CN115998714B - 一种脂质纳米颗粒、递送***及递送***的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂质纳米颗粒、递送***及递送***的制备方法，属于生物医药领域，本发明提供了一种包含两种阳离子脂质分子的脂质纳米颗粒；该纳米脂质颗粒作为载体可将mRNA高效递送至体内细胞，从而实现mRNA分子在细胞内翻译表达相关疫苗抗原，并在启动细胞内天然免疫反应***的背景下，实现对获得性免疫***的激活，以该脂质纳米颗粒为载体所制备的递送***对mRNA分子的包封率达95%以上，且有效性和安全性均等同于现有的LNP体系。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体的说，涉及一种脂质纳米颗粒、递送***及递送***的制备方法。
背景技术
在新兴的mRNA疫苗及其基因药物的研究及应用领域，一个关键技术环节是能够将mRNA分子递送进入细胞内的介导***的开发，其通常以纳米颗粒载体的不同形式实现。在这些不同形式的纳米递送载体中，脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle，LNP）技术，是针对COVID-19的mRNA疫苗需求而得以迅速开发的新兴领域，这一技术基于脂质分子在特定组成形式时与细胞膜有效融合的特性实现将具有翻译能力的mRNA分子递送进入体内细胞，从而实现mRNA分子在细胞内翻译表达相关疫苗抗原，并在启动细胞内天然免疫反应***的背景下，实现对获得性免疫***的激活。目前的LNP，主要包括4种基本的脂质分子，分别为阳离子脂质、磷脂分子、胆固醇及PEG化脂质分子。这些分子的具体形式可以有所差异，但从已上市的三个mRNA疫苗所使用的LNP组成情况看，这一组合形成较为固定的模式（如下表）。
目前的LNP，胆固醇在脂质颗粒的形成过程中起到稳定作用，是必备组分之一。
尽管目前的技术已经提供了一系列的纳米脂质颗粒的组成，但是提供新组分的纳米脂质颗粒仍有积极的意义。
发明内容
阳离子脂质在纳米颗粒载体的形成中具有关键作用，它与可电离脂质共同启动颗粒自组装的物理化学过程，同时对包裹mRNA分子具有关键作用。本发明的申请人通过大量的实验研究，制备了包含两种阳离子脂质的纳米颗粒载体，并通过两种阳离子脂质的配比，可取代胆固醇，所制备的递送***对mRNA分子的包封率达95%以上，且有效性和安全性均等同于现有的LNP体系。
为此，本发明的第一目的在于提供一种脂质纳米颗粒的配方，第二目的在于提供以该脂质纳米颗粒为载体的递送***，第三目的在于提供该递送***的制备方法。
本发明的第一目的是通过以下技术方案实现的：
所述的脂质纳米颗粒包括两种阳离子脂质、一种中性磷脂分子和一种PEG化脂质分子。所包含的两种阳离子脂质分别为（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）(以下简称DHA)和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐（DOTAP-Cl）。
进一步的，DHA与DOTAP-Cl的摩尔比为48-58:12-20。
进一步的，所述的中性磷脂分子为1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）；所述的PEG化脂质分子为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺（mPEG-DTA-2K）。
进一步的，DHA、DOTAP-Cl、DOPC、mPEG-DTA-2K的摩尔比为48-58：12-20：23-28：1.8-2.5。
本发明的第二目的是通过以下技术方案实现的：
将上述脂质纳米颗粒作为载体应用在生物活性物质递送***的制备中。
进一步的，所述的生物活性物质递送***为mRNA疫苗或类病毒结构的mRNA疫苗。
进一步的，所述疫苗为用于预防病毒感染的疫苗。
进一步的，所述病毒为SARS-CoV-2。
一种以脂质纳米颗粒为载体的mRNA递送***的制备工艺，包括以下步骤：
S1.将DHA，DOTAP-CL，DOPC，mPEG-DTA-2K溶于无水乙醇，充分溶解，得到有机相；用NaAc 10mM、海藻糖为0.0001%的缓冲液稀释mRNA得到水相。
S2.将步骤S1有机相与水相经微流控制备得到mRNA-ADT（该***命名分别取本申请的纳米脂质颗粒中DHA中的字母A、DOPC中的字母T和DOTAP中的字母A，以ADT命名），以含有NaAc 10mM、海藻糖为0.0001%的缓冲液做15-20倍稀释，经100Kda超滤离心管超滤浓缩后得到负载有mRNA的ADT脂质颗粒的悬液，该悬液中脂质颗粒与mRNA中的氮磷摩尔比为4-6:1。
本发明的有益效果：
1、本发明的脂质纳米颗粒配方，不需要使用胆固醇作为稳定剂，仍然可以达到良好的载体递送效果，以本发明的脂质纳米颗粒作为载体构建的递送***，不需要添加胆固醇做稳定剂，对mRNA分子的包封率达95%以上，且有效性和安全性均等同于现有的LNP。
2、本发明的脂质纳米颗粒所制备的递送***，所形成的ADT的直径在包封前为50-60nm，包裹mRNA分子（以SARS-CoV-2的S1序列转录制备的mRNA分子，其在含有5’-UTR和3’-UTR和polyA的情况下的序列长度为2471 nt）情况下的直径为70-80nm，包裹后的颗粒呈均匀的球形囊状结构，包封率达95%以上。
3、以本发明的脂质纳米颗粒为载体所制备的递送***，能使同样剂量的mRNA分子在细胞内产生与Moderna公司配方相似的翻译表达效率。所制备的递送***可将mRNA高效递送至体内细胞，从而实现mRNA分子在细胞内翻译表达相关疫苗抗原，并在启动细胞内天然免疫反应***的背景下，实现对获得性免疫***的激活。
附图说明
图1是本发明的递送体系对mRNA包封前和包封后电镜形态对比；
图2是本发明的递送体系对mRNA包封前和包封后电泳检测对比；
图3是本发明的递送体系包裹EGFP荧光蛋白表达情况对比；
图4是本发明的递送体系转染效率对比；
图5是本发明的递送体系转染细胞S1表达情况；
图6是不同递送***S1 mRNA免疫小鼠后血清抗体效价检测对比；
图7是不同递送***S1 mRNA免疫小鼠后血清中病毒中和抗体效价检测对比；
图8是不同递送***S1 mRNA免疫小鼠后细胞免疫反应检测对比；
图9是mRNA分子进入细胞后有效表达抗原蛋白；
图10免疫组织病理结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的说明，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下多获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明是通过以下技术方案实现的：
实施例1
纳米脂质颗粒及应用
本发明的脂质纳米颗粒不含胆固醇、包括两种阳离子脂质一种中性磷脂分子和一种PEG化脂质分子。
第一种阳离子脂质为：
（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）（简称DHA）
英文名：((4-Hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)
第二种阳离子脂质为：
(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐（DOTAP-Cl）
英文名：(2,3-Dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium-chloride
作为优选方案，所述的中性磷脂分子为：
(1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱)（DOPC）；
英文名：（1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）。
所述的PEG化脂质分子为：
2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺（mPEG-DTA-2K）；
英文名为：2-[(polyethyleneglycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide。
其中，DHA、DOTAP-Cl、DOPC、mPEG-DTA-2K的摩尔比为48-58：12-20：23-28：1.8-2.5。
本实施例的纳米脂质颗粒作为载体在制备生物活性物质递送***中的应用。
实施例2
以实施例1的脂质纳米颗粒做载体的mRNA-ADT递送***的制备方法，包括以下步骤：
S1：将DHA，DOTAP-CL，DOPC，mPEG-DTA-2K分别按分子浓度：20%、10%、20%、10%溶于GR级的无水乙醇，充分溶解。溶解温度优选37-42℃。
S2:按照DHA：DOTAP-CL：DOPC：mPEG-DTA-2K=54.7：16.5：26.7：2.1的摩尔比将步骤S1的无水乙醇溶液混合，制备得到有机相。
S3：用NaAc 10mM、百分浓度为0.0001%海藻糖的缓冲液稀释mRNA（mRNA含量可以根据所需使用剂量确定，但需满足氮磷摩尔比（N/P值）为4-6:1），制备得到水相。
S4：通过NanoAssemblr IgniteTM微流控设备，按有机相与水相1:3（ml/min）流速比，总流速15-20ml/min，制备得到mRNA-ADT。以含有NaAc 10mM、海藻糖为0.0001%的缓冲液稀释mRNA-ADT，稀释倍数为15-20倍，以100 Kda超滤离心管超滤浓缩。离心条件：15℃、2500×g、20分钟，直至稀释液体积接近稀释前。其最终的氮磷比N/P=4-6。
所制备的ADT***的物理化学特性分析：
基于已有的不同类型LNP的物理化学特性分析表明，能够有效将mRNA递送进入细胞的LNP颗粒直径通常为60-120nm，并表现相应的表面电位（Zeta电位）和聚合物分散性指数f（PDI）。
对本实施例所形成的ADT脂质纳米颗粒做了相应的表征特性、包裹mRNA分子和游离mRNA分子对比等结果表明，本实施例所形成的ADT脂质纳米颗粒的直径在包封前为50-60nm，在包封mRNA分子（包封SARS-CoV-2的S1序列转录制备的mRNA分子，其在含有5’-UTR和3‘-UTR和poly A尾的情况下其序列长度为2471 nt）情况下的直径为70-80nm，其PDI和Zeta电位分别为0.1-0.2和30-40 mv。具体分析数据见表2。
表2 mRNA-LNP递送***包封mRNA前后表征特性
对包裹mRNA分子前后的形态学电镜观察表明，包封后的颗粒呈均匀的球形囊状结构（附图1）。
同时，对该ADT包裹mRNA的包封率检测（用Quant-iT™ RiboGreen™ RNA Reagentand Kit Catalog Numbers R11490试剂盒检测），结果表明，包封率达95%以上。
表-3 ADT递送***对mRNA的包封率
凝胶电泳结果亦证明了这一结果（附图2）。
本实施例所形成的mRNA-ADT脂质纳米颗粒体内和体外细胞的转染效果
研究表明，具有mRNA分子细胞内递送能力的ADT脂质颗粒性能分析的主要指标即为其对体内和体外细胞的转染效果。
利用经实施例2制备的、包裹EGFP mRNA分子的制品以不同剂量转染了体外培养的293细胞，同时使用Moderna公司的LNP配方作为参照，在转染后24小时内观察荧光蛋白表达（附图3），结果表明：本发明的递送***具有良好的转染能力，其转染效率高达80%以上（附图4），与Moderna公司的LNP配方没有显著差异。
利用经实施例2制备的、包裹有SARS-CoV-2的S1基因mRNA分子的制品转染293细胞，于转染后24h收集细胞培养物，使用12% SDS-PAGE分离重组蛋白，经电转将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。使用TBST制备5%脱脂牛奶室温封闭1h，洗涤3次，加入抗S蛋白的特异性一抗4℃过夜孵育，洗涤3次，然后与带过氧化物酶（HRP）标记的二抗（抗IgG(H+L)抗体）室温孵育1h，洗涤3次。最终，经ECL超灵敏化学发光法将上述处理的PVDF膜置于Bio-Rad凝胶成像仪中进行曝光和显色。以此确定ADT体系的转染效率。同时，我们使用Moderna公司的配方组成作为参照。结果表明，本发明的ADT体系配方能使同样剂量的mRNA分子在细胞内产生与Moderna公司配方相似的翻译表达效率（附图5）。
递送***用于mRNA疫苗的免疫效果分析
在不同种类LNP体系用于mRNA疫苗的研究领域中，动物特异性免疫反应的形成及其临床免疫保护有效性是判定LNP体系应用价值的最重要指标。
以SARS-CoV-2刺突蛋白的S1基因，该S1基因主要包含病毒与细胞ACE2 受体结合的RBD部分，所编码转录的mRNA分子，该mRNA分子携带的5'-UTR和3'-UTR，其中5'-UTR为YFV17D株基因的5'-UTR，3'-UTR为人类线粒体基因中核糖体的3'-UTR，经实施例2的ADT体系制备成为实验性疫苗，以相应的mRNA剂量范围，形成总脂质量为1.95mg/dose的mRNA实验性疫苗，按0，21天免疫模式免疫Balb/c小鼠，其免疫途径为肌肉注射，分别于二免后14天、28天检测其抗体效价，细胞免疫反应等指标，其结果表明：由ADT脂质颗粒体系所介导的SARS-CoV-2 S1基因 mRNA分子，能够在小鼠体内诱导明显的抗体反应，其结合抗体效价高达105-6以上（附图6）。其真病毒中和抗体效价亦为102-3以上（附图7）。而相应的IFN-γ和IL-4特异的Elispot检测亦提示，免疫小鼠形成了***的特异性抗S抗原的免疫反应（附图8）。
安全性分析：
在之前多个mRNA疫苗的研究中，已经积累了大量相关LNP制备脂质分子药理学资料，在本发明的ADT脂质颗粒体系的组成配方中，所有使用的脂质原料均已得到了相关病理学观察并证实了其安全性。着重观察了这些脂质原料在本实施例的配方组成中形成的ADT的安全性，主要从其形成mRNA疫苗制剂后，免疫机体所形成的组织分布和应用后各器官组织的大体病理学观察。观察结果表明，该ADT体系在携带S1mRNA分子免疫后，首先可以在肌肉组织中介导mRNA分子进入细胞后有效表达抗原蛋白（附图9），该表达在时间上有一定动力学变化。在24-48小时内表达至峰值（附图9）。同时，在各组织脏器中均未检测到该mRNA分子的存在（表4）。
表4.mRNA在小鼠不同组织表达情况
注：“—”表示未检测到mRNA抗原分子；“+”表示检测到mRNA抗原分子。
同时，在免疫后不同时间对动物的组织病理和大体病理学观察中，均未检测到异常的病理学改变，仅在注射局部有一定程度的炎细胞聚集和轻度组织损伤。（表5及附图10）
表5 mRNA局部免疫后不同时间点不同组织病理学检测
注：“—”表示未检测到组织病理学改变；“++”表示检测到淋巴细胞浸润；“+++”表示检测到淋巴细胞浸润及组织轻度损伤。
上述工作表明，本发明所设计构建的ADT脂质颗粒递送***在具有自主配方的基础上，实现了有效递送疫苗mRNA分子的功能，其仍然具有相应的安全特性。可用于进一步的mRNA疫苗，尤其是SARS-CoV-2 mRNA疫苗的应用研究。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，由两种阳离子脂质分子、一种中性磷脂分子和一种PEG化脂质分子组成；
所述的两种阳离子脂质分子分别为（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐；
所述的中性磷脂分子为1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱；所述的PEG化脂质分子为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺；
其中，（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）与(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐的摩尔比为48-58：12-20。
2.如权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺，四者的摩尔比为48-58：12-20：23-28：1.8-2.5。
3.如权利要求2所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺，四者的摩尔比为54.7：16.5：26.7：2.1。
4.如权利要求1-3任一项所述的脂质纳米颗粒作为载体在制备生物活性物质递送***中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，所述的生物活性物质递送***为mRNA疫苗。
6.如权利要求4所述的应用，所述的生物活性物质递送***为类病毒结构的mRNA疫苗。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述疫苗为用于预防病毒感染的疫苗。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病毒为SARS-CoV-2。
9.一种基因递送***，其特征在于，包含如权利要求1-3任一项所述的脂质纳米颗粒载体和基因物质。
10.一种以脂质纳米颗粒为载体的mRNA递送***的制备工艺，其特征在于，所述脂质纳米颗粒包括（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐两种阳离子脂质分子，其制备方法包括以下步骤：
S1.将（（4-羟基丁基）氮杂二烷基）双（己烷-6,1-二基）双（2-己基癸酸酯）、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺溶于无水乙醇，充分溶解，得到有机相；用NaAc 10mM、海藻糖为0.0001%的缓冲液稀释mRNA得到水相；
S2.将步骤S1有机相与水相经微流控制备得到mRNA-ADT，以含有NaAc 10mM、海藻糖为0.0001%的缓冲液做15-20倍稀释，经100 Kda超滤离心管超滤浓缩后得到负载有mRNA的ADT脂质颗粒的悬液，该悬液中脂质颗粒与mRNA中的氮磷摩尔比为4-6:1。
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Citations (3)
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| CN113402404A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-09-17 | 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 | 脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂 |
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