JP2021059527A

JP2021059527A - 蛍光標識剤およびフタロシアニン

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Publication number: JP2021059527A
Application number: JP2020152478A
Authority: JP
Inventors: 英範皆嶋; Hidenori Minashima; 梨乃横倉; Rino Yokokura; 純平早川; Junpei Hayakawa
Original assignee: Toyo Ink SC Holdings Co Ltd
Current assignee: Artience Co Ltd
Priority date: 2019-10-03
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2021-04-15

Abstract

【課題】蛍光強度、耐光性に優れた蛍光標識剤、およびそれに用いるフタロシアニン系化合物の提供。【解決手段】例えば下記化合物を含む蛍光標識剤。【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光標識剤およびそれに用いられるフタロシアニンに関する。

バイオイメージングは、タンパク質、細胞、組織等を可視化する技術であり、生体内分子・細胞機能の解明や創薬の研究等、生物学、医学の研究領域で幅広く活用されている。中でも蛍光バイオイメージング法は、現象の動的な観察、多色観察、および高感度観察が可能なイメージング法である。蛍光バイオイメージング法は、標的部位で選択的に結合、濃縮、発現等する蛍光標識剤、あるいは、標的部位で選択的に発光する蛍光標識剤を用い、紫外〜近赤外領域の光を照射した際にその蛍光標識剤が発する蛍光を検出することにより、標的を可視化することができる。近年は、非侵襲的な診断を可能にする医学診断用イメージング法としても注目されている。

一般に生体の組織は、ヘモグロビンおよび水など、光の透過を妨げる物質を多く含むため、組織深部にある標的部位のイメージングはより困難である。しかしながら、生体透過性に優れるため「生体の窓」とも呼ばれる近赤外領域の光（７００〜１５００ｎｍ）を用いた近赤外蛍光イメージングは、その困難を部分的に回避できるため、患者への負担が少ない画像診断や外科手術ナビゲーションツールとして臨床現場への応用が進められている。

蛍光標識剤は、生体分子、細胞、組織等を標識する機能を有する蛍光物質であり、高感度に標識するためには、高い蛍光強度を有する必要がある。蛍光標識剤としては、水溶性の有機分子であるシアニン系色素やキサンテン系色素等が用いられるが、非特許文献１および２に記載されているように、蛍光強度の低さや、耐光性など光安定性の低さが課題であった。近年、近赤外領域におけるバイオイメージング用のシアニン系色素であるインドシアニングリーン等に関してその蛍光強度を改善する手法が開発されているように（特許文献１）、より高い蛍光強度や光安定性を有する蛍光標識剤が求められている。

近赤外吸収色素として特許文献２に示されるような水溶性フタロシアニン色素が挙げられるが、蛍光標識剤として用いるには蛍光強度が低いといった課題があった。

国際公開第２０１６／１５２９５４号国際公開第２００９／１３３６６８号

会澤英樹、外３名、「診断試薬用シリカナノ粒子の開発」、古河電工時報、古河電気工業株式会社、平成２０年３月、第１２１号、ｐ．１７ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ第３４巻、第１号、通算３９４号、２０１７年１月１２日発行シーエムシー出版、ｐ．２９

本発明が解決しようとする課題は、蛍光強度、耐光性に優れた蛍光標識剤およびフタロシアニンを提供することである。

本発明者らは前記諸問題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記課題を解決するための優れた特性を有するフタロシアニンを見出し、本発明をなしたものである。

すなわち本発明は、下記一般式（１）で表されるフタロシアニンを含むことを特徴とする蛍光標識剤に関する。

一般式（１）

（Ｒ_１〜Ｒ_１５は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、−ＣＯＯＭ^１、−ＳＯ_３Ｍ^１、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基である。ただし、Ｒ_１〜Ｒ_１５の内の少なくとも一つは−ＳＯ_３Ｍ^１である。Ｍ^１は、水素原子またはアルカリ金属を表す。Ｍは、２価〜４価の金属原子を表し、Ｍが２価の金属原子である場合はｋは０であり、Ｍが３価の金属原子である場合はｋは１であり、Ｍが４価の金属原子である場合はｋは２である。Ｚは、それぞれ独立に、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ_１６Ｒ_１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ_１８、−ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ_１９、または−ＯＳｉＲ_２０Ｒ_２１Ｒ_２２を表す。Ｒ_１６およびＲ_１７は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルコキシ基、または置換基を有してもよいアリールオキシ基を表す。Ｒ_１８は、水素原子、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ_１９は、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ_２０〜Ｒ_２２は、それぞれ独立に、置換基を有してもよいアルキル基、または置換基を有してもよいアリール基を表す。）

本発明は、MがＭｇ、Ｚｎ、ＡｌまたはＳｉであることを特徴とする蛍光標識剤に関する。

本発明は、下記一般式（１）で表されることを特徴とするフタロシアニンに関する。

一般式（１）

本発明は、MがＭｇ、Ｚｎ、ＡｌまたはＳｉであることを特徴とするフタロシアニンに関する。

本発明によって、蛍光強度や耐光性に優れた蛍光標識剤、およびフタロシアニンを提供することが可能となった。

図１は、蛍光標識剤Ｈ−１の蛍光強度評価における蛍光スペクトルである。図２は、蛍光標識剤Ｈ−２の蛍光強度評価における蛍光スペクトルである。図３は、蛍光標識剤Ｈ−５の蛍光強度評価における蛍光スペクトルである。図４は、蛍光標識剤Ｈ−５７の蛍光強度評価における蛍光スペクトルである。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の蛍光標識剤に用いられるフタロシアニンは、一般式（１）で表される構造を有する。

アルキル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基、オクタデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、イソペンチル基、２−エチルヘキシル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、ネオペンチル基等を挙げることができる。アルキル基の炭素数は１〜３０の範囲内であることが好ましい。

上記アルキル基における置換基としては、フッ素、塩素、臭素等のハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、カルボキシル基等の他、後述するアリール基、シクロアルキル基、複素環基が挙げられる。また、構造の一部が、エステル結合（−ＣＯＯ−）やエーテル結合（−Ｏ−）で置換されたものも置換基として含めるものとする。

したがって、置換アルキル基としては、上記の置換基で置換されたアルキル基を意味する。一つ又は二つ以上の置換基で置換されたものであっても良い。例えば、ハロゲン原子で置換されたアルキル基の具体例としては、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、−（ＣＦ_２）_４ＣＦ_３、−（ＣＦ_２）_５ＣＦ_３、−（ＣＦ_２）_６ＣＦ_３、−（ＣＦ_２）_７ＣＦ_３、−（ＣＦ_２）_８ＣＦ_３、トリクロロメチル基２，２−ジブロモエチル基等を挙げることができる。

また、エステル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ（−ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−(ＣＨ_２)_５−ＣＯＯ−（ＣＨ_２）_１１−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ−(ＣＯＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_３)_２等を挙げることができる。エステル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２〜３０の範囲内であることが好ましい。

また、エーテル結合で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−ＣＨ_３（ここでｎは１から８の整数である）、−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｍ−ＣＨ_３（ここでｍは１から５の整数である）、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_３−、−ＣＨ_２−ＣＨ−（ＯＣＨ_３）_２等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。エーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、２〜３０の範囲内であることが好ましい。

また、エステル結合（−ＣＯＯ−）およびエーテル結合（−Ｏ−）で置換されたアルキル基の具体例としては、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_３を挙げることができる。エステル結合（−ＣＯＯ−）およびエーテル結合で置換されたアルキル基の炭素数は、３〜３０の範囲内であることが好ましい。

シクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シクロへキシル基、２，５−ジメチルシクロペンチル基、４−ｔｅｒｔ−プチルシクロヘキシル基等が挙げられる。また、シクロアルキル基の炭素数は５〜１２の範囲内であることが好ましい。置換シクロアルキル基の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。

アルケニル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルケニル基が挙げられる。アルケニル基はその構造中に一つの二重結合を一般的に指すが、本明細書においては複数の二重結合を有するものもアルケニル基に含めるものとする。具体例としては、ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、イソプロペニル基、イソブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、１，３−ブタジエニル基等を挙げることができる。アルケニル基の炭素数は２〜１８の範囲内であることが好ましい。置換アルケニル基の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。

アリール基としては、単環または縮合多環のアリール基が挙げられる。例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−ビフェニル基、ｍ−ビフェニル基、２−アントリル基、９−アントリル基、２−フェナントリル基、３−フェナントリル基、９−フェナントリル基、２−フルオレニル基、３−フルオレニル基、９−フルオレニル基、１−ピレニル基、２−ピレニル基、３−ペリレニル基、ｏ−トリル基、ｍ−トリル基、ｐ−トリル基、４−メチルビフェニル基、ターフェニル基、４−メチル−１−ナフチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ナフチル基、４−ナフチル−１−ナフチル基、６−フェニル−２−ナフチル基、１０−フェニル−９−アントリル基、スピロフルオレニル基、２−ベンゾシクロブテニル基等が挙げられる。アリール基の炭素数は６〜１８の範囲内であることが好ましい。置換アリール基の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。

複素環基としては、脂肪族複素環基や芳香族複素環基が挙げられる。具体例としては、ピリジル基、ピラジル基、ピペリジノ基、ピラニル基、モルホリノ基、アクリジニル基等が挙げられる。また、下記構造式で表される基も挙げられる。複素環基の炭素数は、４〜１２であることが好ましい。環員数は、５〜１３であることが好ましい。

置換複素環基の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。例えば、複素環基３−メチルピリジル基、Ｎ−メチルピペリジル基、Ｎ−メチルピローリル基等が挙げられる。

アルコキシル基としては、直鎖状または分岐鎖状のアルコキシル基が挙げられる。具体例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ネオペンチルオキシ基、２，３−ジメチル−３−ペンチルオキシ基、ｎ−へキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ステアリルオキシ基、２−エチルへキシルオキシ基等が挙げられる。アルコキシル基の炭素数は１〜６の範囲内であることが好ましい。置換アルコキシル基の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。

置換アルコキシル基の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。具体例としては、トリクロロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基、２，２，３，３−テトラフルオロプロポキシ基、２，２−ビス（トリフルオロメチル）プロポキシ基、２−エトキシエトキシ基、２−ブトキシエトキシ基、２−ニトロプロポキシ基、ベンジルオキシ基等が挙げられる。

アリールオキシ基としては、単環または縮合多環のアリールオキシ基が挙げられる。具体例としては、フェノキシ基、ｐ−メチルフェノキシ基、ナフチルオキシ基、アンスリルオキシ基等が挙げられる。アリールオキシ基は、単環のアリールオキシ基が好ましい。また、炭素数６〜１２のアリールオキシ基が好ましい。

置換アリールオキシ基の置換基としては、上述したアルキル基における置換基と同じ置換基が挙げられる。例えば、ｐ−ニトロフェノキシ基、ｐ−メトキシフェノキシ基、２，４−ジクロロフェノキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基、２−メチル−４−クロロフェノキシ基等が挙げられる。

Ｍ_１のアルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム等が挙げられる。

Ｍとしては、２価の金属原子としては、Ｂｅ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｔｉ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｃａ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｃｄ、Ｂａ、Ｐｔ、等が挙げられる。３価の金属原子としては、Ａｌ、Ｇａ、Ｉｎ等が挙げられる。４価の金属原子としては、Ｓｉ、Ｍｎ、Ｓｎ、Ｃｒ、Ｚｒ等が挙げられる。蛍光強度の観点からは、Ｍｇ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｎが好ましい。

Ｚは、フタロシアニンの保存安定性の観点から水酸基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ_１６Ｒ_１７、−ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ_１９、または−ＯＳｉＲ_２０Ｒ_２１Ｒ_２２が好ましい。

本発明のフタロシアニンの置換基には、少なくとも一つの−ＳＯ_３Ｍ^１基が含まれ、置換基の個数としては、フタロシアニンの水溶性の観点から１から８個が好ましい。

本発明のフタロシアニンの置換基には、フタロシアニンのα位に少なくとも一つの水酸基が含まれ、フタロシアニン中の水酸基の個数としては、１から８個が好ましい。さらには、分子内水素結合を形成し耐光性を向上させる観点からフタロシアニンのα位に１から４個の水酸基を有することがより好ましい。

（蛍光標識剤）
本発明の蛍光標識剤の用途は特に限定されないが、例えば、細胞、タンパク質や生体内の低分子化合物を蛍光ラベルすることで、生体内での挙動を可視化することが挙げられる。
この用途の場合、本発明のフタロシアニンに、抗原等のターゲット分子に結合する物質を修飾することが好ましい。ターゲット分子に結合する物質としては、ターゲット分子と特異的に結合する一次抗体、その一次抗体に結合する二次抗体、アビジン、ビオチン、あるいは糖鎖等が挙げられる。

また、近赤外領域の光を用いた画像診断として、毛細血管やがん腫瘍部分に本発明の蛍光標識剤を集め、毛細血管やがん腫瘍部分をイメージングすることも可能である。この方法は、励起光照射により近赤外領域に蛍光を放射する性質を持つ本発明の蛍光標識剤を造影剤として生体内に投与する。次に身体の外側から近赤外の波長である励起光を照射し、血管やがん腫瘍部分に集まった蛍光造影剤から放射される蛍光を検出して、肉眼で確認できない毛細血管や病変部位を確定するものである。

本発明のフタロシアニンの濃度は特に限定されないが、例えば、細胞を扱う場合、細胞の機能障害や増殖阻害等への影響を考量すると、濃度は低い方が好ましく、本発明のフタロシアニンの濃度は１００μＭ以下であることが好ましい。

（蛍光標識剤の作製方法）
本発明における蛍光標識剤の作製方法は、特に限定されないが、例えば、本発明のフタロシアニンを水に溶解させる方法を挙げることができる。

水に溶解させるときは、プロペラ撹拌機、タービン撹拌機、ボルテックスミキサー、撹拌子を用いたマグネティックスターラーによる撹拌、あるいは超音波照射装置による溶解等が好適に用いられる。

上記の作製方法で使用される水としては、イオン交換水、蒸留水、あるいは超純水を挙げることができる。細胞を扱う場合は、生理条件に近づけるために水に塩を加えた生理食塩水、さらにリン酸緩衝剤を加えたリン酸緩衝生理食塩水等を好適に用いることができる。

本発明のフタロシアニンの合成方法としては特に限定されないが、例えば、フタロニトリル誘導体を原料として公知の方法でフタロシアニンを合成した後、下記反応式で示すように、対応するアルコキシフタロシアニンを濃硫酸と発煙硫酸の混合溶媒中で加熱撹拌することで、スルホン化およびアルコキシ基の分解によるヒドロキシル化を行い得ることができる。

フタロニトリル誘導体が非対称の構造である場合、得られるフタロシアニンは置換基の位置が異なる異性体の混合物として得られる。本明細書においては、異性体の構造のうち一例を示している。

本発明のフタロシアニンの具体例としては、以下のフタロシアニンが挙げられるが、本発明のフタロシアニンはこれらに限定されない。

本発明のフタロシアニンは、着色材として印刷インキ、ＩＪインキ、プラスチック、塗料、繊維、文具、筆記具、化粧品等の着色に使用することができる。

以下に、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。なお、実施例中「部」とは、「質量部」を表す。

＜フタロシアニン１の製造方法＞

３−ニトロフタロニトリル１０部および２，４−ジメチル−３−ペンタノール７．４部をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）７０部に溶解し、この溶液に、別途調製したｔ−ブトキシナトリウム６．１部およびＤＭＦ４０部を含む溶液を、０℃以下の温度で滴下し、室温（２５℃）で２時間反応させた。その後、８０％酢酸４．８部および塩酸１７．５部を加え、更に、水７０部を滴下して生じた結晶を濾別し、得られた結晶を水で洗浄した後に乾燥して、３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリル１１．９部を得た。次に、キノリン６８部および無水塩化アルミニウム２．２部の溶液にアンモニアガスを導入し、上記で得られた３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリル１１．９部を加えた。１８０℃に加熱して２時間反応させた。これを室温（２５℃）まで冷却し結晶を析出させた。生じた結晶を濾別し、結晶を４７％メタノール水溶液で洗浄した後に乾燥して、フタロシアニン１を１０．３部を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、ｍ／ｚ＝１０３１．８５（理論値１０３０．５２）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニン１の構造を有することが同定された。

＜フタロシアニン２の製造方法＞

３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリル１１．９部とｎ−アミルアルコール１００部、塩化マグネシウム１．６部、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン８．４部を混合し、１３６℃で６時間還流した。攪拌したまま室温（２５℃）まで冷却した反応溶液にメタノール５０部を添加し、析出した固体をろ過し、メタノール１５０部で洗浄した後に乾燥して、フタロシアニン２を７．６部得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、ｍ／ｚ＝９９３．６４（理論値９９２．５５）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニン２の構造を有することが同定された。

＜フタロシアニン３の製造方法＞

３,６−ジエトキシフタロニトリル１１．９部とｎ−アミルアルコール１００部、塩化マグネシウム１．８部、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン９．４部を混合し、１３６℃で６時間還流した。攪拌したまま室温（２５℃）まで冷却した反応溶液にメタノール５０部を添加し、析出した固体をろ過し、メタノール１５０部で洗浄した後に乾燥してフタロシアニン３を７．０部得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、ｍ／ｚ＝８８９．５４（理論値８８８．３４）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニン３の構造を有することが同定された。

＜フタロシアニン４の製造方法＞

フタロシアニン２の製造方法で使用した塩化マグネシウムを塩化亜鉛２．２部に変更して、フタロシアニン２の製造方法と同様にして製造した。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝１０３３．９１（理論値１０３２．５０）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニン４の構造を有することが同定された。

＜フタロシアニン５の製造方法＞

スルホラン１２０部、１，８−ジアザビシクロ［５，４，０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）６．２部に３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペンチル）オキシ−１，３−ジイミノイソインドリン１０部および四塩化珪素６．２部を加え、１６０〜１７０℃で８時間加熱撹拌後、室温（２５℃）まで冷却し、３５％塩酸８０部と水１５００部の混合溶液に注入撹拌し、８０℃で２時間加熱撹拌した。その後、析出した沈澱を濾別して、メタノール：水（質量比４：１）混合溶液で洗浄後、乾燥して、フタロシアニン５を５．９部得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝１０３１．６８（理論値１０３０．５５）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニン５の構造を有することが同定された。

＜フタロシアニン６〜１３の製造方法＞
フタロシアニン１の製造方法で使用した３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリルを下記に示すフタロニトリル誘導体に変更した以外は、フタロシアニン１の製造と同様にして、表２に示すフタロシアニン６〜１３をそれぞれ製造した。尚、フタロニトリル誘導体は、フタロシアニン１の製造における３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリルと同モル量使用した。また、フタロニトリル誘導体とフタロシアニンの置換基Ｒａは同じ置換基を表す。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、表２に示した分子イオンピーク（ｍ／ｚ）が検出され、表２に示したフタロシアニン６〜１３の構造を有することが同定された。

フタロニトリル誘導体

フタロシアニン６〜１３

＜フタロシアニン１４〜２９の製造方法＞
フタロシアニン１４〜２１は、フタロシアニン２の製造方法で使用した３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリルを下記に示すフタロニトリル誘導体に変更した以外は、フタロシアニン２の製造と同様にして、それぞれ製造した。またフタロシアニン２２〜２９は、フタロシアニン２の製造方法で使用した塩化マグネシウムを塩化亜鉛２．２部に変更して、フタロシアニン２の製造方法と同様にして製造した。尚、フタロニトリル誘導体は、フタロシアニン２の製造における３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペントキシ）フタロニトリルと同モル量使用した。また、フタロニトリル誘導体とフタロシアニンの置換基Ｒａは同じ置換基を表す。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、表３に示した分子イオンピーク（ｍ／ｚ）が検出され、表３に示したフタロシアニン１４〜２９の構造を有することが同定された。

フタロニトリル誘導体

フタロシアニン１４〜２９

＜フタロシアニン３０〜３７の製造方法＞
フタロシアニン５の製造方法で使用した３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペンチル）オキシ−１，３−ジイミノイソインドリンを下記に示すジイミノイソインドリン誘導体に変更した以外は、フタロシアニン５の製造と同様にして、表４に示すフタロシアニンをそれぞれ製造した。尚、ジイミノイソインドリン誘導体は、フタロシアニン５の製造における３−（２’，４’−ジメチル−３’−ペンチル）オキシ−１，３−ジイミノイソインドリンと同モル量使用した。また、ジイミノイソインドリン誘導体とフタロシアニンの置換基Ｒａは同じ置換基を表す。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、表４に示した分子イオンピーク（ｍ／ｚ）が検出され、表４に示したフタロシアニン３０〜３７の構造を有することが同定された。

ジイミノイソインドリン誘導体

フタロシアニン３０〜３７

＜フタロシアニン３８の製造方法＞

フタロシアニン５の製造方法で使用した四塩化ケイ素をトリクロロオクタデシルシランに変更した以外は、フタロシアニン５の製造と同様にして製造した。尚、トリクロロオクタデシルシランは、フタロシアニン５の製造における四塩化ケイ素と同モル量使用した。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、ｍ／ｚ＝１２６７．３６（理論値１２６６．８４）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニン３８の構造を有することが同定された。

[実施例１]
＜フタロシアニンＦ−１の製造方法＞

濃硫酸９．２部、２５％発煙硫酸５．５部の混合溶液にフタロシアニン１を１部加え、５０℃で４時間加熱撹拌した。反応液を冷却後、８０部の氷に反応液を添加し、析出した沈澱を濾別した。さらに、テトラヒドロフラン５０部に濾別した固体を懸濁させ、再度沈澱を濾別して、テトラヒドロフラン５０部で洗浄後、乾燥して、０．５部の粗製物を得た。粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製ＳｍａｒｔＦｌａｓｈＡＫＲＯＳ）を用いて精製し、０．２部のフタロシアニンＦ−１を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、ｍ／ｚ＝９３９．６５（理論値９４０．７５）に分子イオンピークが検出された。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ １２．２６（４Ｈ，ｓ）８．５８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）７．５４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）。

[実施例２〜３７]
＜フタロシアニンＦ−２〜Ｆ−３７の製造方法＞
フタロシアニンＦ−１の製造方法で使用したフタロシアニン１を表５に示すフタロシアニンに変更した以外は、フタロシアニンＦ−１の製造と同様にして、表５に示すフタロシアニンをそれぞれ製造した。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、表５に示した分子イオンピーク（ｍ／ｚ）が検出され、表５に示したフタロシアニンＦ−２〜Ｆ−３７の構造を有することが同定された。

[実施例３８]
＜フタロシアニンＦ−３８の製造方法＞

フタロシアニンＦ−１の製造方法で使用したフタロシアニン１をフタロシアニン３８に変更した以外は、フタロシアニンＦ−１の製造と同様にして製造した。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、ｍ／ｚ＝１１９３．３６（理論値１１９４．２３）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニンＦ−３８の構造を有することが同定された。

[実施例３９]
＜フタロシアニンＦ−３９の製造方法＞

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０部中で、フタロシア二ンＦ−１を１部とトリフェニルクロロシラン０．２５部を４５℃で２時間反応させた。その後、真空蒸留にてＤＭＦを除去し、粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製ＳｍａｒｔＦｌａｓｈＡＫＲＯＳ）を用いて精製し、０．１５部のフタロシアニンＦ−３９を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝１１９７．２１（理論値１１９８．０３）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニンＦ−３９の構造を有することが同定された。

[実施例４０〜５１]
＜フタロシアニンＦ−４０〜５１の製造方法＞
フタロシアニンＦ−３９の製造方法で使用したトリフェニルクロロシランを、表６に示す酸性化合物にそれぞれ変更して、フタロシアニンＦ−３９と同様にして、表６に示すフタロシアニンＦ−４０〜５１をそれぞれ製造した。尚、酸性化合物は、フタロシアニンＦ−３９の製造におけるトリフェニルクロロシランと同モル量使用した。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、表６に示した分子イオンピーク（ｍ／ｚ）が検出され、表６に示したフタロシアニンＦ−４０〜５１の構造を有することが同定された。

[実施例５２]
＜フタロシアニンＦ−５２の製造方法＞

Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０部中で、フタロシア二ンＦ−５を１部と３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン０．３７部を４５℃で２時間反応させた。その後、真空蒸留にてＤＭＦを除去し、粗製物を中圧分取液体クロマトグラフ（山善製ＳｍａｒｔＦｌａｓｈＡＫＲＯＳ）を用いて精製し、０．２５部のフタロシアニンＦ−５２を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝１１８７．２４（理論値１１８８．１０）に分子イオンピークが検出され、上記フタロシアニンＦ−５２の構造を有することが同定された。

[実施例５３、５４]
＜フタロシアニンＦ−５３、５４の製造方法＞

フタロシアニンＦ−５２の製造方法で使用した３−アミノプロピルジメチルエトキシシランを表７に示す酸性化合物にそれぞれ変更してフタロシアニンＦ−５２と同様にして製造した。尚、酸性化合物は、フタロシアニンＦ−５２の製造における３−アミノプロピルジメチルエトキシシランと同モル量使用した。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果、表７に示した分子イオンピーク（ｍ／ｚ）が検出され、表７に示したフタロシアニンＦ−５３、５４の構造を有することが同定された。

[比較例１]
＜フタロシアニンＦ−５５の製造方法＞

３０％発煙硫酸１０部にフタロシアニンクロロアルミニウム（東京化成製）を１部加え、６０℃で１０時間加熱撹拌した。反応液を冷却後、８０部の氷に反応液を添加し、析出した沈澱を濾別した。さらに、テトラヒドロフラン５０部に濾別した固体を懸濁させ、再度沈澱を濾別して、テトラヒドロフラン５０部で洗浄後、乾燥して、フタロシアニンＦ−５５を得た。質量分析装置（ＴＯＦ−ＭＳ：ブルカー・ダルトニクス社製ａｕｔｏｆｌｅｘＩＩ）により分析した結果ｍ／ｚ＝７１５．０３（理論値７１６．０５）とｍ／ｚ＝７９５．７５（理論値７９６．００）に分子イオンピークが検出され、スルホン基が２個または３個導入された構造を有することが同定された。

[比較例２]
＜フタロシアニンＦ−５６の製造方法＞

国際公開ＷＯ２００９／１３３６６８号広報の実施例１記載の方法で上記フタロシアニンの混合物を得た。

[比較例３]
インドシアニングリーン（東京化成製）を用いた。

[実施例５５]
＜蛍光標識剤の作製Ｈ−１＞
リン酸緩衝液（Ｇｉｂｃｏ^ＴＭＰＢＳｐＨ７．２ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）２００００部にフタロシアニンＦ−１を０．０３８部溶解した。０．２μｍナイロン製メンブレンフィルターで濾過して、フタロシアニンＦ−１の蛍光標識剤を作製した。

[実施例５６〜１０８]
＜蛍光標識剤Ｈ−２〜５４の作製＞
蛍光標識剤Ｈ−１の作製で使用したフタロシアニンＦ−１のかわりに、表８に示すフタロシアニンに変更した以外は、蛍光標識剤Ｈ−１の作製と同様にして、蛍光標識剤Ｈ−２〜５４をそれぞれ作製した。ただし、各フタロシアニンは、フタロシアニンＦ−１と同モル量使用した。

[比較例４]
＜蛍光標識剤Ｈ−５５の作製＞
蛍光標識剤Ｈ−１の作製で使用したフタロシアニンＦ−１をフタロシアニンＦ−５５０．０３部に変更した以外は、蛍光標識剤Ｈ−１の作製と同様にして、蛍光標識剤Ｈ−５５を作製した。

[比較例５]
＜蛍光標識剤Ｈ−５６の作製＞
蛍光標識剤Ｈ−１の作製で使用したフタロシアニンＦ−１をフタロシアニンＦ−５６０．１２部に変更し、さらに炭酸ナトリウムを０．０６部添加した以外は、蛍光標識剤Ｈ−１の作製と同様にして、蛍光標識剤Ｈ−５６を作製した。

[比較例６]
＜蛍光標識剤Ｈ−５７の作製＞
蛍光標識剤Ｈ−１の作製で使用したフタロシアニンＦ−１を、インドシアニングリーンに変更した以外は、蛍光標識剤Ｈ−１の作製と同様にして、蛍光標識剤Ｈ−５７を作成した。インドシアニングリーンは、フタロシアニンＦ−１と同モル量使用した。

＜蛍光強度評価＞
各々の蛍光標識剤について、蛍光光度計（日本分光株式会社製、ＦＰ−６５００）を用いて蛍光スペクトルを測定し、蛍光波長７８０〜８４０ｎｍの範囲内での最大蛍光強度を求めた。また、この時の励起光は色素の最も長波長側の吸収極大波長に相当する波長を用いた。比較例６の蛍光標識剤Ｈ−５７の最大蛍光強度を１とした時の、各々の分散体の蛍光強度の相対値を算出し、下記の基準に基づいて評価した。蛍光強度の相対値が４以上である場合、各フタロシアニンは蛍光標識剤としての特性が良好であるといえる。（実用レベルは３以上）
４：蛍光強度８以上
３：蛍光強度４以上、８未満
２：蛍光強度１以上、４未満
１：蛍光強度１未満

＜耐光性評価＞
各々の蛍光標識剤について、色素の最も長波長側の吸収極大波長に相当する波長を、蛍光分光光度計（日本分光社製ＦＰ―６５００、励起波長のスリット幅２０ｎｍ）で２時間間照射した際の吸収スペクトルの変化を分光光度計（株式会社日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ−４１００）を用いてそれぞれ測定した。光照射前の最大吸収波長の吸光度をＩ_０、光照射後の最大吸収波長の吸光度をＩ_１を記録し、Ｉ_１／Ｉ_０値を耐光性の指標とした。
評価基準は以下の通りである。（実用レベルは３以上）
４：相対強度９０％以上
３：相対強度８５％以上、９０％未満
２：相対強度８０％以上、８５％未満
１：相対強度８０％未満

＜細胞の視認性評価＞
１０％ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＦＢＳ）および１％ペニシリン―ストレプトマイシンを含ませたＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉａ（ＭＥＭ）の培地にＨｅＬａ細胞を混合し、これらの１００μｌを９６ウェルプレートに添加した際に、各ウェルのＨｅＬａ細胞が５×１０^４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌになるようにＨｅＬａ細胞を播種し、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２含有Ａｉｒ、加湿環境）内で２４時間培養した。その後、ウェルプレート中の培地を取り除き、蛍光標識剤を上記培地で１０倍希釈したものをそれぞれ１０μｌ添加し、さらにインキュベーター内に２４時間静置した。その後、各ウェルの培地を取り除き、リン酸緩衝液（Ｇｉｂｃｏ^ＴＭＰＢＳｐＨ７．２ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）１００μｌで洗浄後、上記培地を１００μｌ添加した。適切な波長の励起フィルターおよび蛍光フィルターを設置した蛍光顕微鏡（キーエンス社製、ＢＺ−Ｘ８００）を用いて、細胞の暗視野像と蛍光像を観察した。細胞の像が、明瞭に観察されれば良好であり、不明瞭であれば不良である。

以下、評価結果を表８に示す。図に蛍光標識剤Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−５、Ｈ−５７の蛍光スペクトルを示す。

本発明のフタロシアニンを用いて作製した蛍光標識剤H−１〜５４（実施例５５〜１０８）は、蛍光標識剤H−５５〜５７（比較例４〜６）よりも蛍光強度、耐光性が良好であった。さらに、これらが向上したことで細胞の視認性も明瞭であった。このことから、本発明のフタロシアニンは、優れた蛍光標識剤としての特性を有することが明らかとなった。

Claims

下記一般式（１）で表されるフタロシアニンを含むことを特徴とする蛍光標識剤。

一般式（１）

（Ｒ_１〜Ｒ_１５は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、−ＣＯＯＭ^１、−ＳＯ_３Ｍ^１、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基である。ただし、Ｒ_１〜Ｒ_１５の内の少なくとも一つは−ＳＯ_３Ｍ^１である。Ｍ^１は、水素原子またはアルカリ金属を表す。Ｍは、２価〜４価の金属原子を表し、Ｍが２価の金属原子である場合はｋは０であり、Ｍが３価の金属原子である場合はｋは１であり、Ｍが４価の金属原子である場合はｋは２である。Ｚは、それぞれ独立に、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ_１６Ｒ_１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ_１８、−ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ_１９、または−ＯＳｉＲ_２０Ｒ_２１Ｒ_２２を表す。Ｒ_１６およびＲ_１７は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルコキシ基、または置換基を有してもよいアリールオキシ基を表す。Ｒ_１８は、水素原子、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ_１９は、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ_２０〜Ｒ_２２は、それぞれ独立に、置換基を有してもよいアルキル基、または置換基を有してもよいアリール基を表す。）
MがＭｇ、Ｚｎ、ＡｌまたはＳｉであることを特徴とする請求項１記載の蛍光標識剤。
下記一般式（１）で表されることを特徴とするフタロシアニン。
一般式（１）

（Ｒ_１〜Ｒ_１５は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、ホルミル基、シアノ基、−ＣＯＯＭ^１、−ＳＯ_３Ｍ^１、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアルケニル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基である。ただし、Ｒ_１〜Ｒ_１５の内の少なくとも一つは−ＳＯ_３Ｍ^１である。Ｍ^１は、水素原子またはアルカリ金属を表す。Ｍは、２価〜４価の金属原子を表し、Ｍが２価の金属原子である場合はｋは０であり、Ｍが３価の金属原子である場合はｋは１であり、Ｍが４価の金属原子である場合はｋは２である。Ｚは、それぞれ独立に、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアルコキシ基、置換基を有してもよいアリールオキシ基、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｒ_１６Ｒ_１７、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ_１８、−ＯＳ（＝Ｏ）_２Ｒ_１９、または−ＯＳｉＲ_２０Ｒ_２１Ｒ_２２を表す。Ｒ_１６およびＲ_１７は、それぞれ独立に、水素原子、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルコキシ基、または置換基を有してもよいアリールオキシ基を表す。Ｒ_１８は、水素原子、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ_１９は、水酸基、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいアリール基、または置換基を有してもよい複素環基を表す。Ｒ_２０〜Ｒ_２２は、それぞれ独立に、置換基を有してもよいアルキル基、または置換基を有してもよいアリール基を表す。）
ＭがＭｇ、Ｚｎ、ＡｌまたはＳｉであることを特徴とする請求項３記載のフタロシアニン。