 10th amino acid residue (the amino acid residue in the region corresponding to the 725th to 728th positions of SEQ ID NO: 3) from the C-terminal of the wild-type ACE3. It holds all the basics). More preferably, the expression-enhanced ACE3 or its partial polypeptide in the present invention is the 7th to 17th amino acid residue from the C-terminal of the wild-type ACE3 (amino acid in the region corresponding to the 718 to 728 position of SEQ ID NO: 3). Residues) are all retained.
  • the expression-enhanced ACE3 or a partial polypeptide thereof in the present invention retains a region corresponding to 11 amino acids (positions 724 to 734 of SEQ ID NO: 3) at the C-terminal of wild-type ACE3.
  • mutation of some amino acid residues in the region corresponding to positions 724 to 734 of SEQ ID NO: 3 in the ACE3 or its partial polypeptide is allowed.
  • the enhanced expression of ACE3 or a partial polypeptide thereof in the present invention means that the expression level of the ACE3 or a partial polypeptide thereof is improved.
  • means for increasing the expression level of the target polypeptide include means for improving the transcription level of the gene encoding the polypeptide (hereinafter, also referred to as the target gene).
  • the target gene As a means for improving the transcription amount of the target gene, for example, a control region (strong control region) that strongly promotes transcription of the gene is substituted or inserted into the control region of the target gene on the genome of the filamentous fungus.
  • the strong control region may be operably linked to the target gene.
  • the gene fragment of the target gene which is operably linked to the control region (preferably the strong control region) as needed, is introduced into the genome or plasmid of the filamentous fungus to express the target gene in the cell.
  • the control region preferably the strong control region
  • control region that can be used to improve the transcription amount, for a gene whose transcription amount does not decrease even under high glucose conditions, for example, for trichoderma filamentous fungi, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpd), pyruvate dehydrogenase (pdc), enolese (eno), alcohol dehydrogenase (adh), triose phosphate generase (tpi), aldolase (fba), pyruvate kinase (pyruvate kinase ⁇ ) Dehydrogenase I (ald1), alcohol dehydrogenase II (ald2), pyruvate dehydrogenase (pda), glucokinase (glk), glucokinase (glk), actin (act1), transfection gene (act1), transfection gene, etc.
  • preferable high control regions include control regions such as
  • the target gene can be isolated by a conventional method from a filamentous strain or the like of the same species as the parent filamentous fungus. Alternatively, it may be chemically synthesized based on the nucleotide sequence of the gene of the parent filamentous fungus.
  • Preferred examples of the target gene are a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 90% sequence identity to SEQ ID NO: 4 and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the polynucleotides encoding the same, or their partial polynucleotides, may be mentioned.
  • nucleotide sequence that is at least 90% identical to SEQ ID NO: 4 is a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added or inserted in the sequence of SEQ ID NO: 4.
  • Preferred examples of the partial polynucleotide include the polynucleotide encoding the partial polypeptide of ACE3 described above.
  • the expression level of ACE3 or a partial polypeptide thereof in the mutant strain of the present invention is improved as compared with the parent filamentous fungus.
  • the transcription amount of the gene encoding ACE3 or a partial polypeptide thereof in the mutant strain of the present invention is improved as compared with the parent filamentous fungus.
  • the expression level of a gene or polypeptide can be quantified by known means such as quantitative PCR, microarray, Western blotting, ELISA, HPLC and the like.
  • the mutant filamentous fungus of the present invention produced by the above procedure contains the modified XYR1 obtained by the above-mentioned modification of XYR1, and as described above, the expression of ACE3 or a partial polypeptide thereof is higher than that of the parent filamentous fungus. It has been strengthened.
  • the mutant filamentous fungus of the present invention is a partial polypeptide of ACE3 operably linked to a control region (preferably a strongly control region) (preferably the amino acid sequence at positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3 or at least the amino acid sequence thereof.
  • a control region preferably a strongly control region
  • a gene encoding (a polypeptide consisting of a 90% sequence identical amino acid sequence) has been introduced, thereby enhancing the expression of the partial polypeptide of the ACE3.
  • the modified XYR1 contained in the mutant filamentous fungus of the present invention is a region corresponding to positions 771 to 865 of SEQ ID NO: 1 with respect to SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% sequence identity identical thereto, preferably.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which at least one amino acid residue in the region corresponding to positions 810 to 833 is substituted, deleted, inserted or added, and which functions as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the modified XYR1 contained in the mutant filamentous fungus of the present invention is located in a region corresponding to positions 771 to 865 of SEQ ID NO: 1 with respect to SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% sequence identical thereto.
  • the modified XYR1 has at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 1 and has the following (a)-(m): (A) Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at the position corresponding to position 812 of SEQ ID NO: 1. (B) Ph, Trp or Tyr at the position corresponding to position 814 of SEQ ID NO: 1; (C) Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr; at the position corresponding to position 816 of SEQ ID NO: 1. (D) Tyr at the position corresponding to position 817 of SEQ ID NO: 1; (E) Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr; at the position corresponding to position 820 of SEQ ID NO: 1.
  • the modified XYR1 has one or more of the (a), (c), (e), (g), (h), and (j) and / or the (b). , (F), (k), (l), (m). More preferably, the modified XYR1 has one or more of the (c), (e), (g), (h), (j) and / or the (b), (f). Have any one or more of.
  • the modified XYR1 is at least 90% sequence identical to SEQ ID NO: 1 and is any one of (d), (f), (h), (i) and (j). It is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having the above and functions as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the modified XYR1 is at least 90% sequence identical to SEQ ID NO: 1 and: Lys, Ph, Trp or Tyr, preferably Ph, more preferably Lys or Tyr; at the position corresponding to position 821 of SEQ ID NO: 1. Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr, preferably Val, more preferably Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or at the position corresponding to position 824 of SEQ ID NO: 1.
  • Tyr A polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid residue selected from the group consisting of and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the modified XYR1 is at least 90% sequence identical to SEQ ID NO: 1 and: Tyr at the position corresponding to position 817 of SEQ ID NO: 1; Tyr; and at the position corresponding to position 825 of SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid residue selected from the group consisting of and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the mutant filamentous fungus of the present invention can express cellulase-based biomass-degrading enzymes such as cellulase and hemicellulase even in the absence of cellulase-inducing substances such as cellulose, sophorose and cellooligosaccharide. Furthermore, the mutant filamentous fungus can efficiently produce a protein even in an environment in which a cellulase-inducible carbon source such as glucose is used as a main carbon source, for example, even in the absence of a cellulase-inducible substance.
  • a cellulase-inducible carbon source such as glucose
  • the present invention provides a method for producing a protein using the mutant filamentous fungus of the present invention described above.
  • the mutant filamentous fungus of the present invention is cultured. By culturing, the protein of interest is produced and accumulated in the culture. By separating the target protein from the culture, the target protein can be produced.
  • the target protein to be produced examples include cellulase-based biomass-degrading enzymes such as cellulase and hemicellulase, exoglucanase, endoglucanase, ⁇ -glucosidase, protease, lipase, mannase, arabinase, galactase, and amylase.
  • the target protein may be one type of protein or a mixture of a plurality of types of proteins.
  • the target protein is a cellulase-based biomass-degrading enzyme, more preferably cellulase and / or hemicellulase, and even more preferably cellulase and hemicellulase.
  • the hemicellulase include xylanase, ⁇ -xylosidase, ⁇ -arabinofuranosidase and the like, of which xylanase is preferable.
  • the target protein may be a heterologous protein that is not originally produced by filamentous fungi.
  • a recombinant filamentous fungus is prepared by inserting a gene encoding a heterologous protein into the mutant filamentous fungus of the present invention, and the recombinant filamentous fungus is cultured to obtain a protein containing the heterologous protein. be able to.
  • the heterologous protein can be secreted and produced in a culture.
  • the medium used for protein production may be either a synthetic medium or a natural medium as long as it contains components necessary for normal growth of filamentous fungi and protein production such as carbon source, nitrogen source, inorganic salt and vitamin.
  • the carbon source may be any carbon source that can be assimilated by the mutant filamentous fungus, for example, sugars such as glucose and fructose, sugar alcohols such as sorbitol, alcohols such as ethanol and glycerol, and acetic acid. Organic acids and the like can be mentioned. These can be used alone or in combination of two or more.
  • the mutant filamentous fungus is cultured in an environment in which a cellulase non-inducible carbon source is used as a main carbon source.
  • a cellulase non-inducible carbon source examples include glucose, fructose, sucrose, maltose, glycerol and the like. Of these, glucose is preferable in terms of cost.
  • the target protein to be produced is a cellulase-based biomass-degrading enzyme
  • the culture by this method may be carried out in the presence of a cellulase-inducing substance such as cellulose, sophorose and cellooligosaccharide, but the inducible substance is absent.
  • the mutant filamentous fungi are cultured while feeding a non-inducible carbon source such as glucose. May be good. At this time, culturing by dissolving the cellulase non-inducible carbon source, for example, glucose in aqueous ammonia containing a nitrogen source or an aqueous solution containing an ammonium salt, and pouring the solution into culturing is performed. It is preferable because it can suppress foaming inside.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium salts such as ammonium sulfate, nitrogen compounds such as amines, peptone, and natural nitrogen sources such as soybean hydrolyzate.
  • Examples of the inorganic salt include potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, potassium carbonate and the like.
  • vitamins examples include biotin and thiamine. Further, if necessary, a substance required for growth by the filamentous fungus of the present invention can be added.
  • Culturing is preferably carried out under aerobic conditions such as shaking culture and aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 10 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher, more preferably 25 ° C. or higher, and preferably 50 ° C. or lower, more preferably 42 ° C. or lower, more preferably 35 ° C. or lower. Further, it is preferably 10 to 50 ° C, more preferably 20 to 42 ° C, and more preferably 25 to 35 ° C.
  • the pH at the time of culturing is 3 to 9, preferably 4 to 5.
  • the culture time is 10 hours to 10 days, preferably 2 to 7 days.
  • the target protein is separated from the obtained culture by a conventional method. For example, by collecting the culture, performing cell crushing treatment by ultrasonic waves, pressurization, etc. as necessary, and appropriately combining filtration, centrifugation, ultrafiltration, salting out, dialysis, chromatography, etc., the said.
  • the target protein can be separated from the culture.
  • the degree of separation of the target protein is not particularly limited.
  • the culture supernatant and its crudely separated purified product can be obtained as a composition containing the target protein.
  • the present invention also includes the following substances, manufacturing methods, uses, methods, etc. as exemplary embodiments. However, the present invention is not limited to these embodiments.
  • a method for producing a mutant filamentous fungus Including modifying XYR1 and ACE3 expression in parent filamentous fungi
  • the modification of XYR1 corresponds to positions 810 to 833 of SEQ ID NO: 1 with respect to a polypeptide consisting of SEQ ID NO: 1 or at least 90% sequence-identical amino acid sequence and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the modification of ACE3 expression comprises enhancing the expression of a polypeptide consisting of the amino acid sequence at positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence and functions as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the at least one amino acid residue is It is preferably at least one selected from the group consisting of Val, Ile, Leu, Ala, Gly, Thr, and Glu.
  • Substitution of at least one amino acid residue Preferably: Substitution of Thr with Tyr at the position corresponding to position 817 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Val with Lys, Ph, Trp or Tyr at the position corresponding to position 821 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Ala for Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr at the position corresponding to position 824 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Glu with Tyr at the position corresponding to position 825 of SEQ ID NO: 1; Substitution of Ala for Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at the position corresponding to position 826 of SEQ ID NO: 1.
  • At least one selected from the group consisting of [5] The method described.
  • the amino acid sequence at positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence that is at least 90% identical to this Preferably, it retains all the amino acid residues in the region corresponding to positions 725 to 728 of SEQ ID NO: 3, and more preferably, it retains all the amino acid residues in the region corresponding to positions 718 to 728 of SEQ ID NO: 3. And Or Preferably, it retains a region corresponding to positions 724 to 734 of SEQ ID NO: 3, but some amino acid residues in the region may be mutated.
  • the method according to any one of [1] to [6].
  • the transcription amount of the gene encoding the polypeptide is improved by introducing the gene encoding the polypeptide operably linked to the control region into the filamentous fungus.
  • the method described. [10]
  • the XYR1 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 registered as XP_0069666692, or is composed of an amino acid sequence having at least 90% sequence identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and cellulase and hemi.
  • Substitution of at least one amino acid residue is preferably described below: Substitution of Thr with Tyr at the position corresponding to position 797 of SEQ ID NO: 51; Substitution of Val with Lys, Ph, Trp or Tyr at the position corresponding to position 801 of SEQ ID NO: 51; Substitution of Ala for Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr at the position corresponding to position 804 of SEQ ID NO: 51; Substitution of Glu with Tyr at the position corresponding to position 805 of SEQ ID NO: 51; Substitution of Ala for Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at the position corresponding to position 806 of SEQ ID NO: 51, At least one selected from the group consisting of The method according to any one of [1] to [9].
  • the mutant filamentous fungus Preferably, the catabolite repression is alleviated as compared to the parent filamentous fungus. More preferably, the cellulase is expressed in the absence of a cellulase-inducing substance.
  • the filamentous fungus is preferably a Trichoderma spp.
  • the Trichoderma spp. Is preferably Trichoderma Risei or a mutant strain thereof.
  • [14] A method for producing a protein, which comprises culturing a filamentous fungus produced by the method according to any one of the above [1] to [13].
  • the protein is preferably cellulase and / or hemicellulase.
  • the culture is preferably carried out in the presence of glucose.
  • modified XYR1 at least one amino acid residue in the region corresponding to positions 810 to 833 of SEQ ID NO: 1 is substituted, deleted, inserted or inserted into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or at least 90% sequence identical thereto.
  • the partial polypeptide of ACE3 is a polypeptide consisting of the amino acid sequence at positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having at least 90% sequence identical thereto, and functions as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase. , Mutant filamentous fungus.
  • the amino acid sequence at positions 107 to 734 of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence that is at least 90% identical to the amino acid sequence is Preferably, it retains all the amino acid residues in the region corresponding to positions 725 to 728 of SEQ ID NO: 3, and more preferably, it retains all the amino acid residues in the region corresponding to positions 718 to 728 of SEQ ID NO: 3.
  • the mutant filamentous fungus according to [17] which retains a region corresponding to positions 724 to 734 of SEQ ID NO: 3, although some amino acid residues in the region may be mutated.
  • the modified XYR1 is selected from the group consisting of the following in the region corresponding to positions 810 to 833 of SEQ ID NO: 1 with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or at least 90% sequence identical thereto.
  • Substitution of at least one amino acid residue Replacement of Val with Lys, Ph, Trp or Tyr; Replacement of Ile with Ph, Trp or Tyr; Replacement of Leu with Ph, Trp or Tyr; Substitution of Ala for Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr; and Replacement of Gly with Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr; Substitution of Thr to Tyr; and Substitution of Glu to Tyr, A polypeptide consisting of the amino acid sequence of the cellulase and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the mutant filamentous fungus according to [17] or [18].
  • the modified XYR1 has at least 90% sequence identical to SEQ ID NO: 1 and has the following (a) to (m): (A) Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr at the position corresponding to position 812 of SEQ ID NO: 1. (B) Ph, Trp or Tyr at the position corresponding to position 814 of SEQ ID NO: 1; (C) Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr; at the position corresponding to position 816 of SEQ ID NO: 1. (D) Tyr at the position corresponding to position 817 of SEQ ID NO: 1; (E) Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr; at the position corresponding to position 820 of SEQ ID NO: 1.
  • the modified XYR1 is at least 90% sequence identical to SEQ ID NO: 1 and: Lys, Ph, Trp or Tyr, preferably Ph, more preferably Lys or Tyr; at the position corresponding to position 821 of SEQ ID NO: 1. Val, Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or Tyr, preferably Val, more preferably Glu, Ile, Leu, Lys, Ph, Thr, Trp or at the position corresponding to position 824 of SEQ ID NO: 1.
  • Tyr A polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid residue selected from the group consisting of and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • the modified XYR1 is at least 90% sequence identical to SEQ ID NO: 1 and: Tyr at the position corresponding to position 817 of SEQ ID NO: 1; Tyr; and at the position corresponding to position 825 of SEQ ID NO: 1. Val, Ile, Leu, Phe, Trp or Tyr, preferably Val or Trp, at the position corresponding to position 826 of SEQ ID NO: 1.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid residue selected from the group consisting of and functioning as a transcriptional activator of cellulase and hemicellulase.
  • Example 1 Construction of plasmid DNA for gene transfer The following DNA fragments 1 to 5 were prepared by PCR using the genomic DNA of Trichoderma Riesei as a template.
  • Fragment 1 Promoter region about 1.5 kbp upstream of act1 gene (TRIREDRAFT_44504)
  • Fragment 2 xyr1 gene (SEQ ID NO: 2, about 3.0 kbp)
  • Fragment 3 Partial polypeptide of ACE3 (107-734 of SEQ ID NO: 3) Nucleotide encoding (position) (881 to 2918 nucleotide region of SEQ ID NO: 4, about 2.0 kbp)
  • fragment 4 terminator region of about 0.6 kbp downstream of cbh1 gene (TRIREDRAFT_44504)
  • fragment 5 pyr4 gene (TRIREDRAFT_74020) ) About 2.7 kbp region.
  • Fragments 1 and 2 were combined to construct cassette 1: Pact1-XYR1. Fragments 1 and 3 were combined to construct cassette 2: Patch1-ACE3. A transformation marker fragment was prepared in which a fragment 6 of about 0.5 kbp and a fragment 7 of about 1.0 kbp were arranged as homologous sequences for pop-out upstream and downstream of the fragment 5, respectively. Fragment 4 and the transformation marker fragment were combined to construct cassette 3: Tcbh1-pyr4. Binding of DNA fragments was performed according to the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) protocol. Table 1 shows the constructed cassette, the DNA fragments contained therein, and the primers used to construct the cassette.
  • Table 1 shows the constructed cassette, the DNA fragments contained therein, and the primers used to construct the cassette.
  • Cassettes 1 and 3 were bound and inserted into the HincII restriction enzyme cut point of pUC118 (Takara Bio) to construct the xyr1 constitutive expression plasmid pUC-Pact1-XYR1.
  • cassettes 2 and 3 were bound and inserted into the HincII restriction enzyme cut point of pUC118 (Takara Bio) to construct the ace3 constitutive expression plasmid pUC-Pact1-ACE3.
  • PUC-Pact1-XYR1 V821F
  • pUC-Pact1-XYR1 A824V
  • pUC-Pact1-XYR1 V821F
  • pUC-Pact1-XYR1 A824V
  • pUC-Pact1-XYR1 V821F
  • V821F is a plasmid encoding a mutant XYR1 (V821F) in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with the amino acid of V821F.
  • pUC-Pact1-XYR1 (A824V) is a plasmid encoding a mutant XYR1 (A824V) in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is substituted with A824V.
  • the constructed plasmids pUC-Pact1-ACE3, pUC-Pact1-XYR1 (V821F), and pUC-Pact1-XYR1 (A824V) were replicated.
  • the plasmid was introduced into competent cells Escherichia coli DH5 ⁇ Compentent Cells (Takarabio), cultured in LB medium supplemented with ampicillin (37 ° C., 1 day), and from the cultured cells using NucleoSpin TM plasmid (Machray Nagel). The plasmid was recovered and purified.
  • Example 2 Preparation of mutant strain of filamentous fungus
  • the Trichoderma Riesei JN13 ⁇ pyr4 strain was transformed by introducing the plasmid constructed in Example 1.
  • the plasmid was introduced by the protoplast PEG method (Biotechnol Bioeng, 2012, 109 (1): 92-99).
  • Transformants as a marker of pyr4 gene the selective medium (2% glucose, 1.1 M sorbitol, 2% agar, 0.2% KH 2 PO 4 ( pH5.5), 0.06% CaCl 2 ⁇ 2H 2 at any% w / v%); O , 0.06% CsCl 2, 0.06% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5% (NH 4) 2 SO 4, 0.1% Trace element1 Selected.
  • Trace element1 is as follows: 0.5g FeSO 4 ⁇ 7H 2 O , 0.2g CoCl 2, 0.16g MnSO 4 ⁇ H 2 O, in distilled water 0.14g ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O Mess up to 100 mL. From the obtained transformants, it was confirmed by PCR that the gene fragment of interest was inserted, and the JN13_ACE3 strain into which pUC-Pact1-ACE3 was introduced and the pUC-Pact1-XYR1 (V821F) were introduced. The JN13_XYR1 (V821F) strain was obtained.
  • the JN13_ACE3 strain highly expresses ACE3 with the ace3 constitutive expression plasmid pUC-Pact1-ACE3.
  • the JN13_XYR1 (V821F) strain expresses the mutant XYR1 (V821F).
  • Example 3 Culturing of a filamentous fungus mutant strain
  • the filamentous fungus strain obtained in Example 2 was cultured to produce a protein.
  • 50 mL of the medium was placed in a 500 mL flask, the spores of the strain prepared in Example 2 were inoculated to 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and cultured with shaking at 28 ° C. and 220 rpm (Pris). Made by PRXYg-98R).
  • the medium composition is as follows.
  • Trace element 2 1% glucose, 0.14% (NH 4) 2 SO 4, 0.2% KH 2 PO 4, 0.03% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.03% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.1 % High Polypeptone N, 0.05% Bacto Yeast extract, 0.1% Tween 80, 0.1% Trace element2, 50 mM tartrate buffer (pH 4.0) (% are all w / v%).
  • the composition of Trace element 2 is as follows.
  • the medium composition is as follows.
  • Example 4 Protein Concentration Measurement The protein concentration of the culture of Example 3 was measured by the bradford method. In the bradford method, the Quick Start protein assay (BioRad) was used, and the amount of protein was calculated based on the calibration curve prepared using bovine gamma globulin as a standard protein.
  • FIG. 1 shows the relative protein productivity of each strain when the protein productivity of the JN13 strain (parent strain) in the culture using only glucose as a carbon source (glucose culture) is 1. Compared with the culture in the presence of cellulose, the protein productivity of the parent strain JN13 in the glucose culture was significantly reduced.
  • Example 5 Protein Composition Analysis The protein composition of the culture of Example 3 was analyzed. For the analysis, Mini PROTENA TGX Stain-Free Gels (Any KD, 15well, BIORAD) was used. As a standard, Precision Plus Protein Unsteined standard was used. The appropriately diluted culture of Example 3 and Buffer were mixed and treated at 99 ° C. for 5 minutes, applied to a gel, and electrophoresed at 200 V for 35 minutes. From the obtained image file (FIG. 2), the band intensity ratio was calculated using analysis software (Image Lab), and the composition ratio of the produced protein was calculated. The amount of each protein produced was determined from the composition ratio and the protein concentration determined in Example 4. Next, the relative productivity of each protein in each strain was calculated, with the protein productivity of only the XYR1 mutation (XYR1 (V821F) strain) as 1.
  • XYR1 mutation XYR1 (V821F) strain
  • the composition ratio of the product is closer to that of the parent strain in the presence of cellulose, and the composition ratio of the product is closer to that of the parent strain in the presence of cellulose, and CBH1 is a major cellulase, as compared with the XYR1 single mutant strain and the ACE3 high expression strain. , CBH2 and EG1 productivity were significantly improved.
  • Example 6 Preparation of filamentous fungus mutant strain The amino acid substitution of T817Y was carried out by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 23 and 24 shown in Table 4 using pUC-Pact1-XYR1 as a template in the same procedure as in Example 1. A plasmid pUC-Pact1-XYR1 (T817Y) expressing the mutant XYR1 was constructed.
  • the primers shown in Table 4 are used to express mutant XYR1 with amino acid substitutions of V821Y, V821K, A824I, A824L, A824F, A824W, A824Y, A824T, A824K, A824E, E825Y, A826V, and A826W.
  • Each plasmid was constructed.
  • the constructed plasmid was transformed into the JN13_ACE3 ⁇ pyr4 strain by the same method as in Example 2 to obtain a filamentous fungus mutant strain into which ACE3 and the above-mentioned mutant XYR1 were introduced.
  • JN13_XYR1 (V821F) + ACE3 strain, JN13_XYR1 (A824V) + ACE3 strain, XYR1 single mutant strain (JN13_XYR1 (V821F)), and ACE3 high expression strain (JN13_ACE3) prepared in Example 2 were used.
  • Glucose culture was carried out according to the method described in Example 3, and then protein concentration measurement and protein composition analysis of the culture were carried out according to the method described in Examples 4 and 5.
  • BXL1 is ⁇ -xylosidase BXL1
  • CBH1 is cellulase CBH1
  • CBH2 + EG1 is cellulase CBH2 and EG1
  • XYN1 + XYN2 is xylanase XYN1 and XYN2, and other proteins.
  • a filamentous strain that highly expresses ACE3 and expresses mutant XYR1 (T817Y, V821Y, V821K, A824I, A824L, A824F, A824W, A824Y, A824T, A824K, A824E, E825Y, A826V and A826W) prepared in this example. All produced proteins with the same compositions as the JN13_XYR1 (V821F) + ACE3 strain and the JN13_XYR1 (A824V) + ACE3 strain prepared in Example 2.
  • the productivity of not only xylanase but also the major cellulases CBH1, CBH2 and EG1 was significantly improved as compared with the XYR1 single mutation.
  • the effective mutation of XYR1 is not limited to V821F and A824V, but glucose that adds at least one amino acid mutation to the region presumed to be ⁇ -helix in the active activation domain of XYR1 (usually glucose that causes catabolite repression).
  • the mutant XYR1 exhibiting the property of improving protein productivity even when the drug was used was effective for the production of cellulase and xylanase in the absence of an inducer.
  • the cellulase / xylanase gene can be obtained in the same manner as when a cellulase-inducible substance such as cellulose is used. It was shown that the promoter can be activated and protein production can be efficiently induced.

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Abstract

変異糸状菌の製造方法。該方法は、親糸状菌におけるＸＹＲ１及びＡＣＥ３発現を改変することを含む。該ＸＹＲ１の改変は、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドに対する、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加であり、該ＡＣＥ３発現の改変は、ＡＣＥ３の部分ポリペプチドの発現強化である。

Description

変異糸状菌、及びそれを用いたタンパク質の製造方法
　本発明は、変異糸状菌、及びそれを用いたタンパク質の製造方法に関する。
　糸状菌は、多種のセルラーゼ及びヘミセルラーゼを生産することから、植物性多糖の分解菌として注目されている。なかでも、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）は、セルラーゼとヘミセルラーゼを同時に、かつ大量に生産することが可能であることから、セルラーゼ系バイオマス分解酵素の製造のための微生物として注目されている。
　工業的な微生物培養のための炭素源は、安価かつ可溶性であることが望ましい。従来、微生物の培養における炭素源としてはグルコースが汎用されている。しかしながら、グルコース存在下では、カタボライト抑制と呼ばれる制御機構により、微生物による物質生産性の低下又は飽和が起こる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属等の糸状菌のカタボライト抑制に、広域制御型転写因子ＣｒｅＡや、ＣｒｅＢ、ＣｒｅＣ、ＣｒｅＤ等が関与していることが報告されている（特許文献１）。これらの転写因子の制御によりアスペルギルスのカタボライト抑制を調節できる可能性があるが、未だ充分な成果は得られていない。トリコデルマについても、カタボライト抑制の機構解析が進められている（特許文献２、非特許文献１）。しかし、トリコデルマのカタボライト抑制の機構には未だ不明な点が多く、抑制回避には至っていない。
　微生物による酵素などタンパク質の生産には誘導物質が必要なことがある。例えば、トリコデルマにおいては、主要なセルラーゼ遺伝子cbh1、cbh2、egl1及びegl2の発現はセルロース、セロビオースなどにより誘導され、セルラーゼ生産に誘導物質は必須である（非特許文献２）。一般的に、微結晶性セルロースであるアビセルなどがセルラーゼ生産の誘導物質に用いられる。しかしセルロース基質は、高価であり、また多くは不溶性であるため工業プロセスに負荷をかけることから、工業用途への使用はコスト的に及び設備の面で困難である。
　誘導物質としてセルロースを用いずに可溶性のラクトースを用いたセルラーゼ生産法（特許文献３）や、トリコデルマ由来のセルラーゼ（βグルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドロラーゼを含む）とグルコースを高温で反応させることで、グルコースからソホロースとゲンチオビオースなどの誘導性のある糖を合成する手法（特許文献４）が開示されている。しかしながら、誘導性のある糖を用いたセルラーゼ生産もなお、コストやプロセス負荷の面でデメリットを抱える。
　転写制御因子の改変による、誘導物質を利用せずともセルラーゼ及びキシラナーゼの発現が可能な微生物の作出に向け、セルラーゼ発現機構の解析が進められている。トリコデルマのセルラーゼ誘導発現に関与する正の転写因子としてＸＹＲ１、ＡＣＥ２、ＡＣＥ３、ＨＡＰ２／３／５などが報告されている（非特許文献３）。ＸＹＲ１のＣ末端１４０アミノ酸を短縮することでトリコデルマのセルラーゼ生産性が失われること、ＸＹＲ１のＡ８２４Ｖ変異を有するトリコデルマでキシラナーゼの脱制御が起こり、セルラーゼ生産が増加することが報告されている（非特許文献３、４）。非特許文献５には、トリコデルマ株においてＸＹＲ１のＶ８２１Ｆ変異にＡＣＥ２の向上発現を組み合わせることで、グルコースやスクロースを炭素源とする培地でのタンパク質生産性が向上したことが報告されている。なお従来は、ＸＹＲ１の遺伝子配列には糸状菌特異的転写因子ドメイン（fungal-specific transcription factor domain）のコード領域の上流に２０アミノ酸領域分のイントロンが存在すると考えられていた（非特許文献６）ため、上記文献に開示されるＸＹＲ１のＡ８２４及びＶ８２１は、一旦それぞれＡ８０４及びＶ８０１に訂正された。しかし一方で、該２０アミノ酸領域はイントロンではなくアミノ酸に翻訳されているという報告も以前からなされていた。最近では、後者の知見が正しいと考えられている（例えば、非特許文献５及び７）、その場合、上記文献に開示されるＡ８２４及びＶ８２１はＸＹＲ１の配列上の正しいアミノ酸番号を表しているとみなされる。
　非特許文献８には、ＡＣＥ３とＸＹＲ１が相互作用してトリコデルマ・リーセイのセルラーゼ遺伝子発現を調節することが示唆されている。特許文献５には、トリコデルマ・リーセイにおいてtre77513（ＡＣＥ３）遺伝子の発現を増加及び減少させることで、そのセルラーゼ等の生産性を増加及び低下させる方法が開示されている。特許文献６及び非特許文献９には、Ｎ側のＺｎ（II）2Ｃｙｓ6型ＤＮＡ結合ドメインの６個のシステインを全て保持し且つＣ末端のアミノ酸を欠損した改変ＡＣＥ３を向上発現する糸状菌が、誘導物質非存在下でもセルラーゼ発現を向上させたことが報告されている。非特許文献９にはまた、該Ｃ末端欠損ＡＣＥ３を向上発現し、さらにＸＹＲ１の野生型又はＡ８２４Ｖ変異体を共発現する糸状菌が記載されているが、ただしこの糸状菌における当該ＸＹＲ１の共発現によるセルラーゼ発現に対する効果は、誘導物質存在下では僅かに観察されたものの、誘導物質非存在下では観察されていない。
（特許文献１）特開２０１５－３９３４９号公報
（特許文献２）特表平１１－５１２９３０号公報
（特許文献３）特許第６１６９０７７号公報
（特許文献４）特許第５３６６２８６号公報
（特許文献５）米国特許第９５１２４１５号公報
（特許文献６）国際公開公報第２０１８／０６７５９９号
（非特許文献１）Appl Environ Microbiol, 1997, 63:1298-1306
（非特許文献２）Curr Genomics, 2013, 14:230-249
（非特許文献３）BMC Genomics, 2015, 16:326
（非特許文献４）Biotech Biofuels, 2013, 6:62
（非特許文献５）Biotech Biofuels, 2017, 10:30
（非特許文献６）NCBI Reference Sequence: XP_006966092.1 [www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/XP_006966092.1]
（非特許文献７）Biotech Biofuels, 2020, 13:93
（非特許文献８）J Biol Chem, 2019, doi:10.1074/jbc.RA119.008497
（非特許文献９）Biotech Biofuels, 2020, 13:137
　本発明は、変異糸状菌の製造方法であって、
　親糸状菌におけるＸＹＲ１及びＡＣＥ３発現を改変することを含み、
　該ＸＹＲ１の改変が、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドに対する、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加であり、
　該ＡＣＥ３発現の改変が、配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現強化である、
方法、を提供する。
変異糸状菌株の相対タンパク質生産性。 変異糸状菌株の培養物のタンパク質組成分析：ゲル電気泳動像。 変異糸状菌株における各種タンパク質の相対生産性。 変異糸状菌株における各種タンパク質の相対生産性。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性はＬｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列におけるアミノ酸及びヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～１６個、より好ましくは１～１２個、さらに好ましくは１～８個、さらに好ましくは１～４個を意味し得る。本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「挿入」には、所定の位置の５’側又は３’側へのアミノ酸又はヌクレオチドの挿入が含まれる。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、または相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。
　当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
　本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
　本発明は、変異糸状菌及びその製造方法、ならびに当該変異糸状菌を用いたタンパク質の製造方法を提供することに関する。本発明は、糸状菌のタンパク質生産性を向上させることに関する。従来、糸状菌をグルコース存在下で培養すると、カタボライト抑制によりタンパク質生産が抑制されることがあった。特に、糸状菌におけるセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のセルラーゼ系バイオマス分解酵素の発現は、セルロース、ソホロース、セロオリゴ糖（セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオース等）などのセルラーゼ誘導性物質により誘導される必要があり、一方、グルコース存在下では発現誘導が抑制される。
　本発明者らは、ＸＹＲ１とＡＣＥ３発現とを組み合わせて改変した変異糸状菌が、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの生産に従来必須であった誘導物質を用いることなく、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のタンパク質を高生産することを見出した。本発明では、糸状菌に対して、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子であるＸＹＲ１及びＡＣＥ３にそれぞれ所定の改変を加えることで、該糸状菌にセルロース等のセルラーゼ誘導性物質なしでセルラーゼ及びヘミセルラーゼを発現させる能力を与え、かつ該糸状菌がグルコース等のセルラーゼ非誘導性炭素源の存在下でセルラーゼ及びヘミセルラーゼ等のタンパク質を高発現することを可能にする。ＸＹＲ１とＡＣＥ３発現とを組み合わせて改変することにより、いずれか一方のみを改変した場合と比べて、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの発現能は顕著に向上する。該ＸＹＲ１とＡＣＥ３発現の改変は、カタボライト抑制の緩和、あるいはセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写促進に寄与しているものと考えられる。
　本発明により提供される糸状菌は、グルコース等のセルラーゼ非誘導性炭素源を主要な炭素源とする環境下でも効率よくタンパク質を生産することができる。また当該糸状菌は、高価なセルラーゼ誘導性物質を使用しなくとも、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のタンパク質を効率的に生産することができる。本発明によれば、糸状菌を用いたタンパク質生産の効率化及びコスト低下が可能である。
　したがって、一態様において本発明は、変異糸状菌、及びその製造方法を提供する。基本的には、本発明の変異糸状菌の製造方法は、親糸状菌におけるＸＹＲ１とＡＣＥ３発現とを改変することを含む。該方法において、ＸＹＲ１とＡＣＥ３発現とを改変する順序は、各々の改変が達成される限り、限定されない。
　本発明で用いられる親糸状菌の例としては、限定ではないが、真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）に属する糸状菌が挙げられる。より詳細な例としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属等の糸状菌が挙げられる。このうち、トリコデルマ属の糸状菌が好ましい。
　該トリコデルマ属の糸状菌の例としては、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハリジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）等が挙げられ、好ましくはトリコデルマ・リーセイ及びその変異株が挙げられる。例えば、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４株及びその変異株、好ましくは、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、トリコデルマ・リーセイＰＣＤ－１０株（ＦＥＲＭ　Ｐ－８１７２）、トリコデルマ・リーセイＪＮ１３株、又はそれらの変異株などを、親糸状菌として好ましく用いることができる。
　ＸＹＲ１（Ｘｙｌａｎａｓｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　１）は、糸状菌におけるセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子である。ＸＹＲ１は、Ｚｎ（II）2Ｃｙｓ6　ｂｉｎｕｃｌｅａｒ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｄｏｍａｉｎを持つキシラナーゼ遺伝子発現制御の主要因子で、トリコデルマ属（ＸＹＲ１）、フサリウム属（ＸＹＲ１）、ニューロスポラ属（ＸＹＲ１）、アルペルギルス属（ＸＬＮＲ）などの酵母を除く子嚢菌に広く保存されている。トリコデルマ・リーセイのＸＹＲ１は、キシラナーゼ・キシロース代謝遺伝子、セルラーゼ遺伝子の全てを統御する。トリコデルマ・リーセイのＸＹＲ１は、ｎｃｂｉデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／］）において、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＸＰ＿００６９６６０９２．１として登録されている。
　従来、ＸＹＲ１の遺伝子配列には、糸状菌特異的転写因子ドメイン（fungal-specific transcription factor domain）のコード領域の上流（配列番号２の１０２４～１０８３番ヌクレオチド領域）に２０アミノ酸領域分のイントロンが存在すると考えられており、ＸＹＲ１の全長は９２０アミノ酸であると考えられていた。上記のｎｃｂｉデータベース（非特許文献６）でも、ＸＰ＿００６９６６０９２．１のＸＹＲ１は、９２０アミノ酸長のアミノ酸配列（配列番号５１）からなり、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドとして規定されている。一方、配列番号２の該１０２４～１０８３番ヌクレオチド領域はイントロンではなくアミノ酸に翻訳されているという報告が従来からなされていた。最近では、後者がＸＹＲ１の正しい構造であると考えられている（例えば非特許文献５及び７）。その場合、ＸＹＲ１は、配列番号２の該１０２４～１０８３番ヌクレオチド領域にコードされる３２０～３３９アミノ酸領域を有し、全長は９４０アミノ酸である。
　上記の事情を考慮して、特に説明しない場合、本明細書で開示されるＸＹＲ１のアミノ酸配列は、９４０アミノ酸長の配列番号１で表され、ＸＹＲ１のアミノ酸残基の番号（アミノ酸配列上の位置）は、配列番号１の配列における残基の番号（位置）で表される。また上記の事情を考慮して、本明細書においては、配列番号１における３４０位以降のアミノ酸残基は、配列番号５１における［配列番号１における位置－２０］位のアミノ酸残基と解釈されるべきである。例えば、配列番号１における８１０～８３３位は、配列番号５１における７９０～８１３位であり、つまり、配列番号１における８１０位は配列番号５１における７９０位であり、配列番号１における８３３位は配列番号５１における８１３位であり、配列番号１における８２１位及び８２４位は、それぞれ配列番号５１における８０１位及び８０４位であり、その他の位置についても同様である。
　したがって、本発明で改変させるＸＹＲ１（親ＸＹＲ１）の例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。該親ＸＹＲ１の別の例としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドが挙げられる。該配列番号１と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列の一例としては、配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明による該ＸＹＲ１の改変は、親ＸＹＲ１のＡｃｉｄｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ中のα－ヘリックスと推定される領域に少なくとも１つのアミノ酸残基の変異を加えることである。より詳細には該ＸＹＲ１の改変は、親ＸＹＲ１である、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドに対する、配列番号１の７７１～８６５位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の変異（すなわち置換、欠失、挿入又は付加）によって行われる。好ましい実施形態において、該変異を施される少なくとも１つのアミノ酸残基は、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域に位置する。
　好ましい実施形態において、前述した少なくとも１つのアミノ酸残基は置換される。該置換されるアミノ酸残基は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、及びＧｌｕからなる群より選択される少なくとも１つであり、より好ましくは、下記（1）及び（2）：（1）Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕ、（2）Ａｌａ又はＧｌｙ、からなる群より選択される少なくとも１つであるか、あるいは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、及びＧｌｕからなる群より選択される少なくとも１つであり、さらに好ましくは、Ｖａｌ及びＡｌａからなる群より選択される少なくとも１つである。好ましくは、これらのアミノ酸残基はそれぞれ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒに置換される。
　該Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、及びＧｌｕの置換の好ましい例としては、以下が挙げられる：
　ＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＬｅｕのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＧｌｙのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＴｈｒのＴｙｒへの置換；及び
　ＧｌｕのＴｙｒへの置換。
　より好ましい実施形態において、該アミノ酸残基の置換は、以下からなる群より選択される少なくとも１つである：
　配列番号１の８１２位に相当する位置におけるＧｌｙのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８１４位に相当する位置におけるＶａｌのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８１６位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｈｒのＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２０位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２１位に相当する位置におけるＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２３位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２４位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＧｌｕのＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２７位に相当する位置におけるＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８３０位に相当する位置におけるＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；及び、
　配列番号１の８３１位に相当する位置におけるＬｅｕのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換。
　さらに好ましい実施形態において、本発明によるＸＹＲ１の改変は、親ＸＹＲ１に対する、配列番号１の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位及び８２６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の置換によって行われる。該８１７位、８２１位、８２４位、８２５位及び８２６位に相当する位置に置換されるアミノ酸残基は、それぞれ前述のとおりである。
　別のさらに好ましい実施形態において、本発明によるＸＹＲ１の改変は、親ＸＹＲ１に対する、配列番号１の８２１位及び８２４位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の置換によって行われる。該８２１位に相当する位置に置換されるアミノ酸残基は、好ましくはＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、より好ましくはＰｈｅであり、さらに好ましくはＬｙｓ又はＴｙｒである。該８２４位に相当する位置に置換されるアミノ酸残基は、好ましくはＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、より好ましくはＶａｌであり、さらに好ましくはＧｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒである。
　別のさらに好ましい実施形態において、本発明によるＸＹＲ１の改変は、親ＸＹＲ１に対する、配列番号１の８１７位、８２５位及び８２６位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の置換によって行われる。該８１７位に相当する位置に置換されるアミノ酸残基は、好ましくはＴｙｒである。該８２５位に相当する位置に置換されるアミノ酸残基は、好ましくはＴｙｒである。該８２６位に相当する位置に置換されるアミノ酸残基は、好ましくはＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり、より好ましくはＶａｌ又はＴｒｐである。
　一例において、親ＸＹＲ１における、配列番号１の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位、及び８２６位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれ前述した置換後のアミノ酸残基ではない。好ましくは、親ＸＹＲ１における配列番号１の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位、及び８２６位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号１の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位、及び８２６位のアミノ酸残基と同じである。
　別の一例において、親ＸＹＲ１における、配列番号１の８１２位、８１４位、８１６位、８１７位、８２０位、８２１位、８２３位、８２４位、８２５位、８２６位、８２７位、８３０位、及び８３１位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれ前述した置換後のアミノ酸残基ではない。好ましくは、親ＸＹＲ１における配列番号１の８１２位、８１４位、８１６位、８１７位、８２０位、８２１位、８２３位、８２４位、８２５位、８２６位、８２７位、８３０位、及び８３１位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれ、配列番号１の８１２位、８１４位、８１６位、８１７位、８２０位、８２１位、８２３位、８２４位、８２５位、８２６位、８２７位、８３０位、及び８３１位のアミノ酸残基と同じである。
　別の一例において、親ＸＹＲ１における配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域のアミノ酸配列は、配列番号１の８１０～８３３位と同じである。
　親糸状菌のポリペプチドのアミノ酸残基を変異（置換、欠失、挿入又は付加）する手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親糸状菌のゲノムにおいて、変異すべきアミノ酸配列（親ＸＹＲ１）をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）を、変異したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、変異遺伝子ともいう）に変更し、該変異遺伝子から目的の変異を有するポリペプチド（改変ＸＹＲ１）を発現させることができる。
　親遺伝子への目的の変異を導入する方法としては、例えば、相同組換えを利用した方法を挙げることができる。例えば、親糸状菌のゲノムにおける親遺伝子を、相同組換えによって、変異遺伝子と置き換えることができる。相同組換えの具体的な方法の例では、まず、変異遺伝子、及び必要に応じて薬剤耐性遺伝子又は栄養要求遺伝子を含む相同組換え用ＤＮＡコンストラクトを構築し、これを常法により親糸状菌に導入する。次いで、薬剤耐性又は栄養要求性などを指標にして、ゲノム上に該相同組換え用コンストラクトが組込まれた形質転換株を選択する。必要に応じて、ゲノム解析や酵素活性解析により、得られた形質転換株が目的の変異を有することを確認してもよい。
　相同組換え用ＤＮＡコンストラクトは、単離した親遺伝子に部位特異的変異を導入することで構築することができる。部位特異的変異導入は、例えば、インバースＰＣＲ法、アニーリング法、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）などの当該分野における常法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
　ＤＮＡコンストラクトの親糸状菌への導入には、プラスミド等の形質転換に一般的に使用されるベクターを用いることができる。細胞へのＤＮＡコンストラクトやベクターの導入は、例えばプロトプラスト法、プロトプラストＰＥＧ法、コンピテントセル法などの通常の手法を用いることができる。
　親遺伝子は、親糸状菌と同種の糸状菌株等から常法により単離することができる。あるいは、親遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて化学合成してもよい。必要に応じて、親遺伝子は、それを導入する宿主（親糸状菌）にあわせてコドン至適化されてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ　Ｕｓａｇｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ（［ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／］）から入手可能である。
　該親遺伝子は、前述した親ＸＹＲ１、すなわち配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなりかつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドであればよい。そのようなポリヌクレオチドの例としては、配列番号２のヌクレオチド配列、又はこれと少なくとも９０％配列同一なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
　親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードする配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードする配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードする配列（コドン）を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードする配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、２組のプライマーを用いてそれぞれ増幅した、導入すべきヌクレオチド変異を含む目的領域の上流側及び下流側のＤＮＡ断片を、ＳＯＥ－ＰＣＲにより１つに連結することで行うことができる。変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。
　あるいは、親糸状菌を突然変異処理に付し、次いでゲノム解析や酵素活性解析により、目的の変異を有する菌株を選択することができる。突然変異処理としては、具体的には、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルニトロソウレア、紫外線や放射線の照射などが挙げられる。また、種々のアルキル化剤や発癌物質も変異原として用いることができる。
　本発明によるＡＣＥ３発現の改変とは、ＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの発現を強化することである。ＡＣＥ３は、糸状菌におけるセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子である。ＡＣＥ３は、ラクトース誘導時のセルラーゼ遺伝子、及び一部のキシラナーゼ遺伝子の転写に必須である。またＡＣＥ３は、ｘｙｒ１の転写制御にも部分的に関与する。トリコデルマ・リーセイのＡＣＥ３は、ｎｃｂｉデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／］）において、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＱＥＭ２４９１３．１として登録されており、ここでＡＣＥ３は、配列番号３のアミノ酸配列からなり、配列番号４のヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドとして規定されている。非特許文献６によれば、配列番号３のアミノ酸配列のうち、５２３～７３４位はＸＹＲ１と相互作用すると推定されている領域であり、３９１～５２２位は糸状菌特異的転写因子ドメインと推定されている領域であり、１２０～１６０位はＺｎ（II）2Ｃｙｓ6型ＤＮＡ結合ドメインと推定されている領域である。
　したがって、本発明で発現強化されるＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの例としては、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又はその部分ポリペプチドが挙げられる。ＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの別の例としては、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチド、又はその部分ポリペプチドが挙げられる。該配列番号３と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列の一例としては、配列番号３のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明においては、該ＡＣＥ３の全長ポリペプチドの発現を強化してもよいが、その部分ポリペプチド、好ましくは、配列番号３の１０７～７３４位に相当する領域を少なくとも含むポリペプチドの発現を強化すればよい。したがって、本発明で発現強化される該ＡＣＥ３の例としては、配列番号３の１～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられ、ＡＣＥ３の部分ポリペプチドの例としては、配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
　好ましくは、本発明で発現強化されるＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドは、野生型ＡＣＥ３のＣ末端から７～１０個目のアミノ酸残基（配列番号３の７２５～７２８位に相当する領域のアミノ酸残基）を全て保持している。より好ましくは、本発明で発現強化されるＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドは、野生型ＡＣＥ３のＣ末端から７～１７個目のアミノ酸残基（配列番号３の７１８～７２８位に相当する領域のアミノ酸残基）を全て保持している。あるいは、好ましくは本発明で発現強化されるＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドは、野生型ＡＣＥ３のＣ末端の１１アミノ酸（配列番号３の７２４～７３４位）に相当する領域を保持している。ただし、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子としての機能を維持できる限り、該ＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドにおける配列番号３の７２４～７３４位に相当する領域における一部のアミノ酸残基の変異（例えば、配列番号３の７２９～７３４位における１つ以上の残基の置換、欠失、挿入又は付加）は許容される。
　好ましくは、本発明におけるＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの発現強化とは、該ＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの発現量が向上することをいう。目的ポリペプチドの発現量を増加させる手段としては、該ポリペプチドをコードする遺伝子（以下、目的遺伝子ともいう）の転写量を向上させる手段が挙げられる。目的遺伝子の転写量を向上させる手段としては、例えば、親糸状菌のゲノム上の目的遺伝子の制御領域に、該遺伝子の転写を強く促進する制御領域（強制御領域）を置換又は挿入して、該強制御領域を目的遺伝子と作動可能に連結させることが挙げられる。あるいは、必要に応じて制御領域（好ましくは強制御領域）と作動可能に連結された、該目的遺伝子断片を、親糸状菌のゲノムもしくはプラスミド中に導入して細胞内で発現可能な目的遺伝子の数を増加させることで、目的遺伝子の転写量を向上させることができる。
　該転写量の向上のために用いることができる制御領域の例としては、高グルコース条件下においても転写量が低下しない遺伝子、例えばトリコデルマ属糸状菌については、ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（gpd）、ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（pdc）、ｅｎｏｌａｓｅ（eno）、ａｌｃｏｈｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（adh）、ｔｒｉｏｓｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（tpi）、ａｌｄｏｌａｓｅ（fba）、ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ（pyk）、ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（cit）、α－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（kdh）、ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　Ｉ（ald1）、ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ＩＩ（ald2）、ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（pda）、ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ（glk）、ａｃｔｉｎ（act1）、ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１α（tef1）、などの遺伝子の制御領域が挙げられる。このうち、好ましい高制御領域の例としては、pdc（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿１２１５３４）、act1（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿４４５０４）などの制御領域が挙げられる。
　目的遺伝子は、親糸状菌と同種の糸状菌株等から常法により単離することができる。あるいは、親糸状菌の遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて化学合成してもよい。該目的遺伝子の好ましい例としては、配列番号４のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、配列番号４と少なくとも９０％配列同一なヌクレオチド配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの部分ポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４と少なくとも９０％配列同一なヌクレオチド配列の一例としては、配列番号４の配列において１又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。該部分ポリヌクレオチドの好ましい例としては、上述したＡＣＥ３の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明の変異株におけるＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの発現量は、親糸状菌と比較して向上している。あるいは、本発明の変異株におけるＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドをコードする遺伝子の転写量は、親糸状菌と比較して向上している。遺伝子又はポリペプチドの発現量は、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ等の公知の手段により定量することができる。
　以上の手順で製造された本発明の変異糸状菌は、上述したＸＹＲ１の改変によって得られた改変ＸＹＲ１を含み、かつ上述のように、親糸状菌と比べてＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの発現が強化されている。
　本発明の変異糸状菌において発現強化されている該ＡＣＥ３又はその部分ポリペプチドの例は、前述したとおりである。好ましくは、本発明の変異糸状菌は、制御領域（好ましくは強制御領域）と作動可能に連結されたＡＣＥ３の部分ポリペプチド（好ましくは配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチド）をコードする遺伝子を導入されており、それによって、該ＡＣＥ３の部分ポリペプチドの発現が強化されている。
　好ましくは、本発明の変異糸状菌に含まれる該改変ＸＹＲ１は、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列に対して、配列番号１の７７１～８６５位に相当する領域、好ましくは８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである。
　より好ましくは、本発明の変異糸状菌に含まれる該改変ＸＹＲ１は、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列に対して、配列番号１の７７１～８６５位に相当する領域、好ましくは８１０～８３３位に相当する領域における、以下からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換：
　ＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＬｅｕのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＡｌａのＧｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＧｌｙのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＴｈｒのＴｙｒへの置換；及び
　ＧｌｕのＴｙｒへの置換、
がなされたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである。
　さらに好ましくは、該改変ＸＹＲ１は、配列番号１と少なくとも９０％配列同一であって、かつ以下の（ａ）～（ｍ）：
（ａ）配列番号１の８１２位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｂ）配列番号１の８１４位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｃ）配列番号１の８１６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｄ）配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｙｒ；
（ｅ）配列番号１の８２０位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｆ）配列番号１の８２１位に相当する位置におけるＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｇ）配列番号１の８２３位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｈ）配列番号１の８２４位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｉ）配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＧｌｕのＴｙｒへの置換；
（ｊ）配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｋ）配列番号１の８２７位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｌ）配列番号１の８３０位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；及び、
（ｍ）配列番号１の８３１位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである。
　さらに好ましくは、該改変ＸＹＲ１は、該（ａ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｊ）のいずれか１つ以上を有するか、及び／又は該（ｂ）、（ｆ）、（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）のいずれか１つ以上を有する。さらに好ましくは、該改変ＸＹＲ１は、該（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｊ）のいずれか１つ以上を有するか、及び／又は該（ｂ）、（ｆ）のいずれか１つ以上を有する。
　さらに好ましい実施形態において、該改変ＸＹＲ１は、配列番号１と少なくとも９０％配列同一であって、かつ該（ｄ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）及び（ｊ）のいずれか１つ以上を有するアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである。
　別のさらに好ましい実施形態において、該改変ＸＹＲ１は、配列番号１と少なくとも９０％配列同一であって、かつ以下：
　配列番号１の８２１位に相当する位置におけるＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＰｈｅ、より好ましくはＬｙｓ又はＴｙｒ；及び、
　配列番号１の８２４位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＶａｌ、より好ましくはＧｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである。
　別のさらに好ましい実施形態において、該改変ＸＹＲ１は、配列番号１と少なくとも９０％配列同一であって、かつ以下：
　配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｙｒ；
　配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＴｙｒ；及び、
　配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＶａｌ又はＴｒｐ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである。
　本発明の変異糸状菌は、セルロース、ソホロース及びセロオリゴ糖などのセルラーゼ誘導性物質の非存在下であっても、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ等のセルラーゼ系バイオマス分解酵素を発現することができる。さらに、該変異糸状菌は、グルコース等のセルラーゼ非誘導性炭素源を主要な炭素源とする環境下でも、例えばセルラーゼ誘導性物質の非存在下でさえ、効率よくタンパク質を生産することができる。
　したがって、さらなる一態様において、本発明は、上述した本発明の変異糸状菌を用いたタンパク質の製造方法を提供する。本発明によるタンパク質の製造方法においては、本発明の変異糸状菌を培養する。培養により、培養物中に目的のタンパク質が生成、及び蓄積される。該培養物から目的タンパク質を分離することにより、目的タンパク質を製造することができる。
　製造される目的タンパク質の例としては、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ系バイオマス分解酵素、エキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、マンナーゼ、アラビナーゼ、ガラクターゼ、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。該目的タンパク質は、１種類のタンパク質であっても、複数種のタンパク質の混合物であってもよい。好ましくは、該目的タンパク質は、セルラーゼ系バイオマス分解酵素であり、より好ましくはセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼであり、さらに好ましくはセルラーゼ及びヘミセルラーゼである。該ヘミセルラーゼの例としては、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、α－アラビノフラノシダーゼなどが挙げられ、このうちキシラナーゼが好ましい。
　あるいは、該目的タンパク質は、糸状菌が本来生産しない異種タンパク質であってもよい。この場合は、本発明の変異糸状菌に対して、異種タンパク質をコードする遺伝子を挿入することで組換え糸状菌を作製し、この組換え糸状菌を培養することで異種タンパク質を含むタンパク質を得ることができる。さらに、該異種タンパク質をコードする遺伝子を糸状菌で機能する分泌シグナルペプチドと作動可能に連結させることによって、該異種タンパク質を培養物中に分泌生産させることができる。
　当該タンパク質製造に使用される培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど、通常の糸状菌の増殖及びタンパク質生産に必要な成分を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
　炭素源としては、当該変異糸状菌が資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、フラクトース等の糖質、ソルビトールのような糖アルコール、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを挙げることができる。これらは単独で、又は複数を組み合わせて使用することができる。
　好ましくは、本発明によるタンパク質の製造方法では、セルラーゼ非誘導性炭素源を主要な炭素源とする環境下で該変異糸状菌を培養する。セルラーゼ非誘導性炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、マルトース、グリセロールなどが挙げられる。このうち、コストの点でグルコースが好ましい。製造する目的タンパク質がセルラーゼ系バイオマス分解酵素である場合、本方法での培養は、セルロース、ソホロース及びセロオリゴ糖などのセルラーゼ誘導性物質の存在下で行ってもよいが、該誘導性物質の非存在下でも該目的タンパク質の高生産が可能であり、該誘導性物質の使用又は不使用の場合に限定されない。また本発明においては、カタボライト抑制をより低減しつつ、効率よくセルラーゼ系バイオマス分解酵素などのタンパク質を生産するため、グルコースなどの非誘導性炭素源を流加しながら該変異糸状菌を培養してもよい。このとき、該セルラーゼ非誘導性炭素源、例えばグルコースを、窒素源であるアンモニア水、又はアンモニウム塩を含有する水溶液に溶解させ、該溶解液を流加して培養することが、培養効率や培養中の泡立ちを抑制できる点から好ましい。
　窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。
　無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。
　ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の糸状菌が生育に要求する物質を添加することができる。
　培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、且つ好ましくは５０℃以下、より好ましくは４２℃以下、より好ましくは３５℃以下である。また、好ましくは１０～５０℃、より好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３５℃である。培養時のｐＨは３～９、好ましくは４～５である。培養時間は、１０時間～１０日間、好ましくは２～７日間である。
　培養後、得られた培養物から、常法により目的タンパク質を分離する。例えば、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、ろ過、遠心分離、限外ろ過、塩析、透析、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、該培養物から目的タンパク質を分離することができる。目的タンパク質の分離の程度は特に限定されない。例えば、培養上清やその粗分離精製物を、目的タンパク質を含む組成物として取得することができる。
　本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕変異糸状菌の製造方法であって、
　親糸状菌におけるＸＹＲ１及びＡＣＥ３発現を改変することを含み、
　該ＸＹＲ１の改変が、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドに対する、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加であり、
　該ＡＣＥ３発現の改変が、配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドの発現強化である、
方法。
〔２〕前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、
　好ましくはＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、及びＧｌｕからなる群より選択される少なくとも１つであり、
　より好ましくは下記（1）及び（2）：（1）Ｖａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕ、（2）Ａｌａ又はＧｌｙ、からなる群より選択される少なくとも１つであるか、あるいは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、及びＧｌｕからなる群より選択される少なくとも１つであり、
　さらに好ましくはＶａｌ及びＡｌａからなる群より選択される少なくとも１つであり、
かつ、好ましくは、該少なくとも１つのアミノ酸残基が置換される、
〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、配列番号１の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位及び８２６位に相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つである、〔２〕記載の方法。
〔４〕好ましくは、前記少なくとも１つのアミノ酸残基がそれぞれ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒに置換される、〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換が、
　好ましくは、以下：
　　ＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　　ＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　　ＬｅｕのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　　ＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　　ＧｌｙのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＴｈｒのＴｙｒへの置換；及び
　ＧｌｕのＴｙｒへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つであり、
　より好ましくは、以下：
　配列番号１の８１２位に相当する位置におけるＧｌｙのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８１４位に相当する位置におけるＶａｌのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８１６位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｈｒのＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２０位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２１位に相当する位置におけるＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２３位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２４位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＧｌｕのＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２７位に相当する位置におけるＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８３０位に相当する位置におけるＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；及び、
　配列番号１の８３１位に相当する位置におけるＬｅｕのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つである、
〔２〕～〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換が、
　好ましくは、以下：
　配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｈｒのＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２１位に相当する位置におけるＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２４位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＧｌｕのＴｙｒへの置換；及び、
　配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つである、
〔５〕記載の方法。
〔７〕配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列が、
　好ましくは、配列番号３の７２５～７２８位に相当する領域のアミノ酸残基を全て保持しており、より好ましくは、配列番号３の７１８～７２８位に相当する領域のアミノ酸残基を全て保持しており、
あるいは、
　好ましくは、配列番号３の７２４～７３４位に相当する領域を保持しており、ただし該領域における一部のアミノ酸残基は変異していてもよい、
〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記ポリペプチドの発現強化が、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写量を向上させることにより行われる、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕好ましくは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写量の向上が、制御領域と作動可能に連結された該ポリペプチドをコードする遺伝子を、親糸状菌に導入することにより行われる、〔８〕記載の方法。
〔１０〕前記ＸＹＲ１がＸＰ＿００６９６６０９２．１として登録されている配列番号５１のアミノ酸配列からなるポリペプチドであるか、又は配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなりかつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである場合、
　前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換は、好ましくは、以下：
　　配列番号５１の７９７位に相当する位置におけるＴｈｒのＴｙｒへの置換；
　　配列番号５１の８０１位に相当する位置におけるＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号５１の８０４位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　配列番号５１の８０５位に相当する位置におけるＧｌｕのＴｙｒへの置換；及び、
　配列番号５１の８０６位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換、
からなる群より選択される少なくとも１つである、
〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記変異糸状菌が、
　好ましくは、親糸状菌と比べてカタボライト抑制が緩和されており、
　より好ましくは、セルラーゼ誘導性物質の非存在下でセルラーゼを発現する、
〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕好ましくは、前記糸状菌がトリコデルマ属菌である、〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
〔１３〕好ましくは、前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイ又はその変異株である、〔１２〕記載の方法。
〔１４〕前記〔１〕～〔１３〕のいずれか１項記載の方法で製造された糸状菌を培養することを含む、タンパク質の製造方法。
〔１５〕好ましくは、前記タンパク質がセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼである、〔１４〕記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記培養がグルコース存在下で行われる、〔１４〕又は〔１５〕記載の方法。
〔１７〕変異糸状菌であって、改変ＸＹＲ１を含み、かつ親糸状菌と比べてＡＣＥ３の部分ポリペプチドの発現が強化されており、
　該改変ＸＹＲ１は、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列に対して、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドであり、
　該ＡＣＥ３の部分ポリペプチドが、配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである、
変異糸状菌。
〔１８〕好ましくは、配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列が、
　好ましくは、配列番号３の７２５～７２８位に相当する領域のアミノ酸残基を全て保持しており、より好ましくは、配列番号３の７１８～７２８位に相当する領域のアミノ酸残基を全て保持しており、
あるいは、
　好ましくは、配列番号３の７２４～７３４位に相当する領域を保持しており、ただし該領域における一部のアミノ酸残基は変異していてもよい、〔１７〕記載の変異糸状菌。
〔１９〕好ましくは、該改変ＸＹＲ１が、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列に対して、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域における、以下からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換：
　ＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＩｌｅのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＬｅｕのＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；及び、
　ＧｌｙのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
　ＴｈｒのＴｙｒへの置換；及び
　ＧｌｕのＴｙｒへの置換、
がなされたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである、
〔１７〕又は〔１８〕記載の変異糸状菌。
〔２０〕好ましくは、該改変ＸＹＲ１が、配列番号１と少なくとも９０％配列同一であって、かつ以下の（ａ）～（ｍ）：
（ａ）配列番号１の８１２位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｂ）配列番号１の８１４位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｃ）配列番号１の８１６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｄ）配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｙｒ；
（ｅ）配列番号１の８２０位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｆ）配列番号１の８２１位に相当する位置におけるＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｇ）配列番号１の８２３位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｈ）配列番号１の８２４位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｉ）配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＧｌｕのＴｙｒへの置換；
（ｊ）配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｋ）配列番号１の８２７位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；
（ｌ）配列番号１の８３０位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ；及び、
（ｍ）配列番号１の８３１位に相当する位置におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである、
〔１９〕記載の変異糸状菌。
〔２１〕好ましくは、該改変ＸＹＲ１が、配列番号１と少なくとも９０％配列同一であって、かつ以下：
　配列番号１の８２１位に相当する位置におけるＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＰｈｅ、より好ましくはＬｙｓ又はＴｙｒ；及び、
　配列番号１の８２４位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＶａｌ、より好ましくはＧｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである、
〔２０〕記載の変異糸状菌。
〔２２〕好ましくは、該改変ＸＹＲ１が、配列番号１と少なくとも９０％配列同一であって、かつ以下：
　配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｙｒ；
　配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＴｙｒ；及び、
　配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ、好ましくはＶａｌ又はＴｒｐ、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドである、
〔２０〕又は〔２１〕記載の変異糸状菌。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１　遺伝子導入用プラスミドＤＮＡの構築
　トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにて、以下のＤＮＡ断片１～５を調製した。断片１：act1遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿４４５０４）の上流約１．５ｋｂｐのプロモーター領域、断片２：xyr1遺伝子（配列番号２、約３．０ｋｂｐ）、断片３：ＡＣＥ３の部分ポリペプチド（配列番号３の１０７～７３４位）をコードするポリヌクレオチド（配列番号４の８８１～２９１８番ヌクレオチド領域、約２．０ｋｂｐ）、断片４：cbh1遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿４４５０４）の下流約０．６ｋｂｐのターミネーター領域、断片５：pyr4遺伝子（ＴＲＩＲＥＤＲＡＦＴ＿７４０２０）の約２．７ｋｂｐ領域。
　断片１と２を結合してカセット１：Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１を構築した。断片１と３を結合してカセット２：Ｐａｃｔ１－ＡＣＥ３を構築した。断片５の上流及び下流に、それぞれ約０．５ｋｂｐの断片６と、約１．０ｋｂｐの断片７をポップアウト用の相同配列として配置した形質転換マーカー断片を調製した。断片４と該形質転換マーカー断片とを結合して、カセット３：Ｔｃｂｈ１－ｐｙｒ４を構築した。ＤＮＡ断片の結合はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って実施した。構築したカセット及びそれに含まれるＤＮＡ断片、ならびにカセットの構築に用いたプライマーを表１に示す。
　カセット１と３を結合し、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点に挿入して、xyr1恒常発現プラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１を構築した。またカセット２と３を結合、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点に挿入して、ace3恒常発現プラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＡＣＥ３を構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１を鋳型とする表２のプライマーを用いたＰＣＲにより、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）及びｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）をそれぞれ構築した。ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）は、配列番号２のアミノ酸配列に対してＶ８２１Ｆのアミノ酸置換がなされた変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）をコードするプラスミドである。ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）は、配列番号２のアミノ酸配列に対してＡ８２４Ｖのアミノ酸置換がなされた変異ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）をコードするプラスミドである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　構築したプラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＡＣＥ３、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）、及びｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）を複製した。コンピテントセルＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ）にプラスミドを導入し、アンピシリン添加ＬＢ培地で培養し（３７℃、１日間）、培養後の菌体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎTMＰｌａｓｍｉｄ（マッハライ・ナーゲル）を用いてプラスミドを回収及び精製した。
実施例２　糸状菌変異株の作製
　トリコデルマ・リーセイＪＮ１３Δｐｙｒ４株は実施例１で構築したプラスミドを導入して形質転換した。プラスミド導入はプロトプラストＰＥＧ法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，１０９（１）：９２－９９）により行った。形質転換体は、ｐｙｒ４遺伝子をマーカーとして、選択培地（２％グルコース、１．１Ｍソルビトール、２％アガー、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．５）、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＣｓＣｌ2、０．０６％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１％ Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ１；％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ１の組成は以下のとおりである：０．５ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ2、０．１６ｇ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。得られた形質転換体の中から、目的の遺伝子断片が挿入されていることをＰＣＲにより確認し、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＡＣＥ３が導入されたＪＮ１３＿ＡＣＥ３株、及びｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）が導入されたＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）株を得た。ＪＮ１３＿ＡＣＥ３株は、ace3恒常発現プラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＡＣＥ３によりＡＣＥ３を高発現する。ＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）株は、変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）を発現する。
　形質転換株に対し再度形質転換を行うため、０．２％の５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）一水和物が含まれるＰＤＡ培地を用いて再度５－ＦＯＡ耐性を獲得し生育する株を選抜した。すなわち、ＪＮ１３＿ＡＣＥ３株の胞子を５－ＦＯＡ含有培地に塗布し、生育株をＪＮ１３＿ＡＣＥ３Δｐｙｒ４株として取得した。取得された株に対し、上記ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）又はｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）を形質転換することで、ＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）＋ＡＣＥ３株、及びＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）＋ＡＣＥ３株を得た。これらの株は、ＡＣＥ３を高発現し、変異ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ又はＡ８２４Ｖ）を発現する。
実施例３　糸状菌変異株の培養
　実施例２で得た糸状菌株を培養してタンパク質を生産させた。前培養では、５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、実施例２で作製した株の胞子を１×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて振とう培養した（プリス社製ＰＲＸＹｇ－９８Ｒ）。培地組成は以下の通りである。１％グルコース、０．１４％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ハイポリペプトンＮ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ　８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ２、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ２の組成は以下の通りである。６ｍｇ Ｈ3ＢＯ3、２６ｍｇ （ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ２Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ2を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。
　２日間の前培養後、本培養を行った。５００ｍＬのフラスコに培地を５０ｍＬ仕込み、前培養液を１％（ｖ／ｖ％）植菌し、２８℃、２２０ｒｐｍにて４日間培養した。培地組成は以下の通りである。３％セルロース又は３％グルコース、０．１４％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ハイポリペプトンＮ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ　Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ　８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ２、１．２８％クエン酸水素二アンモニウム、５０ｍＭ酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）（％はいずれもｗ／ｖ％）。
実施例４　タンパク質濃度測定
　実施例３の培養物のタンパク質濃度をｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。ｂｒａｄｆｏｒｄ法では、Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用し、ウシγグロブリンを標準タンパク質として作成した検量線をもとにタンパク質量を計算した。グルコースのみを炭素源に用いた培養（グルコース培養）でのＪＮ１３株（親株）のタンパク質生産性を１としたときの、各株の相対タンパク質生産性を図１に示す。セルロース存在下での培養と比べて、グルコース培養での親株ＪＮ１３のタンパク質生産性は大幅に低下した。これはグルコースのみを炭素源に用いた場合には誘導物質が存在せず、セルラーゼ群及びキシラナーゼ群の発現が転写活性化誘導されないためと推定される。ＸＹＲ１とＡＣＥ３の両方を改変したＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）＋ＡＣＥ３株及びＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）＋ＡＣＥ３株では、親株と比べて、さらにはＸＹＲ１とＡＣＥ３の一方のみを改変したＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）株及びＡＣＥ３株と比べても、グルコース培養でのタンパク質生産性が顕著に向上した。
実施例５　タンパク質組成分析
　実施例３の培養物のタンパク質組成を分析した。分析には、Ｍｉｎｉ　ＰＲＯＴＥＡＮ　ＴＧＸ　Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ　Ｇｅｌｓ（Ａｎｙ　ＫＤ，１５ｗｅｌｌ，ＢＩＯＲＡＤ）を用いた。スタンダードとして、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ　ｓｔａｎｄａｒｓを用いた。適宜希釈した実施例３の培養物とＢｕｆｆｅｒを混合して９９℃で５分間処理したものをゲルにアプライし、２００Ｖ、３５分間電気泳動した。得られた画像ファイル（図２）から、解析ソフト（Ｉｍａｇｅ　Ｌａｂ）を用いてバンド強度比率を計算し、生産されたタンパク質の組成比を計算した。該組成比と実施例４で求めたタンパク質濃度から各タンパク質の生産量を求めた。次いで、ＸＹＲ１変異のみ（ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）株）でのタンパク質生産性を１として、各株での各タンパク質の相対生産性を算出した。
　各株で生産されたタンパク質について、組成比を表３、相対生産性を図３に示す。グルコース培養下で、ＪＮ１３株（親株）ではセルラーゼ及びキシラナーゼ（ＢＸＬ１、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２＋ＥＧ１、ＸＹＮ１＋ＸＹＮ２）はほとんど生産されなかった。ＸＹＲ１単独変異株（ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ））ではＸＹＮ１＋ＸＹＮ２などのキシラナーゼ（ＸＹＮ１＋ＸＹＮ２）が主に生産された。ＡＣＥ３高発現株（ＡＣＥ３）は、ＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１などのセルラーゼの比率が向上したが、ただし図１に示したように、タンパク質の総生産量はＸＹＲ１単独変異株と比べて少なく、親株と同程度であった。ＸＹＲ１変異とＡＣＥ３高発現を組み合わせた株（ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）＋ＡＣＥ３、及びＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）＋ＡＣＥ３）では、グルコース培養下でもセルラーゼ及びキシラナーゼが生産された。またＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）＋ＡＣＥ３、及びＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）＋ＡＣＥ３では、ＸＹＲ１単独変異株やＡＣＥ３高発現株と比べて、生産物の組成比がセルロース存在下での親株により近づき、かつ主要なセルラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１の生産性が大幅に向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例６　糸状菌変異株の作製
　実施例１と同様の手順で、ｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１を鋳型とする表４に示す配列番号２３及び２４のプライマーを用いたＰＣＲにより、Ｔ８１７Ｙのアミノ酸置換がなされた変異ＸＹＲ１を発現するプラスミドｐＵＣ－Ｐａｃｔ１－ＸＹＲ１（Ｔ８１７Ｙ）を構築した。同様の手順で、表４に示すプライマーを用いてＶ８２１Ｙ、Ｖ８２１Ｋ、Ａ８２４Ｉ、Ａ８２４Ｌ、Ａ８２４Ｆ、Ａ８２４Ｗ、Ａ８２４Ｙ、Ａ８２４Ｔ、Ａ８２４Ｋ、Ａ８２４Ｅ、Ｅ８２５Ｙ、Ａ８２６Ｖ、及びＡ８２６Ｗのアミノ酸置換がなされた変異ＸＹＲ１を発現するプラスミドをそれぞれ構築した。構築したプラスミドを、実施例２と同様の手法でＪＮ１３＿ＡＣＥ３Δｐｙｒ４株に対し形質転換することで、ＡＣＥ３及び上記変異ＸＹＲ１が導入された糸状菌変異株を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記で得られた変異株、ならびに、実施例２で作製したＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）＋ＡＣＥ３株、ＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）＋ＡＣＥ３株、ＸＹＲ１単独変異株（ＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ））、及びＡＣＥ３高発現株（ＪＮ１３＿ＡＣＥ３）を、実施例３に記載の方法に従ってグルコース培養し、次いで実施例４及び５に記載の方法に従って、培養物のタンパク質濃度測定及びタンパク質組成分析を実施した。
　各株で生産されたタンパク質について、組成比を表５、相対生産性を図４に示す。図４中、ＢＸＬ１はβ－キシロシダーゼＢＸＬ１、ＣＢＨ１はセルラーゼＣＢＨ１、ＣＢＨ２＋ＥＧ１はセルラーゼＣＢＨ２及びＥＧ１、ＸＹＮ１＋ＸＹＮ２はキシラナーゼＸＹＮ１及びＸＹＮ２、ｏｔｈｅｒｓはその他のタンパク質である。本実施例で作製した、ＡＣＥ３を高発現し変異ＸＹＲ１（Ｔ８１７Ｙ、Ｖ８２１Ｙ、Ｖ８２１Ｋ、Ａ８２４Ｉ、Ａ８２４Ｌ、Ａ８２４Ｆ、Ａ８２４Ｗ、Ａ８２４Ｙ、Ａ８２４Ｔ、Ａ８２４Ｋ、Ａ８２４Ｅ、Ｅ８２５Ｙ、Ａ８２６Ｖ及びＡ８２６Ｗ）を発現する糸状菌変異株はいずれも、実施例２で作製したＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ）＋ＡＣＥ３株及びＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ａ８２４Ｖ）＋ＡＣＥ３株と同様の組成でタンパク質を生産した。またこれらの糸状菌変異株はいずれも、ＸＹＲ１単独変異株（ＪＮ１３＿ＸＹＲ１（Ｖ８２１Ｆ））、及びＡＣＥ３高発現株（ＪＮ１３＿ＡＣＥ３）と比較して、グルコース培養下において主要なセルラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１の生産性が大幅に向上した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上のとおり、ＸＹＲ１変異とＡＣＥ３高発現を組み合わせることで、ＸＹＲ１単独変異と比較して、キシラナーゼだけでなく、主要なセルラーゼであるＣＢＨ１、ＣＢＨ２及びＥＧ１の生産性が大幅に向上した。ＸＹＲ１の有効変異はＶ８２１Ｆ及びＡ８２４Ｖに限定されず、ＸＹＲ１のＡｃｉｄｉｃ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ中のα－ヘリックスと推定される領域に少なくとも１つのアミノ酸の変異を加えた、ｇｌｕｃｏｓｅ　ｂｌｉｎｄ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（通常はカタボライト抑制を引き起こすグルコースを用いてもタンパク質生産性が向上する性質）を示す変異ＸＹＲ１が、誘導物質の非存在下でのセルラーゼ及びキシラナーゼ生産に有効であった。したがって、上記のＸＹＲ１変異とＡＣＥ３高発現との組み合わせにより、グルコースなどのセルラーゼ非誘導性炭素源を用いた場合においても、セルロースなどのセルラーゼ誘導性物質を用いた場合と同様にセルラーゼ／キシラナーゼ遺伝子のプロモーターを活性化させ、タンパク質生産を効率よく誘導することができることが示された。

Claims (13)

  1. 　変異糸状菌の製造方法であって、
    　親糸状菌におけるＸＹＲ１及びＡＣＥ３発現を改変することを含み、
    　該ＸＹＲ１の改変が、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドに対する、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加であり、
    　該ＡＣＥ３発現の改変が、配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドの発現強化である、
    方法。
  2. 　前記少なくとも１つのアミノ酸残基がＶａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＧｌｕからなる群より選択される少なくとも１つであり、かつ、該少なくとも１つのアミノ酸残基は置換される、請求項１記載の方法。
  3. 　前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、配列番号１の８１７位、８２１位、８２４位、８２５位及び８２６位に相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２記載の方法。
  4. 　前記少なくとも１つのアミノ酸残基がそれぞれ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒに置換される、請求項２又は３記載の方法。
  5. 　前記少なくとも１つのアミノ酸の置換が、以下：
    　配列番号１の８１７位に相当する位置におけるＴｈｒのＴｙｒへの置換；
    　配列番号１の８２１位に相当する位置のＶａｌのＬｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
    　配列番号１の８２４位に相当する位置のＡｌａのＶａｌ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換；
    　配列番号１の８２５位に相当する位置におけるＧｌｕのＴｙｒへの置換；及び、
    　配列番号１の８２６位に相当する位置におけるＡｌａのＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒへの置換、
    からなる群より選択される、請求項２～４のいずれか１項記載の方法。
  6. 　前記ポリペプチドの発現強化が、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写量を向上させることにより行われる、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記変異糸状菌がセルラーゼ誘導性物質の非存在下でセルラーゼを発現する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. 　前記糸状菌がトリコデルマ属菌である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　前記トリコデルマ属菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項８記載の方法。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項記載の方法で製造された変異糸状菌を培養することを含む、タンパク質の製造方法。
  11. 　前記タンパク質がセルラーゼ及び／又はヘミセルラーゼである、請求項１０記載の方法。
  12. 　前記培養がグルコース存在下で行われる、請求項８又は９記載の方法。
  13. 　変異糸状菌であって、改変ＸＹＲ１を含み、かつ親糸状菌と比べてＡＣＥ３の部分ポリペプチドの発現が強化されており、
    　該改変ＸＹＲ１は、配列番号１又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列に対して、配列番号１の８１０～８３３位に相当する領域における少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルラーゼ及びヘミセルラーゼの転写活性化因子として機能するポリペプチドであり、
    　該ＡＣＥ３の部分ポリペプチドが、配列番号３の１０７～７３４位のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％配列同一なアミノ酸配列からなるポリペプチドである、
    変異糸状菌。
     
      
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