JP7360241B2 - ムコ多糖症i型を治療するための遺伝子治療 - Google Patents
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- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
- C12N15/8645—Adeno-associated virus
-
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Description
本出願には、米国政府からの助成金、国立衛生研究所(NIH)番号R01DK54481、P40OD010939及びP30ES013508によってある程度支援された研究が含まれている。米国政府は本発明に特定の権利を有してもよい。
本発明は、ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群及び/またはシャイエ症候群であると診断された患者を含むムコ多糖症I型(MPS I)を治療するための遺伝子治療のアプローチに関する。
(i)rAAVゲノムコピー(GC)の力価が少なくとも1×109GC/mL~1×1014GC/mL(+/-20%)であること;
(ii)SDS-PAGE解析(実施例5Dを参照のこと)によって測定されるrAAVの中空粒子/完全粒子の比が0.01~0.05(95%~99%中空カプシドがない)
の間である、または他の実施形態では、少なくとも約50%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、もしくは少なくとも約90%中空カプシドがないこと;及び/または
(iii)少なくとも約4×108GC/脳質量g~約4×1011GC/脳質量gのrAAV懸濁液の用量が効能を有することを特徴とする。効能は、試験管内での細胞培養アッセイ、たとえば、細胞当たり既知の感染効率のrAAV GCでHuh7またはHEK293の細胞に形質導入し、形質導入の72時間後にIDUA活性について上清をアッセイする、実施例6Gに記載されている試験管内の効能アッセイによって測定することができる。
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヵ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36カ月:約1013~約5×1014GC;
・3~12歳:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12歳以上:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18歳以上(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
NSの病変は90日目及び180日目での脊髄にて観察された。これらの軸索の変化は後根神経節におけるニューロンに対する免疫が介在する効果に続発すると見なされる。
(i)rAAVゲノムコピー(GC)の力価が少なくとも1×109GC/mL~1×1014GC/mL(+/-20%)であること;
(ii)SDS-PAGE解析(実施例6Dを参照のこと)によって測定されるとき、rAAVの中空粒子/完全粒子の比が0.01~0.05(95%~99%中空カプシドがない)の間である、または他の実施形態では、少なくとも約50%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、もしくは少なくとも約90%中空カプシドがないこと;及び/または
(iii)少なくとも約4×108GC/脳質量g~約4×1011GC/脳質量gのrAAV懸濁液の投与が効能を有すること
を特徴とする。
ystems.comでの活性のアッセイプロトコールを参照のこと。酵素活性を測定する他の好適な方法は、本明細書に記載されているものを含めて記載されている[たとえば、Kakkis,E.D.,et al(1994).Protein Expression Purif.5:225-232;Rome,L.H.,et al(1979).Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:2331-2334を参照のこと]。活性はまた、記載されている方法、たとえば、E.Oussoren,et al,Mol Genet Metab.2013,Aug;109(4):377-81.doi:10.1016/j.ymgme.2013.05.016.Epub,2013,Jun,4を用いて評価してもよい。
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヵ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36カ月:約1013~約5×1014GC;
・3~12歳:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12歳以上:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18歳以上(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
-2の穿刺が挙げられてもよい。たとえば、腰椎穿刺の手段によってクモ膜下腔全体にわたる拡散のために物質が導入されてもよい。別の例では、注入は大槽内にであってもよい。
e Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses.Journal of
Infectious Diseases,2009.199(3):p.381-390にて記載されたように測定されてもよい。
efficient transduction independently of
DNA synthesis”,Gene Therapy,(August,2001),Vol.8,Number,16,Pages,1248-1254を参照のこと。自己相補性AAVは米国特許第6,596,535号;同第7,125,717号;及び同第7,456,683号に記載されており、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。
遺伝子を移すのに機能的ではない。
5.1.1.発現カセット
特定の実施形態では、配列番号1のヌクレオチド配列を有することを特徴とするhIDUA遺伝子を含有する発現カセットを含むAAVベクターが提供される。本発明者らによって開発されたこの配列は、配列番号2をコードするGenBankNP000194.2の公開された遺伝子コーディング配列と約83%の同一性を有する。別の実施形態では、発現カセットは配列番号1に対して少なくとも約80%同一であるヌクレオチド配列を有することを特徴とするhIDUA遺伝子を含有し、機能的なヒトα-L-イズロニダーゼをコードする。別の実施形態では、配列は配列番号1に対して少なくとも約85%同一性であり、または配列番号1に対して少なくとも約90%同一であり、機能的なヒトα-L-イズロニダーゼをコードする。一実施形態では、配列は、配列番号1に対して少なくとも約95%同一であり、配列番号1に対して少なくとも約97%同一であり、または配列番号1に対して少なくとも約99%同一であり、機能的なヒトα-L-イズロニダーゼをコードする。一実施形態では、これは、配列番号1の約1~約78に相当するヒトα-L-イズロニダーゼ(すなわち、配列番号2のアミノ酸26付近またはアミノ酸27付近からアミノ酸653付近をコードする)のリーダーペプチド配列を含む完全長のhIDUA遺伝子を包含する。別の実施形態では、hIDUA遺伝子は、機能的なヒトα-L-イズロニダーゼ酵素、すなわち、配列番号2のアミノ酸27付近~653付近または本明細書で特定されるその機能的な変異体の1つの分泌された部分に融合される異種リーダー配列を含む合成ペプチドである機能的な合成ヒトα-L-イズロニダーゼ酵素をコードする。その上さらなる発現カセットは配列番号5及び配列番号6で特定されるものを含む。それぞれでは、各発現カセットはAAV2の5’及び3’ITRが隣接する。さらに、それぞれはプロモータ、エンハンサ、hIDUA遺伝子、及びポリAを含有する。
好適なリーダーペプチドは必然ではないが、好ましくはヒト起源のものである。好適なリーダーペプチドは参照によって本明細書に組み入れられるhttp://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/zhang270.htmから選択されてもよく、または選択されたタンパク質におけるリーダー(シグナル)ペプチドを決定するための種々のコンピュータプログラムを用いて決定されてもよい。限定されないが、そのような配列は長さ約15~約50アミノ酸、または長さ約19~約28アミノ酸であってもよく、または必要に応じてさらに長くてもよく、もしくはさらに短くてもよい。加えて、IDUA酵素の酵素活性を評価するのに有用であるとして少なくとも1つの試験管内の方法が記載されている[たとえば、Kakkis,et al,Mol.Genet.Metabol,2001,Mar;72(3):199-208を参照のこと]。
ェブに基づくGCG Wisconsinパッケージへのインターフェース:Gapプログラム)。
.Immunol.,161:1063-8;免疫グロブリン重鎖;T細胞受容体鎖),ニューロン特異的なエノラーゼ(NSE)プロモータのようなニューロン性(Andersen,et al.,(1993),Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15),ニューロフィラメント軽鎖遺伝子(Piccioli,et al.,(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5),及びニューロン特異的なvgf遺伝子(Piccioli,et al.,(1995),Neuron,15:373-84)。或いは、調節できるプロモータが選択されてもよい。たとえば、参照によって本明細書に組み入れられるWO2011/126808B2を参照のこと。
特定の実施形態では、AAVカプシド、その中でパッケージされているAAV逆方向末端反復、その発現を制御する調節性配列の制御下でのヒトα-L-イズロニダーゼ(hIDUA)遺伝子を有する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子が提供され、その際、前記hIDUA遺伝子は配列番号1で示される配列または機能的なヒトα-L-イズロニダーゼをコードするそれと少なくとも約95%同一である配列を有する。図1の模式図も参照のこと。一実施形態では、hIDUAの発現カセットにはAAVの5’ITRとAAVの3’ITRが隣接する。別の実施形態では、AAVは一本鎖AAVであってもよい。
US2010/0047174]も参照のこと。特に望ましいrAAVの1つはAAV2/8.TBG.hIDUA.coである。
なTaqMan解析に供する。
rAAV9.hIDUA製剤は、生理食塩水と界面活性剤と生理的に適合性の塩または塩の混合物とを含有する水溶液に懸濁された有効量のAAV.hIDUAベクターを含有する懸濁液である。好適には、製剤は、生理的に許容できるpHに、たとえば、pH6~8、またはpH6.5~7.5、pH7.0~7.7、またはpH7.2~7.8の範囲で調整される。脳脊髄液のpHは約7.28~約7.32なので、髄内送達のためにはこの範囲内のpHが所望であってもよいのに対して、静脈内送達については、6.8~約7.2のpHが所望であってもよい。しかしながら、最も広い範囲内及びこれら部分範囲内での他のpHが他の経路の送達のために選択されてもよい。
およその分子量を与え、最後の数字×10はポリオキシエチレン含量の比率を与える。一実施形態では、ポロキサマー188が選択される。界面活性剤は懸濁液の約0.0005%~約0.001%までの量で存在してもよい。
5.2.1.標的患者集団
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されているような治療上有効な量の修飾されたhIDUAの発現カセットを送達することを含むI型ムコ多糖症を治療する方法である。特に、本明細書で提供されるのは、それを必要とする患者に治療上有効な量の本明細書に記載されているrAAV.hIDUAを送達することを含む、MPS Iであると診
断された患者にて神経認知の低下を防ぐ、治療する及び/または改善する方法である。「治療上有効な量」の本明細書に記載されているrAAV.hIDUAベクターは以下の段落のいずれか1つで特定される症状の1以上を是正してもよい。
治療の投与の0、1、2、7日以上前に開始されてもよい。そのような治療法には、同一日における2以上の薬剤(たとえば、プレドニゾロン、ミコフェノレートモフェチル(MMF))及び/またはシロリムス(すなわち、ラパマイシン)の同時投与が関与してもよい。これら薬剤の1以上が同一用量または調整された用量で、遺伝子治療の投与後に継続してもよい。そのような治療法は必要に応じて約1週間(7日間)、約60日間またはそれ以上であってもよい。特定の実施形態では、タクロリムスを含まない投薬計画が選択される。
・以下のいずれかを含むIC注入について禁忌を有する:
゜ベースラインMRI検査の見直しがIC注入の禁忌を示す
゜IC注入の禁忌を生じる頭部/頸部の手術の既往
゜CT(または造影剤)または全身麻酔に対する禁忌を有する
゜MRI(またはガドリニウム)に対する禁忌を有する
゜<30mL/分/1.73m2の推定糸球体濾過量(eGFR)を有する
・MPS Iに起因しない神経認知欠損を有する、または神経精神病状態も診断を有する・シロリムス、MMFまたはプレドニゾロンに対する過敏性反応の既往を有する
・免疫抑制療法について適当ではない状態(たとえば、<1.3×103/μLの好中球の絶対数、<100×103/μLの血小板数及び<12g/dL(男)または<10g/dL(女)のヘモグロビン)を有する
・腰椎穿刺に対する禁忌を有する
・HSCTを受けている
・治療の前6ヵ月以内にIT投与を介してラロニダーゼ投与を受けていた
・どこかの時点でラロニダーゼIT投与を受け、患者を過度のリスクに置くIT投与に関連すると見なされる重大な有害事象を経験した
・治療の前少なくとも3ヵ月間完全寛解になっていない、リンパ腫の既往、または皮膚の有棘細胞癌もしくは基底細胞癌以外の別の癌の既往
・患者がギルバート症候群の以前既知の既往症及び総ビリルビンの<35%の結合ビリルビンを示す分画ビリルビンを有さない限り、>3×正常の上限(ULN)のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)または>1.5×ULNの総ビリルビン
・ヒト免疫不全ウイルス(HIV)陽性検査の既往、活動型または再発性のB型肝炎またはC型肝炎、またはB型肝炎、C型肝炎またはHIVの陽性スクリーニング検査の既往
・妊娠中、出産後<6週、母乳授乳中、または妊娠を計画中(自己またはパートナー)
・治療の前1年以内のアルコールまたは薬物の乱用の既往
・患者の安全を脅かす深刻なまたは不安定な医学的または心理学的な状態を有する。
・制御不良の発作。
他の実施形態では、主治医は、これらの身体的な特徴(医学的既往)の1以上の存在が本明細書で提供されているような治療を除外すべきではないことを決定してもよい。
患者への投与に好適な医薬組成物は、生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意の賦形剤とを含む製剤緩衝液におけるrAAV.hIDUAベクターの懸濁液を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物は髄内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物は嚢内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物は静脈内に投与される。特定の実施形態では、医薬組成物は20分間(±5分間)にわたる点滴によって末梢静脈を介して送達される。しかしながら、この時間は必要に応じてまたは所望に応じて調整されてもよい。しかしながら、投与のさらに他の経路が選択されてもよい。代わりにまたはさらに、投与の経路は所
望に応じて組み合わせてもよい。
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヵ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36カ月:約1013~約5×1014GC;
・3~12歳:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12歳以上:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18歳以上(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
治療法の有効性は、(a)MPS I患者における神経認知低下の予防、及び(b)疾患の生体マーカー、たとえば、CSF、血清及び/または尿におけるGAGのレベル及び/または酵素活性の低下、及び/または肝臓及び脾臓の容量を評価することによって測定することができる。神経認知は、知能指数(IQ)を測定することによって、たとえば、ハーラーの対象についてBayleyの乳児発達スケールによって測定されるように、またはハーラー・シャイエの対象についてWechsler短縮版知能検査(WASI)によって測定されるように判定することができる。神経認知の発達及び機能の他の適当な測定、たとえば、Bayleyの乳児発達スケール(BSID-III)を用いて発達指数(DQ)を評価すること、Hopkins言語学習試験を用いて記憶を評価すること、及び/または注意変数試験(TOVA)を使用することが利用されてもよい。他の神経心理学的機能、たとえば、Vineland適応行動尺度、視覚処理、微細運動、コミュニケーション、社会化、日常生活技能、及び情動や行動上の健康がモニターされる。容量測定の拡散テンソル画像(DTI)を取得するための脳の磁気共鳴画像診断(MRI)、及び休息状態のデータ、超音波検査による平均神経断面積、脊髄圧迫の改善、安全性、肝臓サイズ及び脾臓サイズも管理される。
AP)、コラーゲンI型のカルボキシ末端テロペプチド(ICTP)及びコラーゲンI型のカルボキシ末端テロペプチドα1鎖(CTX)の測定;柔軟性及び筋力;6分間歩行試験を含むバイオデックス及び理学療法(バイオデックスIII等速性筋力試験システムを用いて各参加者について膝及び肘での筋力を評価する);能動的関節可動域(ROM);小児健康状態質問票/健康状態質問票(CHAQ/HAQ)身体障害指標スコア;個々の心肺適応度をモニターするための筋電図(EMG)及び/または酸素の利用;運動試験中のピーク酸素取り込み(VO2ピーク);無呼吸・低呼吸指数(AHI);強制肺活量(FVC);左心室重量(LVM)が挙げられてもよい。
I患者にてCSFのグリコサミノグリカン(GAG)の神経認知との関係を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、磁気共鳴画像解析(MRI)によって、たとえば、灰白質及び白質及びCFS脳室の容量分析によって測定されるようなMPS I患者におけるCNSへの物理的変化に対する治療剤の効果を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記
載されている治療剤の有効性は、MPS I患者の脳脊髄液(CSF)、血清及び尿における生体マーカー(たとえば、GAG、HS)に対する治療剤の薬物動態効果を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、MPS I患者における生活の質(QOL)に対する治療剤の影響を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、MPS I患者における運動機能に対する治療剤の影響を評価することによって判定される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療剤の有効性は、MPS I患者における成長及び発達の診査事項に対する治療剤の効果を評価することによって判定される。
hIDUAの全身性送達を伴うCNSへのrAAV.hIDUAの遺伝子治療送達の併用は本発明の方法によって包含される。全身性送達はERT(たとえば、アルデュラザイム(登録商標)を用いて)、または肝臓に指向性を持つrAAV.hIDUA(AAV8カプシドを持つrAAV.hIDUA)を用いた追加の遺伝子治療が伴われ得る。
jから選択されるカプシドを有してもよい。そのような投薬計画では、各ベクターストックの用量は、髄内で送達されるベクターの合計が約1×108GC~1×1014GCの範囲内であるように調整されてもよく;他の実施形態では、双方の経路によって送達される組み合わせたベクターが1×1011~1×1016の範囲内である。或いは、各ベクターは約108GC~約1012GC/ベクターの量で送達されてもよい。そのような用量が実質的に同時に、または異なった時間に、たとえば、約1日~約12週間離して、もしくは約3日~約30日離して、もしくは他の好適な時に送達されてもよい。
ュラザイム(登録商標)(ラロニダーゼ))は9ccの合計注入のために6ccのエリオットB(登録商標)によって希釈される。或いは、さらに多いまたはさらに少ない用量が選択される。同様に、ベクターから発現される場合、低い発現タンパク質のレベルが送達されてもよい。一実施形態では、寛容化のために送達されるhIDUAの量は治療上有効な量よりも少ない。しかしながら、他の用量が選択されてもよい。
本発明は本明細書に記載されている(以下の実施例5)rAAV.hIDUA医薬組成物の製造を提供する。説明に役立つ製造プロセスは図11に提供されている。rAAV.hIDUAベクターは図11に示すフローチャートで示すように製造することができる。手短には、好適な細胞培養によって細胞を製造する(たとえば、HEK293細胞)。本明細書に記載されている遺伝子治療のベクターを製造する方法には、遺伝子治療のベクターの作製に使用されるプラスミドDNAの生成、ベクターの生成及びベクターの精製のような当該技術で周知の方法が含まれる。一部の実施形態では、遺伝子治療のベクターはAAVベクターであり、生成されるプラスミドは、AAVゲノムと対象とする遺伝子とをコードするAAVシス-プラスミド、AAVrep及びcap遺伝子を含有するAAVトランス-プラスミド、及びアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成のプロセスは、たとえば、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドDNAによる細胞への形質移入、形質移入後の無血清培地への培地交換、及びベクター含有細胞及び培養培地の回収のような方法工程を含むことができる。回収されたベクター含有細胞及び培養培地は本明細書では粗細胞回収物と呼ばれる。
権書類である2016年4月13日に出願された米国特許出願番号62/322,055、及び「AAVrh10についての拡張可能な精製法」と題する、2015年12月11日に出願された同62/266,347、ならびにAAV1については、2016年12月9日に出願された国際特許出願番号PCT/US2016/065974及びその優先権書類である2016年4月13日に出願された米国特許出願番号62/322,083及び「AAV1についての拡張可能な精製法」と題する、2015年12月11日に出願された同62/26,351はすべて参照によって本明細書に組み入れられる。
態様の1つでは、本明細書で提供されるベクターはこのセクションで提供され、実施例及び図12にてさらに記載されている方法及び/または用具を介して髄内に投与されてもよい。代わりに、他の用具及び方法が選択されてもよい。方法は、患者の大槽の中にクモ膜下穿刺針を進める工程と、クモ膜下穿刺針の近位ハブに柔軟な配管の全長を接続し、柔軟な配管の近位末端に弁の出力ポートを接続する工程と、前記進める工程と接続する工程の後、患者の脳脊髄液で配管が自給されるのを可能にした後、ある量の等張溶液を含有する第1の容器を弁の水洗入口部に接続し、その後、ある量の医薬組成物を含有する第2の容器を弁のベクター入口部に接続する工程とを含む。第1と第2の容器を弁に接続した後、流体流動のための経路は弁のベクター入口部と出口部の間で開放され、医薬組成物がクモ膜下穿刺針を介して患者に注入され、医薬組成物を注入した後、流体流動のための経路は弁の水洗入口部と出口部の間で開放され、クモ膜下穿刺針を介して等張溶液が注入され、医薬組成物を患者のなかへ洗い流す。
合されてもよく、そのような統合された医療用注入用具は、一方が医薬組成物用であり、一方が生理食塩水溶液用である別個のチャンバーのペアを有する。また、チャンバーまたは容器のサイズは所望の量の流体を含有するように必要に応じて提供されてもよい。
成人の腰椎穿刺(LP)キット(施設によって供給される);
BD(Becton Dickinson)の22または25ゲージ×3-7”のクモ膜下穿刺針(Quincke bevel);
インターベンション医師の指示で使用される同軸導入針(クモ膜下穿刺針の導入用);
旋回(回転)オスルアーロック付き四方小口径活栓;
メスルアーロックアダプター付きTコネクタ延長セット(配管)、6.7インチのおよその長さ;
髄内投与用のオムニパック180(イオヘキソール);
静脈内(IV)投与用のヨウ素化造影剤;
注入用の1%リドカイン溶液(成人LPキットで供給されなければ);
予め充填された生理食塩水(無菌)の10ccの水洗注射器;
X線不透過性マーカー(複数可);
外科用調製器具/髭剃り用かみそり刃;
挿管された対象の適正な位置決めを可能にする枕/支持体;
気管内挿管器具、一般的な麻酔器及び人工呼吸器;
手術中の神経生理学的モニタリング(IONM)器具(及び必要な人材);ならびに
ベクターを含有する10ccの注射器;別個の調剤学マニュアルに従って調製され、CT/手術室(OR)の部屋に運ばれる。
ルの中で文書化される。放射線科及び麻酔科のスタッフからの処置についての別個のコンセントが施設の要件によって得られる。対象は、施設の指針に従って適当な病院での看護ユニット内で配置される静脈内アクセス(たとえば、2つのIVアクセス部位)を有する。静脈内流体は麻酔科医の裁量で投与される。麻酔科医の裁量で及び施設の指針によって、対象は誘導され、適当な患者看護ユニット、保持領域または外科/CT処置室にて全身麻酔の投与と共に気管内挿管を受ける。
けられる。
置される。特定の実施形態では、等張溶液をクモ膜下穿刺針に注入して医薬組成物を患者の中に洗い流した後、クモ膜下穿刺針は、構築としての配管、弁及びそれに接続された容器と共に患者から引き出される。特定の実施形態では、弁は旋回オスルアーロック付き四方活栓である。特定の実施形態では、第1と第2の容器は別個の注射器である。特定の実施形態では、Tコネクタはクモ膜下穿刺針のハブに設置され、配管をクモ膜下穿刺針に相互接続する。任意で、クモ膜下穿刺針はクモ膜下穿刺針の遠位端で導入針を含む。クモ膜下穿刺針は5インチで22または24ゲージのクモ膜下穿刺針である。特定の実施形態では、導入針は3.5インチで18ゲージの導入針である。
この実施例はMPS Iを有する患者のための遺伝子治療の処置に関する。この実施例では、遺伝子治療のベクターである、野生型のhIDUA酵素をコードする修飾されたhIDUA遺伝子を発現する複製欠損のアデノ随伴ウイルスベクター9であるAAV9.CB7.hIDUAがMPS I患者の中枢神経系(CNS)に投与される。AAVベクターの用量が全身麻酔下でCNSに直接注入される。本明細書に記載されているように、神経認知の発達及び/または生体マーカーを含む代理マーカーの臨床測定、たとえば、対象のCSFまたは血清における病原性GAG及び/またはヘキソサミニダーゼの濃度の低下を用いて治療の有効性を評価する。
説明に役立つ遺伝子治療のベクターであるAAV9.CB.hIDUAが実施例3に記載されている。導入遺伝子のカセットからの発現は、CMVの前初期エンハンサ(C4)とニワトリのβアクチンプロモータのハイブリッドであるCB7プロモータによって推進される一方で、このプロモータからの転写はニワトリのβアクチンのイントロン(CI)の存在によって増強される。発現カセットのためのポリAシグナルはRBGポリAである。ベクターは製剤緩衝液(エリオットB溶液、0.001%プルロニックF68)に懸濁さ
れる。製造過程は以下の実施例5にて詳細に記載されている。
18歳以上である患者は、1.4×1013GC(1.1×1010GG/脳質量g)(低用量)または7.0×1013GC(5.6×1010GC/脳質量g)(高用量)のrAAV9.CB7.hIDUAの単回の髄内/嚢内投与を受ける。ベクターの投与については、患者は全身麻酔下に置かれる。腰椎穿刺を行い、先ず5ccのCSFを取り出し、続いてITで造影剤を注入して大槽の視覚化を助ける。CT(造影剤による)を利用して針の挿入及び後頭下の空間へのrAAV9.CB7.hIDUAの投与を導く。ベクターに加えて免疫抑制療法が付与されてもよい。免疫抑制療法には、プレドニゾロン(-2~8日目での60mgのPO QD)、MMF(-2~60日目での1gPO BID)及びシロリムス(-2日目の6mgPO、次いで-1日目から48週目の来診まで2mgQD)が挙げられる。シロリムス用量の調整を行って16~24ng/mL以内の全血トラフ濃度を維持することができる。ほとんどの対象では、用量投与は方程式:新しい用量=現在の用量×(標的濃度/現在の濃度)に基づくことができる。対象は、濃度のモニタリングによるさらなる投与量の調整の前に少なくとも7~14日間新しい維持用量を継続すべきである。好中球減少症が発生すれば(好中球の絶対数<1.3×103μL)、MMF投薬を中断するまたは用量を減らすべきである。任意で、患者は静脈内酵素補充療法(ERT、たとえば、アルデュラザイム(商標)[ラロニダーゼ])の安定な投薬計画、と同様に対処療法(たとえば、理学療法)にとどまることが許され得る。重篤な有害事象には、「Hyの法則」と呼ばれる約3×ULNのALT及び約2×ULNのビリルビン(>35%直接)として定義される高ビリルビン血症を伴う、考えられる薬剤誘発の肝障害が挙げられてもよい。
・新生児:約3.8×1012~約1.9×1014GC;
・3~9ヵ月:約6×1012~約3×1014GC;
・9~36カ月:約1013~約5×1014GC;
・3~12歳:約1.2×1013~約6×1014GC;
・12歳以上:約1.4×1013~約7.0×1014GC;
・18歳以上(成人):約1.4×1013~約7.0×1014GC。
好適な患者には、
血漿、線維芽細胞または白血球で測定されたとき酵素活性によって確認されたMPS
Iの文書化された診断を有するもの;
他の神経学的なまたは精神医学的な因子によって説明できなければ、以下:IQ検査の平均値を下回る2:1標準偏差のスコアもしくは神経心理学的機能(言語の理解力、記憶、注意または知覚的推論)の1ドメインにおけるスコアのいずれかとして定義されるMPS Iによる早期の神経認知欠損の文書化された証拠(カルテ)、
逐次試験における1標準偏差を上回る低下の文書化された歴史的証拠(カルテ)を有するもの;
補助具の有無にかかわらず、試験日に該当する場合、必要とされるプロトコール試験を完成させ、進んで補助具を装用することに従うのに十分な聴覚能力及び視覚能力を有するものが挙げられてもよく、
任意で、少なくとも6ヵ月間のERT(たとえば、アルデュラザイム(登録商標)[ラロニダーゼ]IV)の安定な投薬計画上にある。
・以下のいずれかを含むIC注入について禁忌を有する:
ベースラインMRI検査の見直しがIC注入の禁忌を示す
IC注入の禁忌を生じる以前の頭部/頸部の手術の既往
CT(または造影剤)または全身麻酔に対する禁忌を有する
MRI(またはガドリニウム)に対する禁忌を有する
<30mL/分/1.73m2の推定糸球体濾過量(eGFR)を有する
・MPS Iに起因しない神経認知欠損または神経精神病の状態を有する
・シロリムス、MMFまたはプレドニゾロンに対する過敏性反応の既往を有する
・免疫抑制療法について適当ではない状態(たとえば、<1.3×103/μLの好中球の絶対数、<100×103/μLの血小板数及び<12g/dL[男]または<10g/dL[女]のヘモグロビン)を有する
・腰椎穿刺に対する禁忌を有する
・HSCTを受けている
・治療の前6ヵ月以内にIT投与を介してラロニダーゼ投与を受けていた
・どこかの時点でラロニダーゼIT投与を受け、患者を過度のリスクに置くIT投与に関連すると見なされる有意な有害事象を経験した
・治療の前少なくとも3ヵ月間完全寛解になっていない、リンパ腫の既往、または皮膚の有棘細胞癌または基底細胞癌以外の別の癌の既往
・患者がギルバート症候群の以前既知の既往症及び総ビリルビンの<35%の結合ビリルビンを示す分画ビリルビンを有さない限り、>3×正常の上限(ULN)のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)または>1.5×ULNの総ビリルビン
・ヒト免疫不全ウイルス(HIV)陽性検査の既往、活動型または再発性のB型肝炎またはC型肝炎、またはB型肝炎、C型肝炎またはHIVの陽性スクリーニング検査の既往
・妊娠中、出産後<6週、母乳授乳中、または妊娠を計画中(自己またはパートナー)
・治療の前1年以内のアルコールまたは薬物の乱用の既往
・患者の安全を脅かす深刻なまたは不安定な医学的または心理学的な状態を有する。
・制御不良の発作。
・新生児
・3~9ヵ月齢
・9~36ヵ月齢
・3~12歳
・12歳以上
・18歳以上の年齢での男女の対象が挙げられる。
主要な臨床目的には、MPS I欠損に関連する神経認知の低下を防ぐこと及び/または任意で元に戻すことが挙げられる。臨床目的は、たとえば、ハーラーの対象についてBayleyの乳児発達スケールによって測定されるような、またはハーラー・シャイエの対象についてWASIによって測定されるような、知能指数(IQ)を測定することによって判定される。神経認知の発達及び機能の他の適当な測定、たとえば、Bayleyの乳児発達スケール(BSID-III)を用いて発達指数(DQ)を評価すること、Hopkins言語学習試験を用いて、及び/または注意変数試験(TOVA)を用いて記憶
を評価することが利用される。
この実施例は、イヌ及び非ヒト霊長類の双方において、新生仔におけるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた肝指向型の遺伝子導入は導入遺伝子に対する免疫寛容の持続した状態を誘導し、中枢神経系(CNS)を標的とするその後のベクター投与の有効性を実質的に改善することを実証している。このアプローチは、酵素α-L-イズロニダーゼ(IDUA)の活性の欠損のための進行性のCNS疾患を特徴とするリソソーム蓄積症であるムコ多糖症I型(MPS I)のイヌモデルに適用された。1ヵ月齢のイヌにおける髄内AAV送達を用いたCNSを標的とする遺伝子導入はイヌIDUAに対する抗体の誘導を生じ、それは脳の病変の改善を部分的に減衰させた。1週齢にてイヌIDUAを発現しているベクターによって全身性に処理されたMPS Iイヌは酵素に対する抗体を発生させず、1ヵ月齢での髄内AAV送達の際、CNSにて強固な発現を示し、脳の蓄積症の完全な是正を生じた。ヒトIDUAを発現するAAVベクターで全身性に処理された新生仔アカゲザルは同様に導入遺伝子に対して寛容を発生し、劇的に高いCSFでのIDUAの発生及びその後のCNSでの遺伝子治療後の抗体誘導の非存在を生じた。これらの知見は、免疫学的な発達の決定的な期間の間に導入遺伝子に対する寛容を誘導することによって遺伝子治療の有効性及び安全性を改善する可能性を示唆している。
1.ベクターの作製
被験物質は、ニワトリβアクチンプロモータ(CB7)とキメライントロン(CI)とコドンを最適化させたイヌIDUA導入遺伝子(cIDUA)とポリアデニル化シグナル(RBG)から成る発現カセットをパッケージするAAV9のカプシドから成った。発現構築物にはAAV血清型2の逆方向末端反復が隣接した。このベクターは、AAV2/9.CB7.CI.cIDUA.RBGまたはAAV9.CB7.CI.cIDUA.RBGと名付けられる。一部の動物は新生仔のとき異なるベクターによって静脈内で処理されてイヌIDUAタンパク質に対する寛容を誘導した。このベクターは、肝臓特異的な甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモータ(TBG)と人工イントロン(PI)とコドンを最適化させたイヌIDUA導入遺伝子(cIDUA)とポリアデニル化シグナル(RBG)から成る発現カセットをパッケージするAAV8のカプシドから成った。発現構築物にはAAV血清型2の逆方向末端反復が隣接した。ベクターは293細胞の三重形質移入によって作製し、以前記載された[L.Wang,et al,Human gene therapy,22,1389-1401,(2011);published online EpubNov]ようなイオジキサノール勾配で精製した。
MPS Iイヌのコロニーは、研究における動物の飼育及び使用に関するNIH及びUSDAのガイドラインのもとでペンシルベニア大学獣医学部で維持された。MPS Iイ
ヌの試験プロトコールはすべてペンシルベニア大学の施設内実験動物委員会によって承認された。新生仔MPS Iイヌにおけるベクター注入については、AAV8ベクターを0.5~1mLの無菌生理食塩水にて希釈し、頸静脈を介して注入した。AAV9ベクターの髄内注入及びCSFの回収は、以前記載された[C.Hinderer,et al,Intrathecal Gene Therapy Corrects CNS Pathology in a Feline Model of Mucopolysaccharidosis I.Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy,(2014);published online EpubJul,16]ような後頭下のアプローチを介して行った。合計9匹のMPS Iイヌがこの研究に含まれた。遺伝子型はPCR及び血清の酵素アッセイによって出生時に確認した。6匹のイヌが、1日齢(N=3)または7日齢(N=3)でAAV血清型8ベクター(5×1012ゲノムコピー/kg[GC/kg]体重)のIV注入を投与された。1匹は出生後3日で死亡した。処理した残り5匹の動物と同様に3匹の未処理のMPS Iイヌを1ヵ月齢で髄内AAV9(1012GC/kg)によって処理した。最初の7週齢まで毎週、その後毎月、血液を末梢血管から採取した。CSF(1mL)は、髄内注入のとき(1ヵ月齢)、注入の7及び21日目、及びその後毎月採取した。ナトリウムペントバルビタール80mg/kg、IV)の投与によって安楽死を行った。5匹の動物は9ヵ月齢で安楽死させ、残りは11カ月齢で安楽死させた。未処理のMPS I及び対照は6ヵ月齢~26カ月齢の間で安楽死させた。組織を採取し、以前記載[Hinderer,et al,2014]されたように処理した。
,Nature chemical biology,8,197-204(2012);published online EpubFeb]を用いてカリフォルニア大学サンディエゴ校のGlycotechnology Coreによって実施された。手短には、CSF試料からGAGを抽出し、ヘパリナーゼI、II及びIIIで二糖類に消化した。還元カップリングによるアニリン12Cで二糖類にタグを付け、それをスピードバックで乾燥させた。乾燥させた試料をLC-MS等級の水にて再構成し、既知の濃度のアニリン12Cでタグを付けた標準に混ぜ合わせた。Thermo Scientific Ultimate 3000 HPLCシステムを備えたLTQ Orbitrap Discoveryエレクトロスプレーイオン化質量分光計(Thermo Scientific)にて試料を解析した。
1.MPS Iイヌにおける髄内AAV9が介在する遺伝子導入の後のイヌIDUAに対する抗体の誘導
MPS Iイヌモデルはヒト疾患の症状の多数を忠実に繰り返す[E.Kakkis,et al,Molecular genetics and metabolism,83,163-174(2004);published online EpubSep-Oct;R.M.Shull,et al,Am.J.Pathol.114,487-495(1984)]。これらの動物は、IDUAの第1イントロンの保持を生じるスプライス部位の突然変異のせいで検出可能なIDUA活性を有さない[K.Menon,et al,(Genomics,14,763-768(1992)]。これらの動物には検出可能なIDUA発現がないことを考えて、これらの個体は一般に完全長ではないIDUAを産生する対立遺伝子を運び、そのタンパク質に対してそれらが免疫的に遭遇したことがないままであるので、我々はそれらが、MPS Iの重篤形態の患者で生じる髄内遺伝子治療に対する免疫応答をモデル化することを予想した[N.J.Terlato,G.F.Cox,Can mucopolysaccharidosis type
I disease severity be predicted based on a patient’s genotype? A comprehensive review of the literature.Genetics in medicine:official journal of the American College of Medical Genetics 5,286-294(2003);published online EpubJul-Aug]。MPS Iイヌの脳は、ニューロンにおけるGM3のようなガングリオシドの広範な蓄積、と同様にコレステロールとLIMP2を含むリソソームの膜タンパク質との異常な蓄積を含む、MPS
Iに関連する特徴的な病態を示す[R.M.Shull,et al,Am.J.Pathol.114,487-495(1984)]。MPS Iイヌはまた、髄膜におけるグリコサミノグリカン(GAG)の顕著な蓄積を示し、一部のMPS I患者における脊髄圧迫に寄与する過程である有意な髄膜肥厚を生じる[E.Kachur,et al,Neurosurgery,47,223-228(2000);published
online EpubJul;A.Taccone,et al,Pediatric Radiology,23,349-352(1993);published online EpubSep;S.Vijay,J.E.Wraith,Clinical presentation and follow-up of patients
with the attenuated phenotype of mucopolysaccharidosis type I.Acta Paediatrica,94,872-877(2005)]。
MPS IイヌにおいてイヌIDUAの新生仔発現がその酵素に対する免疫寛容を誘導し得るかどうかを判定するために、出生後1日目(N=3)または7日目(N=3)に肝臓選択性のプロモータからイヌIDUAを発現するAAV血清型8ベクターのIV注入によって6匹のイヌを処理した。出生日に処理したイヌのうち1匹は処理の2日後に死亡した。生き残った新生仔のイヌは全体として未処理のMPS Iイヌについての病歴データに類似し、最初の2週齢でおよそ20%の死亡率を有する[Vite,R.et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 15,1423-1431(2007);published online EpubAug]。MPS Iイヌにおけるこの早期の死亡率の原因は究明されていない;この処理された動物では、死体の検視はMPS Iに典型的な全身性の病変と同様に全身性の細菌感染の可能な証拠を示した。処理した動物は血清IDUAの上昇とそれに続く迅速な低下を明らかにした。こ
れは、新生仔における肝臓遺伝子導入に非統合性のベクターを利用する以前の研究における肝細胞の***の間でのベクターゲノムの喪失による一時的な発現の観察に一致する[L.Wang,et al,Human gene therapy,23,533-539(2012);published online EpubMay]。
リソソーム酵素であるヘキソサミニダーゼ(Hex)はMPS I動物の組織で上方調節され、脳組織及びCSFの双方で上昇したHex活性はIDUA欠乏の下流で生じる異常な細胞性の過程についての有用なマーカーとして役立つ[Hinderer,et al.(2014)]。ベクターの髄内送達のとき(生後約1ヵ月)のCSFのHex活性の測定は、MPS Iイヌすべてにて異常に上昇したHex活性を示した。髄内AAV9のみで処理した動物はHex活性で中程度の低下を示し、最高の残留IDUA発現を伴う動物のみが正常範囲のHex活性に達した。新生仔で全身性の遺伝子導入によって処理され、その後ベクターの髄内投与を受けた5匹の動物はすべてCSFのHexの完全な正常化を実証した。2匹の髄内の処理のみを受けた最低のCSFのIDUAレベルの動物では効果はやや低下したが、脳組織試料におけるHex活性はCSFのHexよりも治療に大きな応答を示し、処理した動物すべてにおいて脳のHex活性の実質的な低下を伴った。
MPS Iイヌにおいて観察された免疫寛容誘導のための新生仔の時間帯が霊長類にて見いだされ得るかどうかを評価するために、新生仔アカゲザル(N=4)にて類似の研究
を行った。これらの動物はIDUA欠乏ではないので、ヒトIDUA導入遺伝子を用いて、活性のある内在性遺伝子を欠いている患者にて種特異的な導入遺伝子に対して予想され得る免疫応答をモデル化した。2匹の新生仔アカゲザルに肝臓特異的なプロモータからヒトIDUAを発現するAAV8ベクターをIVで出生時投与した。双方とも血清IDUA活性の一時的な上昇を明らかにした。2匹の追加の新生仔に無関係な導入遺伝子(ヒト第IX因子)を発現するAAV8ベクターをIVで出生時投与した。4匹の動物すべてに、1ヵ月齢で髄内注入によってヒトIDUAを発現するAAV9ベクターを投与した。MPS Iイヌに類似して、IDUA未処理の動物は注入の3週間後、CSFのIDUA活性の低下を示し、投与後2ヵ月までにほぼベースラインレベルに戻った。これらの動物はまたCSFにおいて導入遺伝子特異的な抗体を発生した。出生時にIDUA遺伝子導入をIVで投与した2匹の動物はCSFにてヒトIDUAに対する抗体を発生させず、AAV9の髄内投与の2ヵ月後、正常の10倍を超える高いCSFの酵素活性を維持した。動物はすべて研究期間の間、頑丈で健康のままであり、有害事象の証拠はなく、年齢に基づいて且つ既往対照と比べて正常な成長の軌跡、及び完全な血球数(CBC)及び正常限界範囲内の生化学検査を伴った。
野生型の治療用タンパク質に対する免疫活性化は劣性疾患についての潜在的な懸念である。抗体は静脈内で送達される酵素の分布及び取り込みを妨害することができるので、タンパク質補充療法に対する抗体反応は一部のLSDについて特に難易度が高い[E.J.Langereis,et al,Molecular genetics and metabolism,(2014);published online EpubOct,29]。抗体は形質導入された細胞から分泌される酵素が介在する相互是正を妨害し得るので、抗体はこれらの疾患を標的とする遺伝子治療にとって同等に問題がある。
る寛容を誘導したが、それは1ヵ月齢での髄内遺伝子治療によって非常に高いCSF酵素のレベルが達成されていた。免疫寛容群におけるCSFの高いIDUAレベルは一貫して神経病理の完全な反転を生じ、妨害する抗体反応が克服されるとLSDの髄内遺伝子治療によって可能である有効性の強力な例を提供する。導入遺伝子に対する免疫寛容の誘導のための新生仔の時間帯が非ヒト霊長類にも存在するという知見は、病院への変換について有望であると思われる。本研究に対する幾つかの重要な限界がある。新生仔MPS I患者にてベクターの髄内注入を行うことに関連する高いリスクのために、新生仔では、寛容を誘導する手段としてCNS指向型の遺伝子治療ではなく全身性の遺伝子導入が使用されている。
A.材料及び方法
ベクターは、ヒトのイズロニダーゼ(hIDUA)を発現する血清型9の非複製組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)である。AAV9血清型はIC投与に続いてCNSでのhIDUA産物の効率的な発現を可能にする。
AAV-hIDUAベクターゲノムのプラスミドであるpAAV.CB7.CI.hIDUAco.RBG(p3032)は7,165bpのサイズである。このプラスミドに由来するベクターゲノムは、hIDUA発現カセットに隣接するAAV2に由来するITRを伴った一本鎖DNAゲノムである。導入遺伝子カセットからの発現は、CMVの前初期エンハンサ(C4)とニワトリのβアクチンプロモータの間のハイブリッドであるCB7プロモータによって推進される一方で、このプロモータからの転写はニワトリのβアクチンのイントロン(CI)の存在によって増強される。発現カセットのためのポリAシグナルはRBGポリAである。プラスミドはコドンを最適化し、hIDUA配列を合成することによって構築され、得られた構築物は次いでプラスミド、pENN.AAV.CB7.CI.RBG(p1044)、CB7とCIとRBGを含有するAAV2のITRが隣
接する発現カセットの発現要素にクローニングされてpAAV.CB7.CI.hIDUAco.RBG(p3032)を得た。
逆方向末端反復(ITR):AAVのITR(GenBank #NC001401)は両端で同一であるが、逆向きである配列である。AAV2のITR配列は、AAVとアデノウイルスのヘルパー機能がトランスで提供されると、双方ともベクターDNAの複製の開始点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルとして機能する。そのようなものとして、ITR配列はベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされるシス配列のみを表す。
MPS Iイヌのコロニーは、研究における動物の飼育及び使用に関するNIH及びUSDAのガイドラインのもとでペンシルベニア大学獣医学部で維持された。試験プロトコールはすべてペンシルベニア大学の施設内実験動物委員会によって承認された。組換えヒトIDUAの点滴については、使用直前にラロニダーゼ(Genzyme)を生理食塩水で5倍に希釈した。末梢静脈のカテーテルを介して点滴は2時間にわたって行った。AAV9ベクターの髄内注入及びCSFの採取は、以前記載された[C.Hinderer,et al,(Mol.Ther.J.Am.Soc.Gene Ther.22,2018-2027(2014)]ように後頭下のアプローチを介して行った。ナトリウムペントバルビタール(80mg/kg、IV)の投与によって安楽死を行った。以前記載された[Hinderer(2014)]ように組織を採取し、処理した。
以前記載された[C.Hinderer,et al,(Mol.Ther.J.Am.Soc.Gene Ther.22,2018-2027(2014))]ように組織溶解物及びCSFにてIDUA及びHexの活性を測定した。
リン酸緩衝液pH5.8にて5μg/mLに希釈した組換えヒトIDUA(Genzyme)によって4度で一晩ポリスチレンのELISAプレートをコーティングした。プレートを洗浄し、pH5.8のリン酸緩衝液中の2%BSAでブロックした。PBSにて1:50に希釈したCSF試料と共にプレートを室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、2%BSAを伴ったリン酸緩衝液にて1:10,000に希釈したHRPを結合した抗イヌIgG(Pierce,Rockford,IL)によって結合抗体を検出した。テトラメチルベンジジン基質で15分間ELISAを発色させ、次いで2Nの硫酸で反応を止め、450nmにて吸光度を測定した。連続希釈した陽性試料の標準曲線から力価を算出した。
脳の組織学的な解析は、GM3について陽性のニューロン、コレステロール及びLIMP2の蓄積を定量するための以下の改変と共に以前記載された[C.Hinderer,2014]ように実施し;LIMP2及びフィリピンで染色した大脳皮質の切片の画像は、層I(分子層)と層IIの間の境界が画像の上縁を形成するように10×の対物レンズで撮影した。各動物から合計10枚の画像を取得した。GM3で染色した脳の切片の画像は、脳の分子層を含む大脳皮質表面に直下の領域から4×対物レンズで撮影した。各動物からの7枚の画像を解析した。画像はすべて以前記載された[M.Aldenboven,et al,Biology of Blood and Marrow Transplantation,14,485-498(2008);published online EpubMay]ように「閾値」及び「粒子を解析する」モジュールを用いてImageJソフトウエア(Rasband,W. S.,National Institutes of Health,USA;http://rsb.info.nih.gov/ij/)によって処理した。頸部髄膜の肥厚の定量は頸部脊髄のH&E染色した切片で実施した。300μm間隔でスライド当たり髄膜の全厚さの15の測定を行った。
8 Vectors.Human gene therapy,22,1389-1401,(2011);published online EpubNov]ようなTa
qManPCRによってベクターゲノムを定量した。データは適宜、Kruskal-Wallisの検定、とその後のDunnの検定またはMann-Whitneyの検定を用いて評価した。p<0.05を統計的に有意と見なした。統計的解析はすべてPrism6.0(GraphPadソフトウエア)を用いて行った。
1.ヒトIDUAを発現する髄内AAV9はMPS Iイヌにて導入遺伝子に特異的な強力な免疫を引き出す。
MPS Iイヌは、即時停止コドンを作り出す、成熟mRNAにて第1イントロンの包含を生じるIDUAの突然変異を保有する。MPS Iイヌにおける突然変異は検出できないIDUA活性を生じる[KP.Menon,et al,Genomics,14:763-768(1992);NJ.Terlato,et al,Genet Med,5:286-294(2003);XX.He,et al,Mol.Genet Metab,67:106-112(1999)]。リソソームIDUA活性の非存在下で分解されないGAGが細胞に蓄積する[GN.Sando,et al,Cell,12:619-627(2011)]。冒された組織におけるこの主要なGAG蓄積物質はアルシアンブルー染色によって直接、組織学的に検出することができる[C.Hinderer,et al,Mol.Ther.J.Am.Soc.Gene Ther.22,2018-2027(2014);NJ Terloato,et al.(2003);R.M.Shull,et al,Am.J.Pathol.114,487-95(1984);R.M.Shull,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,12937-12941(1994);L.A.Clarke,et al.,Pediatrics,123,229-40(2009);N.M.Ellinwood,et al.,Mol.Genet.Metab.91,239-250(2007);M.E.Haskins,et al,Am.J.Pathol.112,27(1983);A.Chen,et al,Apmis,119,513-521(2011)]。主要なGAGの蓄積病変に加えて、リソソームGAGの蓄積は特徴的なカスケードの細胞性の異常につながる。上方調節されたGAGはリソソーム拡張の原因となり、それはLIMP2のようなリソソーム膜タンパク質についての強染色によって組織学的に眼に見える。ニューロンはまた、たとえば、ガングリオシド(たとえば、GM3)及びエステル化されていないコレステロールのような物質の二次蓄積も示す。リソソームの蓄積は、たとえば、ヘキソサミニダーゼ(Hex)のようなリソソーム酵素の異常な過剰発現も誘導する。
とは思われなかった。
導入遺伝子に対する誇張された免疫応答の非存在下でヒトIDUAを発現するAAV9ベクターを評価するために、我々は新生仔曝露を介してヒトタンパク質に対する免疫寛容を誘導しようと試みた。出生5日後に、肝特異的プロモータからヒトIDUAを発現するAAV血清型8ベクター(AAV8)の単回静脈内注入によって6匹のMPS Iイヌを処理した。1ヵ月齢にて、以下:1010、1011及び1012GC/kgのような3つのコホート(コホート当たりn=2の動物)においてヒトIDUAを発現する異なる用量のAAV9ベクターの大槽内への髄内注入によって動物を処理した。動物はすべて寛容化されていない動物に類似してCSFのIDUA活性の用量依存性の上昇を示した(図2A)が、このコホートではCSF酵素の発現は21日目を超えて持続し、実験が持続する間検出可能なままだった(図2B、寛容化)。CSFの抗体反応は、処理を経験したことがない(すなわち、寛容化されていない)動物が髄内ベクターを投与された場合に見られるものと比べて鈍く;寛容化されたコホートにおける2匹(I-602及びI-606)だけが検出可能な力価を示し、それは同等のベクター用量で処理した処理未経験動物よりもおよそ20倍低かった(図3)。このコホートで最高の抗体力価を持つイヌ(I-606)だけが処理未経験動物よりも低レベルにもかかわらず、21日目でCSFでの高いリンパ球を示した(図4A及び4B)。これらのコホートでは臨床的な有害事象はなかった。
新生仔遺伝子導入を介してヒトIDUAに対して寛容化した6匹のMPS IイヌをAAV9の髄内注入の6ヵ月後に屠殺した。脳の溶解物はベクターの最高用量でヘキソサミニダーゼ活性の完全な正常化を実証し、最低用量での部分的な是正を伴った(図5)。ヘキソサミニダーゼ活性はベクター用量のすべてにおいてCSFにて正常化された(図8)。MPS I患者における脊髄圧迫に寄与し得る頸部髄膜の肥厚は、すべての用量で処理された動物にて元に戻った(図9)。脳の組織学的な評価は、hIDUAに寛容のイヌではLIMP2及びGM3の蓄積での用量依存性の低下を示した(図6A、6B)。最高のベクター用量で処理した動物は正常対照に類似するLIMP2及びGM2の染色を示し;最低用量では、一部のマーカー(LIMP2及びHex)では測定できる改善がなかったのに対してGM2の蓄積は明らかには低下しなかった。従って、1010GC/kgの低用量は最小効果用量(MED)であると思われた。
トIDUAに対して寛容化された8匹のMPS IイヌにてITでのAAV9.CB7.hIDUAのMEDを確立した。1ヵ月齢にてイヌをITでのAAV9.CB7.hIDUAによって処理し、6ヵ月後、脳の蓄積病変の評価のために安楽死させた。MEDの確立は、LIMP2及びGM3を含むCNS組織におけるMPS I疾患のよく特徴付けられた組織学的な基準を利用した。リソソームの蓄積病変の基準すべてが評価された最高用量(1012GC/kg体重)にて正常化された。このコホートの動物はGM3またはLIMP2の蓄積の正常範囲に達しなかったが、一貫した改善は10倍低い用量(1011GC/kg体重)でも観察された。最低用量群(1010GC/kg体重)では、リソソーム蓄積の組織学的な証拠は、LIMP2染色による中程度の改善及びGM3の蓄積における最小限の改善を示した。従って、我々は1010GC/kg体重がITでのAAV9.CB7.hIDUAのMEDであると推定した。脳の蓄積病変の用量依存性の解消がCSFのIDUA活性に相関し、CSFのスペルミン濃度に逆相関したということは、CSFのIDUA活性及びCSFのスペルミンが臨床試験にてAAV9.CB7.hIDUAの薬物動態の評価のための有用な生体マーカーであり得ることを示している。
ヒトIDUAの肝臓発現が寛容の誘導に必要であるかどうかを判定するために、我々は、1ヵ月齢でのAAV9の髄内注入の前、出生後7及び14日目に組換えヒトIDUA(0.58mg/kg)の点滴によって2匹のMPS Iイヌ(I-663及びI-664)を処理した。ヒトIDUAを発現するベクターで新生仔として処理されたイヌに類似して、酵素処理したイヌは高レベルのCSF IDUA活性(図2A、2B)及びヒトIDUAに対する最小の抗体反応(図2)またはCSFの髄液細胞増加症(図4A-4B3)を持続して示した。双方の動物で脳のヘキソサミニダーゼ活性は低下し(図5)、蓄積病変は効果的に一掃された(図6A、6B)。
MPS Iの治療のための髄内AAV9送達の有効性を評価することは、CSFへの注入を介して達成され得るベクターの分布及び疾患特異的なマーカーに対する形質導入のその程度の影響の双方の評価を必要とした。これらの研究は、十分に類似するサイズ及び生体構造も示して臨床的な送達法及び得られるベクター分布の意味ある評価を可能にしつつ、疾患の病態生理を正確に反映し得る動物モデルの使用を必要とした。MPS Iイヌモデルはヒトの表現型を忠実に複製し、同じ生化学的な及び組織学的な病変だけでなく、同じ臨床所見も示す[KP.Menon,et al,Genomics,14:763-8(1992);RM.Shull,et al,(1984);RM.Shull,et al,(1994);C.Ciron,et al,Ann Neurol,60:204-213(2006);P.Dickson,et al,Ann.Neurol,60:204-213(2006)]。ヒトにおけるMPS Iに対する表現型の類似性のゆえに、MPS Iイヌは全身性疾患の治療のための酵素補充療法の開発で広範に使用された[RM.Shull,et al,PNAS,91:12937-12941(1994);P.Dickson,et al,J.Clin.Invest,118:2868-2876(2008)]。MPS Iイヌはまた、散発的に脊髄圧迫及び水頭症を発生する疾患のCNS所見も模倣する[P.Dickson,et al,Mol.Genet.Metab.99,S15-S15(2010);P.I.Dickson,et al,Mol.Genet.Metab.98,70-70(2009);C.H.Vite,et al,Comp.Med.63,163-173(2013)]。MPS Iイヌについて認知試験は報告されていないけれども、脳における組織学的な及び生化学的な所見は十分に特徴付けられ、その疾患の重篤な形態を持つヒトにおける知見を忠実に反復している[RM Shull(1984);C.Ciron(2006);SU Walkley,et al,Acta Neuropathol.(Berl.)75,611-620(1988)]。MPS Iイヌの脳はリソソーム膜タンパク質(LIMP2)及びガングリオシド(GM3)の蓄積ならびにヘキソサミニダーゼ(Hex)のようなリソソーム酵素の上方調節を明示している。ガングリオシドの蓄積はMPS
I及び他のリソソーム蓄積疾患における認知機能と相関するので、疾患の重症度及び治療転帰を評価するための重要なマーカーである[S.U.Walkley,M.T.Vanier,Secondary lipid accumulation in lysosomal disease, Biochim.Biophys.Acta BBA-Mol.Cell Res.1793,726-736(2009);G.Constantopoulos,et al,J.Neurochem.34,1399-1411(1980)]。MPS Iイヌはまた患者で特定されるものに類似するニューロンの形態における変化も示す[SU Walkley,(1988)]。これらの著しい類似性によってこれはヒトにおけるMPS IのCNS所見に対する新規の治療法としてのAAVの髄内送達の評価のための説得力のあるモデルになった。ITでのAAV9の送達のために臨床的に使用される投与の経路を反復する大型動物モデルの能力と同様に得られるベクターのCNSにおける分布はさらに、これらの研究にとってのMPS Iイヌの妥当性を支持した。
を示す。対照的に、タンパク質の反復IT点滴によって治療された小児及び成人のMPS
I患者双方については、類似の有害効果はなく、IDUAに対するCSF抗体について治療された5人の患者のうち、たった1人が陽性であった[C.Ciron(2006);P.Dickson,et al,(2010);P.I.Dickson,et al,Mol.Genet.Metab.98,70-70(2009);P.I.Dickson,et al,Mol.Genet.Metab.101,115-122(2010);P.I.Dickson,et al,Mol.Genet.Metab.93,247-247(2008);E.Kakkis,et al,Mol.Genet.Metab.83,163-174(2004);T.C.Lund,et al,Mol.Genet.Metab.111,S74(2);M.Vera,et al,Pediatr.Res.74,712-720(2013)]。興味深いことに、MPS
Iイヌは、ヒト酵素に対するよりも低レベルであるが、イヌIDUAに対してもCSF抗体を発生させるということは、このモデルがIDUAに対する免疫に向けた全体的に大きな傾向を有することを示唆しており、それは種特異的ではないタンパク質の使用によって悪化する。MPS Iイヌ及び患者におけるヒトIDUAの静脈内送達及び髄内送達双方の転帰におけるこれらの際立った差異は、MPS IイヌにおけるヒトIDUAに対する一貫して悪化した免疫応答を示し、この応答を防ぐことがヒトにて予想されるベクター活性を反復させるのに必要であることを示唆している。新生仔曝露を介してタンパク質に対する寛容を誘導することが、悪化した免疫応答の介入なしでこのモデルにてヒトベクターの有効性の評価を可能にした。これは、最も妥当な動物モデルにてヒト初回遺伝子治療試験の設計で必須の因子である最小有効用量の正確な決定を可能にする重要情報を提供した。さらに詳しくは、広範な投与量決定試験をMPS Iイヌにて実施した。最小有効用量は免疫寛容の動物で決定されたが、本明細書に記載されているoqPCR法によって決定されたように2×109GC/g脳質量の用量であると推定される。用量漸増安全性試験は免疫能力のある(すなわち、IDUAにもAAVにも遭遇していない)イヌにて実施し、毒性は1012GC/gの用量で観察された。免疫介在性毒性の厳密なイヌモデルにおける1012GC/gでの用量制限毒性試験(DLT)の知見に基づいて、アカゲザルにおける公式の医薬品安全性試験実施基準(GLP)の毒性試験にて10倍低い用量を投与するであろう。公式のGLP非ヒト霊長類(NHP)毒性試験で評価される用量は1.1×1011GC/g脳質量であろう。毒性に遭遇しなければ、臨床の出発用量は1.1×1010GC/g脳質量であろう。この出発用量はイヌMPS Iモデルにおける最小有効用量(MED)よりもほぼ5倍多く、MPS Iイヌ及びネコの研究にて信頼できる組織学的反応を明示した用量とほぼ同じであるということは、この用量の臨床有効性の理に適った期待を支持している。出発用量はまたMPS Iイヌで毒性が観察された用量よりもほぼ90倍少なく、非ヒト霊長類で調べられた用量よりも10倍少ないということは、ベクターまたは導入遺伝子に関連する毒性に対してさらに大きな感受性を示すヒト対象の潜在力を説明する許容できる安全性限界を提供している。これらのデータに基づいて、出発用量は許容できる利益:リスクのプロファイルを表し、その際、用量は治療範囲内にある(従って臨床利益を提供してもよい)と予想されるが、毒性ベクター用量を下回る(従ってそれなりに安全であるはずである)と予想される。以下の計算はイヌにおける用量をヒトにおける出発用量にどのように外挿するかを示す:1ヵ月齢のイヌの脳=45グラム;MED9×1010GC合計(2×109GC/g脳質量);成人の脳=1300グラム;ヒトの出発用量(5×イヌMED)、1.4×1013GC合計(1.1×1010GC/g脳質量)。このアプローチがなければ、唯一の選択肢は種特異的導入遺伝子によるベクターからの有効性データを外挿することであり、それは効能に重要な差異を有してもよく、またはヒトタンパク質に対してさらに免疫寛容であるあまり代表的ではない動物モデルに研究を動かし得る。新生仔寛容の誘導プロトコールが免疫抑制剤の二次的な結末を回避する明瞭な利点を有するけれども、この設定では薬理学的な免疫抑制も採用することができる。
I及び他のリソソーム蓄積疾患についての新生児スクリーニングの進行中の実施は新生児寛容の誘導プロトコールの臨床的評価に決定的に重要であろう。
A.髄内送達
この研究の目的は、6~9ヵ月齢のヒト乳児に発達上類似するモデルである1ヵ月齢のアカゲザルにてヒトIDUAを発現するAAV9ベクターであるAAV2/9.CB7.CI.hIDUAco.RBGの髄内(IT)投与の安全性を評価することだった。加えて、この研究は血清または脳脊髄液(CSF)における導入遺伝子産物に対する抗体がベクター投与の安全性及びヒトIDUAの活性に影響を及ぼすかどうかを評価した。
この研究で使用したベクターには、rAAV9.hIDUA、rAAV8.hIDUA及び無関係な導入遺伝子(hFIX)を有するAAV8ベクターが含まれる。
に対して免疫寛容を誘導するために、出生後1日目(研究では0日目)にて2匹の動物にrAAV8.hIDUA(1012GC/kg)のIV注入を投与した。対照動物には、出生後1日目にて肝特異的プロモータから無関係な導入遺伝子(ヒト第IX因子)を発現する対照ベクター(rAAV8.hFIX)を投与した。次いで、動物はすべて1ヵ月齢(研究の30日目)にて後頭下穿刺によってITでのAAV9.MPSI試験ベクターを投与した。
4匹の1ヵ月齢のアカゲザル(M.mulatta)に3×1012GC/kgのrAAV9.hIDUAをITで投与し、ベクター投与の後1年を超えてモニターした。これらの動物のうち2匹はヒトIDUAタンパク質に対して出生時寛容化した。
ベクターは、サイトメガロウイルスのプロモータ(CMV)とキメライントロン(PI)とコドンを最適化したヒトIDUA導入遺伝子(hIDUA)とポリアデニル化シグナル(SV40)とから成る発現カセットをパッケージするAAV9カプシドから成った。発現カセットにはAAV血清型2の逆方向末端反復が隣接した。この研究ではベクターは1つ使用されたが、このベクターは、AAV2/9.CMV.PI.hIDUA.SV40、AAV2/9.CMV.PI.hIDUAco.SV40、AAV2/9.CMV.PI.hIDUAco.SV40PAまたはAAV9.CMV.PI.hIDUA.SV40のいずれかとして示される。
この研究には、2匹のメスのカニクイザル(ID06-09及び07-19)が含まれた。双方のカニクイザルは1012ゲノムコピー/kg体重(GC/kg)のAAV2/9.CMV.PI.hIDUAco.SV40PAの投与を受けた。それが臨床使用で提案された経路なので、後頭下穿刺を介した髄内(IT)投与が選択された。
2匹のメス成熟カニクイザルをCNVプロモータからヒトIDUAを発現するAAV9ベクターの髄内注入によって処理した。ベクター投与ののち研究の1、7、14、28、91、118、147、182、208、239、261、294、322、350、378、413、434、462、490、518、561、589、624、及び636日目に、体重、身体検査、及び血球数及び血清臨床検査値を評価し、その後、組織病理及びベクターの生体分布の解析のために動物を剖検した。ベクターに関連した臨床的な有害事象はなかった。1匹の動物がベクター投与の600日後に大腿動脈瘤を発症した。これは反復した採血に続発すると考えられ、処理関連でありそうにない。最終CSFパラメータを含む臨床病理パラメータに対する処理関連の影響はなかった。組織病理はCNS病変の証拠を示さず、末梢器官における明らかなベクター関連の異常を示さなかった。生体分布の解析は、例外1つを伴って末梢器官よりも1~2桁多い、双方のNHPSの脳及び脊髄におけるベクターの沈着を示した。AAV9カプシドに対する予め存在する中和抗体がない動物1匹にて有意な肝臓分布が生じ、その際、ベクターに対する血清抗体が予め存在する動物は最小限の肝臓の形質導入を示した。双方の動物からの脳切片の免疫染色はヒトIDUAの発現を明らかにした。
処理に遭遇したことがないマウスと同様に導入遺伝子産物であるヒトのイズロニダーゼ(IDUA)に対する既存の抗体を持つマウスにおいてAAV9.hIDUAの脳室内(ICV)投与に続く毒性の証拠を評価するように予備研究が設計された。
この研究は、アカゲザルにおける画像誘導の後頭下穿刺法によって投与後180日までのAAV9.CB7.hIDUAの安全性及び生体分布を評価した。成熟アカゲザル(n=9、メス6、オス3、1A、B及びC群)に画像誘導の後頭下穿刺法によって1.1×1011GC/g脳質量の用量に近似的に相当する1013GCのAAV9.CB7.hIDUAの単回用量を投与した。追加の3匹の動物(メス2、オス1、2A及びB群)に画像誘導の後頭下穿刺法によって溶媒(エリオットB(登録商標)+0.001%プルロニック(登録商標)F68)の単回用量を投与した。被験物質または対照物質の投与ののち14日目(1A及び2A群)、90日目(1B及び2B群)または180日目(1C群)に動物を安楽死させ、剖検した。毒性は、研究の0、3、7、14、21、30、45、60及び90日目に毎日の観察によって、及び身体検査、CBCや血清の化学パネル、凝固パネル、及びCSFの細胞数の解析、タンパク質やグルコースの濃度によって評価した。剖検では、病理学者が肉眼病変について組織を評価し、顕微鏡で調べた。ベクターのカプシド及び導入遺伝子産物に対するT細胞応答はELISPOTによって評価し、導入遺伝子産物に対する抗体反応はELISAによって血清及びCSFにて測定した。ベクターの生体分布はqPCRによって評価した。
AAV9.hIDUA試験ベクター(エリオットB(登録商標)+0.001%プルロニック(登録商標)F68における)を評価した。この研究には12匹のアカゲザルが含まれた。動物は無作為に5群に割り当てた。オス1及びメス2から成る試験群1A、1B及び1Cを試験ベクターで処理し、それぞれ、研究の14±2日目、90±2日目、または180±2日目に安楽死させ、剖検した。2A群及び2B群の動物は溶媒(エリオット製剤緩衝液)で処理し、それぞれ14±2日目または90±2日目に安楽死させ、剖検した。
側臥位にてX線台に置いた。注入の部位を無菌的に準備した。無菌法を用いて、21~27ゲージで1~1.5インチのQuinckeクモ膜下穿刺針(Becton Dickinson)をCSFの流動が観察されるまで後頭下空間に進めた。ベースライン解析のために1.0mLまでのCSFを採取した。蛍光顕微鏡(OEC9800 C-Arm,GE)を用いた脊髄造影法を介して針の正しい配置を検証した。CSFを採取した後、ルアーアクセスの延長カテーテルをクモ膜下穿刺針に接続してイオヘキソール(商品名:オムニパック180mg/mL、General Electric Healthcare)造影剤と被験物質または対照物質の投薬を促した。カテーテルとクモ膜下穿刺針を介して1mLまでのイオヘキソールを投与した。大槽における造影剤の観察によって針の正しい配置を確認したのち、試験物質または溶媒(1.4mLの容量、1mLに注射器の体積とリンカーのデッドスペースを加えたものに等しい)を含有する注射器を柔軟なリンカーに接続し、20~60秒にわたってゆっくり注入した。針を取り出し、穿刺部位に直圧を適用した。
ベクターの投与処置に関連した有害事象はなかった。AAVベクターゲノムは、AAV9.hIDUA試験ベクターで処理した動物すべての脳及び脊髄の全体にわたって測定した時点すべてにおいて検出され、レベルはこれらの組織では時間を超えて同等だった。末梢臓器、特に肝臓にて有意なベクターの分布もあり、末梢組織におけるベクターゲノムのレベルは時間を超えて同等だった。溶媒対照にも14日で安楽死させた試験ベクター動物にも臨床的な、肉眼でのまたは組織学的な知見はなかった。軽い一時的なCSFでの単核細胞増加症が5/6のAAV9.hIDUA処理動物で観察され、ピークは投与後30日前後だった。
rAAV9.CB7.hIDUAは、(i)hIDUAベクターゲノムプラスミドと、(ii)AAVのrep2とcap9の野生型遺伝子を含有するpAAV29と呼ばれるAAVヘルパープラスミドと、(iii)pAdΔF6(Kan)と呼ばれるヘルパーアデノウイルスプラスミドとのヒトHEK293MCB細胞への三重形質移入によって作製する。パッケージされたベクターゲノムのサイズは4344ntである。
アクチンのイントロン(CI)の存在によって増強される。発現カセットのためのポリAシグナルはウサギβグロビン(RBG)のポリAである。プラスミドはコドンを最適化し、hIDUA配列[配列番号1]を合成することによって構築され、得られた構築物は次いでプラスミド、pENN.AAV.CB7.CI.RBG(p1044)、CB7とCIとRBGを含有するAAV2のITRが隣接する発現カセットの発現要素にクローニングされてpAAV.CB7.CI.hIDUAco.RBG(p3032)を得た。
AAV2/9ヘルパープラスミドpAAV29KanRRepは4つの野生型AAV2repタンパク質とAAV9に由来する3つの野生型AAV VPカプシドタンパク質をコードする。キメラパッケージ構築物を作り出すために、先ず、野生型AAV2のrep及びcap遺伝子を含有するプラスミドp5E18からAAV2のcap遺伝子を取り出し、肝臓DNAから増幅したAAV9のcap遺伝子のPCR断片で置き換えた。得られたプラスミドは識別子pAAV2-9(p0008)を与えられた。正常ではrepの発現を推進するAAVのp5プロモータがこの構築物ではrepの5’末端からcapの3’末端に動かされることに留意のこと。この配置は、プロモータとrep遺伝子(すなわち、プラスミドの主鎖)の間にスペーサーを導入し、repの発現を下方調節し、ベクターの作製を支援する能力を高めるのに役立つ。p5E18におけるプラスミドの主鎖はpBluescriptKSに由来する。AAV2/9ヘルパープラスミドpAAV29KanRRep2は4つの野生型AAV2repタンパク質と3つの野生型AAV VPカプシドタンパク質とカナマイシン耐性とをコードする。
塊を生成させるCorningTフラスコとCS-10を用いて細胞を5×109~5×1010個まで増やすであろう。ガンマ線照射したUSが供給源の10%ウシ胎児血清(FBS)を補完したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で構成される培地にて細胞が培養されるであろう。細胞は足場依存性であり、細胞の解離は動物産物を含まない解離試薬であるTrypLE Selectを用いて達成されるであろう。細胞の播種は無菌で使い捨てのバイオプロセスバッグ及び配管セットを用いて達成されるであろう。細胞は、37℃(±2℃)で5%(±0.5%)CO2の雰囲気にて維持されるであろう。細胞培養培地は新鮮な無血清のDMEM培地で置き換えられ、最適化されたPEIに基づく形質導入法を用いて3種の作製プラスミドで形質移入されるであろう。作製過程で使用されるプラスミドはすべてCMO品質システムならびにcGMP製造の最も際立った特徴;追跡可能性、文書管理及び材料分離を利用する基礎構造という背景において作製されるであろう。
分子を運び、廃棄の流れに運び込む。溶液を再循環させることによって、平行な流れが膜表面を掃き、膜孔の汚染を防ぐ。適当な膜孔サイズ及び表面積を選択することによって所望の分子を保持し、濃縮する一方で液体試料は容量が急速に減らされてもよい。TFF適用における透析濾過には、新鮮な緩衝液の液体が膜を通過する同じ速度で再循環している試料への及び廃棄の流れへの添加が関与する。透析濾過の体積の増加に伴って、増量した小分子が再循環している試料から除かれる。これは、清澄化した生成物の控えめな精製を生じるが、後に続くアフィニティクロマトグラフィ工程と適合性である緩衝液交換も達成する。従って、我々は20mMのトリスpH7.5と400mMのNaClで構成される緩衝液の4容量でその後透析濾過される濃縮のための100kDaのPES膜を利用する。透析濾過された生成物は4℃で一晩保存され、さらに、1.2μm/0.22umの深層濾過器カプセルによって清澄化し、析出物質を取り除くであろう。
の仕様に従って標識されるであろう。ラベルを付けたバイアルは≦-60℃で保存される。
血清型の同一性、中空粒子の含量及び導入遺伝子産物の同一性を含む特徴付けアッセイが行われる。アッセイの説明は以下に現れる。
ウイルスベクターのゲノムDNAを単離し、プライマーウォーキングを用いた2倍配列包括度によって配列が決定されるであろう。配列比較が行われ、予想配列と比較されるであろう。
ベクターのAAV2/9血清型の確認は、質量分光分析(MS)によるVP3カプシドタンパク質のペプチドの解析に基づいたアッセイによって達成される。方法には、SDS-PAGEゲルから切り出したVP3タンパク質のバンドの多重酵素消化(トリプシン、キモトリプシン、及びエンドプロテイナーゼGlu-C)、とその後のカプシドタンパク質の配列決定を行うためのQ-Exactive Orbitrap質量分光計におけるUPLC-MS/MSでの性状分析が関与する。宿主タンパク質生成物の差し引き及び質量スペクトルから導き出したカプシドタンパク質の配列を可能にする直列質量スペクトル(MS)法が開発された。
oqPCRに基づいたゲノムコピー力価が連続希釈の範囲にわたって決定され、同族のプラスミド標準(pAAV.CB7.CI.hIDUAco.RBG.KanR)と比較されるであろう。oqPCRはDNA分解酵素I及びプロテイナーゼKによる逐次消化とそれに続くqPCR解析を利用して、カプシドに包まれたベクターゲノムのコピーを測定する。DNAの検出は、RBGポリA領域とハイブリッド形成する蛍光でタグを付けたプローブと組み合わせたこの同じ領域を標的とする配列特異的なプライマーを用いて達成されるであろう。プラスミドDNAの標準曲線との比較はPCR後の試料の操作を必要とすることなく力価の決定を可能にする。多数の標準、検証試料及び対照(バックグランド及びDNAの混入のための)がアッセイに導入されている。このアッセイは現在制限されていないが、CMOによって制限されるであろう。アッセイは、感度、検出の限界、制限の範囲、及びアッセイ内やアッセイ間の精度を含むアッセイのパラメータを確立し、定義することによって制限されるであろう。内部AAV9参照ロットが確立され、適格性試験に使用されるであろう。我々の以前の経験は、ここに記載されている最適化されたqPCRによって得られる力価が前臨床データの生成で使用された我々の標準qPCRによって達成されたものよりも一般に2.5倍高いことを示唆していることに留意のこと。
薬剤製品の粒子総含量はSDS-PAGE解析によって決定されるであろう。イオジキサノール勾配で精製される参照ベクターの調製物は種々の方法(分析用超遠心、電子顕微鏡、及び260/280nmでの吸光度)によって解析され、調製物が>95%のゲノム含有(完全)粒子を含有することを立証する。この参照物質を既知のゲノムコピー数(従
って延長上で考えると粒子数)に連続希釈し、類似の希釈系列の薬剤製品と共にSDS-PAGEゲルにて泳動する。参照物質及び薬剤製品VP3タンパク質のバンド双方のピーク領域の体積をデンシトメトリーによって測定し、参照物質の体積を粒子数に対してプロットする。薬剤物質の粒子総濃度はこの曲線からの外挿によって決定され、次いでゲノムコピー(GC)力価を差し引いて中空粒子の力価を得る。中空粒子の完全粒子に対する比は中空粒子力価に対するGC力価の比である。
感染力価(IU)を用いてRC32細胞(rep2を発現しているHeLa細胞)におけるベクターの生産的取り込み及び複製を判定する。以前公開されたものに類似する96穴終点形式が採用されている。手短には、rAAV9.CB.hIDUAの連続希釈及び各希釈でrAAVの12の複製を伴う単一希釈のAd5によってRC32細胞を同時に感染させる。感染の72時間後、細胞を溶解し、qPCRを行ってrAAVベクターの入力に比べた増幅を検出する。TCID50算出の終点希釈(Spearman-Karber)を行ってIU/mlとして表される複製力価を決定する。「感染力」の値は細胞と接触する粒子、受容体結合、内部移行、核への輸送及びゲノム複製に左右されるので、それらは、アッセイの構造、及び使用される細胞株における適当な受容体及び結合後の経路の存在によって影響を受ける。受容体及び結合後の経路は普通、不死化された細胞株では維持されないので、感染力アッセイの力価は存在する「感染性」粒子の数の絶対測定値ではない。しかしながら、カプシドに包まれたGCの「感染性単位」に対する比(GC/IU比として記載される)はロットからロットの間での製品一貫性の測定値として使用することができる。
作製過程で生じる可能性があり得る複製能力を持つAAV2/9(rcAAV)の存在について試料が解析されるであろう。細胞に基づく増幅及び継代とそれに続くリアルタイムqPCRによるrcAAVのDNAの検出(cap9標的)から成る3継代アッセイが開発されている。細胞に基づく成分は、試験試料及び野生型ヒトアデノウイルス5型(Ad5)の希釈物を伴うHEK293細胞の植菌単層(P1)から成る。1010GCのベクター生成物が調べた生成物の最大量であろう。アデノウイルスの存在のゆえに、複製能力のあるAAVは細胞培養にて複製するであろう。2日後、細胞溶解物を生成し、Ad5を熱不活化する。清澄化した溶解物を次いで2回目の細胞(P2)に入れ、(再びAd5の存在下で)感度を高める。2日後、細胞溶解物を生成し、Ad5を熱不活化する。清澄化した溶解物を次いで3回目の細胞(P3)に入れ、(再びAd5の存在下で)感度を最大化する。2日後、細胞を溶解し、DNAを遊離させ、次いでそれをqPCRに供し、AAV9 cap配列を検出する。Ad5依存性の様子でのAAV9 cap配列の増幅はrcAAVの存在を示す。AAV2rep遺伝子とAAV9cap遺伝子とを含有するAAV2/9代理陽性対照の使用は、アッセイの検出限界(LOD)が決定される(0.1、1、10及び100IU)のを可能にし、rAAV9.CB7.hIDUAベクターの連続希釈(1×1010、1×109、1×108、1×107GC)を用いて試験試料に存在するrcAAVのおよそのレベルを定量することができる。
qPCRのGC力価を遺伝子発現に関連付けるために、既知の感染効率の細胞当たりのGCによってHuh7またはHEK293細胞に形質導入し、形質導入の72時間後IDUA活性について上清をアッセイすることによって試験管内のバイオアッセイが行われるであろう。IDUA活性は、0.1mlの水で希釈した試料を100ミリモル/Lの4M
U-イズロニド0.1mlと共に37度で1~3時間インキュベートすることによって測定される。290ミリモル/Lのグリシン2ml、180ミリモル/Lのクエン酸ナトリウムpH10.9の添加によって反応を止め、4MUの標準希釈に対する蛍光を比較することによって遊離した4MUを定量する。高度に活性がある前臨床及びtoxのベクター調製物は製品活性の解釈を可能にするであろう。
ビシンコニン酸アッセイを用いたウシ血清アルブミン(BSA)の標準曲線に対する総タンパク質についてベクター試料を先ず定量する。キットで提供されているMicro-BCA試薬と等量の試料を混合することによって測定は行われる。同じ手順がBSA標準の希釈に対して適用される。混合物を60℃でインキュベートし、吸光度を562nmで測定する。4パラメータ適合を用いて既知の濃度の標準吸光度から標準曲線を生成する。4パラメータ回帰に従って未知の試料が定量される。
成熟カニクイザルに1×1012GC/kgのAAV9.CMV.hIDUAを後頭下で注入し、636日後、組織を回収し、即座に-80℃に凍結する。QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)を用いて細胞性の全DNAを組織から抽出する。抽出したDNAにおけるベクターゲノムの検出及び定量は、SV40ポリA内の配列を標的とするプライマー及びプローブのセットを用いたリアルタイムPCR(TaqMan Universal Master Mix, Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)によって実施する。PCR条件は、それぞれ鋳型としての100ngの細胞性の全DNA、300nMのプライマー及び200nMのプローブで設定する。サイクルは、95.8℃で10分間、95.8℃で15秒間と60.8℃で1分とを40サイクルだった。
を止める。4MUの標準希釈に対する蛍光を比較することによって遊離した4MUを定量する。単位は、タンパク質のmg当たり時間当たり遊離したナノモルの4MUとして与えられる。
本研究では、MPS Iイヌに由来するCSF試料の代謝産物のプロファイリングを行ったが、それはCSFのメタボロームにおける実質的な疾患関連の変化を明らかにした。最も顕著な差異は正常対照に比較したスペルミンのレベルでの30倍の上昇だった。この知見はMPS I患者の試料と同様にMPS Iのネコモデルで確認された。スペルミンはHSに結合し、スペルミンの細胞への取り込みはこの相互作用に依存する[M.Belting,S.Persson,L.-Å.Fransson,Proteoglycan involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal,338,317-323(1999);J.E.Welch,P.Bengtson,K.Svensson,A.Wittrup,G.J.Jenniskens,G.B.Ten Dam,T.H.Van Kuppevelt,M. Belting,Single chain fragment anti-heparan sulfate antibody targets the polyamine transport system and attenuates polyamine-dependent cell proliferation.International journal of oncology,32,749-756(2008);published online EpubApr]。グリピカン-1のような細胞表面のプロテオグリカンはそのHS部分を介してスペルミンを結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、HS鎖の細胞内切断は結合したスペルミンを細胞内で遊離させる(K.Ding,S.et al,The Journal of biological chemistry,276,46779-46791,(2001);published online EpubDec,14)。従って、インタクトなHSの再生利用はスペルミンの取り込みに必須である。MPS Iでは、細胞外のスペルミンの蓄積は、不十分なHSの再生利用のゆえのこの取り込みメカニズムの阻害を介して、またはMPSで蓄積する細胞外GAGへのスペルミンの単純な結合を介して生じ、スペルミン結合の平衡をシフトさせて細胞外分布をより好む。さらなる研究はMPS IのCSFにおけるスペルミン蓄積に対するこれらのメカニズムの相対的な寄与に対処すべきである。
nnectivity.Current opinion in neurobiology,16,40-51(2006);published online EpubFeb(10.1016/j.conb.2006.01.011)]。従って、スペルミンの蓄積はMPS Iにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子の1つであってもよい。
実験設計:この研究は当初、健常対照に由来する試料に比べてMPS I患者のCSF試料にて有意に異なるレベルで存在する代謝産物を検出するように設計された。MPS IHの小児及び健常対照に由来するCSF試料の限定された利用可能性のせいで、その後ヒト試料にて候補生体マーカーを評価するつもりで、当初の評価は多数が利用できるMPS Iイヌに由来するCSF試料を用いて実施した。個々の未処理のMPS Iイヌに由来する合計15のCSF試料が分析に利用可能であり、追加の15試料は健常対照から得られた。前向き代謝産物評価におけるMPS IイヌのCSFにて上昇したスペルミンを特定した後、遺伝子治療によって処理されたMPS Iイヌ及びネコの以前の研究に由来するCSF試料と同様に患者の試料にてスペルミンを後向きに測定した。これらの分析のための各群に含まれる対象の数は試料の利用性によって限定され、統計的考慮に基づかなかったので、場合によっては数は統計的比較には不十分である。各状態について定量された細胞の数は、状態当たり>30細胞が細胞当たりの分枝長、神経突起数または神経突起分岐で20%の差異を検出するのに必要とされることを示した予備実験に基づいた。細胞をプレートに入れ、指定された薬剤で処理した後、ウェルをコード化し、細胞画像の取得及び神経突起長や分岐の手動での定量が盲検化したレビュアーによって実施された。異なる基材(チャンバースライド(SigmaS6815)ではなくポリ-L-リシン(Sigma)でコーティングされた組織培養プレート)を用いて野生型とMPSのマウスのニューロンの比較を繰り返し、類似の結果だった。双方の基材を用いて、スペルミン添加の有無で野生型ニューロンの比較を4回行い、類似の結果だった。CSF代謝産物のプロファイリング:CSF代謝産物のプロファイリングはMetabolonによって行った。
のために取っておいた試料1つに分割した。試料を手短にTurboVap(登録商標)(Zymark)に載せ有機溶媒を取り除いた。LCについては、解析についての調製の前に試料を一晩窒素のもとで保存した。GCについては、解析についての調製の前に各試料を一晩真空下で乾燥させた。
央値を設定することによって設備の日間調整の差異の結果生じる変動を補正した。これは試料間の変動を防いだが、同じグラフ尺度で比較される広く異なる生ピーク面積の代謝産物を許した。欠測値は基準化の後に観察された最小値に帰属させた。
EpubFeb(10.1016/j.conb.2006.01.011)。生ピークデータを対数変換し、正常試料の値の平均値に対して基準化した。他の統計的解析はすべてGraphPad Prism6で行った。培養したニューロンの分枝長、神経突起数、及び分岐をANOVAとその後のDunnettの検定によって比較した。CSFの
スペルミン及び皮質のGAP43はKruskal-Wallisの検定とその後のDunnの検定によって比較した。
はGAPDH対照に比べて表す。
1.代謝産物のプロファイリングを介した上昇したCSFスペルミンの特定
CSF代謝産物の当初の評価はMPS Iのイヌモデルを用いて行った。これらの動物はIDUA遺伝子にてスプライス部位に突然変異を持ち、酵素発現の完全な喪失及びMPS I患者のそれに類似する臨床的及び組織学的な特徴の発達を生じる(K.P.Menon,et al,Genomics,14,763-768,(1992);R.Shull,et al.,The American journal of pathology,114,487(1984))。CSF試料は15匹の正常イヌ及び15匹のMPS Iイヌから採取した。CSF試料はLC及びGC-MSによって代謝産物の相対的な量について評価した。質量分光計によってCSF試料にて合計281の代謝産物を陽性で特定することができた。これらのうち、47(17%)は対照に比べてMPS Iイヌで有意に上昇し、88(31%)は対照に比べて低下していた。群間で最も異なる50代謝産物のヒートマップを図17Aに示す。代謝産物のプロファイリングは、MPS Iイヌと正常イヌとの間でポリアミン、スフィンゴ脂質、アセチル化アミノ酸及びヌクレオチドの代謝において顕著な差異を特定した。ランダムフォレストクラスター化解析は、MPS Iイヌと正常イヌとの間における代謝産物の差異への最大の寄与因子としてポリアミンスペルミンを特定した(図21)。試料採取の時点で1ヵ月齢未満だったMPS Iイヌ1匹を除いて、MPS Iイヌでは平均でスペルミンは30倍を超えて上昇した。CSFにおけるスペルミンを定量的に測定するために安定同位元素希釈(SID)-LC-MS/MSアッセイが開発された。ハーラー症候群の6人の幼児(6~26ヵ月齢)及び2人の健常対照(36及び48ヵ月齢)に由来する試料を評価した。双方の健常対照はアッセイの定量限界(1ng/mL)を下回るCSFのスペルミンのレベルを有したのに対して、MPS I患者に由来するCSF試料は平均で定量限界を10倍上回った(図17B)。MPS IH患者におけるスペルミンの上昇は、スペルミンの結合と取り込みにおけるHSの既知の役割に矛盾しないと思われた[M.Belting,et al,Journal of Biological Chemistry,278,47181-47189(2003);M.Belting,et al,Proteoglycan
involvement in polyamine uptake.Biochemical Journal,338,317-323(1999);J.E.Welch,et al,International journal of oncology,32,749-756(2008))]。正常イヌ及びMPS Iイヌの脳試料はポリアミン合成経路における転写上調節される酵素について類似のmRNA発現レベルを有するので、上昇した合成は上昇したCSFスペルミンの原因ではありそうにないと思われた。
軸索の損傷に続いて、ニューロンはポリアミン合成を上方調節し、それは神経突起の伸長を促進する(D.Cai,et al,Neuron,35,711-719(2002);published online EpubAug,15;K.Deng,et
al,The Journal of neuroscience,:the official journal of the Society for Neuroscience,29,9545-9552(2009);published online EpubJul,29;Y.Gao,et al,Neuron,44,609-621(2004);published online EpubNov,18;R.C.Schreiber,et al.,Neuroscience,128,741-749(2004))。従って我々は、MPSのニューロンで記載されている異常な神経突起過剰成長の表現型におけるスペルミンの役割を評価した(Hocquemiller,S.,et al,Journal of neuroscience research,88,202-213(2010))。MPS Iマウスに由来するE18皮質ニューロンの培養はコロニーの野生型マウスに由来するニューロンよりも培養にて4日後、大きな神経突起数、分岐及び合計分枝長を示した(図19A~F)。スペルミン合成の阻害剤であるAPCHAによるMPSニューロンの処理は神経突起成長と分岐を有意に減らした。この効果はスペルミンを置き換えることによって反転できた(図18A~F)。同じ濃度のAPCHAは正常ニューロンの成長に影響を及ぼさなかった。生体内で特定されたものに類似する濃度で野生型ニューロンの培養にスペルミンを添加することは神経突起成長と分岐において有意な増加を生じた(図18A~F)。
生体内でのGAP43の発現及びスペルミンの蓄積に対するIDUA欠乏の効果を評価するために、我々は、未処理のMPS Iイヌと同様にCNS指向型の遺伝子治療で処理したものにてCSFのスペルミンのレベル及び脳のGAP43のレベルを測定した。我々は以前、イヌIDUA導入遺伝子を運ぶアデノ随伴ウイルス血清型9ベクターの髄内注入で処理した5匹のMPS Iイヌを記載した(C.Hinderer,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy,23,1298-1307(2015);published online Epub Aug)。MPS Iイヌは正常なIDUA酵素に対する抗体を発生することができるので、イヌのうち2匹は新生仔として肝臓IDUA遺伝子導入で予備処理してそのタンパク質に対する免疫寛容を誘導した。寛容化されたイヌは双方とも、AAV9処理に続く正常を十分に上回る脳IDUA活性を示した。3匹の寛容化されなかったイヌは様々なレベルの発現を示し、1匹の動物は正常より大きいレベルに達し、他の2匹はほぼ正常の発現を示した(図19A~D)。CSFのスペルミン低下は脳のIDUA活性に反比例し、最低のIDUA発現の2匹のイヌでは未処理の動物に比べて3倍の低下を示し、最高の発現の動物では20倍を超える低下があった(図19A~D)。GAP43はMPS Iイヌの前頭皮質では上方調節され、発現はベクターで処理した動物すべてにおいて正常化された(図19A~19D)。
ミンのレベルとIDUAの再構成との間の関係性を評価した。新生仔肝臓遺伝子導入によってヒトIDUAに対して予め寛容化したMPS Iイヌを3つの用量(1010、1011、1012GC/kg、用量当たりn=2)のうち1つでのヒトIDUAを発現するAAV9ベクターの髄内注入によって処理した(C.Hinderer,et al,Neonatal tolerance induction enables accurate evaluation of gene therapy for MPS I in a canine model.Molecular Genetics and Metabolism,http://dx.doi.org/10.1016/j.ymgme.2016.06.006))。注入の6ヵ月後、CSFのスペルミンを評価した(図20A-20B)。CSFのスペルミンの低下は用量依存性であり、中程度及び高い用量の動物は正常範囲に達したのに対して低用量の動物ではCSFのスペルミンは部分的に低下するに過ぎなかった。IDUA欠乏とCSFスペルミンの蓄積の間での関係を独立して検証するために、我々はMPS IのネコモデルにてCSFスペルミンのレベルを評価した。我々が以前報告した遺伝子治療研究に由来するCSF試料を用いて、我々は、未処理のMPS Iネコは高いCSFスペルミンを示すことを見いだした(図20A、20B)(C.Hinderer,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of
Gene Therapy.22,2018-2027(2014);published online EpubDec(10.1038/mt.2014.135))。ネコIDUAを発現する高用量のAAV9の髄内投与はCSFスペルミンのレベルを正常化した(図20A)。
本研究で我々はMPS Iイヌに由来するCSF試料の代謝産物のプロファイリングを行い、それはCSFメタボロームにおける実質的な疾患関連の変化を明らかにした。最も顕著な差異は正常対照に比べたスペルミンのレベルでの30倍を超える上昇だった。この知見はMPS I患者と同様にMPS Iのネコモデルにて確認された。スペルミンは高親和性でHSに直接結合し、スペルミンの細胞取り込みはこの相互作用に左右される(M.Belting,S.PERSSON,L.-A.Fransson,Proteoglycan involvement in polyamine uptake. Biochemical Journal,338,317-323(1999);J.E.Welch,et al,International journal of oncology,32,749-756(2008))。グリピカン-1のような細胞表面のプロテオグリカンはそのHS部分を介してスペルミンを結合することができ、グリピカンタンパク質のエンドサイトーシスの後、HS鎖の細胞内切断は結合したスペルミンを細胞内で遊離させる(Belting,et al.上記で引用;K.Ding,S.et
al,The Journal of biological chemistry,276,46779-46791,(2001);published online EpubDec,14)。従って、インタクトなHSの再生利用はスペルミンの取り込みに必須である。IDUAの欠乏のゆえの不十分なHSの再生利用はこのスペルミンの取り込みメカニズムを阻害し、細胞外スペルミンの蓄積をもたらす。或いは、細胞外GAGがスペルミンを隔離し、平衡をシフトさせて細胞外分布に有利に働いてもよい。この研究におけるLC-MSの試料調製で採用されるメタノール脱タンパク質工程も可溶性HSを沈殿させるということは、CSFで検出されるスペルミンは結合していないので、GAGの結合ではなく取り込みの阻害が細胞外スペルミンの蓄積の原因であることを示唆している(N.Volpi,Journal of chromatography.B,Biomedical applications,685,27-34(1996);published online EpubOct,11)。神経ネットワークの形成及び維持は神経突起成長及びシナプス形成の正確な制御を必要とする。発生の間、CNSの環境は神経突起の形成に対してだんだん阻害性になっていき、ミエリン関連タンパク質が成人
の脳では神経突起成長を大きく遮断している。神経突起成長の低下に向かうこの発生上のシフトはGAP43の発現と平行する(S.M.De la Monte,et al,Developmental Brain Research,46,161-168(1989);published online Epub4/1/)。MPSのニューロンが示す持続するGAP43の発現及び誇張された神経突起の伸長が阻害と成長の促進シグナルのこの正常な均衡を妨げ、その結果、異常な結合性及び損傷された認知を生じてもよい(Hocquemiller,et al,上記で引用)。HSの蓄積が神経突起成長の増加にどのようにつながるのかは解明されていない。多数の研究が神経突起の伸長にポリアミンを関与させ;軸索の損傷に続いて、スペルミン及びその前駆体であるプトレシン及びスペルミジンの合成についての律速酵素が上昇し、ミエリンからの阻害性シグナルが存在しても神経突起の伸長の増強を可能にする(Cia(2002),Deng(2009),Gao(2004)すべて上記で引用)。さらに、プトレシンによるニューロンの処理はCSFに直接注入されると神経突起成長を誘導し、効果はスペルミン合成の阻害剤によって阻止される(Deng(2009);上記で引用)。ポリアミンが神経突起成長に対して効果を発揮するメカニズムは知られていない。可能性のある標的の1つは、NMDA受容体であり、その活性化はスペルミンの結合によって強化される。(J.Lerma,Neuron,8,343-352(1992);published online Epub2//(http://dx.doi.org/10.1016/0896-6273(92)90300-3))。NMDAのシグナル伝達は神経突起の伸長を誘導し、受容体のスペルミン感受性のサブユニットは発生の間、高度に発現される(D.Georgiev,et al,Experimental cell research,314,2603-2617(2008);published online EpubAug,15(10.1016/j.yexcr.2008.06.009);R.G.Kalb,Regulation of motor neuron dendrite growth by NMDA receptor activation.
Development,120,3063-3071(1994);J.Zhong,et al,Journal of neurochemistry,64,531-539(1995))。とりわけ、多数の神経栄養因子はHSが修飾した受容体を介して結合し、細胞外マトリクスにおけるHSとの相互作用は神経突起成長に影響を及ぼすことができる(D.Van Vactor,et al,Current opinion in neurobiology,16,40-51(2006);published
online EpubFeb(10.1016/j.conb.2006.01.011))。従って、スペルミンの蓄積はMPS Iにおける異常な神経突起成長を促進する幾つかの因子の1つであってもよい。CSF試料が評価された15匹のMPS Iイヌのうち、1匹だけがスペルミン濃度の正常範囲内に入った。28日齢で、これは研究に含まれた最も幼若な動物だった。この研究はそれがハーラー症候群の乳児で6ヵ月齢までにすでに上昇することを実証しているが、この知見はスペルミンの蓄積が年齢依存性であってもよいことを示している。将来の研究はMPS患者にてCSFスペルミンのレベルを長期にわたって評価すべきである。ほとんどの患者は発達遅滞の発症に先立って1~2年の正常な発達を経験するので、もし、スペルミンがMPS患者の年齢と共に増加するのであれば、これは認知低下の動態を説明し得る。神経突起成長を変化させる代謝産物の蓄積を誘発する損傷されたHS代謝の可能性は、MPSにおける酵素の欠乏と異常な神経突起成長の表現型との間での新規の関係性を指し示し、それはこれらの疾患に関連する認知不全を説明してもよい。将来の研究は他のMPSにおけるスペルミンの上昇を確認すべきである。これらの知見はまた、CSFのスペルミンが、MPSのための新規のCNS指向型の治療法の薬物動態を評価するための非侵襲性の生体マーカーとして有用であることも示している。CNS指向型の治療法についての将来の試験は認知評価項目とCSFスペルミンの変化との間の相関を評価すべきである。
A.前処置スクリーニングの評価
1.プロトコール来診1:スクリーニング
治験責任医師は、対象(または指定された介護者)がインフォームドコンセントにサインする際、完全に情報が与えられるために嚢内(IC)処置、投与処置自体及び可能性のある安全性リスクすべてにつながるスクリーニング過程を記載するであろう。
適格性をよく調べる適当な時間を与えるために、最初のスクリーニング来訪と試験来訪2(0日目)前の1週間までの間の時間で以下の手順が行われるべきである。
・ガドリニウムの有無での頭部/頸部の磁気共鳴画像診断(MRI)[注:対照はガドリニウムを受け取る好適な候補者でなければならない(すなわち、eGFR>30mL/分/1.73m2)]
・頭部/頸部のMRIに加えて、治験医師は屈曲/伸長試験を介した頸部のさらなる評価の必要性を判定するであろう
・MRIプロトコールにはT1、T2、DTI、FLAIR及びCINEのプロトコール画像が含まれるであろう
・CSFの流れの適切な評価及びCSF空間の間での連絡の考えられる遮断または喪失の特定を可能にする頭部/頸部のMRA/MRV(注:硬膜内/経硬膜手術の既往を持つ対象は除外されてもよく、またはさらなる検査(たとえば、放射線ヌクレオチド大槽造影法)を必要としてもよい)
・神経放射線科医/神経外科医の対象処置評価会議:3施設からの代表者が電話会議(またはウェブ会議)を有して利用できる情報(走査、既往歴、身体検査、臨床検査等)に基づいてIC処置について各対象の適格性を議論するであろう。あらゆる試みを行って対象を損なうIC処置または評価に向かう手続きの際の合意を達成すべきである(すなわち、各メンバーは行われた決断を受け入れる準備万端であるべきである)
・麻酔術前評価、MPS患者の特定の生理的必要性に留意しながら、気道、頸部(短縮した/肥厚した)及び頭部の可動域(頸部屈曲の程度)の詳細な評価を伴った-28日目~1日目
IC処置に先立って、CT室は以下の設備及び薬物が存在することを確認するであろう:
・成人腰椎穿刺キット(施設ごとに供給される)
・BD(Becton Dickinson)22または25ゲージ×3~7”のクモ膜下穿刺針(Quincke先端部)
・インターベンション医師の裁量で使用される(クモ膜下穿刺針の導入のための)同軸導入針(たとえば、18G×3.5”)
・旋回(回転)オスルアーロック付きの四方小口径活栓
・メスルアーロックアダプター付きのTコネクタ延長セット(配管)、およそ6.7”の長さ
・オムニパック180(イオヘキソール)、クモ膜下腔内投与用
・静脈内(IV)投与用のヨウ素化造影剤
・注入用の1%リドカイン溶液(成人LPキットで供給されなければ)
・予め充填された10cc生理食塩水(無菌)の水洗注射器
・X線不透過性マーカー(複数可)
・外科用準備装備/髭剃り刃
・挿管された対象の正しい位置決めを可能にする枕/支持体
・気管内挿管の装置、全身麻酔用の機械、及び人工呼吸器
・手術中の神経生理学的なモニタリング(IONM)装置(及び必要な人材)
・別々の薬局マニュアルに従って調製され、CT/手術室(OR)の部屋に運ばれるAAV9.hIDUAを含有する10ccの注射器
・試験及び手順についてのインフォームドコンセントが確認され、カルテ及び/または試験ファイルの中で文書化されるであろう。放射線科及び麻酔科のスタッフからの手順に関する別々の合意が施設内要件によって得られるであろう。
・試験対象は施設内指針に従って適当な病院内看護ユニットにて取り付けられる静脈内アクセスを有するであろう(たとえば、2つのIVアクセス部位)。静脈内流体は麻酔科医の裁量で投与されるであろう。
・麻酔科医の裁量で及び施設内指針ごとに、試験対象は、適当な患者看護ユニット、保持区域または外科/CTの処置室に誘導され、そこで全身麻酔の投与と共に気管内挿管を受けるであろう。
・腰椎穿刺を行い、先ず5ccの脳脊髄液(CSF)を取り出し、その後髄内に造影剤(オムニパック180)を注入して大槽の視覚化を助けるであろう。患者の適当な位置決め操作を行って造影剤の大槽内への拡散を促す。
・すでにそのように行われていないのであれば、手術中神経生理学的モニタリング(IONM)装置を対象に取り付けるであろう。
・対象は腹臥位または側臥位でCTスキャナー台に載せられるであろう。
・適当と見なされれば、対象は、術前評価の間安全であると判定される程度に頸部屈曲を提供し、且つ位置決めの後文書化される正常な神経生理学的なモニターシグナルを提供する方法で位置決めされるであろう。
・以下の試験スタッフ及び治験医師(複数可)が存在することを確認し、施設内で特定されるであろう。
゜処置を行うインターベンション医師/神経外科医
゜麻酔科医及び呼吸器技師
゜看護師及び医師助手
゜CT(またはOR)技師
゜神経生理学技師
゜現場研究コーディネーター
・頭蓋底の下の患者の皮膚は適宜剃られるであろう。
・CTスカウト画像化を行い、その後、必要とみなされればインターベンション医師よる処置前計画のIV造影剤でのCTを行い標的の位置を突き止め、脈管構造を画像化するであろう。
・いったん標的部位(大槽)が特定され、針の軌道が計画されると、皮膚が用意され、施設内指針のとおりに無菌技法を用いて手術用覆布で覆われるであろう。
・インターベンション医師によって指示されたようにX線不透過性マーカーが標的皮膚の位置に置かれるであろう。
・マーカーの下の皮膚は1%リドカインの浸潤を介して麻酔されるであろう。
・同軸導入針を使用する選択肢と共に、22Gまたは25Gのクモ膜下穿刺針が大槽に向かって進められるであろう。
・針を進めた後、施設内設備を用いて実現可能な最薄のCTスライス厚さ(理想的には
≦2.5mm)を用いてCT画像が得られるであろう。連続CT画像は、針及び関連する軟組織(たとえば、傍脊柱筋群、骨、脳幹及び脊髄)の適切な視覚化を可能にする可能な最低放射線量を使用すべきである。
・正しい針の配置は、針ハブにおけるCSFの観察及び大槽内での針の視覚化によって確認されるであろう。
・インターベンション医師は、ベクターを含有する注射器が滅菌野に近いが、その外側に置かれることを確認するであろう。ベクターを取り扱う、または投与することに先立って、施設は、滅菌野内での処置を支援するスタッフによって手袋、マスク及び眼の保護が行われることを確認するであろう(滅菌野の外側の他のスタッフはこれらの手順を取る必要はない)。
・短い(約6”)の延長配管を挿入されたクモ膜下穿刺針に取り付け、それを次いで四方活栓に取り付けるであろう。この装置が対象のCSFでいったん自給されると、10ccの予め充填された生理食塩水の水洗注射器が四方活栓に取り付けられるであろう。
・ベクターを含有する注射器がインターベンション医師に手渡され、四方活栓のポートに取り付けられるであろう。
・ベクターを含有する注射器に対する活栓のポートがいったん開放されると、注入の間に過剰な力がプランジャーにかからないように注意を払いながら、注射器の内容物はゆっくり(およそ1~2分間かけて)注入されるべきである。
・AAV9.hIDUA試験ベクターを含有する注射器の内容物がいったん注入されると、取り付けられた予め充填された注射器を用いて活栓と針の構築が1~2ccの生理食塩水で洗い流され得るように活栓が回されるであろう。
・準備ができると、インターベンション医師は彼/彼女が対象から装置を取り外すことをスタッフに注意喚起する。
・1回の動きで、針、延長配管、活栓及び注射器が対象からゆっくり取り外され、バイオハザード廃棄物容器または硬質容器(針用)の中に廃棄するための外科用トレイに置く。・針の挿入部位は出血またはCSFの漏出の兆候について調べ、治験医師によって指示されたように処理されるであろう。指示されたように、ガーゼ、外科用テープ及び/またはTegaderm包帯を用いて部位が手当てされるであろう。
・対象はCTスキャナーを出て、仰臥位でストレッチャーに乗るであろう。
・麻酔が中断され、麻酔後の看護についての以下の施設内指針について対象が看護されるであろう。神経生理モニターはこの研究対象から取り除かれる。
・回復の間、対象が横たわるストレッチャーの頭部をやや高くすべきである(約30度)。
・対象は、施設内指針のとおりに好適な麻酔後看護ユニットに移されるであろう。
・対象が適正に意識を回復し、安定な状態になった後、彼/彼女はプロトコールが命じる評価のために適当なフロア/ユニットに収容されるであろう。神経学的な評価がプロトコールのとおりに続き、治験責任医師は病院スタッフ及び研究スタッフと共同で対象の看護を監督する。
この研究の目的は、脳室内(ICV)注入及び腰椎穿刺を介した注入を含む、CSFへの投与のさらに日常的な方法を評価することであった。手短には、この研究では、ICVとICのAAV投与をイヌで比較した。ベクターの投与を非ヒト霊長類にて腰椎穿刺を介して評価し、一部の動物はベクターの頭蓋分布を改善することが示唆されている手順である、注入後のトレンデレンブルグ***に置いた。イヌの研究では、ICV及びICのベクター投与は脳及び脊髄の全体を通して類似する効率的な形質導入を生じた。しかしながら、ICVコホートの動物は、明らかに導入遺伝子産物に対する重度のT細胞応答のせいで脳炎を発症した。ICVコホートのみでのこの導入遺伝子に特異的な免疫応答の発生は導入遺伝子発現の部位での注入手順に由来する局在化した炎症の存在に関連することが疑われる。NHPの研究では、腰椎槽へのベクター投与に続く形質導入効率は、極度に大きな注入容量(CSF総容量のおよそ40%)を用いることによって我々の以前の研究に比べて改善した。しかしながら、このアプローチはIC投与よりも依然として効率が悪い。注入の後トレンデレンブルグ***に動物を置くことは追加の利益を提供しなかった。しかしながら、大きな注入容量はベクターの頭蓋分布を改善できることが見いだされた。
1.ベクターの作製:GFPベクターは、サイトメガロウイルスの前初期エンハンサを伴ったニワトリβアクチンプロモータと、人工イントロンと、増強緑色蛍光タンパク質cDNAと、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子と、ウサギβグロビンポリアデニル化配列とを含む発現カセットを運ぶAAV血清型9のカプシドから成った。GUSBベクターは、サイトメガロウイルスの前初期エンハンサを伴ったニワトリβアクチンプロモータと、人工イントロンと、イヌGUSBのcDNAと、ウサギβグロビンポリアデニル化配列とを含む発現カセットを運ぶAAV血清型9のカプシドから成った。ベクターはHEK293細胞の三重形質移入によって作製し、以前記載された[Lock,et al,Human gene therapy.Oct,2010;21(10):1259-1271]ようにイオジキサノール勾配で精製した。
イヌはすべて、研究における動物の飼育と使用に関する国立衛生研究所とUSDAの指針のもとでペンシルベニア大学獣医学部のヒト遺伝性疾患の動物モデルのための国立委託センターで育てられた(NIH OD P40-010939)。
この研究には9歳~12歳の間の6匹のカニクイザルが含まれた。動物は1回につき4~8kgの間で注入された。注入に先立ってベクター(2×1013GC)を5mLのオムニパック(イオヘキソール)180造影剤で希釈した。腰椎穿刺を介したベクターの注入は以前記載された[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online,2014;1]ように行った。髄内空間への正しい注入は蛍光透視法によって検証した。トレンデレンブルグ群の動物については、ベッドの頭部を注入の直後10分間30度下げた。安楽死及び組織採取は以前記載された[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online,2014;1]ように行った。
この研究には1歳のMPS Iイヌ6匹が含まれた。ICV処理したイヌすべてにおいてベースラインMRIを行い、注入の組み合わせを計画した。嚢内注入は以前記載された[Hinderer,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug,2015;23(8):1298-1307]ように行った。ICVの注入については、静脈内プロポフォールでイヌを麻酔し、気管内挿管し、イソフルランで麻酔下を維持し、定位固定枠に入れた。皮膚を無菌で準備し、注入部位の上で切開した。注入部位で単一の穿頭孔を開け、それを介して26ゲージの針を所定の深さに進めた。CSFの戻りで配置を確認した。ベクター(1mL中で1.8×1013GC)をゆっくり1~2分かけて注入した。安楽死及び組織採取は以前記載された[Hinderer,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug,2015;23(8):1298-1307]ように行った。
GPFの発現の評価について記載されたように脳を処理した[Hinderer,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online,2014;1]。GUSB酵素の染色及びGM3の染色は以前記載された[Gurda,et al,Molecular therapy: the journal of the American Society
of Gene Therapy.Oct,8,2015.]ように行った。
剖検のとき、ベクターで処理したイヌからヘパリン処理した試験管に血液を採取した。Ficoll勾配遠心分離によって末梢血単核細胞を単離した。AAV9カプシドペプチド及びGFPペプチドに対するT細胞応答はインターフェロンガンマのELISPOTによって評価した。AAV9及びGFPのペプチドライブラリは10アミノ酸が重複した15量体として合成した(Mimotopes)。AAV9ペプチドライブラリは3つのプール:ペプチド1~50のプールA、ペプチド51~100のプールB及びペプチド101~146のプールCにグループ分けした。GFPペプチドライブラリも3つのプールにグループ分けした。ホルボール12-ミリステート13-アセテートに加えたイオノマイシン塩(PMA+ION)を陽性対照として使用した。DMSOを陰性対照として使用した。細胞をペプチドで刺激し、記載されたようにインターフェロンガンマの分泌を検出した。応答が100万個のリンパ球当たり双方とも55スポット形成単位(SFU)を超え、且つDMSO陰性対照の少なくとも3倍であった場合、応答を陽性と見なした。
剖検のとき、生体分布についての組織をドライアイスで即座に凍結した。DNAの単離及びTaqManPCRによるベクターゲノムの定量は記載された[Wang,et al,Human gene therapy.Nov,011;22(11):1389-1401]ように行った。
GUSB活性は記載された[Gurda,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct,8,2015]ようにCSFにて測定した。
1.イヌにおける脳室内及び嚢内のベクター送達の比較
リソソーム蓄積症であるムコ多糖症I型(MPS I)のイヌモデルを用いた我々の以前の研究は、大槽へのAAV9の注入は脳及び脊髄全体を効果的に標的とすることができることを実証した[Hinderer,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of
Gene Therapy.Aug,2015;23(8):1298-1307]。この研究では、我々は、成熟MPS Iイヌの大槽または側脳室に投与されたGFPレポーター遺伝子を発現するAAV9ベクターの分布を比較した。ベクター(1.8×1013ゲノムコピー)の大槽への1mLの単回注入によって3匹のイヌを処理した。追加の3匹のイヌは側脳室への同じベクターの単回ベクター注入を受けた。ICV注入によって処理したイヌについてはベースラインMRIを行って注入のためのさらに大きな側脳室を選択し、目標座標を定義する。定位固定枠を用いて注入を行い、指定された脳室を正確に標的とした。
我々は以前、NHPの大槽または腰椎槽へのAAV9の注入を比較し、腰椎経路は脊髄を標的とするのに10倍効率が低く、脳を標的とするのに100倍効率が低いことを見いだした[C.Hinderer,et al,Molecular Therapy-M
ethods & Clinical Development.12/10/online,2014;1]。その後、他の研究者が、腰椎穿刺によるAAV9の投与を用いたさらに良好な形質導入を実証し、ベクターの頭蓋分布の改善は注入後、動物をトレンデレンブルグ***に置くことによって達成された[Myer,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Oct,31,2014]。このアプローチでは、ベクターは過剰容量の造影剤に希釈され、溶液の密度を高め、トレンデレンブルグにある間、重力が推進する分布を促進する。L3-4間隙にてGFPを発現するAAV9(2×1013ゲノムコピー)の単回注入で6匹の成熟カニクイザルを処理した。ベクターは最終容量5mLのイオヘキソール180造影剤に希釈した。動物のうち4匹は、注入直後の10分間、処置台の頭側を-30度の角度の状態で置いた。10分後、蛍光透視画像を捕捉してCSFにおける造影剤分布を検証した。とりわけ、この大きな注入容量(動物のCSF総容量のおよそ40%)[Reiselbach,et al,New England Journal of Medicine.1962;267(25):1273-1278]に伴って、トレンデレンブルグ***に置かれていない動物においてでさえ造影剤は脊髄クモ膜下腔に沿って及び基底槽の中に迅速に分布した(図18)。PCRによるベクターゲノムの分布(図19)及びGFP発現(図20)の解析は脳及び脊髄の全体にわたる形質導入を実証した。形質導入された細胞の数または分布に対する注入後位置決めの明らかな効果はなかった。以前報告されたように、髄内のAAV投与の後、末梢及び肝形質導入へのベクター逃避があった[Hinderer,et al,Molecular Therapy-Methods & Clinical Development.12/10/online,2014;1;Haurigot,et al,Journal of Clinical Investigation.Aug,2013;123(8):3254-3271]。肝臓形質導入の程度はAAV9に対する既存の中和抗体(NAb)の存在に依存する。6匹の動物のうち4匹は検出できるベースラインのAAV9のNAb(<1.5の力価)を有さず、2匹の動物(4051及び07-11)は1:40の力価でAAV9に対する検出できる既存の抗体を有した。以前の結果に一致して、既存の抗体は肝臓形質導入を阻止し、脾臓へのベクターの分布の増加を生じた[Wang,et al,Human gene therapy.Nov,2011;22(11):1389-1401,but had no impact on
CNS transduction;Haurigot,et al,Journal
of Clinical Investigation.Aug,2013;123(8):3254-3271]。
後頭下穿刺法は臨床現場では一般的な手順ではないので、我々は、側脳室及び腰椎槽を含むCSFアクセスのさらに日常的な部位を評価した。ここで、我々は、高い密度のベクター溶液と注入後のトレンデレンブルグ***とを採用して腰椎領域から頭蓋へのベクターの分布を改善する方法を評価した。
置で発生する外傷によって引き起こされる局所の炎症は、導入遺伝子産物に対する免疫応答を誘導するのに必要とされる危険シグナルを提供してもよい。このことは、IC注入ではなく、脳への直接注入によって送達されるAAVベクターから発現される酵素に対する細胞介在性免疫応答を発生するMPS Iイヌにおける以前の研究によって支持されている[Ciron,et al,Annals of Neurology.Aug,2006;60(2):204-213;Hinderer,et al,Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy.Aug,2015;23(8):1298-1307]。そのような免疫応答についての潜在力は、導入遺伝子産物が異物として認識されるかどうかに左右され―内在性にも産生されるタンパク質を発現するベクターの送達については、注入によって引き起こされる炎症反応でさえも自己タンパク質に対する寛容を壊さないかもしれない。同じことは、導入遺伝子産物に類似するタンパク質の産生を可能にするミスセンス変異を運ぶ劣性疾患の患者について真実であってもよい。従って、免疫のリスクは、患者集団及び導入遺伝子産物に応じて変化し、場合によっては導入遺伝子に対する破壊的なT細胞応答を防ぐのに免疫抑制が必要であってもよい。本知見は、有害な免疫応答のリスクは投与のICV経路ではなくIC経路を用いて軽減されそうであり得ることを示唆している。
6年5月16日に出願された米国仮特許出願番号62/337,178、2016年4月16日に出願された米国仮特許出願番号62/323,271、及び2016年2月3日に出願された米国仮特許出願番号62/290,547のように参照によって本明細書に組み入れられる配列表を含有する。本明細書で引用されている出版物、特許及び特許出願はすべて、それぞれの出版物、特許及び特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。前述の本発明は理解の明瞭さの目的で説明及び例示のために少し詳しく記載されているが、添付のクレームの精神または範囲から逸脱することなく特定の変更及び改変をそれらに対して行うことができることは、本発明の教示の観点から当業者には容易に明らかであろう。
Claims (11)
- ムコ多糖症I型(MPS I)であると診断されたヒト対象の治療に用いるための医薬組成物であって、
製剤緩衝液中の複製欠損組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の懸濁液を含み、
(a)前記rAAVは、AAV9カプシドとベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムはAAVの5’逆方向末端反復(ITR)、発現カセット及びAAVの3’ITRを含み、前記AAVの5’ITR及びAAVの3’ITRはAAV2に由来し、前記発現カセットは、その発現を指向する発現制御配列に操作可能に連結されているヒトα-L-イズロニダーゼ(hIDUA)をコードする異種核酸配列を含み、前記発現制御配列は、サイトメガロウイルスの前初期(CMV IE)エンハンサ、ニワトリβアクチンのプロモータ、ニワトリβアクチンのイントロン及びウサギβグロビンのポリアデニル化(ポリA)シグナル配列を含み、前記hIDUAコーディング配列は機能的なhIDUAをコードする配列番号1のヌクレオチド1~1962の核酸配列を有し、前記発現カセットは配列番号3のヌクレオチド(nt)198~nt4126の核酸配列を含み、前記ベクターゲノムは前記AAV9カプシドにパッケージされ;及び、
(b)前記製剤緩衝液は生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意に賦形剤とを含み;
前記製剤緩衝液が髄内投与に適したものである、
前記医薬組成物。 - 前記rAAVが、平坦用量で1×1010GC/g脳質量~5.6×1010GC/g脳質量で製剤緩衝液中に懸濁されているか、及び/又は、前記懸濁液が、少なくとも1×109ゲノムコピー(GC)/mL(+/-20%)の(a)のrAAVのGCの力価を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- ムコ多糖症I型(MPS I)であると診断されたヒト対象の治療に使用するための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)であって、前記rAAVは、複製欠損であって、約4×108GC/g脳質量~約4×1011GC/g脳質量の用量で髄内注入によって懸濁液で投与され、そして、
(a)前記rAAVは、AAV9カプシドとベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムはAAVの5’逆方向末端反復(ITR)、発現カセット及びAAVの3’ITRを含み、前記AAVの5’ITR及びAAVの3’ITRはAAV2に由来し、前記発現カセットは、その発現を指向する発現制御配列に操作可能に連結されているヒトα-L-イズロニダーゼ(hIDUA)をコードする異種核酸配列を含み、前記発現制御配列は、サイトメガロウイルスの前初期(CMV IE)エンハンサ、ニワトリβアクチンのプロモータ、ニワトリβアクチンのイントロン及びウサギβグロビンのポリアデニル化(ポリA)シグナル配列を含み、前記hIDUAコーディング配列は機能的なhIDUAをコードする配列番号1のヌクレオチド1~1962の核酸配列を有し、前記発現カセットは配列番号3のヌクレオチド(nt)198~nt4126の核酸配列を含み、前記ベクターゲノムはAAV9カプシドにパッケージされ;
(b)髄内製剤緩衝液が生理的に適合性の水性緩衝液と界面活性剤と任意に賦形剤とを含み;及び、
(c)前記rAAVのゲノムコピー(GC)力価は少なくとも1×109GC/mL(±20%)である、
前記rAAV。 - 前記ヒト対象がハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群またはシャイエ症候群であると診断される請求項3の使用のためのrAAV。
- 免疫抑制投薬計画にて前記ヒト対象にrAAVが同時投与される、請求項3または4の使用のためのrAAV。
- 前記治療が、
(a) Bayleyの乳児発達スケールを用いてまたはWASIを用いて評価したとき、前記ヒト対象における知能指数(IQ)の上昇を生じ、
(b) 前記ヒト対象に由来する血清試料を測定したとき、機能的なhIDUAレベルの上昇を生じ、または、
(c) 前記ヒト対象の血清、尿及び/または脳脊髄液(CSF)の試料で測定したとき、GAGレベルの低下を生じる、
請求項3~5のいずれか1の使用のためのrAAV。 - 効能が試験管内のアッセイによって測定される請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 前記試験管内のアッセイが、既知の感染効率のrAAVの細胞当たりのGC力価でHEK293またはHuh7細胞に形質導入することと、4MU-イズロニド酵素アッセイを用いて形質導入の72時間後にhIDUA活性について形質転換された細胞からの上清をアッセイすることとを含む請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記懸濁液が6.8~7.8のpHを有する請求項1、2または7~8に記載の医薬組成物。
- 前記懸濁液が、
(a) 新生児患者への送達のために製剤化され、約1.4×1011ゲノムコピー(GC)~約1.4×1014GCを含むか、
(b) 約3ヵ月齢~約9ヵ月齢である患者への送達のために製剤化され、約2.4×1011~約2.4×1014GCを含むか、
(c) 約9ヵ月齢~約36ヵ月齢である患者への送達のために製剤化され、約4×1011~約4×1014GCを含むか、
(d) 約3歳~約12歳である患者への送達のために製剤化され、約4.8×1011~約4.8×1014GCを含むか、
(e) 約12歳以上である患者への送達のために製剤化され、約5.6×1011~約5.6×1014GCを含むか、または、
(f) 約18歳以上である患者への送達のために製剤化され、約1.4×1013~約7.0×1013GCを含む、
請求項1に記載の医薬組成物。 - 請求項1、2または7~10のいずれか1項に記載の医薬組成物の成分と、髄内投与に必要とされる成分とを含み、任意に前記懸濁液を希釈するのに有用な希釈緩衝液をさらに含む、ムコ多糖症I型(MPS I)であると診断されたヒト対象の治療に用いるためのキット。
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