JPH1060000A

JPH1060000A - 抗体の精製方法

Info

Publication number: JPH1060000A
Application number: JP8238651A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Otaki; 伸之大瀧; Senya Inoue; 千也井上
Original assignee: Kanto Chemical Co Inc
Current assignee: Kanto Chemical Co Inc
Priority date: 1996-08-22
Filing date: 1996-08-22
Publication date: 1998-03-03

Abstract

(57)【要約】【課題】抗体を、その生理活性を損なうことなく、迅
速に、簡便に、かつ安価に精製する方法を提供する。【解決手段】抗体を含有する溶液をリン酸の金属塩か
らなる分離材と接触させ、抗体を該分離材に吸着させた
後、溶液と該分離材を分別し、更に該分離材から抗体を
溶離・回収してなるバッチ法による抗体の分離精製方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術】本発明は、抗体の精製方法に関す
る。

【０００２】

【従来技術】動物の生体防御機構に関して重要な役割を
担っている抗体は、医療や臨床診断をはじめとする幅広
い分野で利用されている。例えば、１９世紀末に開発さ
れた抗血清療法は、抗体の作用を利用した治療方法であ
る。また、抗体は微量物質の特異的測定方法としての利
用も盛んで、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法などに用
いられている。これらの測定方法は、臨床検査薬に応用
されているほか、医学・薬学・生化学分野などにおける
基礎研究に欠くことのできないものとなっている。この
ように抗体の利用の拡大に伴って、抗体を効率よく作製
し、精製する技術に対する要求が高まっている。

【０００３】一般的な抗体の作製方法としては、マウ
ス、ウサギ、ヒツジなどの動物を免疫することによって
抗血清を作製し、その抗血清からポリクローナル抗体を
精製する方法、または抗体産生能を有するＢ細胞と増殖
能を有するミエローマ細胞とを細胞融合して調製したハ
イブリドーマをマウスまたはラットなどの腹腔にて増殖
させ、モノクローナル抗体を含む腹水を作製し、その腹
水から抗体を精製する方法、または同様にして調製した
ハイブリドーマを血清培地または無血清培地などを用い
て細胞培養することによってモノクローナル抗体を含む
培養液を作製し、その培養液から抗体を精製する方法な
どがある。抗血清や腹水、培養液中に作製した抗体を精
製する方法としては、試薬の添加による方法および分離
材を用いる方法に大別される。

【０００４】試薬の添加による方法には、硫酸アンモニ
ウムなどの中性塩の添加による塩析法や、アルコール沈
殿法など、抗体とそれ以外の成分との溶解度差を利用し
た沈殿分別法が知られている。こうした方法に用いる試
薬類は比較的安価で、精製条件も温和ではあるが、操作
が煩雑であるために処理に長時間を要し、抗体の回収率
や純度が低い場合も多いので、結果的に精製コストは高
くなる。

【０００５】分離材を用いる方法には、カラム法とバッ
チ法による２種の精製方法が知られている。カラム法と
は、分離材を充填したカラムに、抗体を含有する血清や
腹水、培養上清などを送液して導入した後、更に抗体と
そのほかの成分とに分離する方法である。したがって、
分離材はカラムに充填しなければ使用できないことに加
えて、送液ポンプ、検出器、フラクションコレクターな
どの特別な設備を必要とするために、精製に要するコス
トは高い。また、大量の培養上清などをカラムに導入す
る際に要する時間は、カラムの特性や送液ポンプの能力
などによって制約されるため、カラム法による大量処理
には長時間が必要であり、問題が多い。

【０００６】一方、バッチ法は、抗体を含有する血清や
腹水、培養上清などをビーカーなどの容器に入れ、それ
に分離材を加えて抗体を吸着させた後、分離材を取り出
し抗体を分離材から溶離・回収する方法であり、血清や
腹水、培養上清などの処理量の多少にかかわらず簡便に
短時間で処理することができる有用な方法である。ま
た、カラム法のように特別な設備を必要としないので、
精製コストも非常に低いという利点がある。しかしなが
ら、バッチ法による精製方法に用いる分離材は、抗体を
吸着させる工程における撹拌や振盪などの操作、または
培養上清などから分離材を分別する際の遠心分離などの
操作に耐え得る高い機械的強度、また培養上清などから
の分離材の分別操作を容易にするための分離材の十分な
沈降性などが要求されるため適切な分離材を求めること
は容易ではない。例えば免疫グロブリンクラスＧ（Ｉｇ
Ｇ）に対して親和性を持つとされているプロテインＡや
プロテインＧをリガンドとして固定化したゲルは、カラ
ム法による抗体の精製に広く用いられているが、バッチ
法による抗体の精製用分離材としてもしばしば用いられ
る。ところがこの場合、リガンドを固定化する基材であ
るゲルが軟質で機械的強度が小さく、またゲルの材質が
多糖類であるために比重が小さく沈降性に乏しいこと、
更に、撹拌操作における分離材同士の接触によるリガン
ドの損失なども起こり易く、元来バッチ法に用いる分離
材としては不適当である。それに加えて、抗体とプロテ
インＡまたはプロテインＧとの結合が強固であるがため
に、抗体の回収にはｐＨ３程度の強酸性の溶離液を使用
しなければならず、そのために、抗体の変性や失活が起
こり易いという難点がある。このように、バッチ法によ
っても、精製方法に用いる分離材として適当なものが存
在しないため、同法による抗体の適切な分離精製方法に
も問題があるというのが現状である。

【０００７】さらに、前述のプロテインＡやプロテイン
Ｇは、ＩｇＧ以外の免疫グロブリンクラスの抗体、例え
ば免疫グロブリンクラスＭ（ＩｇＭ）や免疫グロブリン
クラスＡ（ＩｇＡ）には親和性を持たないために、Ｉｇ
Ｇ以外の抗体の分離精製には使用できないし、抗体を産
生する動物の種類によっては、ＩｇＧであってもプロテ
インＡやプロテインＧに対する親和性を持たないため
に、分離精製には使用できない。このように、プロテイ
ンＡやプロテインＧを固定化したゲルを用いる分離精製
方法の適用範囲は狭い。更にプロテインＡやプロテイン
Ｇは菌類から産生されるものであるので量産化が困難で
あるために、それらを固定化したゲルは高価であり、こ
うしたゲルを用いるバッチ法による抗体の精製方法のコ
ストは高い。また、プロテインＡの原料である黄色ブド
ウ球菌に由来する毒性物質の混入が懸念されるために、
特に、抗体を医療分野へ応用する場合には、安全性の面
での不安は解消されない。

【０００８】以上のとおり、従来の抗体の分離精製方法
には数多くの問題があり、未だそれが解決されていな
い。こうした状況下、抗体を迅速に、簡便に、かつ安価
に、変性・失活のない状態で精製するための技術の開発
が望まれている。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
の背景の技術に鑑み、動物の血清や腹水、または培養液
にて作製した抗体を、その生理活性を損なうことなく、
迅速に、簡便に、かつ、安価に精製しうるバッチ法によ
る抗体の精製方法において用いる分離材粒子を提供する
ことにある。

【００１０】

【解決すべき課題の解決手段】本発明者らは、これまで
に、ピロリン酸またはメタリン酸の金属塩が、タンパク
質、酵素、核酸などの生体物質を分離対象とするクロマ
トグラフィー用固定相として好適な性質を有することを
明らかにし（特願平５−２２９７０３）、また、鳥類の
卵黄に産生される抗体であるＩｇＹの分離精製に対して
も有用であることを見出した（特願平８−７８１３
９）。その後、動物の血清や腹水または培養液にて作製
した抗体の精製にあたって、迅速に、簡便に、かつ、安
価に精製しうるバッチ法による精製方法の開発について
検討を進めたところ、オルトリン酸、ピロリン酸または
メタリン酸の金属塩からなる分離材粒子が、バッチ法に
よる精製に好適な機械的強度や沈降性を有し、該分離材
を用いることによって、上記の課題を一挙に解決できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１１】すなわち、本発明は、抗体を含有する溶液
をリン酸の金属塩からなる分離材と接触させ、抗体を該
分離材に吸着させた後、溶液と該分離材を分別し、更に
該分離材から抗体を溶離・回収してなるバッチ法による
抗体の分離精製方法である。

【００１２】本発明における分離材は、バッチ法による
抗体の分離材として使用するに十分な機械的強度、具体
的には抗体の吸着工程における撹拌または振盪などの操
作や分別時における濾別、デカンテーション、遠心分離
などの操作に十分耐え得る機械的強度を具備しているこ
とが望ましく、そのような機械的強度を付与するため
に、５００〜１２００℃の焼成温度で加熱することによ
って分離材粒子を強固にする方法を用いることができ
る。バッチ法で効率よく抗体を精製するためには、大き
な表面積を有する分離材を用いて、分離材の単位量あた
りの抗体の吸着負荷量を高めるのがよく、分離材の表面
積を大きくするためには、例えば、粒子表面あるいは粒
子全体がリン酸の金属塩からなる数ミクロン以下の大き
さの微細粒子を凝集させ、多孔質の凝集体とする方法が
あるが、そのような多孔質の凝集体はそのままでは機械
的強度に弱く、撹拌または振盪などの処理によって容易
に凝集体が壊れてしまい、バッチ法による抗体の分離材
として使用するには不適当なものである。しかしなが
ら、５００〜１２００℃の焼成温度で加熱して微細粒子
同士を焼結させることによって、分離材の単位量あたり
の抗体の吸着負荷量が大きく、しかも機械的強度の高
い、バッチ法による精製方法に用いるに適した分離材を
調製することが可能である。ただし、本発明におけるバ
ッチ法による抗体の精製法に用いる分離材の多孔性は、
抗体と分離材との間の静電的な吸着作用とは直接には関
係ないので、無孔質の材料と多孔質の材料のいずれであ
ってもよいが、１回の操作でより多量の抗体を精製する
ためには、分離材の単位量あたりの抗体の吸着負荷量が
大きい、少なくとも１ｍ²／ｇ以上の大きな表面積を有
するものが好ましい。

【００１３】本発明におけるバッチ法による抗体の精製
法に用いる分離材は、リン酸の金属塩が抗体に対する吸
着材として作用するものであり、そのためには抗体と接
触する該分離材表面がリン酸の金属塩であることが必要
であり、該リン酸の種類としてはオルトリン酸、ピロリ
ン酸、メタリン酸が望ましく、該金属塩の金属としては
マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、マンガ
ン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウム、ジルコニ
ウム、チタン、イットリウム、ランタン、珪素などの金
属が望ましい。特に、ピロリン酸マグネシウムおよびピ
ロリン酸ジルコニウム、ピロリン酸チタンは本発明に係
わる分離材といて好適である。オルトリン酸またはピロ
リン酸またはメタリン酸の金属塩は結晶学的には非晶質
であっても結晶質であってもよい。また、完全にオルト
リン酸、ピロリン酸またはメタリン酸の金属塩だけから
成る物質である必要はなく、実質的にオルトリン酸、ピ
ロリン酸、メタリン酸の金属塩が抗体の分離材として機
能し、使用する溶離液中で安定に存在する物質であれば
よい。すなわち、オルトリン酸、ピロリン酸またはメタ
リン酸の金属塩に、別種のリン酸塩が少量混在している
場合も、本発明における「オルトリン酸の金属塩」、
「ピロリン酸の金属塩」または「メタリン酸の金属塩」
として夫々理解されるべきである。なお、珪素は厳密に
は非金属として分類されるが、リン酸塩の金属成分と同
様に振舞い、リン酸珪素を形成し、ピロリン酸マグネシ
ウムやピロリン酸ジルコニウムなどと同様に、本発明に
おけるバッチ法による抗体の分離材として有用な性質を
有することから、本発明においては、珪素を「オルトリ
ン酸、ピロリン酸またはメタリン酸の金属塩」の金属と
して含むものとする。

【００１４】本発明に係わる分離材は、抗体との吸着に
関与する材料表面がオルトリン酸、、ピロリン酸または
メタリン酸の金属塩であればよく、抗体の吸着に関与し
ない内部の材質は金属やガラス、セラミックスなどの無
機物質であってもよく、あるいはアガロースゲルなどの
有機物質であってもよい。もちろん材料表面も材料内部
もすべてがオルトリン酸、ピロリン酸またはメタリン酸
の金属塩であってもよい。これらの場合、分離材として
の比重が１よりも大きい場合、沈降性が高くなり、抗体
を吸着した分離材の分別回収が容易であるという利点が
ある。また分離材の形状は粒子状であることが望ましい
が、実施状況に応じてペレット状、繊維状など様々な形
状にして用いることができる。分離材を粒子状にして使
用する場合の分離材の大きさは、使用状況に応じて適当
な大きさを選択するのが望ましい。例えば、０.１〜２
ｍｌ程度の少量の腹水から抗体を回収・精製する場合に
は、平均粒子径が０.５〜15μｍ、殊に望ましくは４〜
１０μｍの範囲の粒子径の粒子を用いて吸着させ、遠心
分離によって抗体を吸着した分離材を分別し、更に抗体
を回収する方法が好適である。また、１０ｍｌ以上の大
量の抗血清や培養液などから抗体を回収する場合には、
抗体を含有する抗血清や培養液に該分離材を懸濁させる
ことによって分離材に抗体を吸着させ、更に、抗体を吸
着させた分離材を回収するためには、濾別またはデカン
テーションによる分別が望ましいが、この工程において
は、平均粒子径が３０μｍ〜５ｍｍの範囲の、十分な沈
降性を有する大きさの粒子を用いるのが好適である。

【００１５】オルトリン酸、ピロリン酸またはメタリン
酸の金属塩の製法は特に限定されず、様々な公知の方法
を用いることができる。例えば、ピロリン酸マグネシウ
ムを得るのに、マグネシウムとリンの原子比が１：１と
なるように硝酸マグネシウムの水溶液とピロリン酸アン
モニウムの水溶液とを混合撹拌して調製したスラリー
に、更にメタノールを加えてホモジナイザーで処理した
後、噴霧熱分解して球状粒子を得て、これを６００〜１
０００℃で焼成することによって、粒子全体がピロリン
酸マグネシウムから成る本発明の分離材を得ることがで
きる。分離材の材料表面だけがオルトリン酸、ピロリン
酸またはメタリン酸の金属塩から成る態様の分離材を作
製することも可能である。例えば、分離材の内部の材料
として使用するために３次元網目状に連続した細孔を有
するアルミナなどのセラミックスの多孔体を公知の技術
を用いて作製し、この多孔体をサブミクロンの微細なピ
ロリン酸マグネシウム粒子を水などに分散して調製した
スラリーに浸漬し、多孔体の全表面をスラリーで覆うよ
うにしてから、引き上げて余分なスラリーを除去した
後、乾燥、焼成することによって、分離材表面がピロリ
ン酸マグネシウムから成る態様の分離材を作製すること
ができる。

【００１６】本発明に係わるバッチ法による抗体の精製
法において、抗体は分離材であるオルトリン酸、ピロリ
ン酸またはメタリン酸の金属塩に、静電的相互作用によ
って穏やかに吸着されているものと推定され、更に抗体
の脱着には抗体を変性・失活させる恐れのない、中性付
近にｐＨを調製した緩衝液を用いることが可能であるた
めに、抗体と分離材との一連の吸脱着作用によって抗体
を変性・失活させる恐れがないという格別の利点があ
る。特に、分離材に吸着した抗体を回収するために使用
する溶離液は、抗体に対して好適なｐＨ６〜８の範囲の
溶液を用いることができる。溶液のｐＨを６以下または
８以上にして抗体を回収することも可能であるが、一般
にアルカリ条件下では分離材に対する抗体の吸着量が低
下し分離も悪くなる、あるいは酸性条件下で行えば抗体
の活性を損なう恐れがあるなど、中性付近のｐＨの条件
下で抗体の回収を行う以上に格別のメリットが得られる
ことはほとんどない。したがって、本発明に係わるバッ
チ法による抗体の精製方法において、ｐＨ６〜８の条件
下で抗体を回収するのが望ましい。

【００１７】

【実施の形態】本発明に係わる精製材料を用いた抗体の
精製は、以下のようにして行うことができる。

【００１８】まず公知の方法により、ウサギやヒツジな
どの動物を免疫して抗血清を作製する。抗血清は採取し
適当な容器に入れ、本発明に係わる分離材を加えて数分
間振盪することによって抗体を分離材に吸着させる。次
いで、分離材を加えた抗血清から、抗体を吸着した分離
材を濾別する。濾別した分離材は、リン酸ナトリウムや
リン酸カリウムでｐＨを６〜８に調製した塩化ナトリウ
ム溶液や塩化カリウム溶液や、ｐＨ６〜８に調製したリ
ン酸ナトリウム緩衝液やリン酸カリウム緩衝液で抗体を
脱着させ、精製・回収することができる。抗体の脱着の
工程において、溶離液の種類を使い分けることによって
免疫グロブリンクラスの異なる抗体を分離・回収するこ
とができる。例えば、初めに３００〜５００ｍＭの塩化
ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液を溶離液として
用いることによって免疫グロブリンクラスＧの抗体を脱
着・回収し、次いで３００〜５００ｍＭのリン酸ナトリ
ウム緩衝液またはリン酸カリウム緩衝液を溶離液として
用いることによって免疫グロブリンクラスＭの抗体を脱
着・回収することができる。同様の方法で、抗血清のほ
か、血清や腹水、培養液などからも抗体を簡便に回収・
精製することが可能である。

【００１９】

【実施例】以下に、本発明の実施例を掲げ、本発明を具
体的に説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定
されるものではない。実施例１ピロリン酸マグネシウム組成となるように塩基性炭酸マ
グネシウムスラリーとピロリン酸水溶液を混合撹拌し、
更にメタノールを加えて調製したスラリーを６５０℃で
噴霧熱分解した。得られた生成物を更に７００℃で４時
間熱処理した後、分級して４〜１０μｍの球状粒子を得
た。この球状粒子をＸ線回折分析をした結果、ピロリン
酸マグネシウムの結晶だった。また、このピロリン酸マ
グネシウムを走査型電子顕微鏡で観察した結果、多数の
サブミクロンの球状粒子が凝集・焼結して多孔質な４〜
１０μｍの球状体を形作っていた。

【００２０】免疫グロブリンクラスＭ（ＩｇＭ）のモノ
クローナル抗体を含有するマウス腹水１ｍｌをマイクロ
チューブ（容量２.２ｍｌ）に入れ、ピロリン酸マグネ
シウム球状粒子０.５ｇを加えて３分間振盪し、ＩｇＭ
抗体をピロリン酸マグネシウムに吸着させた。次いで、
腹水を１０００rpmで３分間遠心処理し、ＩｇＭ抗体を
吸着したピロリン酸マグネシウムを沈降させた。腹水は
パスツールピペットでマイクロチューブから除去した。
ピロリン酸マグネシウムに吸着したホスト動物由来のＩ
ｇＧを取り除くために、マイクロチューブにリン酸ナト
リウムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ塩化ナトリ
ウム溶液１.５ｍｌを加えて３分間振盪した後、１００
０rpm×３分間遠心処理し、上澄みを取り除いた。この
工程を合計５回行った後、ＩｇＭ抗体を精製・回収する
ために、ｐＨ６.８に調整した３００ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液１.５ｍｌをマイクロチューブに入れ、同様
に振盪および遠心処理をし、上澄みを試験管に移した。
この工程を合計３回行い、精製されたＩｇＭ抗体溶液約
４.５ｍｌを得た。このＩｇＭ抗体溶液の純度をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた結果、Ｉｇ
Ｍ抗体のＨ鎖およびＬ鎖に由来する２本のバンドのほか
には、バンドは検出されなかった。また吸光度測定法に
よる、この精製処理工程におけるＩｇＭ抗体の回収率は
ほぼ１００％であった。このように本発明に係わるバッ
チ法による抗体の精製法によって、マウス腹水からモノ
クローナルＩｇＭ抗体を損失することなく高純度に分離
精製することができた。実施例２ピロリン酸ジルコニウム組成となるようにオキシ酢酸ジ
ルコニウム水溶液とリン酸を混合撹拌して精製したスラ
リーを、２００℃で噴霧乾燥して４０〜６０μｍの球状
粒子を得た。この生成物を更に９００℃で６時間熱処理
してピロリン酸ジルコニウムの多孔質な球状粒子を得
た。

【００２１】免疫グロブリンクラスＧ２ａ（ＩｇＧ２
ａ）のモノクローナル抗体を含有するラット腹水１０ｍ
ｌを試験管に入れ、ピロリン酸ジルコニウム球状粒子
４.０ｇを加えて５分間振盪し、ＩｇＧ２ａ抗体をピロ
リン酸ジルコニウムに吸着させた。次いで、孔径１０μ
ｍのフィルターを底部に装着したシリンジに腹水を注ぎ
こみ、ＩｇＧ２ａ抗体を吸着させたピロリン酸ジルコニ
ウムを濾別した。更に、腹水中の夾雑成分である血清ア
ルブミンなどを除去するためにｐＨ６.８に調整した１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液２０ｍｌでピロリン酸ジル
コニウムを洗浄した。その後、ＩｇＧ２ａ抗体を回収す
るために、リン酸カリウムでｐＨを６.８に調整した４
００ｍＭ塩化カリウム溶液５ｍｌをシリンジに注ぎこ
み、シリンジ下部から留出する溶出液を回収し、ラット
ＩｇＧ２ａ抗体溶液約５ｍｌを得た。このＩｇＧ２ａ抗
体溶液の純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で調べた結果、ＩｇＧ２ａ抗体のＨ鎖およびＬ鎖に由
来する２本のバンドのほかには、バンドは検出されなか
った。また吸光度測定法による、この精製処理工程にお
けるＩｇＧ２ａ抗体の回収率はほぼ１００％であった。
このように本発明に係わるバッチ法による抗体の精製方
法によって、ラット腹水からモノクローナルＩｇＧ２ａ
抗体を損失することなく高純度に分離精製することがで
きた。実施例３オルトリン酸アルミニウム組成となるように硝酸アルミ
ニウム水溶液とリン酸三アンモニウム水溶液を混合撹拌
して調製したスラリーを、２００℃で噴霧乾燥して３０
〜８０μｍの球状粒子を得た。この生成物を更に１００
０℃で１２時間熱処理してオルトリン酸アルミニウムの
多孔質な球状粒子を得た。

【００２２】免疫グロブリンクラスＧ２ｂ（ＩｇＧ２
ｂ）のモノクローナル抗体を含有するマウス腹水５ｍｌ
を試験管に入れ、オルトリン酸アルミニウム球状粒子
２.５ｇを加えて５分間振盪し、ＩｇＧ２ｂ抗体をオル
トリン酸アルミニウムに吸着させた後、５分間静置して
分離材粒子を自然沈降させ、上澄みを捨てた。腹水中の
夾雑成分である血清アルブミンなどを除去するためにｐ
Ｈ７.０に調整した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液２
０ｍｌを加え、振盪させた後、５分間静置して分離材粒
子を自然沈降させ、上澄みを捨てた。その後、ＩｇＧ２
ｂ抗体を回収するために、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液でｐＨを７.０に調整した３００ｍＭ塩化ナトリウ
ム溶液１０ｍｌを加え、振盪させた後、５分間静置して
分離材粒子を自然沈降させ、上澄みを回収し、マウスＩ
ｇＧ２ｂ抗体溶液約１０ｍｌを得た。精製後のマウスモ
ノクローナルＩｇＧ３抗体の純度と回収率は実施例２と
同じであった。実施例４リン酸マグネシウムアンモニウム・六水和物を６００℃
で６時間反応させた後、生成物をボールミルで粉砕して
ピロリン酸マグネシウム微粒子を得た。この微粒子を水
に分散して調製したスラリーを原料として、公知の撹拌
造粒法によって平均粒子径５００μｍ〜３ｍｍの球状粒
子を作製し、それを７００℃で６時間熱処理してピロリ
ン酸マグネシウムの球状粒子を得た。

【００２３】免疫グロブリンクラスＧ３（ＩｇＧ３）の
マウスモノクローナル抗体を含有する血清培地（１０％
ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地、抗体濃度：約３０mg／リッ
トル）から得た培養上清２リットルに、１Ｎ塩酸を加え
ｐＨを６.８に調整した。ピロリン酸マグネシウム球状
粒子１０ｇを培養上清に入れて５分間オーバーヘッドス
ターラーで撹拌し、ＩｇＧ３抗体をピロリン酸マグネシ
ウムに吸着させた。次いで、孔径１０μｍのフィルター
を底部に装着したシリンジに培養上清を注ぎこみ、Ｉｇ
Ｇ３抗体を吸着させたピロリン酸マグネシウムを濾別し
た。更に、血清培地中の夾雑成分である血清アルブミン
などを除去するためにｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液３０ｍｌでピロリン酸マグネシウム
を洗浄した。その後、ＩｇＧ３抗体を回収するために、
リン酸カリウムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ塩
化カリウム溶液１０ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シリン
ジ下部から留出する溶出液を回収し、マウスＩｇＧ３抗
体溶液約１０ｍｌを得た。精製後のマウスモノクローナ
ルＩｇＧ３抗体の純度と回収率は実施例２と同じであっ
た。

【００２４】なお、本実施例において使用した分離材を
回収し、その使用前後の粒子の形状を走査型電子顕微鏡
で観察したところ、粒子の破壊などは認められず、撹拌
を含むバッチ法による一連の精製操作で使用するに十分
な機械的強度を有することが確認できた。実施例５メタリン酸アルミニウム組成となるようにアルミナとリ
ン酸アンモニウムを配合して６００℃で８時間反応させ
た後、生成物を粉砕して微粒子を得た。この微粒子を水
に分散して調製したスラリーを２００℃で噴霧乾燥して
６０〜９０μｍの球状粒子を作製し、それを８００℃で
８時間熱処理した。この球状粒子をＸ線回折分析した結
果、メタリン酸アルミニウム（Ａ型）の結晶であった。

【００２５】免疫グロブリンクラスＭ（ＩｇＭ）のマウ
スモノクローナル抗体を含有する無血清培地（ＲＰＭＩ
１６４０培地、抗体濃度：約４０mg／リットル）から
得た培養上清５リットルに、１Ｎ塩酸を加えｐＨを６.
８に調整した。メタリン酸アルミニウム球状粒子２５ｇ
を培養上清に入れて５分間オーバーヘッドスターラーで
撹拌し、ＩｇＭ抗体をメタリン酸アルミニウムに吸着さ
せた。次いで、孔径２０μｍのフィルターを底部に装着
したシリンジに培養上清を注ぎこみ、ＩｇＭ抗体を吸着
させたメタリン酸アルミニウムを濾別した。更に、無血
清培地に添加されている血清アルブミンなどを除去する
ためにｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液５０ｍｌでメタリン酸アルミニウムを洗浄した。
その後、ＩｇＭ抗体を回収するために、リン酸ナトリウ
ムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ塩化ナトリウム
溶液１５ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シリンジ下部から
留出する溶出液を回収し、マウスＩｇＭ抗体溶液約１５
ｍｌを得た。精製後のマウスモノクローナルＩｇＭ抗体
の純度と回収率は実施例１と同じであった。実施例６ピロリン酸亜鉛組成となるように酸化マグネシウムとリ
ン酸アンモニウムを７５０℃で８時間反応させた後、生
成物をボールミルで粉砕して平均粒径１００〜２００μ
ｍの粒子を得た。

【００２６】免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）のポリ
クローナル抗体を含有するウサギ抗血清１０ｍｌに、リ
ン酸１ナトリウムおよびリン酸２カリウムを混合して調
整したｐＨ７.０の１０ｍＭ酸緩衝液で５倍に希釈した
もの５０ｍｌに、ピロリン酸亜鉛粒子１０ｇを入れて５
分間オーバーヘッドスターラーで撹拌し、ＩｇＧ抗体を
ピロリン酸亜鉛に吸着させた。次いで、孔径１０μｍの
フィルターを底部に装着したシリンジに希釈した抗血清
を注ぎこみ、ＩｇＧ抗体を吸着させたピロリン酸亜鉛を
濾別した。更に、血清中の夾雑成分である血清アルブミ
ンなどを除去するためにリン酸１ナトリウムおよびリン
酸２カリウムでｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリン酸緩
衝液２０ｍｌでピロリン酸亜鉛を洗浄した。その後、Ｉ
ｇＧ抗体を回収するために、リン酸１ナトリウムおよび
リン酸２カリウムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ
塩化ナトリウム溶液１０ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シ
リンジ下部から留出する溶出液を回収し、ウサギＩｇＧ
抗体溶液約１０ｍｌを得た。精製後のウサギポリクロー
ナルＩｇＧ抗体の純度と回収率は実施例２と同じであっ
た。

【００２７】本実施例は、全工程を低温条件下で行った
が、ほかの実施例における常温条件下での精製と比較し
ても、精製材料に対する抗体の吸着特性に違いは認めら
れず、本発明における抗体の精製方法が、温度条件に依
存することなく利用できることを示すものである。実施例７ピロリン酸チタン組成となるように酸化チタンとリン酸
アンモニウムを８５０℃で１２時間反応させた後、生成
物をボールミルで粉砕して平均粒径６０〜１５０μｍの
ピロリン酸チタン粒子を得た。

【００２８】ヤギ血清５００ｍｌをｐＨ６.６に調整し
た１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で２倍に希釈したも
の１リットルに、ピロリン酸チタン粒子５０ｇを入れて
５分間オーバーヘッドスターラー撹拌し、抗体をピロリ
ン酸チタンに吸着させた。次いで、孔径５０μｍのフィ
ルターを底部に装着したシリンジに希釈した血清を注ぎ
こみ、抗体を吸着させたピロリン酸チタンを濾別した。
更に、血清中の夾雑成分である血清アルブミンなどを除
去するためにリン酸ナトリウムでｐＨ６.６に調整した
１０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌでピロリン酸チタンを
洗浄した。その後、ＩｇＧ抗体を回収するために、リン
酸ナトリウムでｐＨを６.６に調整した５００ｍＭ塩化
ナトリウム溶液５０ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シリン
ジ下部から留出する溶出液を回収し、ヤギＩｇＧ抗体溶
液約５０ｍｌを得た。次いでｐＨ６.６に調整した５０
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液５０ｍｌをシリンジに注
ぎこみ、シリンジ下部から留出する溶出液を回収し、ヤ
ギＩｇＧ抗体溶液５０ｍｌを得た。ヤギＩｇＧ抗体およ
びＩｇＭ抗体の純度と回収率は実施例１および２と同じ
であった。実施例８カルシウムとマグネシウムの原子比が１：１となるよう
にリン酸水素カルシウムとリン酸水素マグネシウムを希
硝酸に溶解し、１５０℃でドライアップ後、８５０℃で
熱分解して、金属成分がカルシウムとマグネシウムの２
成分から成るピロリン酸塩を作製した。生成物はボール
ミルで粉砕して平均粒径８０〜２５０μｍの粒子を得
た。このピロリン酸塩のＸ線回折データはＡＳＴＭのデ
ータ集に収録されているＣａＭｇＰ₂Ｏ₇のＸ線回折デー
タ（X-ray Powder Diffraction File No. 24-135）に一
致した。

【００２９】免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）のポリ
クローナル抗体を含有するラット抗血清５ｍｌをｐＨ
６.８の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で１０倍に希
釈したもの５０ｍｌに、ピロリン酸カルシウムマグネシ
ウム粒子１０ｇを入れて５分間振盪し、ＩｇＧ抗体をピ
ロリン酸カルシウムマグネシウムに吸着させた。次い
で、孔径４０μｍのフィルターを底部に装着したシリン
ジに希釈した抗血清を注ぎこみ、ＩｇＧ抗体を吸着させ
たピロリン酸カルシウムマグネシウムを濾別した。更
に、血清中の夾雑成分である血清アルブミンなどを除去
するためにｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液２０ｍｌでピロリン酸カルシウムマグネシウ
ムを洗浄した。その後、ＩｇＧ抗体を回収するために、
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨを６.８に調整
した５００ｍＭ塩化ナトリウム溶液１０ｍｌをシリンジ
に注ぎこみ、シリンジ下部から留出する溶出液を回収
し、ラットＩｇＧ抗体溶液約１０ｍｌを得た。精製後の
ラットポリクローナルＩｇＧ抗体の純度と回収率は実施
例２と同じであった。

【００３０】

【発明の効果】以上のように本発明に係わる抗体の精製
方法は、治療薬、診断薬、高感度試薬、触媒などに応用
が期待されている抗体を効率よく簡単に、かつ安価に回
収・精製できるため、工業的に大量生産する方法として
利用できるものである。更に本発明の方法は中性付近に
ｐＨを調製した溶離液を使用することができるため、抗
体にとって極めて温和な分離条件となり、得られる抗体
の活性を損なう恐れがないという優れた効果を奏する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗体を含有する溶液をリン酸の金属塩か
らなる分離材と接触させ、抗体を該分離材に吸着させた
後、溶液と該分離材を分別し、更に該分離材から抗体を
溶離・回収してなるバッチ法による抗体の分離精製方
法。
【請求項２】リン酸の金属塩がオルトリン酸、ピロリ
ン酸またはメタリン酸の金属塩である請求項１に記載の
抗体の分離精製方法。
【請求項３】オルトリン酸、ピロリン酸またはメタリ
ン酸の金属塩がマグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウム、マンガン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウ
ム、ジルコニウム、チタン、イットリウム、ランタン、
珪素から選ばれた金属の塩である請求項１、２に記載の
抗体の分離精製方法。
【請求項４】分離材が、バッチ法による抗体の分離精
製方法における一連の操作において使用するに十分な機
械的強度を持ち、かつ比重が１より大きいことを特徴と
する、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の分離精製
方法。
【請求項５】分離材への抗体の吸着および分離材から
の抗体の溶離・回収に、ｐＨ６〜８の範囲のｐＨに調整
した溶液を用いることを特徴とする、請求項１〜４のい
ずれかに記載の抗体の分離精製方法。