CN104017073A - 一种胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胶原蛋白的制备方法，具有如下步骤：①取动物尾，并对动物尾进行灭菌处理，手术剥离筋腱，并收集筋腱；②使用含尿素溶液筋腱浸没，在溶液中将筋腱破碎，将已破碎的尾腱尿素混合液在2-25℃提取；③将混合溶液进行过滤处理，去除未溶解的杂质后获得粗提液，对粗提液进行凝胶分离；④将粗提液进行去除盐和去杂质处理后得到精制液；⑤取精制液用冻干机冻干，即可得到医用级胶原蛋白。本发明可以大大节省提取和纯化的时间，并且收率可以达到90%以上，大大提高了提取和纯化的效率，同时，利用本发明所提供的方法所生产的胶原蛋白产品杂质少，纯度高，避免了提取过程所引起的降解，保证了产品胶原蛋白的完整性和生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白纯化技术领域，尤其是一种胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是世界上应用最为广泛的生物材料，目前国际年产量在2万吨左右。在医学领域，胶原蛋白作为高生物相容性、高生物活性材料被广泛应用于创伤控制和转化医学。2011年，国际著名的商务测评机构Frost&Sullivan的市场调研数据也表明，胶原蛋白已经成为最有市场竞争力的生物医学材料，用于再生医学，并将进一步发展，成为器官替代医学两大材料之一，其技术就绪水平——Technology readiness level(TRL)评分为8(最高9)。美国医药食品管理局(FDA)预测，到2015年胶原蛋白将占有超过20％的生物医学材料市场，年销售额超过200亿美元。
胶原蛋白是哺乳动物中含量十分丰富的蛋白，也是非常重要的一种蛋白质。胶原蛋白的类型、质量以及分布的改变直接影响动物体正常的机能，如导致透明软骨的退行性关节炎、血管基质的动脉粥状硬化、血管和肾胶原性基底膜的糖尿病、伤口愈合中异常的瘫痕形成、角膜和晶状体异常、***遗传性疾病等。且研究显示胶原蛋白具有非常重要的生物学性能：
(1)胶原的止血功能。天然的胶原聚集体本身就是很好的止血剂，它通过两方面发挥作用：促进血小板凝聚和血浆结块。胶原与血小板之间的作用机理还未完全清楚，但是有关其相互作用的许多现象已经得到证实。胶原使血小板凝聚的能力似乎来源于游离氨基，尤其是赖氨酸侧链氨基。封闭胶原羧基，不会造成凝血能力的明显下降，不过却削弱了胶原促使血浆结块的作用。所以，胶原的天然结构尤其是足够发达的四级结构，是胶原具有凝聚能力的基础。胶原的止血作用使其可以用作凝血材料，物理形态可以是粉状、片状、海绵状等。
(2)低免疫原性。可溶性胶原的免疫原性很低，不溶性胶原的免疫原性更低。胶原蛋白虽是大分子物质，但其结构重复性大，与其它具有免疫原的蛋白质相比，胶原的免疫原性非常低，人们甚至一度认为胶原不具有抗原性。最近的研究表明，胶原有3种类型的抗原因子：第1类是由胶原肽链非螺旋的端肽引起的；第2类是由胶原三股螺旋的构象引起的；第3类是由a链螺旋区的氨基酸顺序引起的。第2类抗原因子仅存在于天然胶原分子中，第3类只出现在变性胶原中，而第1类抗原因子在天然和变性胶原蛋白中均存在。
(3)生物相容性。胶原蛋白作为细胞生长的依附和支架物，能诱导上皮细胞等增殖、分化和移行。胶原分子特有的三股螺旋结构及其交联形成的纤维或网络构成细胞重要组成成分，故胶原材料无论是在被吸收前作为形成新组织的骨架，还是被吸收同化进入宿主，成为宿主组织的一部分，都与细胞周围的基质有着良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生理功能整体一部分。
胶原蛋白的这些生物学性能使得其在医学、食品、同用化学品、生物医用材料等领域中占据十分重要的地位，被认为是值得永远研究且具有多用途的生物高分子材料。
在胶原蛋白的市场应用方面，国际知名医疗器械企业都在进行胶原蛋白医学应用的研发，包括创伤包扎材料、特殊疮口控制霜剂、胶原蛋白泡沫及海绵等。以胶原蛋白产品为基质材料，加入细胞乃至干细胞技术，开发新的细胞活性的器官移植及器官修复产品成为行业的新的技术趋势。
近年来，国际大型企业(如法国罗赛洛(RUSSELOT)集团)开始着手开发合成胶原蛋白及其类似物的研发，但受合成技术限制，水平较低，产量有限，价格昂贵(目前市面合成高纯度胶原蛋白的售价高达3000美元/毫克)，仅能用于科研应用。
一直以来，胶原蛋白主要从动物的组织器官提取，如猪牛的皮、骨骼和筋腱等。胶原蛋白提取方法有传统酸解法，中性盐萃取法和酶法。所有方法都先将鼠尾清洗后置入萃取溶液进行溶解。离心后，粗提液可以作为产品储存也可以进一步加工处理进行精提。中性盐萃取法有着显著的技术劣势，主要是产率低下不足5％，而且杂质蛋白含量高，基本被淘汰了。
目前，中国国内最常见的胶原蛋白提取工艺仍然基于传统的酸解法，而且主要原料是牛筋腱(蹄筋)和鼠尾筋腱。由于技术局限，酸解法提取产率只能从鼠尾筋腱湿重计算，产率不超过60％。为了提高萃取率，很多情况下，还要用胰蛋白酶对筋腱进行预处理。虽然，动物筋腱超过90％的组分为胶原蛋白，但是其从动物体的剥离过程人力消耗大，且不易处理干净，造成产品最后染杂，特别是动物血液和肌肉组织的污染很难去除。另外，很多动物组织的蛋白酶仍然存在，在酸解过程中，会和酸同时起作用于胶原蛋白，造成胶原蛋白的不规则水解，大大降低了流程的可控性与可重复性，直接影响到胶原蛋白的质量，特别是其特殊的生物学功能性。因此，需要一种简单可行的方法来提取高纯度的胶原蛋白。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中胶原蛋白的提取率低，品质不好及制备时间过长等技术问题，提供一种胶原蛋白的制备方法，该方法制备时间短，提取率高、得到的胶原蛋白品质好。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种胶原蛋白的制备方法，具有如下步骤：
①动物尾腱的准备
取动物尾，并对动物尾进行灭菌处理后，手术剥离筋腱，并收集筋腱；
②胶原蛋白的提取
使用含尿素溶液将步骤①中得到的筋腱浸没，在溶液中将筋腱破碎，将已破碎的尾腱尿素混合液在2-25℃℃混匀10-30h；
③胶原蛋白的纯化
将步骤②得到的混合溶液进行过滤处理，去除未溶解的杂质后获得粗提液，对粗提液进行凝胶分离，根据紫外吸收选取合适体积段的溶液进行收集；
④精制
将步骤③收集的粗提液进行去除盐和去杂质处理后得到精制液，精制液中含盐量低于0.1％；
⑤冻干
取步骤④得到的精制液用冻干机冻干，即可得到医用级胶原蛋白。
进一步的，步骤①中的灭菌方法为采用70％酒精擦拭若干遍。
进一步的，步骤①中手术剥离筋腱的方法为：将灭菌后的动物尾放入磷酸盐缓冲液中保存，在磷酸盐缓冲液中用手术刀去除外表皮，然后将动物尾中白色筋腱剥离抽出，避免带出骨渣和碎肉，将动物尾腱放入磷酸盐缓冲液中清洗若干遍直至滤液无血迹为止，用漏斗过滤，收集筋腱。
进一步的，步骤②中将动物尾腱与含尿素溶液进行混合时可以采用摇床进行混匀，摇床转速50-320rpm；也可以采用磁力搅拌器混匀，磁力搅拌器的转速100-1200rpm。
进一步的，所述的含尿素溶液中含1-10mol/L的尿素和0-1mol/L的无机盐。
进一步的，步骤③中所述的过滤处理为：取步骤②得到的混合溶液上层清液过0.22-10μm醋酸纤维膜，获得粗提液，然后使用蛋白质纯化***或蠕动泵对粗提液进行凝胶分离，根据滤液紫外吸收选取UV280>0.01部分体积段的溶液进行收集，分离体积：有效柱容积为1:10-1:100。作为优选，分离体积：有效柱容积为1:50。
第一种实施例，步骤④中所述的精制方法为：采用透析法，透析袋材质为醋酸纤维，孔径为10K道尔顿，经过若干次透析脱盐，含盐量低于0.1％后，即得到精制的胶原蛋白溶液。
第二种实施例，步骤④中所述的精制方法为：采用超滤法，滤膜采用管式抗污染膜，孔径为10K道尔顿，经过5-20倍连续洗滤，获得高纯度溶液，含盐量低于0.1％后，即得到精制的胶原蛋白溶液。
具体的，步骤⑤中冻干时采用的冻干容器为离心管或者表面皿。
作为优选，步骤⑤中冻干的时间为48-72小时。冻干时间一般根据制取的量决定，量大则冻干时间延长，量小则冻干时间缩短。
采用了上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：
(1)制备时间短：本法采用尿素法提取只需要1天时间，后面采用超滤技术可以将纯化时间缩短到几小时。而传统的酸解法和酶解法提取纯化时间需要3天，甚至一周以上。
(2)收率高：一般中性盐提取法收率不到5％，酸提法或者酶解提取法收率可以达到60％左右，本方法按尾腱干重计算，收率可以达到90％以上。
(3)品质好：酸提或者酶解提取法在提取过程中必然会使胶原蛋白的降解和变性，导致胶原蛋白失去其天然结构和活性。而本法避免了提取过程的降解，保证了胶原蛋白的完整性和生物活性。
(4)处理过程简单：采用溶剂尿素溶液具有很高的杀菌性能，并能进行病毒灭活，显著降低了细菌基数，减少了内毒素含量。
(5)应用广泛：本发明涉及的胶原蛋白适用于生物医学研究，也适合做医疗器械产品，特别适合制备细胞支架材料，还可以应用于体细胞的三维培养；也可以作为细胞贴壁培养的培养基。
附图说明
图1为本发明胶原蛋白的聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)分析图；最左面为marker，中间不同条带为不同滤出液的图谱。
图2为本发明胶原蛋白的Wester-Blot分析图谱。C：阳性对照，采用高纯度胶原蛋白作为对照；水：目标胶原蛋白的水溶液；胶：其他胶原蛋白；
根据sds-page分析和Wester-Blot，产品符合胶原蛋白的特征，且具有非常高的纯度，无杂质蛋白条带。
具体实施方式
实施例1
本发明的一种胶原蛋白的制备方法，具有如下步骤：
①动物尾腱的准备
取动物尾，可取大鼠尾、小鼠尾或者袋鼠尾，并对动物尾采用消毒酒精擦拭若干遍进行灭菌处理，将灭菌后的动物尾放入磷酸盐缓冲液(PBS)中保存，在磷酸盐缓冲液中用手术刀去除外表皮，然后将动物尾中白色筋腱剥离抽出，避免带出骨渣和碎肉，将动物尾腱放入磷酸盐缓冲液中清洗若干遍直至滤液无血迹为止，用漏斗过滤，收集筋腱；
②胶原蛋白的提取
使用适量含尿素溶液将步骤①中得到的筋腱浸没，在溶液中将筋腱破碎，将已破碎的尾腱尿素混合液在2-25℃混合均匀，一般需要10-30小时，将动物尾腱与含尿素溶液进行混合时可以采用摇床进行混匀，摇床转速50-320rpm；也可以采用磁力搅拌器混匀，磁力搅拌器的转速100-1200rpm；
③胶原蛋白的纯化
将步骤②得到的混合溶液进行过滤处理，取步骤②得到的混合溶液上层清液过0.22-10μm醋酸纤维膜，获得粗提液，然后使用蛋白质纯化***(AKTA)或蠕动泵对粗提液进行凝胶分离，根据滤液紫外吸收选取UV280>0.01部分体积段的溶液进行收集，分离体积：有效柱容积为1:10-1:100。作为优选，分离体积：有效柱容积为1:50；
使用缓冲液为2M尿素的盐溶液，流速为0.5-1mL/min，有效柱容积为50ml，经过100ml缓冲液之后，上样1ml经过过滤的粗提液，收集UV280>0.01部分体积段的溶液。然后用50ml缓冲液洗脱，继续上样。
④精制
将步骤③收集的粗提液进行去除盐和去杂质处理后得到精制液，采用透析法，透析袋材质为醋酸纤维，孔径为10K道尔顿，经过若干次透析脱盐，含盐量低于0.1％后，即得到精制的胶原蛋白溶液；
⑤冻干
取步骤④得到的精制液放入离心管或者表面皿等容器，用冻干机冻干48-72小时，即可得到医用级胶原蛋白。
作为溶解筋腱的关键溶液，所述的含尿素溶液中含2mol/L的尿素和0.5mol/L的无机盐。
实施例2
实施例2用于说明本发明所提供的胶原蛋白的制备方法。
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤②中所使用的含尿素溶液中尿素的浓度为5mol/L，氯化钠的浓度为0.1mol/L，获得胶原蛋白产品2。
实施例3
实施例3用于说明本发明所提供的胶原蛋白的制备方法。
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤②所使用的含尿素溶液中尿素的浓度为1mol/L，氯化钠的浓度为0.5mol/L，获得胶原蛋白产品3。
实施例4
实施例4用于说明本发明所提供的胶原蛋白的制备方法。
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤②所使用的含尿素溶液中尿素的浓度为8mol/L，获得胶原蛋白产品4。
实施例5
实施例5用于说明本发明所提供的胶原蛋白的制备方法。
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤②所使用的含尿素溶液中尿素的浓度为10mol/L，获得胶原蛋白产品5。
实施例6
实施例6用于说明本发明所提供的胶原蛋白的制备方法。
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤②中溶解的温度条件为4℃，溶解时间为48h，获得胶原蛋白产品6。
实施例7
实施例7用于说明本发明所提供的胶原蛋白的制备方法。
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤中③过滤是采用100层无菌纱布过滤混合液获得粗滤液，获得胶原蛋白产品7。
实施例8
实施例8用于说明本发明所提供的胶原蛋白的制备方法。
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤④的精制采用采用超滤法，滤膜采用管式抗污染膜，孔径为10K道尔顿，经过5-20倍连续洗滤，获得高纯度溶液，含盐量低于0.1％后，即得到精制的胶原蛋白溶液，获得胶原蛋白产品8。
对比例1
采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，所使用的尿素溶液的浓度为0.5mol/L，获得胶原蛋白产品9。
检测实施例1-8和对比例1制得的胶原蛋白产品1-9的产品收率和胶原蛋白纯度，结果列于表1。
表1胶原蛋白的收率和纯度比较
| 胶原蛋白产品 | 收率(重量％) | 纯度(重量％) |
| 1 | 80 | 95 |
| 2 | 85 | 95 |
| 3 | 90 | 95 |
| 4 | 92 | 95 |
| 5 | 93 | 95 |
| 6 | 90 | 95 |
| 7 | 85 | 95 |
| 8 | 80 | 97 |
| 9 | 50 | 90 |
将测试例1-8的结果与测试例9的结果进行对比可以看出，采用本发明所提供的方法所生产的胶原蛋白的产品的收率在80％以上，产品的纯度在95％以上。
将本发明的到的胶原蛋白与其他方法得到的胶原蛋白的性能进行比较，见表。
表2胶原蛋白的性能比较
| 指标 | 酸提法 | 酶提法 | 本法 |
| 提取率 | 60％ | 75％ | 90％ |
| 纯度(Sds-page法) | 90％ | 90％ | 95％ |
| 三维结构完整性 | 不完整 | 不完整 | 完整结构 |
| 内毒素 | <0.5EU/mg | <0.5EU/mg | <0.05EU/mg |
| 制备时间 | 7-10天 | 5-7天 | 2-3天 |
从以上实施例和测试例可以看出，按照本发明所提供的方法生产胶原蛋白产品可以大大节省操作的步骤和时间，产品的收率和纯度高，并且具有优良的生物学活性。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种胶原蛋白的制备方法，其特征是具有如下步骤：
①动物尾腱的准备
取动物尾，并对动物尾进行灭菌处理后，手术剥离筋腱，并收集筋腱；
②胶原蛋白的提取
使用含尿素溶液将步骤①中得到的筋腱浸没，在溶液中将筋腱破碎，将已破碎的尾腱尿素混合液在2-25℃提取；
③胶原蛋白的纯化
将步骤②得到的混合溶液进行过滤处理，去除未溶解的杂质后获得粗提液，对粗提液进行凝胶分离，根据紫外吸收选取合适体积段的溶液进行收集；
④精制
将步骤③收集的粗提液进行去除盐和去杂质处理后得到精制液，精制液中含盐量低于0.1%；
⑤冻干
取步骤④得到的精制液用冻干机冻干，得到医用级胶原蛋白。
2.如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：步骤①中的灭菌方法为采用70%酒精擦拭。
3.如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：步骤①中手术剥离筋腱的方法为：将灭菌后的动物尾放入磷酸盐缓冲液中保存，在磷酸盐缓冲液中用手术刀去除外表皮，然后将动物尾中白色筋腱剥离抽出，避免带出骨渣和碎肉，将动物尾腱放入磷酸盐缓冲液中清洗直至滤液无血迹为止，用漏斗过滤，收集筋腱。
4.如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：步骤②中将动物尾腱与含尿素溶液进行混合时可以采用摇床进行混匀，摇床转速50-320rpm；或者采用磁力搅拌器混匀，磁力搅拌器的转速100-1200rpm。
5.如权利要求1或4所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：所述的含尿素溶液中含1-10mol/L的尿素和0-1mol/L的无机盐。
6.如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：步骤③中所述的过滤处理为：取步骤②得到的混合溶液的上层清液过0.22-10μm醋酸纤维膜，获得粗提液，然后使用蛋白质纯化***或蠕动泵对粗提液进行凝胶分离，根据滤液紫外吸收选取UV280>0.01部分体积段的溶液进行收集，分离体积：有效柱容积为1:10-1:100。
7.如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：步骤④中所述的精制方法为：采用透析法，透析袋材质为醋酸纤维，孔径为10K道尔顿，经过若干次透析脱盐至含盐量低于0.1%后，即得到精制的胶原蛋白溶液。
8.如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：步骤④中所述的精制方法为：采用超滤法，滤膜采用管式抗污染膜，孔径为10K道尔顿，经过5-20倍连续洗滤，获得高纯度溶液至含盐量低于0.1%后，即得到精制的胶原蛋白溶液。
9.如权利要求1所述的胶原蛋白的制备方法，其特征是：步骤⑤中冻干的时间为48-72h。
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