JP7333563B2 - 脂質ナノ粒子 - Google Patents
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Description
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
上記LNPが約10 mol%~60 mol%の上記イオン性脂質を含む;
上記LNPが約15 mol%~50 mol%の上記ステロールを含む;
上記LNPが約0.5 mol%~10 mol%の上記PEG脂質を含む;及び/又は、
上記LNPが約5 mol%~40 mol%の上記リン脂質を含む。
前記イオン性脂質、前記リン脂質、前記ステロール、前記PEG脂質及び好適なアルコール性溶媒を含む第1のアルコール性組成物を調製することと、
1つ以上の前記核酸及び水性溶媒を含む第2の水性組成物を調製することと、
前記第1及び第2の組成物をマイクロ流体混合装置内で以下の設定:
約0.5 ml/min~約8 ml/min、好ましくは約1 ml/min~4 ml/minの全流量(FR)、
約1/1~5/1、好ましくは約2/1~約3/1の流量比(FRR)、
を用いて混合することと、
を含む、方法を提供する。
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
上記LNPが約35 mol%~65 mol%の上記イオン性脂質を含む;
上記LNPが約15 mol%~60 mol%の上記ステロールを含む;
上記LNPが約0.5 mol%~2 mol%の上記PEG脂質を含む;及び/又は、
上記LNPが約5 mol%~15 mol%の上記リン脂質を含む。
上記LNPが約10 mol%~60 mol%の上記イオン性脂質を含む;
上記LNPが約15 mol%~50 mol%の上記ステロールを含む;
上記LNPが約0.5 mol%~10 mol%の上記PEG脂質を含む;及び/又は、
上記LNPが約5 mol%~40 mol%の上記リン脂質を含む。
上記LNPが約40 mol%~60 mol%の上記イオン性脂質を含む;
上記LNPが約20 mol%~40 mol%の上記ステロールを含む;
上記LNPが約0.5 mol%~5 mol%の上記PEG脂質を含む;及び/又は、
上記LNPが約5 mol%~15 mol%の上記リン脂質を含む。
前記イオン性脂質、前記リン脂質、前記ステロール、前記PEG脂質及び好適なアルコール性溶媒を含む第1のアルコール性組成物を調製することと、
1つ以上の前記核酸及び水性溶媒を含む第2の水性組成物を調製することと、
前記第1及び第2の組成物をマイクロ流体混合装置内で以下の設定:
約0.5 ml/min~約8 ml/min、好ましくは約1 ml/min~4 ml/minの全流量(FR)、
約1/1~5/1、好ましくは約2/1~約3/1の流量比(FRR)、
を用いて混合することと、
を含む、方法を提供する。
この第1の実施例では、mRNA LNPの免疫原性に対する粒径の影響を評価した。そのために、同一組成の140 nm及び230 nmのサイズのmRNA LNPを調製した。LNPは、50 mol% α-D-トコフェロールヘミスクシノイル(イオン性脂質)、10 mol% DOPE、38.5 mol%コレステロール及び1.5 mol% DSG-PEG5000(PEG化脂質)から指定の脂質比(mol%)で構成されていた。LNPは、異なる流量(FR;ml/min)及び水/エタノール体積比(FRR)を用いてNano-Assemblrで作製した。140 nmのサイズのLNPはFR 4 ml/minで作製したが、230 nmのサイズのLNPはFR 1 ml/minで生成した。
本実施例では、マウスにおける静脈内投与後の異なるサイズ及び組成のOVA mRNA LNPの免疫原性を決定した。全てのLNPが、図2に規定されるような指定の脂質比(mol%)のα-D-トコフェロールヘミスクシノイル(イオン性脂質)、DOPE、コレステロール及びDSG-PEG5000で構成されていた。LNPは、同様に図2に規定されるような異なる流量(FR;ml/min)及び水/エタノール体積比(FRR)を用いてNano-Assemblrで作製した。OVA特異的CD8 T細胞のパーセンテージを免疫化の6日後にフローサイトメトリーによって定量化した。この場合も図2から極めて明らかなように、より大きなLNPの免疫原性は、より小さなLNPの免疫原性と比較してより高い。
本実施例では、マウスにおける単回静脈内投与後の異なるサイズ及び組成のOVA mRNA LNPの免疫原性を決定した。プロットは、OVA MHCIエピトープSIINFEKL(5 μg/ml)による脾細胞の再刺激後の脾細胞100万個当たりのIFN-γ分泌CD8+T細胞の数を示す。全てのLNPが、図3に規定されるような指定の脂質比(mol%)のα-D-トコフェロールヘミスクシノイル(イオン性脂質)、DOPE、コレステロール及びDSG-PEG5000で構成されていた。LNPは、同様に図3に規定されるような異なる流量(FR;ml/min)及び水/エタノール体積比(FRR)を用いてNano-Assemblrで作製した。OVA特異的CD8+T細胞のパーセンテージを免疫化の6日後にフローサイトメトリーによって定量化した。
次に、PEG化脂質を変化させた場合の影響を評価した。そのために、2つの異なる組成物をDSG-PEG5000又はDMG-PEG2000のいずれかを用いて作製した。OVA mRNA(10 μg)及びTriMix mRNA(15 μg)を含有する大型LNPの静脈内投与後のOVA特異的T細胞のパーセンテージを決定し、図4に示した。マウスを0日目及び20日目に免疫化した。OVA特異的T細胞の%を15日目及び39日目に血液サンプルで評価した。図4から分かるように、PEG化脂質のタイプは、LNPの免疫原性に影響を与えない。
本実施例では、140 nm及び230 nmのサイズのmRNA LNPを用いた反復免疫化後の小さな及び大きなLNPの免疫原性を評価した(図5)。LNPは、図5に規定されるような指定の脂質比(mol%)の50 mol% α-D-トコフェロールヘミスクシノイル(イオン性脂質)、10 mol% DOPE(リン脂質)、38 mol%コレステロール及び1.5 mol% DSG-PEG5000で構成されていた。LNPは、10 μgのOVA mRNA及び15 μgのTriMix mRNA(CD40L、CD70及びcaTLR4)を含有していた。OVA特異的CD8 T細胞応答のパーセンテージ(Percentages)を免疫化の5日後に測定した。
本実施例では、異なるサイズのFluc mRNA LNPを用いたマウスの静脈注射後の脾臓及び肝臓におけるmRNA発現を比較した(図6)。LNPは、50/10/38.5/1.5のそれぞれの脂質比のα-D-トコフェロールヘミスクシノイル(イオン性脂質)、DOPC、コレステロール及びDSG-PEG5000で構成されていた。異なるサイズのLNPを、異なるマイクロ流体混合の流量(FR1対FR4)を用いて生成した。in vivo生物発光(ph/s/cm2/sr)によって測定される脾臓対肝臓のFluc mRNAの発現比を図に示す。
本実施例では、配合された静脈内mRNA LNPが節内アプローチと比較して優れた免疫原性及び抗腫瘍効果を引き起こすことが実証される。
E7 mRNA、カラム精製、投与1回当たり10 μg
免疫化スケジュール:週3回
本実施例では、mRNA LNP配合物に対するT細胞応答が長続きし、ブースト可能であることが実証される。
3回目の免疫化の40日後のE7特異的T細胞の高い%による収縮期の延長
メモリー変換(Memory conversion)
驚くべきリコール応答:IV配合ワクチンをブーストすることができる
本実施例では、LNPのサイズの影響を実証する更なる実験を行った。
イオン性脂質/chol/DOPE/DMG-PEG2000の比率 - 50/38.5/10/1.5
3回のIV免疫化;0日目、7日目、14日目
mRNA:OVAをコードするmRNA、免疫化1回当たり10 μg
1回目の免疫化の5日後、12日後、19日後及び50日後のOVA特異的CD8 T細胞の%の評価
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図1
% OVA-specific CD8+ T cells OVA特異的CD8+T細胞(%)
図2
% OVA-specific CD8+ T cells OVA特異的CD8+T細胞(%)
図3
IFN-γ secreting T cells/million 100万個当たりのIFN-γ分泌T細胞
図4
% OVA-specific CD8+ T cells OVA特異的CD8+T細胞(%)
Days post immunisation 免疫化後の日数
図5
% OVA specific CD8 T cells OVA特異的CD8 T細胞(%)
1st immunization 1回目の免疫化
2nd immunization 2回目の免疫化
図6
ratio spleen/liver expression 脾臓/肝臓の発現比
図7
T cell response T細胞応答
E7 specific CD8+ T cells E7特異的CD8+T細胞
#immunizations 免疫化の回数
No treatment 処理なし
Tumor volume 腫瘍体積
IV formulation X IV配合物X
Days 日数
IV formulation Z IV配合物Z
図8
Results update 最新結果
E7 specific CD8+ T Cells E7特異的CD8+T細胞
Days 日数
IV mRNA nanoparticle IV mRNAナノ粒子
Formulation 配合物
Effector/memory - day 55 エフェクター/メモリー - 55日目
% of E7 specific T cells E7特異的T細胞(%)
Effector エフェクター
Memory precursor メモリー前駆
Central Memory セントラルメモリー
図9
OVA specific CD8+ T Cells OVA特異的CD8+T細胞
Time (days) 時間(日数)
Claims (13)
- 50 mol%~65 mol%のイオン性脂質と、
ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)及びそれらの混合物を含むリストから選択される、5 mol%~15 mol%のリン脂質と、
15 mol%~40 mol%のコレステロールと、
0.5 mol%~2 mol%のポリエチレングリコール脂質(PEG脂質)と、
1つ以上の核酸分子と、
を含む脂質ナノ粒子(LNP)であって、140 nmの最小平均直径を有することを特徴とする、LNP。 - 前記イオン性脂質が式(I):
RCOOは、ミリストイル、α-D-トコフェロールスクシノイル、リノレオイル及びオレオイルを含むリストから選択され、
Xは、
又は、前記イオン性脂質が、RCCO(RCOO)がα-D-トコフェロールスクシノイルであり、Xが、
- 前記PEG脂質がPEG修飾ホスファチジルエタノールアミン、PEG修飾ホスファチジン酸、PEG修飾セラミド、PEG修飾ジアルキルアミン、PEG修飾ジアシルグリセロール、PEG修飾ジアルキルグリセロール及びそれらの混合物を含むリストから選択される、請求項1又は2に記載のLNP。
- 20 mol%~40 mol%のコレステロールを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のLNP。
- 前記1つ以上の核酸分子がmRNA及びDNAを含むリストから選択され、又はmRNAである、請求項1~4のいずれか一項に記載のLNP。
- 前記1つ以上のmRNA分子が、免疫調節ポリペプチドをコードするmRNA及び/又は抗原をコードするmRNAの群から選択される、請求項5に記載のLNP。
- 前記免疫調節ポリペプチドをコードするmRNAがCD40L、CD70及びcaTLR4をコードするmRNA分子を含むリストから選択される、請求項5又は6に記載のLNP。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の1つ以上のLNPと、許容可能な医薬担体とを含む、医薬組成物又はワクチン。
- 人間医学又は獣医学において使用される、請求項1~7のいずれか一項に記載のLNP又は請求項8に記載の医薬組成物。
- 140nmの最小平均直径を有する核酸含有脂質ナノ粒子(LNP)を作製する方法であって、
50 mol%~65 mol%のイオン性脂質、リン脂質、ステロール、PEG脂質及び好適なアルコール性溶媒を含む第1のアルコール性組成物を調製する工程と、
適切なバッファーを添加した1つ以上の核酸及び水性溶媒を含む第2の水性組成物を調製する工程と、
前記第1及び第2の組成物をマイクロ流体混合装置内で以下の設定:
1 ml/min~4 ml/minの全流量(FR)、
1/1~5/1又は2/1~3/1の流量比(FRR)、を用いて混合する工程と、
を含む、方法。 - 前記アルコール性溶媒がエタノールであり、及び/又は前記水性溶媒が水である、請求項10に記載の方法。
- 哺乳動物において核酸にコードされる抗原に対する免疫応答を誘導するために使用される、請求項1~7のいずれか一項に記載のLNP又は請求項8に記載の医薬組成物。
- 癌又は感染性疾患の治療に使用される、請求項1~7のいずれか一項に記載のLNP、又は請求項8に記載の医薬組成物若しくはワクチン。
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