JP5785098B2 - 単一ポリマー相系を用いる分離方法 - Google Patents
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Description
一般実験手順
1.1 材料
化学薬品
Breox 50A 1000(エチレンオキシド及びプロピレンオキシドの等量コポリマー(EOPO))、Mw 3900、下記参照。
精製モノクローナル抗体(Mab)
次の2種の専売Mab(Mab01及びMab03)を使用した。
Mab01
プロテインAを用いて精製し、陰イオン交換クロマトグラフィーで10倍に濃縮した。
Mab03
プロテインAを用いて精製し、陰イオン交換クロマトグラフィーで10倍に濃縮した。
実際の供給液試料
4種の「実際の」未濾過かつ未清澄化Mab発酵供給液をチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞ベースの発酵で得た。これらは相異なるMabを含み、供給液1、2、3及び4と呼ばれる。緑色蛍光タンパク質(GFP)はE.Coli中で発現させた。
以下に示す原液の適当な量/容量を混合することで、各々の水性二相系(ATPS)溶液を(特記しない限り)直接に10ml Sarstedt管中で調製した。各系の最終容量は5mlであった。混合物を約30秒間渦動させ、次いで40℃の水浴中に約15分間放置して相形成させた。
EOPO、20%(w/w):10gのEOPOを40gのMQ水に溶解することで調製した。
適当な量/容量の原液を混合することで、1種のポリマー(EOPO)に基づく水性二相系(ATPS)を直接に10ml Sarstedt管中で調製した。各系の最終容量は5mlであった。混合物を30秒間渦動させ、次いで水浴中で約40℃に約15分間加熱して相形成させた。
(1)低濃度(20mM)のリン酸Naを使用した場合には、いかなる二相系も形成されなかった。しかし、リン酸Na濃度を50mMに増加した場合、二相系が形成された。
(2)50mMリン酸Naを用いて形成されたATPSでは、100〜300mMリン酸Naを用いて形成された他の系の容量比が4であるのに比べて、高い相容量比(5.25)が得られた。
これは、その張度(重量オスモル濃度)が生細胞を溶解せずに分配するのに適する程度に低い塩濃度を有するEOPOベースの二相系を開発するのが可能であることを示唆している。これは、(1)EOPO濃縮物を添加して二相系を形成するため、最初は増殖培地中に等張性緩衝塩を使用することが望まれる用途、(2)生細胞の外部に輸送される標的タンパク質を含む発酵液を清澄化すると共に、細胞を溶解して宿主細胞タンパク質(HCP)を放出させることなしに細胞を処理することが望まれる用途、及び(3)(2)のような状況であって、細胞が連続培養状態に保たれるか、或いは他の方法によってインタクトな形態で処理される場合において重要である。
実施例1の記載に従って、1種のポリマー(EOPO)に基づくATPSを調製した。表2は条件の異なる4つの系を示しており、これらを用いてポリクローナルIgG Gammanorm又は組換え緑色蛍光タンパク質(GFP)含有溶解E.coli細胞ペースト試料を試験した。
(1)試験した条件下では、低濃度(20mM)のリン酸Naを使用した場合にはいかなる二相系も形成されなかった。しかし、リン酸Na濃度が200mMであった場合には二相系が形成された。
(2)8〜10%w/w EOPO系では、Gammanormポリクローナルヒト抗体由来の全吸収の90〜100%は上部のポリマープア相中に得られた。
(3)490nmで測定したGFP活性のすべては、系4の上部相中に見出された。E.coli細胞破片は単位重力(g)下で界面に分配された。試験管を3000×gで5分間遠心した場合、全ての細胞破片は分離した相を全く乱すことなく管の底部に沈降した。
リン酸塩は、Breoxポリマーを用いた相系形成のために適している。これは、一つにはリン酸塩が比較的低い塩濃度(ある種のPEG−塩二相系の塩濃度の10分の1)で系を形成するからであり、また形成された系が良好な標的タンパク質回収率及び非標的タンパク質に関してある程度の選択性を与えるように思われるからである。しかし、リン酸塩は購入するのに高くつく上、処分するのにも高くつく。それとは対照的に、クエン酸塩は安価であり、生態学的にもやさしい。ここでは、新しい系の調製に際してクエン酸ナトリウム緩衝液を試験した。8%EOPO及び150mM NaClを含む系を調製するため、表3に示すように、様々な濃度のクエン酸Na緩衝液(pH7)を様々な温度で使用した。
●50〜200mMのクエン酸Na濃度を約40℃の温度で用いて二相系を形成することができる。
●250mM以上のクエン酸Na濃度をRTで用いて二相系を形成することができるが、相逆転によって相の順序が逆になった(ポリマー相が上部相になり、水相が下部相になる)。かかる系の水相中におけるIgGの回収率は約96%であった。
●250mM以上のクエン酸Na濃度をRTで用いて形成した系では、それより低い低いクエン酸Na濃度を40℃で用いて形成した系に比べて低い相比が得られた。
これは、クエン酸Naを主要塩の1種として用いて好適なEOPO系を生成できることを証明した(ただし、高いpHでの緩衝能力を高めるために若干のリン酸塩を添加することもできる)。認められた相逆転は、以前に報告されていた(M.Pereira et al.,Biochemical Engineering Journal 15(2003)131−138)。この場合の著者らは、30℃及び40℃のUcon−(NH4)2SO4系を用いて遠心分離発酵試料上澄み液中のポリガラクツロナーゼ(Mabでない)の分配を観察していた。
pH及び疎水的親和性リガンドの効果:
これらの実験では、8%EOPO、150mM NaCl、及び200mMリン酸Na(pH6及び8)又は(PEG−アルキル疎水的親和性リガンドとして作用するように添加した)8μM Myrj59界面活性剤を含む200mMリン酸Na(pH8)からなる5mlの系中で粗Mab供給液1を分配した。水浴中において40℃で約15分間インキュベートした後、相を分離し、HCP含有量を分析した(表4)。結果は、高pH(pH8)の緩衝液を用いれば良好なHCP低減率が得られることを示唆している。
粗供給液及びATPS処理供給液に関するHCPデータを測定した。結果(表5参照)は以下のことを示唆している。
●13〜23%のHCP低減率が生じた。
●HCPの低減率は緩衝液のpHの上昇と共に増加する。
●HCPの低減率はポリマー濃度の上昇と共に増加する。
これらの結果は、かかる系がポリマープア相を好む疎水性活量塩基性タンパク質(例えば、多くの抗体)に関しては多くの他の系と同様に挙動する一方、HCP混合物のある種の成分(通例は数種の酸性タンパク質及び負に帯電したタンパク質を含む)はポリマーリッチ相中により高度に分配されるという考えに合致している。タンパク質の分子量(及び疎水性)もまた、一定の役割を演じることがある。
8%EOPO及び200mMリン酸Na緩衝液(pH7.4)に基づく約10mlのATPSを、0.8gの100%EOPOポリマー、固体リン酸塩(87mgのNaH2PO4、24.5mgのNa2HPO4)及び9.2mlのMab供給液2から調製した。混合し、水浴中において40℃で約15分間インキュベートしたところ、二相系が形成された。相の全容量は9.5mlであって、これは7.7mlの水リッチ相及び1.8mlのポリマーリッチ下部相からなり、4.27の相容量比を与える。この容量比は、40%EOPO溶液を0.8Mリン酸Na緩衝液と共に用いて調製した系からの容量比(5.25)より低い。したがって、濃縮EOPOポリマー及び固体リン酸塩から調製したATPSを用いればMab供給液を16%濃縮できる。
●系が7〜8のpH範囲で100mMクエン酸Na及び150mM NaClを含む場合、両方のMab供給液試料に関して約100%の回収率が得られた。
●8%EOPOに基づく系(4.0〜4.1ml)に比べて少ない容量(3.5〜3.6ml)の水相が得られた。これは、EOPO濃度を上昇させた場合には高いMab濃度が得られることを意味している。
我々は、20%EOPOのポリマー濃度で様々な塩濃度を試験した。結果は、150mM NaClの存在又は不存在下で100mMリン酸Naを使用すれば、Mab含有水相をそれぞれ19%及び28%だけ濃縮できることを示している。
この一連の実験では、8%EOPO、150mM NaCl及び様々な濃度のリン酸Na又はクエン酸Na緩衝液に基づく(かつ2.6mlの粗Mab供給液1又は2を含む)10mlのEOPO−ATPSを調製した。250mMの相逆転した系はRTに保った。その他の系は、相を分離させるため、水浴中において40℃で約15分間インキュベートした。若干の系からの相の純度をSDS PAGE電気泳動(ゲル勾配8〜25%)によって分析した(図2)。粗供給液及びATPS実験後の回収Mabに関するHCPデータを表6に示す。得られた結果からは、以下のような結論を下すことができる。
●リン酸Na又はクエン酸Na緩衝液系のいずれについても、MabはATPSによって部分的に精製された(図2参照)。
●200mMリン酸Na系に基づくATPSによって20%を超えるHCPを低減させることができ、250mMクエン酸Na緩衝液系では約30%を達成できる(表6参照)。
●リン酸Na緩衝液系に比べて、250mMクエン酸Na緩衝液系ではより小さい容量の水相が得られた(8.2mlに対して6.5ml、表6参照)。これは、クエン酸Na系の上部相中におけるMab濃度がより高いことを意味している。
水相の導電率
アフィニティークロマトグラフィーその他の捕捉クロマトグラフィーのような後続の分離段階に対する適合性を調べるため、8%EOPO、150mM NaCl及び様々な濃度の緩衝液(リン酸Na又はクエン酸Na)から調製した5mlのATPSを(2.6mlの)粗Mab供給液の存在下又は不存在下で用いて水相の導電率を測定した。結果は、水リッチ(ポリマープア)標的含有相の導電率が約30〜40mS/cmであったことを示している。我々は、(約35の導電率を有する)ATPSで予備処理したMabをさらなる精製のためMabSelect(プロテインA関連)親和性カラムに直接適用できることを以下に実証する。我々は、これらの溶液が疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びある種の形態の混合モードクロマトグラフィー(又は捕捉濾過)にも適することを提唱する。これらはまた、ある種の形態の標的通過イオン交換又は標的捕捉イオン交換にも適している。試料をイオン交換カラムに直接適用するのであれば、多少の希釈が必要となることもある。しかし、Mab又はFabのような標的タンパク質が高度に帯電していれば、25mS/cmでも良好な結合を達成するのが可能であり得ることが最近証明された(例えば、C.Harinarayan et al.,Biotechnology and Bioengineering,95(2006)775−787)。
8%EOPO、150mM NaCl及び200mM NaP又はクエン酸Na緩衝液から調製した水相及びポリマー相中におけるEOPOポリマーの含有量を、全炭素含有量(TOC)法によって分析した。結果は、水相中のEOPOポリマー含有量が約1%(w/w)にすぎないことを示している。それに対し、ポリマーリッチ相中の含有量は約40%(w/w)であった。この結果は、10%(w/w)Breox 50A 1000−水二相系に関する文献値(Cunha et al.,Journal of Chromatography B,711(1998)53−60)に勝っている。この文献中では、相分離を達成して、8の相容量比並びにそれぞれ約3%及び60%の上部相及び下部相ポリマー濃度を有する系を得るためには温度を60℃に上昇させることが必要であった。このように本系では、(濾過に続いてカラム上に直接装填すべき)標的含有相中のポリマー含有量は、恐らくはリン酸塩又はクエン酸塩が200mMで含まれるため、Cunha et al.の1/3である。さらに、40%EOPOの下部相は60%(w/w)EOPOの系よりも高度に非標的タンパク質を分配させる能力を有すると予想できる。
人工的に自己会合抗体(多量体凝集体)を富化したMab試料を、8%EOPO、150mM NaCl及び200mM リン酸Na(pH7)中での分配にかけた。結果は、凝集体濃度の減少も増加も見られないことを示唆している。高度の分配を可能にするMabの表面構造が凝集体表面上になお存在するとすれば、これは恐らく意外なことではない。同様な結果はMab二量体についても予想される。したがって分配は、理想的には、MabSelectアフィニティークロマトグラフィー又はAdhere多モードクロマトグラフィーのような選択的マルチプレート分離方法と組み合わせるべきである。凝集体が相界面張力によって保持され得るサイズに到達すれば、分配は一部の大きい凝集体を除去するはずである。
粗Mab供給液1(2.6ml Mab)を、上述したような(8%EOPO、200mMリン酸Na(pH7)、150mM NaCl)系による処理にかけた。上部相からの2ml画分を集め、さらなる精製のためHiTrap MabSelect Sureカラム上に適用した。適用された試料は約35mS/cmの導電率を有していた。カラムをpH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)で予備平衡化し、60mMクエン酸Na緩衝液(pH3.4)で溶離した。対照として、EOPO−ATPSではなく遠心分離及び濾過によって処理した同量の粗Mab供給液1(導電率12mS/cm)を同じカラム上で精製した。溶出画分の純度をSDS PAGE電気泳動によって分析した。粗Mab並びにATPS及びプロテインAクロマトグラフィー実験後の回収Mabに関する(商業的ELISAからの)タンパク質回収率及びHCPデータを表7及び表8に示す。これらの実験からの結果は、以下のことを示唆している。
●Mabは、ATPSにより、100%の回収率で部分的に精製された(図3、表7)。
●ATPSで予備処理されたMab試料はMabSelect上に直接適用できる(図4)。
●(試験した供給液及びATPS系については)ATPSによって20%を超えるHCP低減率を得ることができる(表8参照)。
ここでの目的は、ATPSからの水リッチ標的含有相が多モード陽イオン交換体Capto MMCを含む後続のクロマトグラフィー段階に適合し得るかどうかを検証することであった。実際のMab供給液1である未清澄化供給液(pH7)を使用した。Mabの概略pIは6.5であり、その濃度は0.4mg/mlであった。MMCには、熱誘起相の分配後における水リッチ標的含有相を装填した。対照として、遠心分離によって清澄化した供給液を使用した。ATPS系の組成は、8%EOPO、200mMリン酸塩(pH7.4)、150mM NaClであった。いずれの場合にも、装填溶液のpHはクロマトグラフィーに先立って5に調整した。
ここで我々は、本発明に係る分配が、凝集体の形成を増加させたり、回収率を低下させたり、或いはプロテインA段階に関して回収率及び純度を低下させたりするようにしてMabを妨害しないことを示す。即ち、ATPSは清澄化兼分離段階として作用し、プロテインAカラムの汚損を引き起こすことがある大きい粒子又は凝集体の含有量を低減させることができた。ATPSを直接に発酵容器(又は発酵液を移した容器)内で形成することにより、分配を同一単位操作の一部とすることができ、時間の損失がない。第2の段階として、上述した場合と同様にして、MabSelect Sureを用いてMab含有画分(水リッチ相)をさらに精製した。
クロマトグラフィーは5mlのHiTrap MabSelectSureを用いて実施した。分析は、1ml HiTrap MabSelectSureカラム及びSuperdex 200 5/150 GLを用いて実施した。試料は50mlの供給液又は水リッチ相であり、緩衝液Aは0.15M NaCl中の20mMリン酸ナトリウム(pH7.2)であり、緩衝液Bは50mMクエン酸ナトリウム(pH=3.0)であった。流量は5ml/分(150cm/h)、勾配は0〜100%の階段勾配であった。通過液及び溶出液を集め、さらにMab、HCP及び凝集体レベルを分析した。回収率の推定及びその他の分析を一層正確に(カラムを汚損することがある大きい凝集体に関係しないように)するため、水リッチ相を遠心分離してから後続のクロマトグラフィー段階に適用した。したがって、この遠心分離段階はクロマトグラフィーに先立つテプス濾過と同等なものと見なされた。
MabSelectSureカラムを用いてMabの濃度を測定した。50μlの試料を1ml HiTrap MabSelectSureカラムに適用した。溶出液ピークの面積を積分し、それぞれ供給液及び水相の容量を掛けた。ATPSを用いた抽出に関する回収率を、面積単位の総数を比較することで算出した。MabSelectSure段階に関するMabの回収率を同様にして算出した。試料:50μlの供給液又は水相、カラム:1ml HiTrap MabSelectSure、緩衝液A:PBS、緩衝液B:100mMクエン酸ナトリウム(pH=3.0)、流量:1ml/分(150cm/h)、勾配:0〜100%Bの階段勾配。
いかなる希釈或いはpH又は導電率の変化もなしに、水相をMabSelectSureカラムに直接適用することが可能であった(図7)。
Mabタンパク質は、それが比較的疎水性でありかつ通例は正の正味電荷を有するため、リン酸塩又はクエン酸塩のような塩を含むEOPO−水ATPS中の水リッチ相を好む傾向があると推測される。極めて疎水性であるGFPも高いK値を示すとすれば、ブレンステッド式によって予測されるようにサイズが二次的な役割を演じることがある。その予測は、系が分子集合体、二量体及びモノマーMab形態を差別的に分配できないこと(上記参照)によって裏付けられる。幸いにも、それはまた、分配が抗体のFabフラグメントタンパク質(Fab)に対しても適していることを示唆している。リン酸Na及びクエン酸Na緩衝液に基づくEOPO−ATPSにおいて、系分配中に0.5mg Fabを各系に添加することで、MWが約5.5kDaのポリクローナルFab(pI:5.5〜9.5)の分配を試験した。40℃での相形成後、相を分離し、各相の吸光度を分光光度計によって280nmでモニターした。分配係数(K)及び上部相中における各Fabの%濃度((C/Co)×100%)を算出した(表11参照)。結果は、クエン酸Na緩衝液に基づく水相中におけるFabの回収率がリン酸Na緩衝液に基づく類似の相中(60%)より高い(79%)ことを示している。これらの分配値は、この報告中で注目されたMab及びポリクローナルIgに関する典型値より低い。しかし、試験した系はFabでなくMabに対して最適化されていた。加えて、Fab試料は明らかにpIが極めて酸性であるタンパク質を多少含んでいたので、その分配K値が低いことがあるのは意外でない。
8%EOPO、200mMリン酸Na(pH7.4)及び150mM NaClを含む5mlの系中において、様々なpIを有するタンパク質を40℃で分配した。系中の全タンパク質濃度は1mg/mlであった。相形成後、相を分離し、各相の吸光度を分光光度計によって280nmでモニターした。分配係数(K)を算出し、表12にまとめて示す。結果は、塩基性タンパク質が完全に水相中に分配されたのに対し、最も酸性のタンパク質は上部相及び下部相の両方に分配されたことを示唆している。ポリクローナルIg試料は約7の平均pIを有していたにもかかわらず、恐らくは疎水性及びサイズのために(以前に認められたような)高いK値を示した。
植物、ミルク、血液などに含まれる組換えタンパク質又は天然タンパク質のような各種の生物関連試料に対して二相系を使用する可能性に関し、ミルク系又は血液系の溶液を処理できるか否かを調べるための研究を実施した。ミルクに関する実験では、二相の形成について4種の条件をスクリーニングした(表13参照)。一部の条件で相系が形成されたが、その相形成は脂肪物質の存在並びに(恐らくは)高カルシウムレベルによって複雑化されることが認められた。後者は、オキシポリマー及びリン酸塩とキレート化し、リン酸緩衝食塩水水のPEGに塩化カルシウムを添加した場合に生じるような沈殿を形成し得ることが知られている。結果は、本プロセスがスキムミルクに対して一層良く働くことを示唆している。
Breox及びUconポリマーは、EO及びPOのランダムコポリマーである。Pluronicは、(EO)x(PO)y(EO)x型のコブロックコポリマーである。(10%EO及び90%POを含みかつ約2700の全ポリマーMWを有する)Pluronic L81ポリマーに基づくATPS中におけるMabの回収率を調べるため、Mab供給液2を用いて、相異なる塩タイプ(リン酸塩及びクエン酸塩)に関する若干の実験を行った。Pluronic L81は上記の研究の多くで使用したBreoxポリマーより低いTcを有しており、室温で使用するのに適するかもしれない。ポリマー濃度が10〜20%である場合、二相系は室温で形成されたが、これは他の熱応答性クラウディングポリマーも本発明の方法で使用するのに適していることを表している。MabSelect Sure分析を用いて、水リッチ相中の(供給液2からの)Mab回収率を測定した。EOPOに基づくATPSを対照として使用した。結果を表14に示すが、これはEOPO系に関して92%以上及び(非最適化)L81系に関して86%以上のMab回収率を示している。
ここで我々は、14リットルスケールで遠心分離なしに細胞除去(清澄化)を可能にするため、Breox(EOPO)ポリマーを塩との濃縮状態で直接にWAVE(商標)バッグ中の10L Mab細胞培養物に添加してなる水性二相系(ATPS)を使用することを示す。この研究では、容量低減を最適化するのではなく混合の容易さを助けるため、ポリマー及び塩原液を添加する方法が選択されたことに注意されたい。その上、相系は迅速な分離及び良好なMab回収率を達成するようにも選択された。それは、Mab回収率と宿主細胞タンパク質除去とのバランスを取るように最適化されたわけではなかった。上記の実施例に基づけば、HCP及び他の夾雑物の除去に関する試薬添加方法及び系最適化は、機能し得るモデル系が実証できれば明らかであるように感じられた。
一般実験手順
ウイルス関連の実験は、上記の抗体発酵供給液及びそれに関連する実験からの代表的な系をウイルスワクチン処理に関連する実験に適用することを含んでいた。したがって、同様なポリマー、塩、系及び技法を使用した。2種のウイルス株を用いて2つの例示的な実験を行った。第1のものはCHO細胞タンパク質で増強されたショ糖勾配精製ウイルスを用いた分配を含み、第2のものは(同一供給源からの)清澄化かつ濃縮ウイルスで増強された実際のウイルス供給液であった。
Breox(商標)50A 10001、MW 3900、上記参照。
2種の生物学的材料の試料を使用した。第1のものは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞発酵液からMabSelect親和性カラム(GE Healthcare社)通過液(FT)を取り出すことで得たワクチン増強CHO細胞系供給液であった。FTはMabをほとんど又は全く含んでいなかったが、標準的なCHO宿主細胞タンパク質及び他の夾雑物は含んでいた。それをA/H1N1/New Caledoniaインフルエンザウイルスの40%ショ糖勾配で精製されたインタクトウイルス画分(ホルムアルデヒド処理、赤血球凝集素(HA)濃度約200μg/ml)で富化した。
以下の表17に示す原液の適当な量/容量を混合することで、各々の水性二相系(ATPS)を直接に15ml Sarstedt管中で調製した。かかるATPSは、100mM NaP(pH7)及び150mM NaCl中の8〜12%EOPO系に基づいていた。ウイルス供給液混合物の添加後、各系の最終容量をPBSで10mlに調整した(表参照)。混合物を約30秒間渦動させ、次いでオーブン内において40〜45℃で約1時間放置して相形成させた。次いで、形成された相を分離し、以下に示す方法で分析した。
BREOX 50A 1000、100%(w/w):そのまま使用した。
ショ糖勾配で精製されたウイルス増強CHO細胞試料に関する分配結果を、インタクトなウイルス粒子を検出する酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)法(宝酒造)を用いて分析した。これは、ショ糖密度勾配で精製された試料のインタクトウイルス画分からのウイルスでCHO FT供給液を増強した場合(上記)に一致している。
相異なるBreoxポリマー濃度(8〜12%w/w)を有する3相系を二重反復実験で試験した。系及び塩の組合せは、タンパク質処理に関して試験したものと同じであった。40℃より高く加熱したところ、供給液試料中に二相が容易に形成された。下部相は高いポリマー濃度のために分析するのが困難であったが、上部相は加熱前の一相系と同様に容易に分析された。若干の場合には、熱応答性EOPOブロックコポリマー(例えば、Pluronic(登録商標)L81)を用いて同様な結果が得られた(データは示さず)。全体の結果を図13に示す。3種のEOPOポリマー濃度のいずれにおいても、実際のウイルス供給液試料は基本的に同様な結果を与えたことがわかる。即ち、Biacore HAアッセイによる上部相中のウイルスHAは約20%であり、上部相中のHCPは60〜70%であり、上部相中の総(Bradford)タンパク質は70〜80%であり、上部相中のDNAは5%未満であった。供給液が清澄化CHO細胞供給液で増強されたインタクトなショ糖勾配精製ウイルスである別の実験では、(PicoGreen(登録商標)アッセイで測定された)上部相へのDNA分配は70%であったのに対し、ELISAアッセイによって分析されたインタクトウイルスの上部相分配は70〜100%であった。DNA分配は、EOPOの2ポリマー系に関して国際公開第2004/020629号に記載されたものと一致している。
Claims (5)
- 未清澄化チャイニーズハムスター卵巣(CHO)ブロス中の標的抗体を該未清澄化チャイニーズハムスター卵巣(CHO)ブロスを含む水性液体から単離する方法であって、
(a)容器内で前記水性液体を、親水性の熱応答性ポリマー並びにNaCl、Na2PO4、KPO4、NaSO4、クエン酸カリウム、(NH4)2SO4、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム及びこれらの組合せからなる群から選択される100〜300mMの濃度の1種以上の添加塩と合わせる段階と、
(b)(a)で得られた液体混合物を、前記熱応答性ポリマーの曇り点より高い条件下で穏やかに混合して、前記標的抗体が、熱応答性ポリマーが濃縮されていない相中に分配され、非標的化合物及び粒子は相界面又は熱応答性ポリマーリッチ相に様々に異なる程度に分配された1ポリマー二相系を形成せしめる段階と、
(c)標的抗体を単離する段階と
を含んでいて、前記熱応答性ポリマーがエチレンオキシドプロピレンオキシド(EOPO)コポリマーである、方法。 - (i)標的含有相を新しい相補的な相と混合することによって別の分配に付す段階と、
(ii)標的抗体が濃縮された相から標的抗体を回収する段階と
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - (iii)ポリマーリッチ相からのポリマーを分配単位操作に再循環させる段階
をさらに含む、請求項2記載の方法。 - 標的含有相を、クロマトグラフィー段階に直接使用する、請求項1記載の方法。
- 前記水性液体中の標的抗体の濃度が10g/Lを超える、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
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