JP7280577B2 - 蛍光バイオイメージング方法 - Google Patents
蛍光バイオイメージング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7280577B2 JP7280577B2 JP2019080935A JP2019080935A JP7280577B2 JP 7280577 B2 JP7280577 B2 JP 7280577B2 JP 2019080935 A JP2019080935 A JP 2019080935A JP 2019080935 A JP2019080935 A JP 2019080935A JP 7280577 B2 JP7280577 B2 JP 7280577B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fluorescence
- group
- wavelength
- fluorescent labeling
- labeling agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
[1]
組織、器官、または生体の内部にある蛍光標識剤から発せられる蛍光を蛍光検出器によって検出することを含む蛍光バイオイメージング方法であって、
前記蛍光の検出は、第1の波長領域において行われ、
前記第1の波長領域は、前記蛍光標識剤の蛍光の強度が、前記蛍光標識剤の最大蛍光波長における蛍光強度の1%以上50%以下の範囲内となる蛍光波長領域である、
蛍光バイオイメージング方法。
[2]
前記第1の波長領域は、前記最大蛍光波長より長波長側にあり、前記第1の波長領域の最短波長と前記最大蛍光波長との差が30nm以上である、[1]に記載の蛍光バイオイメージング方法。
[3]
前記第1の波長領域は、前記最大蛍光波長より長波長側にあり、前記蛍光標識剤の最大蛍光波長が710nm以上である、[1]または[2]に記載の蛍光バイオイメージング方法。
[4]
前記蛍光標識剤がフタロシアニン系化合物の蛍光色素を含む、[1]~[3]いずれか一項に記載の蛍光バイオイメージング方法。
[5]
前記フタロシアニン系化合物が、フタロシアニン基本骨格の6員環上の少なくとも1箇所に原子数3以上の置換基を有し、かつ、2価~4価の中心金属を有する、[4]に記載の蛍光バイオイメージング方法。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、Tween(登録商標)20、Tween(登録商標)40、Tween(登録商標)60、およびTween(登録商標)80等のポリオキシエチレンソルビタン系脂肪酸エステル、Cremophor(登録商標)ELおよびCremophor(登録商標)RH60等のポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、Solutol(登録商標)HS15等の12-ヒドロキシステアリン酸-ポリエチレングリコールコポリマー、ならびにTriton(登録商標)X-100およびTriton(登録商標)X-114等のオクチルフェノールエトキシレート等を挙げることができる。
R1~R16は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、-COOM1、-SO3M1、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよい複素環基、置換基を有してもよいアルコキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、置換基を有してもよいアルキルチオ基、または置換基を有してもよいアリールチオ基である。M1は、水素原子、またはアルカリ金属を表す。R1~R16は、隣接する基同士が互いに連結して追加的な環を形成してもよい。追加的な環は4~7員であることが好ましく、6員環または5員環が特に好ましい。追加的な環の具体例としてはベンゼン環およびイミダゾール環が挙げられるがこれらに限定されない。追加的な環は、R2とR3、R6とR7、R10とR11、および/またはR14とR15が互いに連結して形成するものが特に好ましい。追加的な環がさらにR1~R16と同様に定義される置換基を有してもよい。
3-ニトロフタロニトリル10部および2,4-ジメチル-3-ペンタノール7.4部をN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)70部に溶解し、この溶液に、別途調製したt-ブトキシナトリウム6.1部およびDMF40部を含む溶液を、0℃以下の温度で滴下し、室温(25℃)で2時間反応させた。その後、80%酢酸4.8部および塩酸17.5部を加え、更に、水70部を滴下して生じた結晶を濾別し、得られた結晶を水で洗浄した後に乾燥して、3-(2’,4’-ジメチル-3’-ペントキシ)フタロニトリル11.9部を得た。次に、キノリン68部および無水塩化アルミニウム2.2部の溶液にアンモニアガスを導入し、上記で得られた3-(2’,4’-ジメチル-3’-ペントキシ)フタロニトリル11.9部を加えた。180℃に加熱して2時間反応させた。これを室温(25℃)まで冷却し結晶を析出させた。生じた結晶を濾別し、結晶を47%メタノール水溶液で洗浄した後に乾燥して、アルミニウムフタロシアニン中間体10.3部を得た。このアルミニウムフタロシアン中間体1部を、2-ブタノン10部中で、トリフェニルシラノール0.25部およびトリエチルアミン0.14部と45℃で2時間反応させた。生じた析出物を濾別し、得られた濾液にアセトンを20部加え、さらにイオン交換水15部を滴下することにより、結晶を析出させた。析出した結晶を濾別し、66%アセトン水溶液15部で洗浄した後に乾燥して、0.7部のフタロシアニン系化合物PC1を得た。化合物PC1の構造は上記に示した通りである。
スルホラン120部、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン(DBU)14部に4-(2,2-ビス(トリフルオロメチル)プロピル)オキシ-1,3-ジイミノイソインドリン10部および四塩化珪素5部を加え、160~170℃で8時間加熱撹拌後、冷却し、35%塩酸80部と水1500部の混合溶液に注入撹拌し、80℃で2時間加熱撹拌した。その後、析出した沈澱を濾別して、メタノール:水(質量比4:1)混合溶液で洗浄後、乾燥して、粗製シリコンフタロシアニン中間体10部を得た。この粗製シリコンフタロシアニン中間体を濃硫酸250部に溶解した後、氷水2000部に注入し、析出した沈澱を濾別して、水洗後、乾燥して、シリコンフタロシアニン中間体9部を得た。この中間体5部をピリジン100部、トリ-n-ブチルアミン25部に撹拌溶解した後、冷却しながらクロロジフェニルホスフィン10部を加え、110℃で2時間加熱撹拌した後、冷却し、氷水1000部中に注入した。析出した沈澱を濾別し、水洗後、乾燥して、4部のフタロシアニン系化合物PC2を得た。化合物PC2の構造は上記に示した通りである。
濃硫酸9.2部、25%発煙硫酸5.5部の混合溶液に化合物PC1を1部加え、50℃で2時間加熱撹拌した。反応液を冷却後、80部の氷に反応液を添加し、析出した沈澱を濾別した。さらに、テトラヒドロフラン50部に濾別した固体を懸濁させ、再度沈澱を濾別して、テトラヒドロフラン50部で洗浄後、乾燥して、0.5部の粗製物を得た。粗製物をシリカゲルクロマトグラフィー(アセトニトリル/水=4/1)で精製した。0.4部の化合物PC3を得た。化合物PC3の構造は上記に示した通りである。
3-ニトロフタロニトリル10部およびペンタエチレングリコールモノメチルエーテル7.4部をテトラヒドロフラン100部に溶解し、この溶液に、別途調製したt-ブトキシナトリウム6.1部およびテトラヒドロフラン40部を含む溶液を、0℃以下の温度で滴下し、25℃で3時間撹拌した。その後、エバポレーターでテトラヒドロフランを留去し、得られた粗製物をシリカゲルクロマトグラフィー(メタノール)で精製した。3-(2’,5’,8’,11’,14’,17’,20’ヘプタオキサエイコサン)フタロニトリル8.5部を得た。次に、1-ペンタノール16部、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]-7-ウンデセン(DBU)0.8部に3-(2’,5’,8’,11’,14’,17’,20’ヘプタオキサエイコサン)フタロニトリル2.2部および塩化マグネシウム0.12部を加え、120~130℃で5時間加熱撹拌後、反応液を直接シリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル、メタノール)で精製した。0.8部の化合物PC4を得た。化合物PC4の構造は上記に示した通りである。
比較対照として、市販のインドシアニングリーンを使用した。インドシアニングリーン(ICG)の構造を下記に示す。
フタロシアニン系化合物PC1を2.5部、両親媒性物質である非イオン性界面活性剤Tween80を5000部、アセトン5000部を混合し、室温(25℃)で1時間撹拌した。その後、エバポレーターでアセトンを留去し、PBSを5000部添加して室温(25℃)で1時間撹拌した。この溶液を0.45μmナイロン製メンブレンフィルターで濾過し、さらにこの溶液をPBSで10倍に希釈して色素濃度4μM、両親媒性物質濃度が1重量%である、蛍光標識剤(1)を得た。この例における両親媒性物質の重量は蛍光色素の約2000倍である。
上記2.5部のフタロシアニン系化合物PC1を、3.5部の化合物PC2に変更した以外は、蛍光標識剤(1)と同様に調製し、蛍光標識剤(2)を得た。
上記2.5部のフタロシアニン系化合物PC1を、1.6部のICGに変更した以外は、蛍光標識剤(1)と同様に調製し、蛍光標識剤(3)を得た。
ガス導入管、温度計、コンデンサー、攪拌機を備えた反応容器に、トリエチレングリコールモノメチルエーテル93.4部を仕込み、窒素ガスで置換した。反応容器内を110℃に加熱して、ラウリルメタクリレート35.0部、スチレン35.0部、アクリル酸30.0部、および重合開始剤V-601(和光純薬製;ジメチル2,2’-アゾビス (2-メチルプロピオネート)6.0部の混合物を2時間かけて滴下し、重合反応を行った。滴下終了後、さらに110℃で3時間反応させた後、V-601(和光純薬製)0.6部を添加し、さらに110℃で1時間反応を続けて、アクリル樹脂POLY-1の溶液を得た。POLY-1の重量平均分子量は約16000であった。
フタロシアニン系化合物PC1を2.5部、アクリル樹脂POLY-1のPBS溶液(不揮発分50%)10000部、メタノール5000部を混合し、室温(25℃)で1時間撹拌した。その後、エバポレーターでメタノールを留去し、全体の重量が10000部になるようにPBSを添加して、室温(25℃)で1時間撹拌した。この溶液を0.45μmナイロン製メンブレンフィルターで濾過し、さらにこの溶液をPBSで10倍に希釈して、色素濃度が4μMであり両親媒性物質濃度が1重量%である蛍光標識剤(4)を得た。
3.76部のフタロシアニン系化合物PC3を10000部のPBSに溶解させ、さらにこの溶液の一部を100倍希釈し、0.45μmナイロン製メンブレンフィルターで濾過し、色素濃度4μMである蛍光標識剤(5)を得た。
6.86部のフタロシアニン系化合物PC4を10000部のPBSに溶解させ、さらにこの溶液の一部を100倍希釈し、0.45μmナイロン製メンブレンフィルターで濾過し、色素濃度4μMである蛍光標識剤(6)を得た。
3.10部のICGを10000部のPBSに溶解させ、さらにこの溶液の一部を100倍希釈し、0.45μmナイロン製メンブレンフィルターで濾過し、色素濃度4μMである蛍光標識剤(7)を得た。
分光光度計(株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、U-4100)と蛍光光度計(日本分光株式会社製、FP-6500)を用いて、上記蛍光標識剤の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを取得した(図1)。高い生体透過性が得られる近赤外領域の780~850nm付近に着目すると、フタロシアニン系化合物の最大蛍光波長から大きく長波長側に離れ、最大蛍光波長における蛍光強度の6パーセント程度になっている波長領域(第1の波長領域)において、ICGの最大蛍光波長における蛍光と同様あるいはそれよりも著しく強い蛍光を検出できていることが、図1の結果に示された。すなわち、これらフタロシアニン系色素のこの波長領域を使用することにより、著しく感度の高い蛍光バイオイメージングを行うことができる。なお、図示されているICGの蛍光スペクトルの左端の肩は、励起光の漏れ込みが検出されたものである。
上記で調製された分散系(両親媒性物質を含む)および溶解系(両親媒性物質を含まない)の蛍光標識剤を、それぞれ50μL、マウスの背中の異なる位置に皮下注射し、株式会社パーキンエルマー社製IVIS Lumina K Series 3を用いて蛍光バイオイメージングを行った。異なる蛍光標識剤の分布が入り混じらないように、注射位置は互いに十分離し、注射から短時間後にイメージングを行った。注射された蛍光標識剤の種類を下記表に要約する。蛍光バイオイメージングの結果を図4に示す。
Claims (5)
- 組織、器官、または生体の内部にある蛍光標識剤から発せられる蛍光を蛍光検出器によって検出することを含む蛍光バイオイメージング方法であって、
前記蛍光の検出は、第1の波長領域において行われ、
前記第1の波長領域は、845nm以下であって、前記蛍光標識剤の蛍光の強度が、前記蛍光標識剤の最大蛍光波長における蛍光強度の1%以上20%以下の範囲内となる蛍光波長領域である、
蛍光バイオイメージング方法。 - 前記第1の波長領域は、前記最大蛍光波長より長波長側にあり、前記第1の波長領域の最短波長と前記最大蛍光波長との差が30nm以上である、請求項1に記載の蛍光バイオイメージング方法。
- 前記第1の波長領域は、前記最大蛍光波長より長波長側にあり、前記蛍光標識剤の最大蛍光波長が710nm以上である、請求項1または2に記載の蛍光バイオイメージング方法。
- 前記蛍光標識剤がフタロシアニン系化合物の蛍光色素を含む、請求項1~3いずれか一項に記載の蛍光バイオイメージング方法。
- 前記フタロシアニン系化合物が、フタロシアニン基本骨格の6員環上の少なくとも1箇所に原子数3以上の置換基を有し、かつ、2価~4価の中心金属を有する、請求項4に記載の蛍光バイオイメージング方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019080935A JP7280577B2 (ja) | 2019-04-22 | 2019-04-22 | 蛍光バイオイメージング方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019080935A JP7280577B2 (ja) | 2019-04-22 | 2019-04-22 | 蛍光バイオイメージング方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020176971A JP2020176971A (ja) | 2020-10-29 |
JP7280577B2 true JP7280577B2 (ja) | 2023-05-24 |
Family
ID=72935579
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019080935A Active JP7280577B2 (ja) | 2019-04-22 | 2019-04-22 | 蛍光バイオイメージング方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7280577B2 (ja) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040152987A1 (en) | 2002-11-11 | 2004-08-05 | Carl-Zeiss-Stiftung Trading As Carl Zeiss | Inspection system and inspection method |
JP2008502681A (ja) | 2004-06-14 | 2008-01-31 | ヘレート ハンイェルグ | 蛍光標識としての置換アザポルフィン |
JP2013029800A (ja) | 2011-06-20 | 2013-02-07 | Olympus Corp | 顕微鏡システム |
JP2018169272A (ja) | 2017-03-29 | 2018-11-01 | 東ソー株式会社 | 複数の蛍光物質を用いた標識方法 |
JP2019510220A (ja) | 2016-03-14 | 2019-04-11 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 短波赤外線蛍光を撮像するためのデバイスおよび方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE206124T1 (de) * | 1990-05-15 | 2001-10-15 | Diatron Corp | Nachweisbar markierte markerverbindung mit einem fluorophor-rest , eine fluorescenz-probe mit der markerverbindung und verwendungen derselben. |
-
2019
- 2019-04-22 JP JP2019080935A patent/JP7280577B2/ja active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040152987A1 (en) | 2002-11-11 | 2004-08-05 | Carl-Zeiss-Stiftung Trading As Carl Zeiss | Inspection system and inspection method |
JP2008502681A (ja) | 2004-06-14 | 2008-01-31 | ヘレート ハンイェルグ | 蛍光標識としての置換アザポルフィン |
JP2013029800A (ja) | 2011-06-20 | 2013-02-07 | Olympus Corp | 顕微鏡システム |
JP2019510220A (ja) | 2016-03-14 | 2019-04-11 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 短波赤外線蛍光を撮像するためのデバイスおよび方法 |
JP2018169272A (ja) | 2017-03-29 | 2018-11-01 | 東ソー株式会社 | 複数の蛍光物質を用いた標識方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2020176971A (ja) | 2020-10-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6240285B2 (ja) | リンパ節イメージング用蛍光プローブ | |
Butte et al. | Near-infrared imaging of brain tumors using the Tumor Paint BLZ-100 to achieve near-complete resection of brain tumors | |
ES2198446T3 (es) | Procedimiento para el diagnostico in vivo mediante radiacion de nir utilizando colorantes de cianina. | |
Toyota et al. | Near-infrared-fluorescence imaging of lymph nodes by using liposomally formulated indocyanine green derivatives | |
EP2393420B1 (en) | Charge-balanced imaging agents | |
JP5313249B2 (ja) | ナノ粒子を用いた蛍光共鳴エネルギ移動検出 | |
CN111362971B (zh) | 靶向psma的双苯并噻二唑类化合物及其制备方法与应用 | |
Chelushkin et al. | Phosphorescent NIR emitters for biomedicine: Applications, advances and challenges | |
EA005070B1 (ru) | Флуоресцентный контрастный агент для ближней инфракрасной области спектра | |
JP2010518152A (ja) | 光学イメージングのための蛍光エマルジョン | |
KR20020082207A (ko) | 근적외선 형광 조영제 및 형광 조영법 | |
JP7280577B2 (ja) | 蛍光バイオイメージング方法 | |
JP2020105170A (ja) | 蛍光標識剤、光線力学治療剤およびフタロシアニン | |
JP2020105506A (ja) | 蛍光標識剤およびリンフタロシアニン | |
JP7384195B2 (ja) | 蛍光標識用色素および蛍光標識剤 | |
EP3797293A1 (en) | Endogenous labelling of extracellular vesicles | |
WO2023074778A1 (ja) | 細胞および組織内脂質滴の蛍光イメージング試薬 | |
JP7422301B2 (ja) | 蛍光標識剤、光線力学治療剤およびフタロシアニン | |
JP2021059527A (ja) | 蛍光標識剤およびフタロシアニン | |
JP2005120026A (ja) | 近赤外蛍光造影剤 | |
JP2005145819A (ja) | 蛍光造影剤および体外蛍光造影方法 | |
JP2005170812A (ja) | 蛍光造影剤及び蛍光造影方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220318 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20220318 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220322 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230131 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230405 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230420 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230428 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7280577 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |