JP7352555B2 - 抗体または抗体様分子の精製方法 - Google Patents
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Description
そこで本発明は、抗体などの有用タンパク質溶液からの不純物の除去に有効で、その後の後段プロセスへの負荷も軽い添加剤とその利用方法を提供することを目的とする。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される1以上の元素を含む水不溶性無機化合物で処理する工程を含むことを特徴とする方法。
[2] 前記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される1以上である上記[1]に記載の方法。
[3] 更に、前記水溶液または懸濁液を活性炭に接触させる工程を含む上記[1]または[2]に記載の方法。
[4] 前記水溶液または懸濁液が、抗体または抗体様分子を含む培養液である上記[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5] 前記水溶液または懸濁液が、培養液を遠心処理または膜処理して得られる培養上清である上記[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法。
[6] 前記培養液が、抗体または抗体様分子を生産する組換え宿主細胞の培養液である上記[4]または[5]に記載の方法。
[7] 前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物である上記[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法。
[8] 前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物を遠心または膜処理して得られる上清である上記[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法。
[9] 前記水溶液または懸濁液が、生体抽出物である上記[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 前記抗体または抗体様分子がFc含有タンパク質である上記[1]~[9]のいずれか1項に記載の方法。
[11] 前記抗体または抗体様分子が低分子化抗体である上記[1]~[10]のいずれか1項に記載の方法。
[12] 更に、前記水溶液または懸濁液をフロキュラントで処理する工程を含む上記[1]~[11]のいずれか1項に記載の方法。
[13] 更に、前記水溶液または懸濁液をエンドヌクレアーゼで処理する工程を含む上記[1]~[12]のいずれか1項に記載の方法。
[14] 精製された抗体または抗体様分子を、更にカラム処理又は膜ろ過処理する工程を含む上記[1]~[13]のいずれか1項に記載の方法。
本工程では、精製対象である抗体または抗体様分子を含む水溶液または懸濁液を調製する。本工程の実施は任意であり、既にかかる水溶液または懸濁液が得られている場合などには本工程を実施する必要は無い。水溶液は、抗体または抗体様分子が溶媒である水に溶解しており且つ不溶性成分を含まない溶液をいい、懸濁液は、抗体または抗体様分子が溶媒である水に溶解している一方で、細胞、その破砕物、細胞由来成分の凝集物、凝集タンパク質などの不溶性成分を含む溶液をいう。なお、不溶性成分は、溶液中に分散していてもよく沈降していてもよい。
本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される1以上の元素を含む水不溶性無機化合物で処理することにより、精製対象である抗体または抗体様分子以外の不純物を選択的に水不溶性無機化合物に吸着させ、抗体または抗体様分子を精製する。なお、「精製」とは、水不溶性無機化合物に接触させる前の水溶液または懸濁液における抗体または抗体様分子に対する不純物の割合が、低減されることをいう。また、「処理」とは、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、水不溶性無機化合物に接触させることをいう。以下、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を「抗体含有液」と略記する場合がある。
本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を活性炭に接触させる。本工程は、前述の処理工程の前に実施してもよいし、後に実施してもよいし、或いは水不溶性無機化合物と活性炭とを併用して同時に実施してもよい。但し、本工程の実施は任意である。
本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液をフロキュラントで処理する。本工程は、水不溶性無機化合物による処理工程および/または活性炭との接触工程の前に実施してもよいし、後に実施してもよいし、或いは水不溶性無機化合物および/または活性炭とフロキュラントとを併用して同時に実施してもよい。但し、本工程の実施は任意である。
本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液をエンドヌクレアーゼで処理する。本工程は、上記各工程の前に実施してもよいし、後に実施してもよいし、或いは水不溶性無機化合物、活性炭とフロキュラントおよびフロキュラントから選択される1以上とエンドヌクレアーゼを併用して同時に実施してもよい。但し、本工程の実施は任意である。
以上の工程は、以下に示す膜やカラム処理といった一般的な抗体または抗体様分子の精製工程の前段あるいは後段に限らず、好適に用いることができるが、膜やカラム処理の前段に以上の工程を行う場合に、クロマトグラフィー担体の吸着容量の低下、分離能の低下、背圧上昇による処理速度の低下や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下を抑えることが期待でき、また、膜ろ過プロセスにおいても、単位膜面積当たりの処理容量の低下、背圧上昇、処理速度の低減や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下を抑えることが期待できる。すなわち、以上の工程によって精製された抗体または抗体様分子を、さらにカラム処理又は膜ろ過処理することも、本発明の好ましい一態様であり、言い換えるなら、カラム処理や膜ろ過処理の前処理として、本発明の精製方法を用いることも出来る。
0.025mol/mLのリン酸ナトリウムを含むバッファー(pH7.0)中に10wt%となるよう塩基性炭酸マグネシウムを添加し、分散させ、塩基性炭酸マグネシウム分散液を作製した。その塩基性炭酸マグネシウム分散液に、同量のモノクローナル抗体(IgG)を含む動物細胞由来培養液を加えてよく攪拌した後、25℃インキュベーター中にて1時間静置した。その後、処理した溶液を15,000rpm、15℃、10分で遠心分離し、上澄みを回収した。
塩基性炭酸マグネシウムのかわりに、公知のフロキュラントである0.01%のポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド(pDACMAC)を加えた以外は実施例1と同様に操作を行った。
以下に示す手法にて、処理前の培養上清、および実施例1および比較例1の溶液中のIgGの濃度及び不純物であるDNA及びホストセルプロテイン(HCP)含量を定量した。
IgG濃度はproteinAクロマトグラフィーにより評価した。GEヘルスケア社製クロマトグラフィーシステム、AKTA explorer 10SにproteinAアフィニティーカラムとしてTOSOH社製TSKgel SuperSW mAbを取り付け、0.02mol/mLのリン酸ナトリウムおよび0.01mol/mL硫酸ナトリウムを含むバッファー(pH6.7)を用いて室温下、流速0.7ml/minでカラムに通液し、ここに評価サンプルを50μL添加し、洗浄液として0.02mol/mLのリン酸ナトリウムおよび0.01mol/mL硫酸ナトリウムを含むバッファー(pH6.7)を5Column Volume(CV)送液した後、溶出液として0.02mol/mLのリン酸ナトリウムを含むバッファー(pH2.5)を10CV送液した。溶出ピークの280nmのUV吸光度を、システムに付属のUV吸光度計により計測した。
HCP含量はシグナス社製CHO Host Cell Protein ELISA Kit,3rd Generationを用いて付属のプロトコルに従い計測した。
DNA含量はシグナス社製CHO DNA Amplification Kit in Tubesを用いて、付属のプロトコルに従い計測した。
図1と表1に処理前、および処理後のHCP量を示す。
モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に塩基性炭酸マグネシウムを1w/v%、5w/v%、または10w/v%添加して、室温下ミックスローターを用いて18時間攪拌した。その後、15,000rpm、5分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。IgG、HCPおよびDNA濃度を定量した。結果を表2、図2および図3に示す。
モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に1wt%の水不溶性無機化合物および0.67wt%の活性炭をそれぞれ添加し、室温下ミックスローターを用いて18時間攪拌し、15,000rpm、5分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。水不溶性無機化合物としては、塩基性炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、または酸化アルミニウムを用いた。IgG濃度とHCPおよびDNA含量を定量した。結果を表3、図4および図5に示す。
モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に1wt%の塩基性炭酸マグネシウムを添加し、室温下ミックスローターを用いて18時間攪拌した。その後、処理した溶液を、15,000rpm、5分で遠心分離した後、フィルターろ過して上澄みを回収し、モノクローナル抗体医薬製造用rProtein A担体(「Mabselect SuRe LX」GE Healthcare Life Sciences社製)(1mL)を充填したカラム、または高機能プロテインAクロマトグラフィー用担体(「KANEKA KanCapA 3Gプレパックカラム」カネカ社製)(1mL)に負荷して50mMクエン酸バッファーにて溶出し、0.1M NaOHで洗浄した。得られた負荷液、溶出液及び洗浄液中のIgG,HCPおよびDNAを測定した。結果を表4、図6,図7および図8に示す。
1mLのクロマトグラフィーカラムに塩基性炭酸マグネシウムを充填し、モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清を通液し、IgG、HCPおよびDNA含量を定量した。結果を表5、図9および図10に示す。
重鎖抗体(VHH)を含むPichia培養上清に0.67wt%の活性炭および/または1wt%の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて2時間攪拌した後、15,000rpm、5分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。処理前の培養液と処理液をSDS-PAGEで分析した。得られたSDS-PAGEから、目的物であるVHHの15kDa付近のバンド、不純物である18、25kDa付近のバンド強度を読み取り、VHH回収率と不純物残存率を求めた。得られた結果を表6に示す。
一本鎖抗体(scFV)を含むPichia培養上清に0.67wt%の活性炭および/または1wt%または10wt%の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて2時間攪拌した後、15、000rpm、5分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。処理前の培養液と処理液をSDS-PAGEで分析した。得られたSDS-PAGEから、目的物であるscFVの30kDa付近のバンド、不純物であるそれ以外のバンド強度を読み取り、VHH回収率と不純物残存率を求めた。得られた結果を表7に示す。
VHH含有大腸菌培養上清に1wt%または10wt%の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて2時間攪拌した後、15,000rpm、5分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。処理前の培養液と処理液をSDS-PAGEで分析した。得られたSDS-PAGEから、目的物であるscFVの30kDa付近のバンド、不純物であるそれ以外のバンド強度を読み取り、VHH回収率と不純物残存率を求めた。得られた結果を表8に示す。
Fab含有CHO培養上清に0wt%、1wt%または10wt%の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて2時間攪拌した後、15,000rpmで5分間遠心分離して、処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のFab、HCPおよびDNAの濃度を測定した。なおFab濃度はプロテインGクロマトグラフィーにて測定した。
モノクローナル抗体含有CHO培養上清に0wt%または1wt%の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて18時間攪拌した後、15,000rpmで5分間遠心分離して、処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のIgG濃度および凝集体含量を測定した。なお凝集体含量はゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。
モノクローナル抗体含有CHO培養上清に1wt%の塩基性炭酸マグネシウムおよび/または100U/mLのカネカエンドヌクレアーゼを加え、ミックスローターにて18時間攪拌した後、15,000rpmで5分間遠心分離して処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のIgG濃度、HCP濃度およびDNA濃度を測定した。
モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に1wt%または及び10wt%のリン酸三マグネシウムおよび0.67wt%の活性炭をそれぞれ添加し、室温下ミックスローターを用いて18時間攪拌し、15,000rpmで5分間遠心分離して、処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のIgG濃度とHCPおよびDNA含量を定量した。結果を表12に示す。
Claims (14)
- 抗体または抗体様分子を精製するための方法であって、
不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液に、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される1以上の元素を含む水不溶性無機化合物を添加するか、または、前記水不溶性無機化合物をカラムに充填し、前記水溶液または前記懸濁液を流通させる工程を含むことを特徴とする方法。 - 前記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される1以上である請求項1に記載の方法。
- 更に、前記水溶液または懸濁液を活性炭に接触させる工程を含む請求項1または2に記載の方法。
- 前記水溶液または懸濁液が、抗体または抗体様分子を含む培養液である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水溶液または懸濁液が、培養液を遠心処理または膜処理して得られる培養上清である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養液が、抗体または抗体様分子を生産する組換え宿主細胞の培養液である請求項4または5に記載の方法。
- 前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物を遠心または膜処理して得られる上清である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水溶液または懸濁液が、生体抽出物である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体または抗体様分子がFc含有タンパク質である請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体または抗体様分子が低分子化抗体である請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 更に、前記水溶液または懸濁液をフロキュラントで処理する工程を含む請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 更に、前記水溶液または懸濁液をエンドヌクレアーゼで処理する工程を含む請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 精製された抗体または抗体様分子を、更にカラム処理又は膜ろ過処理する工程を含む請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
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