JP7256816B2 - タンパク質製剤用の賦形剤化合物 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年3月7日に出願された米国特許仮出願第62/639,950号、および2018年6月1日に出願された米国特許仮出願第62/679,647号の利益を主張する。上記の各出願の内容全体が、参照により本明細書に援用される。
本開示の適用上、用語「タンパク質」は、通常1~3000kDaの分子量を有し、個々の三次構造を生成するのに十分長い鎖長を有するアミノ酸の配列を指す。一部の実施形態では、タンパク質の分子量は、約50~200kDaである。他の実施形態では、タンパク質の分子量は、約20~1000kDa、または約20~2000kDaである。用語「タンパク質」と対照的に、用語「ペプチド」は、個々の三次構造を持たないアミノ酸の配列を指す。多種多様なバイオポリマーが、「タンパク質」という用語の範囲に含まれる。例えば、用語「タンパク質」は、抗体、アプタマー、融合タンパク質、PEG化タンパク質、合成ポリペプチド、タンパク質断片、リポタンパク質、酵素、構造ペプチドなどを含む、治療用または非治療用タンパク質を意味し得る。
治療効果を有するタンパク質を含むこれらのバイオポリマーは、「治療用バイオポリマー」と呼ばれる場合がある。治療効果を有するこれらのタンパク質は、「治療用タンパク質」と呼ばれる場合がある。
非治療目的(すなわち、治療を含まない目的)、例えば、家庭、栄養、商業、および産業用途、に使用されるこれらのタンパク質は、「非治療用タンパク質」と呼ばれる場合がある。非治療用タンパク質を含む製剤は、「非治療用製剤」と呼ばれる場合がある。非治療用タンパク質は、植物源、動物源に由来するか、または細胞培養物から生成され得る。それらはまた、酵素または構造タンパク質であり得る。非治療用タンパク質は、触媒、ヒトと動物の栄養、加工補助剤、洗浄剤、廃棄物処理など、家庭、栄養、商業、および産業の用途に使用することができる。
実施形態では、本明細書に記載のタンパク質含有製剤は、単量体損失に対して耐性があり、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)分析によって測定される。本明細書で使用されるSEC分析では、分析物のメインピークは、一般に、製剤に含まれる標的タンパク質に関連しており、タンパク質のこのメインピークは、単量体ピークと呼ばれる。単量体ピークは、凝集(二量体、三量体、オリゴマーなど)または断片化状態とは対照的に、単量体状態での標的タンパク質、例えばタンパク質活性成分の量を表す。単量体のピーク面積は、標的タンパク質に関連する単量体、凝集体、断片のピークの総面積と比較できる。したがって、タンパク質含有製剤の安定性は、経過時間後の単量体の相対量によって観察できる。本発明のタンパク質含有製剤の安定性の改善は、したがって、賦形剤を含まない対照製剤中のパーセント単量体と比較して、一定の経過時間後、高いパーセント単量体として測定することができる。
一態様では、本明細書に開示される製剤および方法は、治療上有効量の治療用タンパク質および賦形剤化合物を含む、改善されたまたは低減された粘度の安定した液体製剤を提供する。実施形態では、製剤は、許容可能な有効成分の濃度および許容可能な粘度を提供しながら、安定性を改善することができる。実施形態では、製剤は、対照製剤と比較した場合、安定性の改善を提供する。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、治療用製剤とあらゆる点で、乾燥重量ベースで同一であるタンパク質活性成分を含む製剤である。実施形態では、製剤は、長期保存、25~45℃などの高温、凍結/解凍条件、剪断または混合、注射、希釈、気泡曝露、酸素曝露、光曝露、および凍結乾燥のストレス条件下で、安定性の改善を提供する。実施形態では、タンパク質含有製剤の改善された安定性は、対照製剤と比較して、可溶性凝集体、粒子、目視不可の粒子(subvisible particles)、またはゲル形成がより低いパーセンテージの形態である。
一態様では、本明細書に開示される製剤および方法は、有効量の非治療用タンパク質および賦形剤化合物を含む、改善または低減された粘度の安定した液体製剤を提供する。実施形態では、製剤は、有効成分の許容可能な濃度および許容可能な粘度を提供しながら、安定性を改善する。実施形態では、製剤は、対照製剤と比較した場合、安定性の改善を提供する。本開示の適用上、対照製剤は、賦形剤化合物を欠く以外は、非治療用製剤とあらゆる点で乾燥重量ベースで同一であるタンパク質活性成分を含む製剤である。
いくつかの賦形剤化合物が本明細書に記載され、それぞれは、1つ以上の治療用または非治療用タンパク質を伴う使用に好適であり、それぞれは、高濃度のタンパク質を含むように製剤を構成することができる。以下に記載の賦形剤化合物のカテゴリのいくつかは:(1)ヒンダードアミン、(2)アニオン性芳香族、(3)官能化アミノ酸、(4)オリゴペプチド、(5)短鎖有機酸、(6)低分子量脂肪族ポリ酸、(7)ジオンおよびスルホン、(8)双性イオン性賦形剤、ならびに(9)水素結合性元素を含むクラウディング剤である。理論に束縛されることなく、本明細書に記載の賦形剤化合物は、他の方法では粒子間(すなわち、タンパク質間)相互作用に関与するであろう治療用タンパク質の特定の断片、配列、構造、または区域と関連すると考えられる。これらの賦形剤化合物と治療用または非治療用タンパク質との会合は、タンパク質間の相互作用を覆い隠すため、過剰な溶液粘度を引き起こすことなく、タンパク質を高濃度で製剤化できるようになる。実施形態では、賦形剤化合物は、より安定したタンパク質間相互作用をもたらすことができる。タンパク質間相互作用は、タンパク質拡散パラメータkD、浸透圧の第2ビリアル係数B22、または当業者によく知られている他の手法によって測定することができる。
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、賦形剤化合物としてヒンダードアミン小分子を用いて製剤化され得る。本明細書で使用される場合、「ヒンダードアミン」という用語は、以下の例と一致する、少なくとも1つの嵩高いまたは立体障害の基を含む小分子を指す。ヒンダードアミンは、遊離塩基の形態で、プロトン化された形態で、またはその2つの組み合わせで使用できる。プロトン化された形態では、ヒンダードアミンは、塩化物イオン、水酸化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、フッ化物イオン、酢酸イオン、ギ酸イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、またはカルボン酸イオンなどのアニオン性対イオンと会合することができる。賦形剤化合物として有用なヒンダードアミン化合物は、第二級アミン、第三級アミン、第四級アンモニウム、ピリジニウム、ピロリドン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、またはグアニジニウム基を含むことができるため、賦形剤化合物は中性pHの水溶液中でカチオン電荷を有する。ヒンダードアミン化合物はまた、環状芳香族、脂環式、シクロヘキシル、またはアルキル基などの、少なくとも1つの嵩高いまたは立体障害の基を含む。実施形態では、立体障害の基は、それ自体、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、グアニジニウム、ピリジニウム、または第四級アンモニウム基などのアミン基であり得る。理論に束縛されるものではないが、ヒンダードアミン化合物は、カチオンpi相互作用によって、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなどのタンパク質の芳香族部分と会合すると考えられている。実施形態では、ヒンダードアミンのカチオン性基は、タンパク質中の芳香族アミノ酸残基の電子豊富なpi構造に親和性を有し得るため、それらが、タンパク質のこれらの部分を遮蔽することによって、そのような遮蔽されたタンパク質が会合および凝集する傾向を減少させる。
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、アニオン性芳香族小分子化合物を賦形剤化合物として製剤化することができる。アニオン性芳香族賦形剤化合物は、フェニル、ベンジル、アリール、アルキルベンジル、ヒドロキシベンジル、フェノール、ヒドロキシアリール、ヘテロ芳香族基、または縮合芳香族基などの芳香族官能基を含むことができる。アニオン性芳香族賦形剤化合物はまた、カルボキシレート、オキシド、フェノキシド、スルホネート、スルフェート、ホスホネート、ホスフェート、またはスルフィドなどのアニオン性官能基を含むことができる。アニオン性芳香族賦形剤は、酸、ナトリウム塩、または他のものとして記載され得るが、賦形剤は、様々な塩の形態で使用され得ることが理解される。理論に束縛されるものではないが、アニオン性芳香族賦形剤化合物は、タンパク質のカチオン性部分と会合することができる嵩高い立体障害の分子であると考えられているため、タンパク質のこれらの部分を遮蔽し、それによって、タンパク質含有製剤を粘稠にするか安定性の問題を引き起こすタンパク質分子間の相互作用を減らすことができる。
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、1つまたは複数の官能化アミノ酸を用いて製剤化することができ、単一の官能化アミノ酸または1つまたは複数の官能化アミノ酸を含むオリゴペプチドを、賦形剤化合物として使用することができる。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、加水分解または代謝されてアミノ酸を生じ得る分子(「アミノ酸前駆体」)を含む。実施形態では、官能化アミノ酸は、フェニル、ベンジル、アリール、アルキルベンジル、ヒドロキシベンジル、ヒドロキシアリール、ヘテロ芳香族基、または縮合芳香族基などの芳香族官能基を含むことができる。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、メチル化、エチル化、プロピル化、ブチル化、ベンジル化、シクロアルキル化、グリセリル化、ヒドロキシエチル化、ヒドロキシプロピル化、PEG化、およびPPGエステルなどのエステル化アミノ酸を含むことができる。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、アルギニンエチルエステル、アルギニンメチルエステル、アルギニンヒドロキシエチルエステル、およびアルギニンヒドロキシプロピルエステルからなる群から選択される。実施形態では、官能化アミノ酸化合物は、中性pHでの水溶液中の荷電イオン化合物である。例えば、単一のアミノ酸は、酢酸塩や安息香酸塩のようなエステルを形成することによって誘導体化することができ、加水分解生成物は、どちらも天然素材である酢酸または安息香酸、加えてアミノ酸である。実施形態では、官能化されたアミノ酸賦形剤化合物は、体内で代謝されて、生物学的に適合性の副生成物を生じる。
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、賦形剤化合物としてオリゴペプチドを用いて製剤化することができる。実施形態では、オリゴペプチドは、その構造が荷電部分および嵩高い部分を有するように設計される。実施形態では、オリゴペプチドは、2~10個のペプチドサブユニットからなる。オリゴペプチドは、二官能性、例えば、非極性のものに結合したカチオン性アミノ酸、または非極性のものに結合したアニオン性アミノ酸であり得る。実施形態では、オリゴペプチドは、2~5個のペプチドサブユニットからなる。実施形態では、オリゴペプチドは、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリジン、ポリアルギニン、およびポリヒスチジンなどのホモペプチドである。実施形態では、オリゴペプチドは、正味のカチオン電荷を有する。他の実施形態では、オリゴペプチドは、Trp2Lys3などのヘテロペプチドである。実施形態では、オリゴペプチドは、ABA反復パターンなどの交互的な構造を有することができる。実施形態では、オリゴペプチドは、アニオン性およびカチオン性アミノ酸の両方、例えば、Arg-Glu、Lys-Glu、His-Glu、Arg-Asp、Lys-Asp、His-Asp、Glu-Arg、Glu-Lys、Glu-His、Asp-Arg、Asp-Lys、Asp-Hisを含むことができる。理論に束縛されるものではないが、オリゴペプチドは、高粘度溶液と安定性の問題につながる分子間相互作用を低減するような方法でタンパク質と結合できる構造を備えている。例えば、オリゴペプチド-タンパク質の会合は、電荷間の相互作用であり、やや非極性のアミノ酸を残して、タンパク質周囲の水和層の水素結合を破壊し、したがって、粘度を低下させるか、または安定性を向上させる。一部の実施形態では、オリゴペプチド賦形剤は、約50mg/mL以下の濃度で組成物中に存在する。
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、賦形剤化合物として短鎖有機酸を用いて処方することができる。本明細書で使用される場合、「短鎖有機酸」という用語は、C2~C6有機酸化合物およびその塩、エステル、アミド、またはラクトンを指す。このカテゴリには、飽和および不飽和カルボン酸、ヒドロキシ官能化カルボン酸、アミド、および直鎖状、分岐状、または環状カルボン酸が含まれる。実施形態では、短鎖有機酸の酸性基は、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、またはそれらの塩である。
治療用または非治療用タンパク質またはPEG化タンパク質の溶液は、溶液粘度の低下または安定性の改善を可能にする特定の賦形剤化合物を用いて製剤化することができ、このような賦形剤化合物は、低分子量のポリ酸である。低分子量ポリ酸は、有機ポリ酸または無機ポリ酸を含み得る。また、これらの低分子量ポリ酸賦形剤は、他の賦形剤と組み合わせて使用することもできる。
効果的な粘度低下または安定化賦形剤は、298Kで少なくとも1g/Lまで純水に可溶であり、pH7で正味の中性電荷を持ち、スルホン、スルホンアミド、またはジオン官能基を含む分子であり得る。好ましくは、分子は、1000g/モル未満、より好ましくは500g/モル未満の分子量を有する。粘度の低下および/または安定性の改善に有効なジオンおよびスルホンは、複数の二重結合を有し、水溶性であり、pH7で正味の電荷を持たないかアニオン性電荷を有し、強い水素結合ドナーではない。理論に束縛されるものではないが、二重結合の特性により、タンパク質との弱いpiスタッキング相互作用が可能になる。実施形態では、高タンパク質濃度で、および高濃度でのみ高粘度を発現するタンパク質では、荷電した賦形剤は、静電相互作用が長距離相互作用であるため、効果的ではない。溶媒和タンパク質の表面は、主に親水性であり、それらを水溶性にする。タンパク質の疎水性領域は、一般に3次元構造内で遮蔽されるが、構造は常に進化し、ほどけ、再び折り畳まれ(「呼吸(breathing)」と呼ばれることもある)、隣接するタンパク質の疎水性領域が互いに接触して、疎水性相互作用による凝集につながる可能性がある。ジオンおよびスルホン賦形剤のpiスタッキング機能は、そのような「呼吸」中に露出され得る疎水性パッチを覆い隠すことができる。賦形剤の他の重要な役割は、近接するタンパク質間の疎水性相互作用と水素結合を破壊することであり、溶液の粘度を効果的に低下させる。この説明に当てはまるジオンおよびスルホン化合物には、ジメチルスルホン、エチルメチルスルホン、エチルメチルスルホニルアセテート、エチルイソプロピルスルホン、シクラミン酸ナトリウム、ビス(メチルスルホニル)メタン、メタンスルホンアミド、メチオニンスルホン、1,2-シクロペンタンジオン、1,3-シクロペンタンジオン、1,4-シクロペンタンジオン、およびブタン-2,3-ジオンが含まれる。
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、安定性を向上させるか、粘度を下げるための賦形剤として、特定の双性イオン化合物を用いて製剤化することができる。本明細書で使用される場合、「双性イオン」という用語は、カチオン性荷電部分およびアニオン性荷電部分を有する化合物を指す。実施形態では、双性イオン性賦形剤化合物は、アミンオキシドである。実施形態では、反対の電荷は、2~8個の化学結合によって互いに分離される。実施形態では、双性イオン性賦形剤化合物は、約50~約500g/モルの分子量を有するものなどの小分子であり得るか、または約500~約2000g/モルの分子量を有するものなどの中間分子量分子であり得るか、または約2000~約100,000g/モルの分子量を有するポリマーなどの高分子量の分子であり得る。
治療用または非治療用タンパク質の溶液は、安定性を改善するか、または粘度を低下するための賦形剤として、水素結合元素を含むクラウディング剤を用いて製剤化することができる。本明細書で使用される場合、用語「クラウディング剤」は、溶液中にタンパク質を溶解するために利用可能な水の量を減少させ、有効なタンパク質濃度を増加させる製剤添加物を指す。実施形態では、クラウディング剤は、タンパク質の粒子サイズを減少させるか、または溶液中でのタンパク質のアンフォールディングの量を減少させることができる。実施形態では、クラウディング剤は、水素結合および水和効果によって水の構造化を引き起こす溶媒修飾剤として作用することができる。実施形態では、クラウディング剤は、溶液中のタンパク質間の分子間相互作用の量を低減することができる。実施形態では、クラウディング剤は、酸素、硫黄、または窒素原子に結合した水素などの少なくとも1つの水素結合ドナー元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約6~約11のpKaを有する少なくとも1つの弱酸性水素結合ドナー元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約2~約50個の水素結合ドナー元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、ルイス塩基などの少なくとも1つの水素結合アクセプター元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約2~約50個の水素結合アクセプター元素を含む構造を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約50~500g/モルの分子量を有する。実施形態では、クラウディング剤は、約100~350g/モルの分子量を有する。他の実施形態では、クラウディング剤は、ラフィノース、イヌリン、プルラン、またはシニストリンなどの、500g/モル超の分子量を有し得る。
特定の実施形態では、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量脂肪族ポリ酸、ジオンおよびスルホン、双性イオン性賦形剤、ならびに水素結合性元素を含むクラウディング剤などの、上記の特定された賦形剤化合物またはその組み合わせ(以下、「賦形剤添加剤」)で製剤化された治療用または非治療用タンパク質の溶液は、タンパク質拡散相互作用パラメータkDまたは第2ビリアル係数B22により測定される改善されたタンパク質間相互作用特性をもたらす。本明細書で使用される場合、上記の特定された賦形剤化合物またはそれらの組み合わせを使用する試験製剤によって達成される1つまたは複数のタンパク質間相互作用パラメータの「改善」は、賦形剤化合物または賦形剤添加剤を含まない同等の製剤を用いて試験製剤を同等の条件下で比較した場合、誘引性タンパク質間相互作用の減少を指し得る。このような改善は、プロセス全体またはその側面に適用される特定のパラメータを測定することで明らかにすることができ、パラメータは、プロセスに関係する任意の計量であり、変化を定量化し、以前の状態または対照と比較することができる。パラメータは、効率、コスト、収率、速度など、プロセス自体に関係し得る。処理中のタンパク質含有製剤の安定性を改善すると、収量が改善し、生物学的活性が増加し、製剤中の粒子の存在が減少するという利点がある。
P~HQ(式1)
τ=γη(式2)
●ウシガンマグロブリン(BGG)、純度>99%、カタログ番号G5009、Sigma Aldrich
●ヒスチジン、Sigma Aldrich
●下記の実施例に記載されているもの以外の材料は、特に指定しない限り、Sigma Aldrichから入手した。
製剤は、賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質のいずれかを模擬するように意図されている。このような製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む50mMの塩酸ヒスチジン中に調製した。最初に、1.94gのヒスチジンを蒸留水に溶解し、1Mの塩酸(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)でpHを約6.0に調整し、次いでメスフラスコ中で蒸留水で250mLの最終容量に希釈することによって、ヒスチジン塩酸を調製した。次いで、賦形剤化合物を、50mMのヒスチジンHClに溶解した。賦形剤のリストは、以下の実施例4、5、6、および7に提供されている。場合によっては、50mMヒスチジンHClに溶解する前に、賦形剤化合物をpH6に調整した。この場合、最初に賦形剤化合物を脱イオン水に約5wt%で溶解し、塩酸または水酸化ナトリウムを使用して、pHを約6.0に調整した。次いで、調製した塩溶液を約65℃の対流式実験用オーブンに入れて、水を蒸発させ、固体の賦形剤を単離した。50mMのヒスチジンHCl中の賦形剤溶液を調製したら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、賦形剤溶液1mLあたり約0.336gのBGGの比率で溶解した。これにより、タンパク質の最終濃度が約280mg/mLになった。賦形剤を含む50mMヒスチジンHCl中のBGGの溶液を、20mLバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
実施例1に記載のように調製された製剤の粘度測定は、DV-IIT LVコーンおよびプレート粘度計(Brookfield Engineering、Middleboro、MA)を用いて行った。粘度計に、CP-40コーンを備え付け、3rpm、25℃で操作した。製剤を、0.5mLの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で3分間インキュベートした後、20秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、1分間の剪断インキュベーションとその後の20秒間の測定収集期間からなる2つの追加ステップが続いた。次いで、収集された3つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。
実験溶液中のタンパク質の濃度は、UV/VIS分光計(Perkin Elmer Lambda 35)で、280nmの波長でタンパク質溶液の吸光度を測定することによって決定した。最初に、機器を、pH6の50mMのヒスチジン緩衝液で吸光度がゼロになるように較正した。次に、タンパク質溶液を、同じヒスチジン緩衝液で300倍に希釈し、280nmでの吸光度を記録した。溶液中のタンパク質の最終濃度は、1.264mL/(mg x cm)の吸光係数値を使用して計算した。
280mg/mLのBGGを含む製剤は、添加された賦形剤化合物を含むいくつかのサンプルを使用して、実施例1に記載のように調製した。これらの試験では、ジメチルシクロヘキシルアミン(DMCHA)、ジシクロヘキシルメチルアミン(DCHMA)、ジメチルアミノプロピルアミン(DMAPA)、トリエタノールアミン(TEA)、ジメチルエタノールアミン(DMEA)、およびナイアシンアミドの塩酸塩が、ヒンダードアミン賦形剤化合物の例として試験された。また、ヒンダードアミン賦形剤化合物の例として、DMCHAのヒドロキシ安息香酸塩とタウリン-ジシアンジアミド付加物を試験した。各タンパク質溶液の粘度を、実施例2に記載のように測定し、結果を、以下の表1に提示し、添加された賦形剤化合物が、粘度を低下させる利点を示す。
添加された賦形剤化合物を含むいくつかのサンプルを用いて、280mg/mLのBGGの製剤を、実施例1に記載のように調製した。各溶液の粘度を、実施例2に記載のように測定し、結果を下の表2に提示し、添加された賦形剤化合物が、粘度を低下させる利点を示す。
オリゴペプチド(n=5)は、NeoBioLab Inc.(Woburn、MA)により、純度95%超で、N末端を遊離アミンとして、C末端を遊離酸として合成した。ジペプチド(n=2)は、LifeTein LLC(Somerset、NJ)によって95%の純度で合成した。添加された賦形剤化合物として合成オリゴペプチドを含むいくつかのサンプルを用いて、実施例1に記載のように280mg/mLのBGGの製剤を調製した。各溶液の粘度を、実施例2に記載のように測定し、結果を下の表3に提示し、添加された賦形剤化合物が、粘度を低下させる利点を示す。
グアニルタウリンは、米国特許第2,230,965号に記載の方法に従って調製した。タウリン(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)3.53部を1.42部のジシアンジアミド(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)と混合し、均一な混合物が得られるまで、乳鉢と乳棒で粉砕した。次に、混合物をフラスコに入れ、200℃で4時間加熱した。生成物を、さらに精製することなく使用した。
製剤は、賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質のいずれかを模擬するように意図されている。そのような製剤を、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む50mM塩酸ヒスチジン緩衝液中に調製した。最初に、1.94gのヒスチジンを蒸留水に溶解し、1Mの塩酸(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)でpHを約6.0に調整し、次いでメスフラスコ中で蒸留水で250mLの最終容量に希釈することによって、ヒスチジン塩酸緩衝液を最初に調製した。次いで、賦形剤化合物を50mMのヒスチジンHCl緩衝液に溶解した。表4に、賦形剤化合物のリストを提供する。場合によっては、賦形剤化合物を50mMのヒスチジンHCl緩衝液に溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にした。場合によっては、50mMのヒスチジンHClに溶解する前に、賦形剤化合物をpH6に調整した。この場合、最初に賦形剤化合物を脱イオン水に約5wt%で溶解し、塩酸または水酸化ナトリウムを使用して、pHを約6.0に調整した。次いで、調製した塩溶液を約65℃の対流式実験用オーブンに入れて、水を蒸発させ、固体の賦形剤を単離した。50mMのヒスチジンHCl中の賦形剤溶液を調製したら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、約280mg/mLの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤を含む50mMヒスチジンHCl中のBGGの溶液を、20mLバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
製剤は、一次賦形剤化合物、二次賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質のいずれかを模擬するように意図されている。一次賦形剤化合物は、以下の表5にリストされているように、アニオン性および芳香族の両方の官能性を有する化合物から選択された。二次賦形剤化合物は、以下の表5にリストされているように、pH6で非イオン性またはカチオン性電荷のいずれかを有し、およびイミダゾリン環またはベンゼン環のいずれかを有する化合物から選択された。これらの賦形剤の製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、50mMのヒスチジン塩酸緩衝液中に調製された。最初に、1.94gのヒスチジンを蒸留水に溶解し、1Mの塩酸(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)でpHを約6.0に調整し、次いでメスフラスコ中で蒸留水で250mLの最終容量に希釈することによって、ヒスチジン塩酸を調製した。次いで、個々の一次または二次賦形剤化合物を、50mMのヒスチジンHClに溶解した。一次および二次賦形剤の組み合わせを、50mMのヒスチジンHClに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にした。上記のように賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、約280mg/mLの最終タンパク質濃度を達成する比率で各試験溶液に溶解した。賦形剤を含む50mMヒスチジンHCl中のBGGの溶液を、20mLバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
製剤は、一次賦形剤化合物、二次賦形剤化合物および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質または非治療用製剤で使用される非治療用タンパク質を模擬するように意図されている。一次賦形剤化合物は、以下の表6にリストされているように、アニオン性および芳香族の両方の官能性を有する化合物から選択された。二次賦形剤化合物は、以下の表6にリストされているように、pH6で非イオン性またはカチオン性電荷のいずれかを有し、およびイミダゾリン環またはベンゼン環のいずれかを有する化合物から選択された。これらの賦形剤の製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、蒸留水中に調製された。一次および二次賦形剤の組み合わせを、蒸留水に溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にした。蒸留水中の賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、約280mg/mLの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤を含む蒸留水中のBGGの溶液を、20mLバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
材料:すべての材料は、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州から購入した。製剤は、賦形剤化合物およびPEGを使用して調製され、PEGは、治療用製剤で使用される治療用PEG化タンパク質を模擬するように意図されている。このような製剤は、等量のPEG溶液を賦形剤溶液と混合することによって調製された。どちらの溶液も、pH7.3の10mMのTris、135mMのNaCl、1mMのtrans-桂皮酸からなるTris緩衝液で調製した。PEG溶液は、3gのポリ(エチレンオキシド)平均分子量約1,000,000(Aldrich Catalog # 372781)を97gのTris緩衝液と混合することによって調製した。完全に溶解させるために、混合物を一晩撹拌した。
調製された製剤の粘度測定は、DV-IIT LVコーンおよびプレート粘度計(Brookfield Engineering、Middleboro、MA)を用いて行った。粘度計に、CP-40コーンを備え付け、3rpm、25℃で操作した。製剤を、0.5mLの容量で粘度計に負荷し、所定の剪断速度と温度で3分間インキュベートした後、20秒間の測定収集時間が続いた。これに次いで、1分間の剪断インキュベーションとその後の20秒間の測定収集期間からなる2つの追加ステップが続いた。次いで、収集された3つのデータポイントを平均し、サンプルの粘度として記録した。
ビーカーに、200mLのリン酸緩衝生理食塩水(Aldrich Cat.#P4417)および4gのBSA(Aldrich Cat.#A7906)を添加し、磁気棒を用いて混合した。次に、400mgのメトキシポリエチレングリコールマレイミド、MW=5,000、(Aldrich Cat.#63187)を添加した。反応混合物を、室温で一晩反応させた。翌日、20滴の0.1MのHClを加えて反応を停止させた。反応生成物は、SDS-PAGEおよびSECにより特徴付けられ、PEG化BSAを明確に示した。反応混合物を、30kDaの分子量カットオフ(MWCO)を有するAmicon遠心管に入れ、数ミリリットルに濃縮した。次に、サンプルを、pHが約6の50mMのヒスチジン緩衝液で20倍に希釈し、続いて、高粘度の液体が得られるまで濃縮した。タンパク質溶液の最終濃度は、280nmで吸光度を測定し、BSAの吸光係数0.6678を使用することによって取得した。結果は、溶液中のBSAの最終濃度が342mg/mLであることを示した。
リン酸緩衝液(25mM、pH7.2)中の5mg/mLのBSA(Aldrich A7906)の溶液は、0.5gのBSAを100mLの緩衝液と混合することによって調製した。次に、1gのメトキシPEGプロピオンアルデヒドMw=20,000(JenKem Technology, Plano, TX 75024)を添加し、続いて0.12gのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(Aldrich 156159)を添加した。反応を、室温で一晩進行させた。翌日、反応混合物をTris緩衝液(10mM Tris、135mM NaCl、pH=7.3)で13倍に希釈し、Amicon遠心管(MWCO 30kDa)を使用して、濃度が約150mg/mLに達するまで濃縮した。
リン酸緩衝液(25mM、pH7.2)中の5mg/mLのリゾチーム(Aldrich L6876)の溶液は、0.5gのリゾチームを100mLの緩衝液と混合することによって調製した。次に、1gのメトキシPEGプロピオンアルデヒドMw=5,000(JenKem Technology,Plano,TX 75024)を添加し、続いて0.12gのシアノ水素化ホウ素ナトリウム(Aldrich 156159)を添加した。反応を、室温で一晩進行させた。翌日、反応混合物をリン酸緩衝液(25mM、pH7.2)で49倍に希釈し、Amicon遠心管(MWCO 30kDa)を使用して濃縮した。タンパク質溶液の最終濃度は、280nmで吸光度を測定し、リゾチームの吸光係数2.63を使用することによって取得した。溶液中のリゾチームの最終濃度は、140mg/mLであった。
賦形剤を含むPEG化BSA(上記の実施例13から)の製剤は、6または12ミリグラムの賦形剤塩を0.3mLのPEG化BSA溶液に添加することによって調製した。溶液を穏やかに振盪することによって混合し、粘度を、A10チャネル(深さ100ミクロン)を備えたRheoSense microViscにより、500s-1の剪断速度で測定した。粘度計の測定は、周囲温度で完了した。表8に提示される結果は、添加された賦形剤化合物が粘度を低下させる効果を示している。
賦形剤としてクエン酸Na塩を有するPEG化BSA(上記の実施例14から)の製剤は、8ミリグラムの賦形剤塩を0.2mLのPEG化BSA溶液に添加することによって調製した。溶液を穏やかに振盪することによって混合し、粘度を、A10チャネル(深さ100ミクロン)を備えたRheoSense microViscにより、500s-1の剪断速度で測定した。粘度計の測定は、周囲温度で完了した。表9に提示される結果は、添加された賦形剤化合物が粘度を低下させる効果を示している。
賦形剤として酢酸カリウムを有するPEG化リゾチーム(上記の実施例15から)の製剤は、6ミリグラムの賦形剤塩を0.3mLのPEG化リゾチーム溶液に添加することによって調製した。溶液を穏やかに振盪することによって混合し、粘度を、A10チャネル(深さ100ミクロン)を備えたRheoSense microViscにより、500s-1の剪断速度で測定した。粘度計の測定は、周囲温度で完了した。表10に提示される結果は、添加された賦形剤化合物が粘度を低下させる利点を示している。
製剤は、賦形剤化合物または2つの賦形剤化合物と試験タンパク質の組み合わせを使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。これらの製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む20mMのヒスチジン緩衝液中に調製した。賦形剤の組み合わせを、20mMのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にした。この実施例の賦形剤化合物を、以下の表11に列挙する。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、約280mg/mLの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤溶液中のBGGの溶液を、5mL滅菌ポリプロピレンチューブ中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で80~100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで約10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
製剤は、賦形剤化合物、第2の賦形剤化合物、および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。第1の賦形剤化合物である賦形剤Aは、局所麻酔特性を有する化合物の群から選択された。第1の賦形剤(賦形剤A)、および第2の賦形剤(賦形剤B)を、表12に列挙する。これらの製剤は、20mMのヒスチジン緩衝液中で、賦形剤Aと賦形剤Bを次のように使用して調製され、それらの粘度が測定され得るようにした。表12に開示される量の賦形剤を、20mMのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にした。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、約280mg/mLの最終タンパク質濃度を達成する比率で賦形剤溶液に溶解した。賦形剤溶液中のBGGの溶液を、5mL滅菌ポリプロピレンチューブ中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で80~100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG-賦形剤溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで約10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
製剤は、賦形剤化合物およびPEGを使用して調製され、PEGは、治療用製剤で使用される治療用PEG化タンパク質を模擬することが意図されており、賦形剤化合物は、表13に示される量で提供された。これらの製剤は、等量のPEG溶液を賦形剤溶液と混合することによって調製された。どちらの溶液も、脱イオン(DI)水で調製した。PEG溶液は、16.5gのポリ(エチレンオキシド)平均分子量約100,000(Aldrich Catalog #181986)を83.5gのDI水と混合することによって調製した。完全に溶解させるために、混合物を一晩撹拌した。
0.25gの固体BGGを4mLの緩衝液と混合して、2つのBGG溶液を調製した。サンプルAの場合:緩衝液は、20mMのヒスチジン緩衝液(pH=6.0)であった。サンプルBの場合:緩衝液は、15mg/mLのカフェイン(pH=6)を含む20mMのヒスチジン緩衝液であった。固体BGGの溶解は、サンプルを、100rpmに設定されたオービタルシェーカーに配置することによって行った。カフェイン賦形剤を含む緩衝液サンプルが、タンパク質をより速く溶解することが観察された。カフェイン賦形剤を含むサンプル(サンプルB)の場合、BGGの完全な溶解が15分で達成された。カフェインを含まないサンプル(サンプルA)の場合、溶解には35分を要した。次に、サンプルを、2つの別個の30kDa分子量カットオフのAmicon Ultra 4 Centrifugal Filter Unitに入れ、サンプルを2,500rpmで10分間隔で遠心分離した。遠心分離を10分間実行するたびに、回収された濾液の容量を記録した。表14の結果は、サンプルBの濾液の回収が速いことを示している。さらに、サンプルBは実行毎に濃縮が続いたが、サンプルAは最大濃縮点に達し、サンプルのさらなる濃縮はもたらされなかった。
この例は、賦形剤としてのカフェインとアルギニンの組み合わせが、BGG溶液の粘度低下に対してどのように有益な効果を有するかを示している。0.18gの固体BGGと0.5mLの20mMのヒスチジン緩衝液をpH6で混合することによって、4つのBGG溶液を調製した。各緩衝液は、以下の表(表15)に記載されるように、異なる賦形剤または賦形剤の組み合わせを含んだ。溶液の粘度は、前の実施例に記載されているように測定された。結果は、ヒンダードアミン賦形剤であるカフェインを、アルギニンなどの既知の賦形剤と組み合わせることができ、その組み合わせが個々の賦形剤自体よりも優れた粘度低下特性を持っていることを示している。
この実施例では、接線流濾過(tangential flow filtration、TFF)を使用して、カフェインの存在下および非存在下で、ウシガンマグロブリン(BGG)溶液を濃縮した。EMD Millipore(Billerica,MA)製造のラボスケールTFFシステムを使用して実験を行った。システムには、30kDa分子量カットオフのUltracel膜(EMD Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州)を含むPellicon XL TFFカセットを取り付けた。名目膜表面積は、50cm2であった。カセットへの供給圧送を30psiに維持し、保持液(retentate)の圧力を10psiに維持した。濾液の流束は、その質量を時間の関数として測定することによって、実験の過程でモニターした。約12グラムのBGGを、15mg/mLのカフェイン、150mMのNaCl、および20mMのヒスチジンを含む500mLの緩衝液に溶解し、pH6に調整した。対照サンプルは、12グラムのBGGを、150mMのNaCl、および20mMのヒスチジンを含む500mLの緩衝液に溶解し、pH6に調整して調製した。緩衝液成分は、Sigma-Aldrichから購入した。TFF処理の前に、両方の溶液を0.2μmのポリエーテルスルホン(PES)フィルター(VWR、Radnor、PA)で濾過した。TFF中の試験サンプルと対照サンプルのパフォーマンスは、物質移動係数によって測定した。物質移動係数は、次の方程式を使用して、各サンプルについて決定した(J.Hung,A.U.Borwankar,B.J.Dear,T.M.Truskett,K.P.Johnston,High concentration tangential flow ultrafiltration of stable monoclonal antibody solutions with low viscosities.J.Memb.Sci.508,113-126 (2016)):
J=kcln(Cw/Cb) (式3)
この実施例では、接線流濾過(tangential flow filtration、TFF)を使用して、カフェインの存在下および非存在下で、ウシガンマグロブリン(BGG)溶液を濃縮した。EMD Millipore(Billerica,MA)製造のラボスケールTFFシステムを使用して実験を行った。システムには、30kDa分子量カットオフのUltracel膜(EMD Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州)を含むPellicon XL TFFカセットを取り付けた。名目膜表面積は、50cm2であった。対照サンプルは、14.6グラムのBGGを、150mMのNaCl、およびpH6に調整された20mMのヒスチジンを含む582mLの緩衝液に溶解することによって、初期BGG濃度が、名目上25.1mg/mLになるように調製した。材料を、0.2μmPESフィルター(VWR、Radnor、PA)で濾過し、次いでTFF装置で処理した。ポンプ速度は、供給圧が最初に30psiになるように調整し、保持液バルブは、保持液の圧力が最初に10psiになるように調整した。ポンプ速度または保持液バルブのいずれかを、4.1時間調整せずに材料を濃縮した。以下の表19に示すように、Bradfordアッセイにより、初期および最終濃度は、それぞれ25.4±0.6および159±6mg/mLと決定された。カフェイン含有サンプルは、14.2gのBGGを、15mg/mLのカフェイン、150mMのNaCl、およびpH6に調整された20mMのヒスチジンを含む566mLの緩衝液に溶解することによって、初期BGG濃度が、名目上25.1mg/mLになるように調製した。材料を、0.2μmPESフィルター(VWR、Radnor、PA)で濾過し、次いでTFF装置で処理した。ポンプ速度と保持液バルブは、以前のものと同一のレベルに設定した。以前と同様に、供給液と保持液の圧力は、それぞれ30psiと10psiであることが確認された。ポンプ速度または保持液バルブのいずれかを、4.1時間調整せずに材料を濃縮した。以下の表19に示すように、Bradfordアッセイにより、初期および最終濃度は、それぞれ24.4±0.5および225±10mg/mLと決定された。TFF処理中にカフェインを使用すると、対照と比較した場合、最終タンパク質濃度が、159から225mg/mLに約42%増加した。
ウシガンマグロブリン(BGG)、L-ヒスチジン、およびカフェインは、Sigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州、各製品番号、G5009、H6034およびC7731)から購入した。脱イオン(DI)水は、EMD Millipore(Billerica,MA)のDirect-Q 3 UV精製システムを使用して、水道水から生成された。0.2μmポアの25mmポリエーテルスルホン(PES)フィルターは、GE Healthcare(Chicago,IL,、カタログ番号6780-2502)から購入した。1-mL Luer-Lokシリンジは、Becton、Dickinson and Company(Franklin Lakes,NJ,reference number 309628)から購入した。20mMのヒスチジン緩衝液(pH6.0)は、L-ヒスチジン、DI水を使用して調製し、1MのHClでpH6.0に滴定した。ヒスチジン緩衝液を使用して、カフェインの15mg/mL溶液を調製した。カフェインを含まない緩衝液およびカフェインを含む緩衝液を使用して、BGGを約280mg/mLの最終濃度に再構成した。タンパク質濃度cは、以下の式を使用して計算した。
4つの精製された研究グレードのバイオシミラー抗体、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブは、Bioceros(Utrecht、オランダ)から購入した。これらは、分注40mMの酢酸ナトリウム水溶液、50mMのトリス塩酸緩衝液(pH5.5)で、それぞれ20、26、15、および23mg/mLのタンパク質濃度の凍結した一定分量として提供された。測定前、タンパク質溶液を室温で解凍し、その後、0.2μmポリエーテルスルホンフィルターを通して濾過した。濾過したタンパク質ストック溶液を、タンパク質ストック溶液と結合緩衝液の比が1:1になるように混合した。プロテインA樹脂への抗体の結合を促進するために使用される結合緩衝液は、脱イオン(DI)水中pH7.2で、0.1Mのリン酸ナトリウムおよび0.15の塩化ナトリウムから構成された。DI水は、EMD Millipore(Billerica,MA)のDirect-Q 3 UV精製システムを使用して、水道水から生成された。これらの溶液は、PIERCE(商標)Protein-A Spin Plate for IgG Screening(ThermoFisher Scientific カタログ#45202)を使用して、プロテインAの結合と溶出の研究を行うために使用された。プレートには96個のウェルがあり、それぞれに50μLのProteinA樹脂が含まれた。200μLの結合緩衝液を各ウェルに加えることによって、樹脂を結合緩衝液で洗浄し、プレートを1000×gで1分間遠心分離し、フロースルー液を廃棄した。その後のすべての遠心分離ステップは、1000×gで1分間行った。この洗浄手順を、もう一度繰り返した。これらの最初の洗浄ステップに続いて、希釈されたタンパク質サンプル、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブを含むサンプルを、プレートのウェルに添加した(ウェルあたり200μL)。次いで、プレートをDaigger Scientific(Vernon Hills、IL)Labgeniusオービタルシェーカー上に置き、260rpmで30分間攪拌し、続いてプレートを遠心分離し、フロースルーを廃棄した。次いで、各ウェルに500μLの結合緩衝液を添加し、プレートを遠心分離し、フロースルーを廃棄することによって、ウェルを洗浄した。この洗浄ステップを、2回繰り返した。これらの洗浄ステップの後、異なる賦形剤が添加された溶出緩衝液を使用して、タンパク質をプレートから溶出した。各溶出について、pH7の1Mのリン酸ナトリウムからなる50μLの中和緩衝液を、コレクションプレートの各ウェルに添加し、次いで200μLの溶出緩衝液を、プレートの各ウェルに添加した。プレートを260rpmで1分間攪拌し、次いで遠心分離した。フロースルーを、分析のために回収した。この溶出ステップを、もう1回繰り返した。賦形剤を含まない対照緩衝液は、20mMのクエン酸を含み、pH2.6であった。プロテインA溶出緩衝液は、しばしばいくらかの量の塩を含むため、クエン酸緩衝液中の100mMのNaClの溶出緩衝液を、二次対照として調製した。
この実施例で使用される試験タンパク質は、実施例27のものと同一であり、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブである。プロテインA結合および溶出の研究は、実施例27のものと同一のプレートを使用して行った。プロテインAプレートから抗体を負荷および溶出する方法は、溶出ステップを除いて、実施例27のものと同一であった。実施例27では、2回の溶出洗浄を行った。しかし、この実施例では、1回の洗浄のみ行った。実施例27のように、溶出緩衝液は、20mMのクエン酸塩(pH2.6)、対照緩衝液から調製された。賦形剤は、以下の表26に記載されている。賦形剤はすべてSigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。実施例27と同一な方法で回収されたタンパク質を、HPLCにより分析し、各タンパク質、すなわち、イピリムマブ、ウステキヌマブ、オマリズマブ、およびトシリズマブのタンパク質回収の結果を、以下の表26~30に示す。
研究グレードのオマリズマブは、Bioceros(ユトレヒト、オランダ)から購入し、40mMの酢酸ナトリウム水溶液、50mMのトリス塩酸緩衝液(pH5.5)中に15mg/mLで凍結して提供された。実験前、タンパク質を室温で解凍し、0.2μmポリエーテルスルホンフィルターで濾過した。濾過した材料を、1:1の比率で、DI水中の20mMリン酸ナトリウム(pH7)からなる結合緩衝液と混合した。水道水は、EMD Millipore(ビレリカ、マサチューセッツ州)のDirect-Q 3 UV精製システムで精製して、DI水を生成した。プロテインA精製は、GE HealthcareのHiTrap Protein-A HPの1mLカラム(シカゴ、イリノイ州、製品番号29048576)を使用して行った。各実験では、最初に、カラムを10mLの結合緩衝液で平衡化した。平衡化後、30mgのタンパク質をProteinAカラムに負荷した。次いで、カラムを5mLの結合緩衝液で洗浄した。カラムを洗浄した後、結合したオマリズマブを、以下の表31に示されている賦形剤を含む溶出緩衝液の1つの画分を使用して、カラムから溶出した。溶出緩衝液は、示された賦形剤を、20mMのクエン酸緩衝液(pH4.0)に溶解することによって調製した。すべての溶出緩衝液を、pH4.0に調整した。5つの1mL画分を収集した。最後に、5mLの100mMクエン酸塩(pH3.0)緩衝液でカラムを洗浄することによって、ProteinAを再生した。各ステップの流速は、1mL/minであり、Fusion 100注入ポンプ(Chemyx、Stafford、TX)で維持した。10mL NormJect Luer Lokシリンジを使用した(Henke Sass Wolf、Tuttlingen、Germany、参照番号4100-000V0)。
製剤は、異なるモル濃度のカフェイン(以下の表32に記載されている濃度で)および試験タンパク質を用いて調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。この実施例の製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、20mMのヒスチジン緩衝液中に調製した。0および80mMのカフェインのストック溶液を、20mMのヒスチジン中に調製し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にした。様々なカフェイン濃度の追加の溶液は、2つのストック溶液をさまざまな容量比で混ぜて調製され、以下の表32に示される濃度で、一連のカフェイン含有溶液を提供した。これらの賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、0.7mLの各賦形剤溶液を、0.25gの凍結乾燥したにBGG粉末に添加することによって、約280mg/mLの最終タンパク質濃度を達成する比率で各試験溶液に溶解した。BGGを含む溶液を、5mLの滅菌ポリプロピレンチューブ中で調合し、オービタルシェーカーテーブル上で100rpmで一晩振盪した。次いで、これらの溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2400rpmで約5分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
水へのカフェインの溶解度を高めるために共溶質として使用された化合物は、Sigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から入手され、ナイアシンアミド、プロリン、プロカインHCl、アスコルビン酸、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、リドカイン、サッカリン、アセスルファムK、チラミン、およびアミノ安息香酸が含まれた。各共溶質の溶液は、乾燥固体を脱イオン水に溶解することで調製し、場合によっては、必要に応じて、pHを、5Mの塩酸または5Mの水酸化ナトリウムで、約6のpHから約8のpHの間の値に調整した。次いで、クラスAのメスフラスコを使用して、溶液を、25mLまたは50mLのいずれかの最終容量に希釈し、溶解した化合物の質量および溶液の最終容量に基づいて濃度を記録した。調製した溶液は、いずれか希釈せずにまたは脱イオン水で希釈して使用した。
周囲温度(約23℃)でのカフェインの溶解度に対する異なる共溶質の影響を、次の方法で評価した。乾燥カフェイン粉末(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)を、20mLガラスシンチレーションバイアルに加え、カフェインの質量を記録した。実施例31に従って調製した10mLの共溶質溶液を、ある場合には、カフェイン粉末に加えた。他の場合では、共溶質溶液と脱イオン水のブレンドを、カフェイン粉末に添加し、最終添加量を10mLに維持した。乾燥カフェイン粉末の体積寄与は、これらの混合物のいずれにおいても無視できるものと見なした。小さな磁気攪拌棒をバイアルに投入し、溶液を、攪拌プレート上で約10分間激しく混合した。約10分後、バイアルで、乾燥カフェイン粉末の溶解が観察され、結果を以下の表33に示す。これらの観察により、ナイアシンアミド、プロカインHCl、2,5-ジヒドロキシ安息香酸ナトリウム塩、サッカリンナトリウム塩、およびチラミンクロリド塩のすべてが、報告されているカフェインの溶解限度(Sigma-Aldrichによれば、室温で約16mg/mL)の少なくとも約4倍に、カフェインの溶解を可能にした。
HUMIRA(登録商標)(AbbVie Inc.、Chicago、IL)は、TNF-アルファ遮断剤である治療用モノクローナル抗体アダリムマブの市販製剤であり、通常、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、中等度から重度の慢性乾癬および若年性特発性関節炎などの自己免疫疾患の炎症反応を減少させるために処方される。HUMIRA(登録商標)は、0.8mLの単回使用用量で販売されており、40mgのアダリムマブ、4.93mgの塩化ナトリウム、0.69mgのリン酸一ナトリウム二水和物、1.22mgのリン酸二ナトリウム二水和物、0.24mgのクエン酸ナトリウム、1.04mgのクエン酸一水和物、9.6mgのマンニトール、および0.8mgのポリソルベート80を含んでいる。この製剤の粘度対濃度プロファイルを、以下の方法で作成した。30kDa分子量カットオフのAmicon Ultra 15遠心濃縮器(EMD-Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州)に約15mLの脱イオン水を満たし、Sorvall Legend RT(ThermoFisher Scientific)で4000rpmで10分間遠心分離して、膜をすすいだ。その後、残留水を除去し、2.4mLのHUMIRA(登録商標)液体製剤を濃縮チューブに添加し、25℃で60分間、4000rpmで遠心分離した。保持液の濃度は、10μLの保持液を1990μLの脱イオン水で希釈し、希釈したサンプルの吸光度を280nmで測定し、希釈係数と1.39mL/mg-cmの吸光係数を使用して濃度を計算した。濃縮サンプルの粘度は、A05チップ(RheoSense、San Ramon、CA)を備えたmicroVisc粘度計を使用して、23℃で250s-1の剪断速度で測定した。粘度測定後、サンプルを少量の濾液で希釈し、濃縮と粘度測定を繰り返した。このプロセスを使用して、以下の表34に示されるように、異なるアダリムマブ濃度で粘度値を生成した。
次の実施例は、HUMIRA(登録商標)を粘度低下賦形剤と緩衝液中で再製剤化することによる、一般的なプロセスを記載する。約0.15gのヒスチジンおよび0.75gのカフェイン(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)を脱イオン水に溶解することによって、20mMのヒスチジン中で粘度低下賦形剤の溶液を調製した。得られた溶液のpHを、5Mの塩酸で約5に調整した。次いで、この溶液を、メスフラスコ中で、脱イオン水で50mLの最終容量に希釈した。得られた緩衝粘度低下賦形剤溶液を、次いで、高mAb濃度でHUMIRA(登録商標)を再製剤化化するために使用した。次に、約0.8mLのHUMIRA(登録商標)を、すすいだAmicon Ultra 15遠心濃縮チューブ(30kDaの分子量カットオフ)に添加し、8~10分間、4000rpmで、25℃でSorvall Legend RTで遠心分離した。その後、上に記載のように調製した約14mLの緩衝粘度低下賦形剤溶液を、遠心濃縮器中の濃縮HUMIRA(登録商標)に添加した。穏やかに混合した後、サンプルを4000rpm、25℃で、約40~60分間遠心分離した。保持液は、粘度低下賦形剤とともに緩衝液中で再製剤化されたHUMIRA(登録商標)の濃縮サンプルであった。サンプルの粘度と濃度を測定し、場合によっては、少量の濾液で希釈して、より低い濃度で粘度を測定した。粘度測定は、前の実施例の濃縮HUMIRA(登録商標)製剤の場合と同様に、microVisc粘度計を用いて完了した。濃度は、脱イオン水で希釈したHUMIRA(登録商標)ストック溶液から作成された標準曲線を使用して、Bradfordアッセイで決定した。粘度低下賦形剤とHUMIRA(登録商標)の再製剤化により、再製剤化されていない市販緩衝液中で濃縮されたHUMIRA(登録商標)の粘度値と比較して、以下の表35に示されるように、30%~60%の粘度低下をもたらした。
カフェイン賦形剤を含む、または含まないアダリムマブ溶液の安定性は、サンプルを2つの異なるストレス条件、撹拌および凍結解凍、に曝露した後に評価した。アダリムマブ薬物製剤HUMIRA(登録商標)(AbbVie)が使用され、実施例33により詳しく記載されている特性を有する。HUMIRA(登録商標)サンプルは、実施例38に記載されているように、元の緩衝液中で200mg/mLのアダリムマブ濃度に濃縮した。この濃縮サンプルを、「サンプル1」と呼ぶ。第二のサンプルは、実施例40に記載されているように、約200mg/mLのアダリムマブおよび15mg/mLの添加カフェインを用いて調製した。カフェインが添加されたこの濃縮サンプルを、「サンプル2」と呼ぶ。次のように、両方のサンプルを希釈剤で希釈して、アダリムマブの最終濃度を1mg/mLにした。サンプル1の希釈剤は、元の緩衝液溶液で、サンプル2希釈剤は、20mMヒスチジン、15mg/mLカフェイン、pH=5である。両方のHUMIRA(登録商標)希釈液を、0.22μmシリンジフィルターで濾過した。層流フード内で、希釈したサンプルごとに、2mLエッペンドルフチューブにそれぞれ300μLの3つのバッチを準備した。サンプルは、以下のストレス条件にさらされた。攪拌の場合、サンプルを、300rpmで91時間、オービタルシェーカーに配置した。凍結解凍の場合、サンプルを、条件ごとに-17~30℃で平均6時間、7回繰り返した。表36に、調製されたサンプルを示す。
Brookhaven Zeta Plus動的光散乱装置を使用して、実施例35のサンプル中のアダリムマブ分子の流体力学的半径を測定し、凝集集団の形成の証拠を探した。表37は、実施例35に従って調製された6つのサンプルのDLS結果を示している。それらのいくつかは(1-A、1-FT、2-A、および2-FT)、ストレス条件にさらされた(「ストレスサンプル」)。その他は(1-Cおよび2-C)、ストレスを受けなかった。表37、および付随する図1、2、および2のDLSデータは、カフェインを含まないストレスサンプルにおけるモノクローナル抗体のマルチモーダルな粒子サイズ分布を示している。賦形剤としてのカフェインの不在下で、ストレスを受けたサンプル1-Aと1-FTは、ストレスを受けていないサンプル1-Cよりも有効径が大きく、さらに、直径が顕著に大きい第2の粒子の集団を示した。より大きな直径を有する粒子のこの新しいグループは、目視不可の粒子への凝集の証拠である。カフェインを含むストレスを受けたサンプル(サンプル2-Aおよび2-FT)は、ストレスを受けていないサンプル2-Cと同様の粒径であり、1つの粒子の集団のみを呈する。これらの結果は、カフェインをこれらのサンプルに添加すると、凝集体または目視不可の粒子の形成が減少したことを示している。
サイズ排除クロマトグラフィを使用して、実施例36に記載されたストレスを受けたおよびストレスを受けていないアダリムマブサンプルから、サイズが約0.1ミクロン未満の目視不可の粒子を検出した。SECを実行するために、ガードカラムを備えたTSKgel SuperSW3000カラム(Tosoh Biosciences、Montgomeryville、PA)を使用し、溶出を280nmでモニターした。実施例36からのストレスを受けたおよびストレスを受けていない各サンプルの合計10μLを、pH6.2の緩衝液(100mMのリン酸、325mMのNaCl)を用いて、0.35mL/分の流速で、均一濃度で溶出した。アダリムマブ単量体の保持時間は、約9分であった。カフェイン賦形剤を含むサンプルでは、検出可能な凝集体は確認されず、3つのサンプルすべての単量体の量は一定のままであった。
モノクローナル抗体のトラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標)、Genentech)は、凍結乾燥粉末として受け取り、DI水で21mg/mLに再構成した。得られた溶液を、Amicon Ultra 4遠心濃縮チューブ(分子量カットオフ、30kDa)で3500rpmで1.5時間遠心分離することによって、そのまま濃縮した。適切な緩衝液でサンプルを200倍に希釈し、1.48mL/mgの吸光係数を使用して280nmで吸光度を測定することによって、濃度を測定した。粘度は、RheoSense microVisc粘度計を使用して測定した。
AVASTIN(登録商標)(モノクローナル抗体ベバシズマブ、Genentechにより市販されている製剤)は、ヒスチジン緩衝液中の25mg/mLの溶液として受け取った。サンプルは、Amicon Ultra 4遠心濃縮チューブ(MWCO 30kDa)で3500rpmで濃縮された。粘度は、RheoSense microViscで測定し、濃度は、280nmでの吸光度で決定した(吸光係数、1.605mL/mg)。賦形剤緩衝液は、25mMのヒスチジンHClとともに10mg/mLのカフェインを添加することによって調製した。AVASTIN(登録商標)ストック溶液を賦形剤緩衝液で希釈し、次いでAmicon Ultra 15遠心濃縮チューブ(MWCO 30kDa)で濃縮した。賦形剤サンプルの濃度は、Bradfordアッセイにより決定し、粘度は、RheoSense microViscを使用して測定した。結果を、以下の表41に示す。
製剤は、賦形剤化合物としてカフェイン、またはカフェインと第2の賦形剤化合物との組み合わせ、および試験タンパク質を使用して調製され、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。このような製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、異なる賦形剤化合物を含む20mMのヒスチジン緩衝液中に調製した。賦形剤の組み合わせ(以下の表42に記載された賦形剤AおよびB)を、20mMのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にした。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、約280mg/mLの最終タンパク質濃度を達成する比率で溶解した。賦形剤溶液中のBGGの溶液を、20mLガラスシンチレーションバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で80~100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで約10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
製剤は、ジメチルスルホン(Jarrow Formulas、Los Angeles、CA)を賦形剤化合物および試験タンパク質として使用して調製し、試験タンパク質は、治療用製剤で使用される治療用タンパク質を模擬するように意図されている。このような製剤は、以下の方法で粘度を測定するために、20mMのヒスチジン緩衝液中に調製した。ジメチルスルホンを、20mMのヒスチジンに溶解し、モデルタンパク質を溶解する前に、得られた溶液のpHを、少量の水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整してpH6にし、次いで0.22ミクロンのフィルターを通して濾過した。賦形剤溶液が調製されたら、試験タンパク質のウシガンマグロブリン(BGG)を、約280mg/mLの濃度で溶解した。賦形剤溶液中のBGGの溶液を、20mLガラスシンチレーションバイアル中に配合し、オービタルシェーカーテーブル上で80~100rpmで一晩振盪させた。次いで、BGG溶液を2mLマイクロ遠心管に移し、IEC MicroMaxマイクロ遠心機で2300rpmで約10分間遠心分離して、粘度測定の前に、混入した空気を除去した。
20mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、50mMのグリシン、35mMのカフェインの緩衝液は、0.392gのMES一水和物、0.374gのグリシン、および0.682gのカフェインを、90mLのMilli-Q超純水に溶解することによって調製した。すべての内容物が溶解した後、溶液のpHを5.5に調整し、メスフラスコにMilli-Q超純水を添加することによって、最終容量を100mLにした。次いで、緩衝液を、ボトルトップフィルター装置を使用して、0.2μmのPESフィルターを通して真空濾過した。20mMのヒスチジン、50mMのグリシン、および35mMのカフェインを含む同様な緩衝液も、同様に調製した。
モノクローナル抗体イピリムマブのサンプルをBioceros(オランダ)から取得し、分子量カットオフ30kDaのAmicon Ultra 15遠心濃縮チューブ(EMD Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州)を使用して、緩衝液を、実施例42の3つの調製された緩衝液に交換した。目標の最終タンパク質濃度は20mg/mLであり、最終濃度は、Synergy HTプレートリーダー(BioTek、ウィヌースキ、バーモント州)を用いて280nmの吸光度(A280)により測定した。タンパク質溶液の吸光度は、ブランク緩衝液の吸光度から差し引いた。ブランクを差し引いたタンパク質溶液の吸光度を、報告されている吸光係数で割り、次いでタンパク質の希釈係数(20倍)を掛けて、最終的なタンパク質濃度を決定する。カフェインは280nmでの吸光度測定に干渉するため、カフェインを含む溶液のタンパク質濃度は、A280で測定されたタンパク質溶液に対する物質収支により決定した。これによって、質量に基づいて測定されたA280タンパク質溶液に近いおよその濃度が得られた。
尿素は、溶液中のタンパク質を変性させ、アンフォールディングさせることが知られている。この実施例のスクリーニング方法論は、ウステキヌマブなどの治療用タンパク質溶液に、特定の濃度の尿素を添加することが含まれていました。この試験例は、保護賦形剤が、尿素の存在下で治療用タンパク質のアンフォールディングを防止または減少させるという仮説に基づいており、アンフォールドしたタンパク質の量を測定することで、尿素の存在下で、タンパク質を安定化させるのに効果的な賦形剤を同定することが可能になる。タンパク質のアンフォールディングを追跡する1つの方法には、Sypro orangeなどの外因性蛍光色素の使用が含まれる。Sypro orangeは、アンフォールドしたタンパク質構造の疎水性領域に結合し、観察される蛍光シグナルの増加につながる。したがって、さまざまな賦形剤の存在下で、アンフォールドしたタンパク質-Sypro orange複合体の蛍光強度の差異を測定すると、安定化の効果を特定することができる。
治療用タンパク質、特に抗体は、処理のさまざまな段階、特に精製およびウイルスの除去の最中に、低pHの溶液条件に曝される。酸性のpH条件へのこの暴露は、コンフォメーションの変化を引き起こし、続いてタンパク質のアンフォールディングと凝集につながる可能性がある。安定化賦形剤を同定するためのスクリーニング方法論には、酸性pHでオマリズマブなどの治療用タンパク質をインキュベートすることが含まれる。保護性の賦形剤は、低pHでの治療用タンパク質の変性を防止または減少させることから、アンフォールドしたタンパク質の量を測定すると、低pHの存在下でタンパク質を安定化させるのに効果的な賦形剤を同定することができる。酸性pHでの治療用タンパク質のアンフォールディングは、Sypro orangeなどの外因性蛍光色素を使用して追跡することができる。この実施例で行ったように、Sypro orange(Thermo-Fisher、Waltham MA)を添加すると、色素がアンフォールドしたタンパク質の疎水性領域に結合し、蛍光シグナルの増加につながる。したがって、異なる賦形剤の存在下で、アンフォールドしたタンパク質-Sypro orangeの蛍光強度の差異を測定すれば、安定剤を特定することができるようになる。
治療用タンパク質は、温度の変動に頻繁にさらされ、三次および二次構造要素の変化につながる可能性がある。これは、タンパク質の凝集につながり、活性な天然タンパク質の量を減少させ得る。熱ストレスから保護する賦形剤は、この実施例において、以下の表47に記載されている賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化研究により特定された。以下の表47に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)またはCayman Chemical(アナーバー、ミシガン州)から入手した。賦形剤のストック溶液は、各賦形剤を100mg/mLの濃度で20mMのヒスチジン緩衝液(pH6.0)に溶解することによって調製した。ヒスチジン緩衝液は、1.55gのヒスチジンを0.500LのMilli-Q水に溶解し、1MのHClを使用してpHを6.0に調整することによって調製した。次いで、各賦形剤調製物(最終濃度が5mg/mL)を、ウステキヌマブ(最終濃度が1mg/mL)と混合することによって、賦形剤を含むタンパク質製剤を調製した。製剤を0.2mLのマイクロ遠心管に一定分量入れ、加熱ブロック内で65℃で120分間インキュベートした。一定分量を0、15、30、60、90、および120分に分取した。サンプルを、氷上で5分間急冷し、5000rpmで10分間遠沈した。次いで、上清を、TSKgel SW3000カラム(30cm x 4.8mm ID)および280nmに設定したAgilent G1351Bダイオードアレイ検出器が装着されたAgilent 1100 HPLCシステムに負荷して、サンプルをサイズ排除HPLCで分析した。50mMのリン酸緩衝液、100mMのNaCl、pH6.5の移動相を、0.35mL/minの流速で使用した。単量体画分は、単量体のピーク面積を積分することによって計算し、積算ピーク面積の変化を、時間の関数としてプロットした。熱安定性は、2時間のインキュベーションの終了時に残留している単量体の割合と相関していた。
治療用タンパク質は、攪拌、攪拌などにより機械的ストレスにさらされることが多く、与えられた剪断ストレスは、タンパク質の凝集を引き起こす可能性がある。剪断ストレスに対する保護を提供する賦形剤は、試験賦形剤(下の表48に列挙されている)の存在下で、治療用タンパク質溶液を攪拌し、凝集した粒子の数の変化を観察することによって特定した。以下の表48に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)またはCayman Chemical(アナーバー、ミシガン州)から入手した。賦形剤のストック溶液は、各賦形剤を100mg/mLの濃度でMilli-Q水に溶解して調製した。次いで、最終濃度が0.5mg/mLの各賦形剤調製物を、最終濃度が2mg/mLのオマリズマブと組み合わせることによって、賦形剤含有タンパク質製剤を調製した。サンプルを0.5mLのクライオジェニックバイアル(ThermoFisher、Waltham、MA)に移し、オービタルシェーカーに固定した。次いで、それらを、300rpmに設定された攪拌で、22℃で72時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、100μLの各サンプルを96ウェルプレートに移し、350nmで吸光度を測定した。凝集の増加は、350nmで光散乱の変化を観察し、それらの変化を、350nmでの対照製剤(賦形剤を添加せずに、試験サンプルと同様に調製された)の光散乱と比較することによって測定した。本質的に保護的である賦形剤は、攪拌ステップ後、凝集の速度を遅くし、A350の吸光度の値を下げるそれらの能力によって特定された。
以下の表49に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)またはCayman Chemical(アナーバー、ミシガン州)から入手した。試験賦形剤のストック溶液(表49に列挙されている)は、各賦形剤を100mg/mLの濃度で20mMのヒスチジン緩衝液(pH6.0)に溶解することによって調製した。緩衝液は、1.55gのヒスチジンを0.500LのMilli-Q水に溶解し、1MのHClを使用してpHを6.0に調整することによって調製した。次いで、最終濃度が5 mg/mLの各賦形剤調製物を、最終濃度が5mg/mLのオマリズマブと組み合わせることによって、賦形剤含有タンパク質製剤を調製した。0.4mLの各製剤を96ウェルポリプロピレンプレート(Advangene、IL)内のウェルに移した。サンプルを、冷凍庫で-80℃に凍結し、室温で少なくとも5サイクル解凍した後、100μLのサンプルを、Greiner CellStarブラックウェル透明フラットボトム96ウェルプレートに移した。賦形剤の安定化の効果は、350nmでの光散乱分析を使用してタンパク質凝集体の形成を測定し、それらの変化を、350nmでの対照製剤(賦形剤を添加せずに、試験サンプルと同様に調製された)の光散乱と比較することによって分析した。本質的に保護的である賦形剤は、攪拌ステップ後、凝集の速度を遅くし、A350の吸光度の値を下げるそれらの能力によって特定された。
賦形剤とタンパク質溶液の配合に使用するために、20mMのヒスチジン塩酸(His HCl)緩衝液のストック溶液は、3.1gのヒスチジン(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)をタイプ1の超純水に溶解することによって調製した。得られた溶液を、1Mの塩酸を滴下することによってpH6に滴定した。pH調整後、緩衝液を、メスフラスコ中で、タイプ1超純水で1Lの最終容量に希釈した。以下の表50に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)またはCayman Chemical(アナーバー、ミシガン州)から入手した。
Bioceros(オランダ)から取得したバイオシミラーモノクローナル抗体オマリズマブとウステキヌマブを、pH6の20mMのHis HCl緩衝液に緩衝液交換し、分子量カットオフ30kDaのAmicon Ultra 15遠心濃縮チューブ(EMD Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州)を使用して濃縮した。得られた濃縮製剤は、濃縮製剤を20mMのHis HClで段階希釈し、100μLの各希釈液をUV透明96ハーフウェルマイクロプレート(Greiner Bio-One、オーストリア)に負荷して、Synergy HTプレートリーダー(BioTek、ウィヌースキ、バーモント州)で280nmの吸光度を測定することによって、タンパク質濃度について280nmの吸光度によって、分析した。次いで、ブランクの光路長補正された吸光度測定値を、それぞれの吸光係数で割り、希釈係数を掛けて、タンパク質濃度を決定した。賦形剤溶液は、20mMのHisHCl(pH6)に望ましい最終濃度の10Xで、または化合物の溶解度限度で調製し、必要に応じて、濃塩酸または水酸化ナトリウムで、pHを6に調整した。次いで、濃縮タンパク質製剤を、384ウェルマイクロプレート(Aurora Microplates、ホワイトフィッシュ、モンタナ州)に、以下の表51に列挙されている賦形剤の、10X賦形剤溶液(9部のタンパク質、1部の賦形剤溶液または緩衝液)と混合した。以下の表51に列挙されている、この実施例で使用されたすべての賦形剤は、最高の純度であり、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)またはCayman Chemical(アナーバー、ミシガン州)から入手した。各サンプルは同じ容量で希釈されているため、各サンプル中のタンパク質濃度は同じである。次いで、マイクロプレートを、Sorvall Legend RT遠心分離機で400×gで遠心分離し、プレートシェーカーで振盪した。振盪後、2μLの20mMのHis HCl中のポリエチレングリコール表面修飾金ナノ粒子(nanoComposix、サンディエゴ、カリフォルニア州)の5倍希釈液を、各サンプルウェルに加えた。マイクロプレートをもう一度振盪して、サンプルに金ナノ粒子を混合し、次いでDynaPro II DLSプレートリーダー(Wyatt Technology Corp.、ゴレタ、カリフォルニア州)に配置して、金ナノ粒子の見かけの粒子サイズを25℃で測定した。水中の金ナノ粒子の既知の粒子サイズに対する、タンパク質製剤中の金ナノ粒子の見かけの粒子サイズの比を使用して、Stokes-Einstein方程式に従って、タンパク質製剤の粘度を決定した。この実施例では、金ナノ粒子の実際の半径に対する見かけの半径の比に、25℃での水の粘度を掛けて、センチポアズ(cP)でのタンパク質製剤の粘度を計算した。これらのテストの結果は、以下の表51にまとめられている。
REMICADE(登録商標)インフリキシマブは、Clinigen Groupから入手し、Janssen添付文書の指示に従って再構成し、50mg/mlのスクロースおよび0.05mg/mLのポリソルベート80を含む5mMのリン酸緩衝液(約pH7)中の10mg/mLのインフリキシマブ溶液を得た。次いで、再構成された薬剤製品を、50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)と1:1の容量で混合した。次いで、得られた溶液を、小規模の分取スケール陽イオン交換カラム(GE Healthcare、Chicago、IL)に注入した。インフリキシマブをカラムに負荷した後、カラムを10カラム容量の50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)で洗浄した。次いで、インフリキシマブを、5カラム容量の250mM塩化ナトリウム、50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)を用いてカラムから溶出した。次いで、溶出したインフリキシマブを、分子量カットオフ30kDaのAmicon Ultra 15(EMD Millipore、ビレリカ、マサチューセッツ州)遠心濃縮器を使用して、pH7の20mMリン酸緩衝液に緩衝液交換した。次いで、pH7の20mMリン酸緩衝液中の4または8mg/mLインフリキシマブのストック溶液を、その後の試験で使用した。
ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)は、Genex Formulas(オーランド、フロリダ州)から購入した栄養サプリメントカプセルから収集され、イタコン酸は、Sigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。これらの物質は、以下の実験において賦形剤として使用された。
4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-エタンスルホン酸(HEPES)、ジサイクロミン塩酸塩、プリジノールメタンスルホン酸、1-ブチルイミダゾール、1-ヘキシルイミダゾールはSigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入し、本実施例では、賦形剤溶液を調製するのに使用した。O-(オクチルホスホリル)コリンは、1Mの溶液としてSigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入し、本実施例では、ストック賦形剤溶液として使用した。
この実施例では、賦形剤のストック溶液を調製するために、次の薬剤:塩化テトラエチルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、1-メチルイミダゾール、1-ブチルイミダゾール、1-ヘキシルイミダゾール、2-エチルイミダゾール、2-メチルイミダゾール、およびスペクチノマイシンを使用し、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。トリグリシン、テトラグリシン、および2-ブチルイミダゾールは、Chem-Impex(Wood Dale、IL)から購入した。ホルデニンHClは、Bulk Supplements(Henderson、NV)から購入した。
治療用タンパク質は、温度の変動にさらされることが多く、その三次および二次構造要素の変化につながる可能性がある。これは、タンパク質の凝集、および活性な天然種の減少につながる。熱ストレスから保護する賦形剤は、賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化の研究で試験された。賦形剤ストックは、以下の表56に列挙される賦形剤を、100mg/mLの濃度で20mMヒスチジン緩衝液、pH6.0に溶解することにって調製した(実施例52に記載されるように調製)。各試験サンプルは、賦形剤ストックを、緩衝液に添加して、賦形剤の最終濃度が5mg/mLになるようにし、ヒスチジン緩衝液中のウステキヌマブストックを20mg/mLから最終濃度の1mg/mLへとタンパク質を希釈することによって(実施例51に記載のように調製される)調製した。製剤を、0.2mLマイクロ遠心管に一定分量入れ、ヒートブロック内で65℃で120分間インキュベートした。一定分量を、0分、30分、60分、90分、120分で回収した。次いで、サンプルを氷上で5分間急冷し、9000rpmで10分間遠沈した。これに続いて、上清のサンプルを、以下のように、SE-HPLCで分析した:TSKgel SW3000サイズ排除クロマトグラフィカラム(30cm x 4.8mm ID)および280nmでモニターするAgilent G1351Bダイオードアレイ検出器が装着されたAgilent 1100 HPLCシステムに、上清を負荷した。0.5%のリン酸、150mMのNaCl、pH3.5の移動相を、0.35mL/minの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算した。熱安定性は、2時間のインキュベーションの最後に残留している単量体の分率と相関関係があり、対照(添加剤なし)と比較した単量体のパーセント増加を記録した。試験した7つの賦形剤の結果を、以下の表56にまとめる。
抗体薬物複合体(ADC)は、小分子薬物の部位特異的送達を可能にする化学リンカーを介した、モノクローナル抗体への小分子の結合によって生成される治療用タンパク質である。結合リンカーと小分子の組み合わせは、そのタンパク質前駆体と比較して、ADCの化学的および物理的性質(電荷、疎水性など)を変更し、追加の安定性の懸念をもたらす。実施例59のウステキヌマブ-FITC化合物を、これらの試験のモデルADC化合物として使用した。モデルADCを熱ストレスから保護する賦形剤は、賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化の研究で試験された。賦形剤ストックは、以下の表57に列挙される賦形剤を、100mg/mLの濃度で20mMヒスチジン緩衝液、pH6.0に溶解することにって調製した(実施例52に記載されるように調製)。各試験サンプルは、賦形剤ストックを緩衝液に最終濃度が5mg/mLになるように添加し、ヒスチジン緩衝液中のウステキヌマブ-FITC(下記の実施例59に記載)をウステキヌマブ-FITCの最終濃度が1mg/mLになるように添加することによって調製した。製剤を、0.2mLマイクロ遠心管に一定分量入れ、ヒートブロックで65℃で120分間インキュベートした。一定分量を、0分、30分、60分、90分、120分で回収した。次いで、サンプルを氷上で5分間急冷し、9000rpmで10分間遠沈した。サンプルを、SE-HPLCで分析し、上清をTSKゲルSW3000サイズ排除クロマトグラフィカラム(30cm x 4.8mm ID)とAgilent G1351Bダイオードアレイ検出器を280nmでモニターしたAgilent 1100 HPLCシステムに負荷した。0.5%のリン酸、150mMのNaCl、pH3.5の移動相を、0.35mL/minの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算し、対照(賦形剤なし)と比較したパーセント単量体の増加を記録した。熱安定性は、2時間のインキュベーションの終了時に残留している単量体の割合と相関していた。
治療用タンパク質は、動態安定性を改善し、タンパク質の凝集や活性な天然種の減少につながり得る構造的摂動を最小限に抑えるために、しばしば低温で維持される。ある場合は、これは、製剤を使用するまで凍結することによってなされるかもしれない。しかし、凍結と解凍を繰り返す間の、低温、濃度勾配、および氷の形成は、タンパク質にストレスを与える可能性がある。熱ストレスから保護する賦形剤を、賦形剤の存在下または不在下での熱劣化研究によって試験し、特定した。賦形剤ストックは、実施例52に記載されるように調製し、20mMのヒスチジン緩衝液、pH6.0に1Mの濃度で、以下の表58に列挙される賦形剤を溶解することによって調製した。各試験サンプルは、賦形剤ストックを、賦形剤の最終濃度が100mMになるように添加し、ヒスチジン緩衝液(実施例50に記載されているように調製)中のウステキヌマブストックを20mg/mLから最終濃度の2mg/mLへとタンパク質を希釈することによって調製した。対照も同じ方法で調製したが、添加剤ストックを加えなかった。次いで、製剤を、0.5mLのクリオバイアルに一定分量入れ、-80℃で120分間凍結した。次いで、室温に保たれた水浴を使用して、サンプルを解凍した。この凍結-解凍サイクルを6回繰り返した後、各サンプルを、0.2mLマイクロ遠心管に一定分量入れ、9000rpmで10分間遠沈した。上清を、TSKゲルSW3000サイズ排除クロマトグラフィカラム(30cm x 4.8mm ID)および280nmでモニタ-するAgilent G1351Bダイオードアレイ検出器が装着されたAgilent 1100 HPLCシステムに負荷して、サンプルをSE-HPLCで分析した。0.5%のリン酸、150mMのNaCl、pH3.5の移動相を、0.35mL/minの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算した。
熱ストレスから保護する賦形剤は、賦形剤の存在下または非存在下での熱劣化の研究で試験された。賦形剤ストックは、実施例52に記載されるように調製し、20mMのヒスチジン緩衝液、pH6.0に1Mの濃度で、以下の表59に列挙される賦形剤を溶解することによって調製した)。各試験サンプルは、賦形剤を、最終濃度が100mMになるように添加し、ヒスチジン緩衝液中のウステキヌマブストックを20mg/mLから最終濃度の2mg/mLへとタンパク質を希釈することによって調製した。対照も同じ方法で調製したが、添加剤ストックを加えなかった。1mLの各サンプルを、2mLガラスバイアル(West Pharmaceutical Services、PA)に一定分量入れ、40℃で4週間インキュベートした。一定分量を、0、1、2、3、および4週間後に回収した。上清を、TSKgel SW3000サイズ排除クロマトグラフィカラム(30cm x 4.8mm ID)および280nmでモニターするAgilent G1351Bダイオードアレイ検出器が装着されたAgilent 1100 HPLCシステムに負荷して、サンプルをSE-HPLCで分析した。0.5%のリン酸、150mMのNaCl、pH3.5の移動相を、0.35mL/minの流速で使用した。単量体画分は、単量体ピーク下のピーク面積を積分し、時間の関数としてプロットされた積算ピーク面積の変化によって計算した。熱安定性は、4週間のインキュベーションの終了時に残留している単量体の割合と相関していた。
抗体薬物複合体(ADC)を代表するモデル化合物を、次のように合成した。ウステキヌマブは、40mMの酢酸ナトリウム水溶液、50mMのトリスHCl緩衝液(pH5.5)中にmAb濃度が26mg/mLの凍結アリコートとして、Bioceros(Utrecht、オランダ)から購入した。サンプルを、pH9.2の炭酸緩衝液に緩衝液交換し、次いで無水ジメチルスルホキシドに溶解した5等量のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)とインキュベートして、ウステキヌマブの等量あたり1.6等量のFITCを取り込んだ。ウステキヌマブに対するFITCの平均モル比は、280nmでの吸光度(タンパク質+FITCを表す)および495nmでの吸光度(FITCを表す)を測定することによって決定した。計算では、280nmでのmAbの吸光係数として1.61L/g.cm、mAbのMWとして148,600、および495nmでのFITCの吸光係数として68,000L/g.cmを使用した。過剰の未反応FITCは、pH6の20mMのヒスチジン緩衝液を用いた透析により除去した。次に、MWCOが30kDaのAmicon遠心管を使用して、サンプルを15mg/mLに濃縮した。
実施例59のADCモデル化合物を、pH6の20mMヒスチジン緩衝液(実施例52に記載されているように調製)でmAb濃度を1mg/mLに希釈した。以下の表60に列挙されている添加賦形剤を用いてサンプルを調製し、モデルADC化合物を機械的剪断応力から保護するそれらの能力をテストした。23℃で72時間、300rpmでシェーカーテーブルに配置して、サンプルに機械的ストレスを加えた。溶液にストレスを加えた後、ADC複合体の粒子サイズを動的光散乱によって決定した。剪断後の対照サンプルの粒子半径は143nmであり、ストレスを受けていないサンプル(半径5.5nm)と比較して有意な凝集を示している。賦形剤を含むサンプルは、ストレスを受けていない対照サンプル(半径5.5nm)と比較して、粒子半径の有意な増加を示さず、機械的剪断応力に対する保護効果を示した。結果を、以下の表60に示す。
25mMのヒスチジン緩衝液、pH6は、0.387gのヒスチジンをMilli-Qタイプ1水に溶解し、塩酸でpH6に滴定し、Milli-Q水で最終容量の100mLに希釈することによって調製した。次いで、緩衝液を使用して、50mMの共溶質溶液を調製し、以下の賦形剤:安息香酸ナトリウム、1-メチル-2-ピロリドン、プロリン、フェニルアラニン、アルギニン一塩酸、ベンジルアルコール、およびニコチンアミド、を使用した。約0.1gのカフェインを、得られた各溶液の一定分量の5mLに溶解して、カフェイン濃度を20mg/mLにした。異なる容量比の共溶質を含む20mg/mLのカフェインと、賦形剤溶液を含むがカフェインを含まない対応する溶液を、96ウェルマイクロプレートに3重に調製し、すべてのケースで総ウェル容量を300μLに維持した。次いで、得られたマイクロプレートを、マイクロプレートテープで密封し、温度を2~5℃の範囲に維持して冷蔵庫で保存した。保存の過程で、ウェル内の沈殿の証拠についてマイクロプレートを目視で観察した。各条件について、最も早く観察された3つのウェルの沈殿を記録し、結果を以下の表61にまとめる。
20mMのヒスチジン-HCl pH6.0(His HCl)のストック緩衝液溶液は、1.55gのヒスチジン(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)をタイプ1超純水に溶解することによって調製した。内容物を完全に溶解させ、塩酸溶液を使用して、pHを6.0に調整した。pH調整後、メスフラスコで最終容量を0.5Lにした。すべての賦形剤は、His HClに溶解し、10x濃度(1M)または化合物の溶解限度で調製した。賦形剤溶液のpHを測定し、必要に応じてpH6.0に調整した。
本発明の特定の実施形態が本明細書で開示されてきたが、上記の明細書は例示的であり、限定的ではない。本発明は、その好ましい実施形態を参照して特に示され説明されてきたが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細においてそれに様々な変更を加え得ることが当業者によって理解される。本明細書を検討すれば、本発明の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される、反応条件、成分の量などを表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、特に明記しない限り、本明細書に記載される数値パラメータは、本発明より得られようと求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
本発明の態様として以下のものが挙げられる。
項1
治療用タンパク質および安定性改善量の安定化賦形剤を含む安定性強化製剤であって、前記安定化賦形剤を欠いている以外は前記安定性強化製剤と同一である対照製剤と比較して、改善された安定性パラメータを特徴とする、安定性強化製剤。
項2
前記治療用タンパク質が、抗体である、項1に記載の安定性強化製剤。
項3
前記抗体が、抗体薬物複合体である、項2に記載の安定性強化製剤。
項4
前記安定化賦形剤が、ヒンダードアミン化合物である、項1に記載の安定性強化製剤。
項5
前記安定化賦形剤が、アニオン性芳香族化合物である、項1に記載の安定性強化製剤。
項6
前記安定化賦形剤が、官能化アミノ酸化合物である、項1に記載の安定性強化製剤。
項7
前記安定化賦形剤が、オリゴペプチドである、項1に記載の安定性強化製剤。
項8
前記安定化賦形剤が、短鎖有機酸である、項1に記載の安定性強化製剤。
項9
前記安定化賦形剤が、低分子量ポリ酸である、項1に記載の安定性強化製剤。
項10
前記安定化賦形剤が、ジオン化合物またはスルホン化合物である、項1に記載の安定性強化製剤。
項11
前記安定化賦形剤が、双性イオン化合物である、項1に記載の安定性強化製剤。
項12
前記安定化賦形剤が、水素結合性元素を有するクラウディング剤である、項1に記載の安定性強化製剤。
項13
前記安定化賦形剤が、約1mM~約500mMの量で添加される、項1に記載の安定性強化製剤。
項14
前記安定化賦形剤が、約5mM~約250mMの量で添加される、項13に記載の安定性強化製剤。
項15
前記安定化賦形剤が、約10mM~約100mMの量で添加される、項14に記載の安定性強化製剤。
項16
前記安定化賦形剤が、約5mg/mL~約50mg/mLの量で添加される、項15に記載の安定性強化製剤。
項17
前記改善された安定性パラメータが、熱保存安定性である、項1に記載の安定性強化製剤。
項18
前記熱保存安定性が、約10℃~30℃の温度で改善される、項17に記載の安定性強化製剤。
項19
前記改善された安定性パラメータが、改善された凍結/解凍安定性である、項1に記載の安定性強化製剤。
項20
前記改善された安定性パラメータが、改善された剪断安定性である、項1に記載の安定性強化製剤。
項21
前記製剤が、前記対照製剤と比較して、減少した粒子数を有する、項1に記載の安定性強化製剤。
項22
前記製剤が、前記対照製剤と比較して、改善された生物学的活性を有する、項1に記載の安定性強化製剤。
項23
治療用製剤の安定性を改善する方法であって、安定性改善量の安定化賦形剤を前記治療用製剤に添加し、それによって前記治療用製剤の前記安定性を改善することを含み、前記治療用製剤の前記安定性は、前記安定化賦形剤を欠いている以外は前記治療用製剤と同一である対照製剤の安定性と比較して、測定される、方法。
項24
前記安定化賦形剤が、ヒンダードアミン、アニオン性芳香族化合物、官能化アミノ酸、オリゴペプチド、短鎖有機酸、低分子量ポリ酸、ジオン、スルホン、双性イオン化合物、および水素結合性元素を有するクラウディング剤からなる群から選択される、項23に記載の方法。
項25
前記対照製剤の前記安定性と比較して、前記治療用製剤の前記安定性を測定する前記ステップが、安定性関連パラメータを測定することを含む、項23に記載の方法。
項26
前記安定性関連パラメータが、熱保存安定性、凍結/解凍安定性、および剪断安定性からなる群から選択される、項25に記載の方法。
項27
前記治療用製剤が、治療用タンパク質を含む、項23に記載の方法。
項28
前記治療用タンパク質が抗体である、項27に記載の方法。
項29
前記抗体が、抗体薬物複合体である、項28に記載の方法。
項30
タンパク質関連プロセスのパラメータを改善する方法であって、前記タンパク質関連プロセスのキャリア溶液に安定性改善量の安定化賦形剤を添加することを含み、前記キャリア溶液が目的のタンパク質を含み、それによって前記パラメータを改善する、方法。
項31
前記パラメータが、タンパク質生成のコスト、タンパク質生成の量、タンパク質生成の速度、およびタンパク質生成の効率からなる群から選択される、項30に記載の方法。
項32
前記目的のタンパク質が、治療用タンパク質である、項31に記載の方法。
Claims (11)
- 治療用タンパク質および粘度低下量のホルデニンを含む液体製剤であって、治療用タンパク質は抗体であり、かつ前記製剤の粘度は、対照製剤の粘度よりも少なくとも30%低くかつ100cP未満であり、前記対照製剤は、前記ホルデニンを含まないが、それ以外は前記製剤と乾燥重量ベースで同一である、液体製剤。
- 前記抗体が、抗体薬物複合体である、請求項1に記載の製剤。
- 前記ホルデニンが、1mM~500mMの量で添加される、請求項1に記載の製剤。
- 前記ホルデニンが、5mM~250mMの量で添加される、請求項3に記載の製剤。
- 前記ホルデニンが、10mM~100mMの量で添加される、請求項4に記載の製剤。
- 前記ホルデニンが、5mg/mL~50mg/mLの量で添加される、請求項5に記載の製剤。
- 治療用タンパク質を含む液体治療用製剤の粘度を低下させる方法であって、治療用タンパク質は抗体であり、前記方法は、粘度低下量のホルデニンを前記製剤に添加し、それによって前記製剤の粘度を、対照製剤の粘度に比べて少なくとも30%だけ低下させることを含み、前記製剤の粘度は、100cP未満であり、前記対照製剤は、前記ホルデニンを含まないが、それ以外は前記製剤と乾燥重量ベースで同一である、方法。
- 前記抗体が、抗体薬物複合体である、請求項7に記載の方法。
- 前記製剤の粘度は、対照製剤の粘度よりも少なくとも30%低い、請求項1に記載の製剤。
- 前記製剤の粘度は、50cP未満である、請求項1に記載の製剤。
- 前記製剤は、少なくとも200mg/mLの抗体を含む、請求項1に記載の製剤。
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