KR102572453B1 - 단백질 가공 처리를 위한 부형제 화합물 - Google Patents

단백질 가공 처리를 위한 부형제 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 폴리산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 점도-강하용 부형제 화합물을 제공하는 단계; 및 대상 단백질을 포함하는 단백질-관련 공정을 위한 담체 용액에 점도-강하용 부형제 화합물을 점도-강하용 함량으로 첨가하는 단계를 포함하는, 단백질-관련 공정의 파라미터를 개선하는 방법, 및 대상 단백질이 용해된 액체 매질과 점도-강하용 부형제를 포함하며, 점도-강하용 부형제가 존재하는 것을 제외하고는 담체 용액과 실질적으로 동일한 대조군 용액 보다 점도가 낮은, 담체 용액을 개시한다.

Description

단백질 가공 처리를 위한 부형제 화합물
관련 출원
본 출원은 2017년 2월 16일자 미국 가출원번호 62/459,893에 대한 혜택을 주장한다. 상기 미국 가출원의 전체 내용은 원용에 의해 본원에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 바이오폴리머의 전달 및 가공 처리를 위한 제제에 관한 것이다.
바이오폴리머는 치료 또는 비-치료 목적으로 사용될 수 있다. 항체 또는 효소 제제와 같은 바이오폴리머-소재 치료제는 질환을 치료하는데 널리 사용된다. 효소, 펩타이드 및 구조 단백질과 같은 비-치료적 바이오폴리머는 가정, 영양, 산업 및 공업 용도와 같은 비-치료적 용도로 유용성을 가진다.
치료 용도로 사용되는 바이오폴리머는 질환을 치료하기 위해 체내 도입을 허용하도록 제제화되어야 한다. 예를 들어, 특정 상황에서, 항체 및 단백질/펩타이드 바이오폴리머 제제는, 정맥내 (IV) 주입에 의한 투여보다는, 피하 (SC) 또는 근육내 (IM) 경로에 의해 전달하는 것이 유익하다. 보다 우수한 환자 순응성 및 SC 또는 IM 주입 편의성을 달성하기 위해, 시린지의 액체 부피는 전형적으로 2 내지 3 cc로 제한되며, 통상적인 의학 장치 및 소구경 바늘을 사용해 제제를 전달할 수 있도록 제제의 점도는 전형적으로 약 20 센티푸아즈 (cP) 미만이어야 한다. 이런 전달 파라미터가 늘 전달되는 제제에 대한 투여 요건에 잘 맞는 것은 아니다.
항체는, 예를 들어, 의도한 치료 효과를 발휘하도록 고 용량 수준으로 전달되어야 할 수 있다. 한정된 액체 부피를 이용해 항체를 고 용량 수준으로 전달하기 위해서는, 제제는 전달 비히클 내 항체의 농도가 높아야 할 수 있으며, 종종 150 mg/mL 수준을 초과할 수도 있다. 이러한 용량 수준에서는, 단백질 용액의 점도 대 농도 곡선이 선형-비선형 전이를 지나, 농도 증가에 따라 제제의 점도는 현저하게 높아진다. 그러나, 높은 점도는 표준 SC 또는 IM 전달 시스템에 적합하지 않다. 바이오폴리머-소재 치료제의 용액은 또한 침전, 혼탁, 유백광, 변성 및 겔 형성, 가역적인 또는 비가역적인 응집과 같은 안정성 문제를 일으키기 쉽다. 안정성 문제는 용액의 저장 수명을 제한하거나 또는 특수 취급을 요한다.
주입용 단백질 제제를 제조하기 위한 한가지 방법은 치료 단백질 용액을 SC 또는 IM 전달에 적합한 현탁액을 제조하도록 재구성할 수 있는 분말로 변환하는 방법이다. 동결건조가 단백질 분말을 제조하기 위한 표준 기술이다. 냉동-건조, 분무 건조 및 심지어 석출 후 초 임계 유체 추출 (super-critical-fluid extraction) 역시 향후 재구성하기 위한 단백질 분말 제조에 사용되어 왔다. 분말 현탁액은 (총 용량이 동일한 용액과 비교해) 재-용해 전 점도가 낮으며, 따라서 입자가 바늘을 통과할만큼 충분히 작은 한, SC 또는 IM 주입에 적합할 수 있다. 그러나, 분말 형태로 존재하는 단백질 결정이 면역 반응을 촉발할 수 있는 고유한 위험성이 있다. 재-용해 후 불확실한 단백질 안정성/활성도 추가적인 문제를 일으킨다. 단백질 분말 현탁액에 의해 생기는 문제를 회피하면서도 치료 목적으로 저 점성의 단백질 제제를 제조하는 기술이 당해 기술 분야에 여전히 요구된다.
전술한 단백질의 치료 용도 외에도, 효소, 펩타이드 및 구조 단백질과 같은 바이오폴리머는 비-치료 용도로 사용될 수 있다. 이러한 비-치료적 바이오폴리머는 다수의 여러 경로로 생산할 수 있으며, 예를 들어, 식물 소스, 동물 소스로부터 전달되거나 또는 세포 배양물로부터 생산될 수 있다.
비-치료 단백질은 과립 또는 분말 물질로서 또는 용액으로서 또는 통상적으로 수중 분산물로서 제조, 이동, 저장 및 취급될 수 있다. 비-치료 용도의 바이오폴리머는 구형 또는 섬유성 단백질일 수 있으며, 이러한 물질의 특정 형태가 수용해성을 제한할 수 있거나 또는 용해시 고 점성을 나타낼 수 있다. 이러한 용액 특성은 비-치료 물질의 제제화, 취급, 보관, 펌핑 및 성능에 문제를 일으킬 수 있으며, 그래서 비-치료 단백질 용액의 점도를 낮추고 용해성과 안정성을 개선하기 위한 방법이 필요한 실정이다.
단백질은 복잡한 바이오폴리머로서, 각각 고유하게 접히는 3D 구조와 표면 에너지 맵 (소수성/친수성 영역 및 전하)을 가지고 있다. 농축 단백질 용액의 경우, 이들 거대분자는 이들의 실제 형태 및 표면 에너지 분포에 따라 복합적인 방식으로 강하게 상호작용할 수 있으며, 심지어 상호-고정 (inter-lock)될 수 있다. 강하고 특이적으로 상호작용하는 "핫-스팟"들이 단백질 클러스터링을 유발하여, 용액의 점도를 증가시킨다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 국소 상호작용 및 클러스터링을 지연함으로써 용액의 점도를 낮추고자 수종의 부형제 화합물들이 바이오치료 (biotherapeutic) 제제에 사용된다. 이러한 시도는 개별적으로, 종종 경험적으로 조정되며, 때때로 인 실리코 시뮬레이션 (in silico simulation)을 통해 진행된다. 부형제 화합물들로 된 조합이 제공될 수도 있지만, 이러한 조합의 최적화는 다시 경험적으로, 사례별로 진행되어야 한다.
당해 기술 분야에서는 비-선형 조건 하 소정의 농도에서 단백질 제제의 점도를 낮추기 위한 진정한 보편적인 접근법을 여전히 필요로 하고 있다. 또한, 당해 기술 분야에서는 단백질 활성은 유지하면서도 이러한 점도 강하를 달성하기 위한 추가적인 요구도 존재한다. 또한, 조정가능한 지속 방출 (sustained release) 프로파일을 가진 제제에 사용하고, 데포 주입 (depot injection)에 적합한 제제에 사용하기 위해, 점도-강하 시스템을 개조하는 것이, 요망될 것이다. 또한, 단백질 및 그외 바이오폴리머의 제조 공정의 개선이 요망된다.
본 발명은, 구현예에서, 단백질; 및 힌더드 아민 (hindered amine), 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 폴리산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 부형제 화합물을 포함하며, 부형제 화합물이 점도-강하용 함량 (viscosity-reducing amount)으로 첨가되는, 액체 제제에 관한 것이다. 구현예에서, 단백질은 페길화된 (PEGylated) 단백질이고, 부형제는 저분자량 지방족 폴리산이다. 구현예에서, 제제는 약학적 조성물이고, 치료 제제는 치료 단백질을 포함하며, 부형제 화합물은 약제학적으로 허용가능한 부형제 화합물이다. 구현예에서, 제제는 비-치료 제제이고, 비-치료 제제는 비-치료 단백질을 포함한다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 제제의 점도를 대조군 제제의 점도 보다 낮게 낮춘다. 구현예에서, 제제의 점도는 대조군 제제의 점도에 대해 적어도 약 10% 미만이거나, 또는 대조군 제제의 점도에 대해 적어도 약 30% 미만이거나, 또는 대조군 제제의 점도에 대해 적어도 약 50% 미만이거나, 또는 대조군 제제의 점도에 대해 적어도 약 70% 미만이거나, 또는 대조군 제제의 점도에 대해 적어도 약 90% 미만이다. 구현예에서, 점도는 약 100 cP 미만, 또는 약 50 cP 미만, 또는 약 20 cP 미만, 또는 약 10 cP 미만이다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <5000 Da, 또는 <1500 Da, 또는 <500 Da의 분자량을 가진다. 구현예에서, 제제는 단백질을 적어도 약 25 mg/mL로 포함하거나, 또는 단백질을 적어도 약 100 mg/mL로 포함하거나, 또는 단백질을 적어도 약 200 mg/mL로 포함하거나, 또는 단백질을 적어도 약 300 mg/mL로 포함한다. 구현예에서, 제제는 부형제 화합물을 약 5 mg/mL 내지 약 300 mg/mL로 포함하거나, 또는 부형제 화합물을 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL로 포함하거나, 또는 부형제 화합물을 약 20 mg/mL 내지 약 100 mg/mL로 포함하거나, 또는 부형제 화합물을 약 25 mg/mL 내지 약 75 mg/mL로 포함한다. 구현예에서, 제제는 대조군 제제와 비교해 개선된 안정성을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 힌더드 아민이다. 구현예에서, 힌더드 아민은 카페인, 테오필린, 티라민, 프로카인, 리도카인, 이미다졸, 아스파르탐, 사카린 및 아세설팜 포타슘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 힌더드 아민은 카페인이다. 구현예에서, 힌더드 아민은 국소 주사용 마취제 화합물이다. 힌더드 아민은 독립적인 약리학적 특성을 가질 수 있으며, 힌더드 아민은 제제에 독립적인 약리학적 효과를 가진 양으로 존재할 수 있다. 구현예에서, 힌더드 아민은 제제에 치료학적 유효량 보다 적은 양으로 존재할 수 있다. 독립적인 약리학적 활성은 국소 마취 활성일 수 있다. 구현예에서, 독립적인 약리학적 활성을 가진 힌더드 아민은 제제의 점도를 추가로 낮추는 제2 부형제와 조합된다. 제2 부형제 화합물은 카페인, 테오필린, 티라민, 프로카인, 리도카인, 이미다졸, 아스파르탐, 사카린 및 아세설팜 포타슘으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구현예에서, 제제는 보존제, 계면활성제, 당 (sugars), 다당류, 아르기닌, 프롤린, 히알루로니다제, 안정화제 및 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 포유류에 액체 치료 제제를 투여하는 것을 포함하며; 치료 제제가 치료 단백질을 치료학적 유효량으로 포함하고; 제제가 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 폴리산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 부형제 화합물을 더 포함하고; 치료 제제가 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인, 질환 또는 장애를 포유류에서 치료하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 치료 단백질은 페길화된 단백질이고, 부형제 화합물은 저분자량 지방족 폴리산이다. 구현예에서, 부형제는 힌더드 아민이다. 구현예에서, 힌더드 아민은 국소 마취제 화합물이다. 구현예에서, 제제는 피하 주입 또는 근육내 주입 또는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 치료 제제에 점도-강하용 함량으로 존재하며, 점도-강하용 함량은 치료 제제의 점도를 대조군 제제의 점도 보다 낮게 감소시킨다. 구현예에서, 치료 제제는 대조군 제제와 비교해 개선된 안정성을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 본질적으로 순수한 물질이다.
또한, 본 발명은, 액체 치료 제제를 주입에 의해 투여하는 것을 포함하며; 치료 제제가 치료 단백질을 치료학적 유효량으로 포함하고; 제제가 국소 주사용 마취제 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용가능한 부형제 화합물을 더 포함하고; 약제학적으로 허용가능한 부형제 화합물이 점도-강하용 함량으로 제제에 첨가되고; 포유류에서 대조군 치료 제제를 투여한 경우와 비교해 부형제 화합물을 포함하는 치료 제제를 투여할 경우에 경험하는 통증을 감소시키며; 대조군 치료 제제가 부형제 화합물을 포함하지 않고 그 외에는 치료 제제와 동일한 것인, 필요한 포유류에서 치료 단백질의 주입 부위에서 통증을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 구현예에서, 치료 단백질; 및 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 폴리산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 부형제 화합물을 포함하는 단백질 액체 제제를 제조하는 단계를 포함하며; 단백질 액체 제제가 대조군 단백질 액체 제제와 비교해 개선된 안정성을 나타내고; 대조군 단백질 액체 제제가 부형제 화합물을 함유하지 않으며 그외에는 단백질 액체 제제와 동일한 것인, 단백질 액체 제제의 안정성을 개선하는 방법에 관한 것이다. 액체 제제의 안정성은 저온 저장 환경 안정성 (cold storage conditions stability), 실온 안정성 또는 승온된 온도 안정성 (elevated temperature stability)일 수 있다.
또한, 본 발명은, 구현예에서, 단백질; 및 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 폴리산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 부형제 화합물을 포함하는 액체 제제에 관한 것으로서, 제제 내 부형제 화합물의 존재는 단백질 확산 상호작용 파라미터 kD 또는 제2 바이러스 계수 (second virial coefficient) B22에 의해 측정되는 바와 같이 단백질-단백질 상호작용을 개선하는 특징을 발생시킨다. 구현예에서, 제제는 치료 제제이며, 이는 치료 단백질을 포함한다. 구현예에서, 제제는 비-치료 제제이고, 이는 비-치료 단백질을 포함한다.
또한, 본 발명은, 구현예에서, 전술한 액체 제제를 제공하는 단계 및 이를 가공 처리 방법에 사용하는 단계를 포함하는 단백질-관련 공정을 개선하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 가공 처리 방법은 여과, 펌핑, 믹싱, 원심분리, 막 분리, 동결건조 또는 크로마토그래피를 포함한다. 구현예에서, 가공 처리 방법은 세포 배양물 수확, 크로마토그래피, 바이러스 불활성화 및 여과로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 가공 처리 방법은 크로마토그래피 공정 또는 여과 공정이다. 구현예에서, 여과 공정은 바이러스 여과 공정 또는 한외여과/정용여과 공정이다.
또한, 본 발명은, 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 단쇄 유기산, 저분자량 지방족 폴리산, 및 다이온 및 설폰으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제 화합물을 포함하는 점도-강하용 부형제 첨가제를 제공하는 단계, 및 대상 단백질을 포함하는 단백질-관련 공정을 위한 담체 용액에 하나 이상의 부형제 화합물을 점도-강하용 함량으로 첨가하는 단계를 포함하며 이로써 파라미터가 개선되는, 단백질-관련 공정의 파라미터를 개선하는 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 파라미터는 단백질 제조 단가, 단백질 생산량, 단백질 생산율 및 단백질 생산 효율로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 파라미터는 프록시 파라미터 (proxy parameter)일 수 있다. 구현예에서, 단백질-관련 공정은 상류 처리 공정이다. 상류 처리 공정을 위한 담체 용액은 세포 배양 배지 (cell culture medium)일 수 있다. 구현예에서, 담체 용액이 세포 배양 배지일 경우, 부형제 첨가제를 담체 용액에 첨가하는 단계는 부형제 첨가제를 보충 배지 (supplemental medium)에 첨가하여 부형제-함유 보충 배지를 제조하는 제1 하위 단계, 및 부형제-함유 보충 배지를 세포 배양 배지에 첨가하는 제2 하위 단계를 포함한다. 다른 구현예들에서, 단백질-관련 공정은 하류 처리 공정이다. 하류 공정은 크로마토그래피 공정일 수 있으며, 크로마토그래피 공정은 단백질-A 크로마토그래피 공정일 수 있다. 구현예에서, 크로마토그래피 공정은 대상 단백질을 회수하며, 대상 단백질은 대조군 용액과 비교해 순도 개선, 수율 개선, 입자 크기 감소, 미스폴딩 감소 또는 응집 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질-관련 파라미터의 개선을 특징으로 한다. 구현예에서, 개선되는 단백질-관련 파라미터는 크로마토그래피 공정으로부터 대상 단백질의 회수율 개선이다. 다른 구현예들에서, 단백질-관련 공정은 여과, 주입, 시린징 (syringing), 펌핑, 믹싱, 원심분리, 막 분리 및 동결건조로 이루어진 군으로부터 선택되며, 선택되는 공정은 대조군 공정과 비교해 물리력 (force) 소모가 낮을 수 있다. 구현예에서, 단백질-관련 공정은 세포 배양 공정, 세포 배양물 수확 공정, 크로마토그래피 공정, 바이러스 불활성화 공정 및 여과 공정으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 단백질-관련 공정은 바이러스 불활성화 공정이며, 바이러스 불활성화 공정은 pH 약 2.5 내지 약 5.0의 수준에서 수행되거나, 또는 바이러스 불활성화 공정은 대조군 공정 보다 높은 pH에서 수행된다. 다른 구현예들에서, 단백질-관련 공정은 여과 공정이다. 여과 공정은 바이러스 제거 여과 공정 또는 한외여과/정용여과 공정일 수 있다. 여과 공정은 여과-관련 파라미터 개선을 특징으로 할 수 있다. 여과-관련 파라미터의 개선은 대조군 용액 보다 빠른 여과 속도일 수 있다. 여과-관련 파라미터의 개선은 응집된 단백질의 양이 대조군 여과 공정에 의해 발생되는 응집된 단백질 양과 비교해 적게 생기는 것일 수 있다. 여과-관련 파라미터의 개선은 물질 이동 효율 (mass transfer efficiency)이 대조군 여과 공정의 물질 이동 효율 보다 높은 것일 수 있다. 여과-관련 파라미터의 개선은 타겟 단백질의 농도 또는 수율이 대조군 여과 공정에 의해 달성되는 타겟 단백질의 농도 또는 수율 보다 높은 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 점도-강하용 부형제 첨가제가 2 이상의 부형제 화합물을 포함하는, 전술한 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 하나 이상의 부형제 화합물은 힌더드 아민이다. 구현예에서, 하나 이상의 부형제 화합물은 카페인, 사카린, 아세설팜 포타슘, 아스파르탐, 테오필린, 타우린, 1-메틸-2-피롤리돈, 2-피롤리디논, 니아신아미드 및 이미다졸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 하나 이상의 부형제 화합물은 카페인, 타우린, 니아신아미드 및 이미다졸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 하나 이상의 부형제 화합물은 음이온성 방향족 부형제이고, 일부 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제는 4-하이드록시벤젠설폰산일 수 있다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 하나 이상의 부형제 화합물 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이거나, 또는 점도-강하용 함량은 하나 이상의 부형제 화합물 약 1 mM 내지 약 400 mM이거나, 또는 점도-강하용 함량은 약 2 mM 내지 약 150 mM의 함량이다. 구현예에서, 담체 용액은 보존제, 당, 다당류, 아르기닌, 프롤린, 계면활성제, 안정화제 및 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 포함한다. 구현예에서, 대상 단백질은 치료 단백질이고, 치료 단백질은 재조합 단백질일 수 있거나, 또는 단일클론 항체, 다클론 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 페길화된 단백질, 항체-약물 접합체, 합성 폴리펩타이드, 단백질 단편, 지단백질, 효소 및 구조 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 구현예에서, 본 방법은 담체 용액에 제2 점도-강하용 부형제를 첨가하는 단계를 더 포함하며, 제2 점도-강하용 부형제를 첨가하는 단계는 파라미터를 추가적으로 개선한다.
또한, 본 발명은, 대상 단백질이 용해된 액체 매질 및 점도-강하용 첨가제를 포함하는 담체 용액에 관한 것으로, 담체 용액은 대조군 용액과 비교해 낮은 점도를 가진다. 담체 용액은 보존제, 당, 다당류, 아르기닌, 프롤린, 계면활성제, 안정화제 및 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부가적인 물질을 더 포함할 수 있다.
도 1은 치료 단백질, 예를 들어 단일클론 항체를 제조하기 위한 발효 공정 ("상류 공정")의 단계들을 나타낸 블럭도이다.
도 2는 치료 단백질, 예를 들어 단일클론 항체를 제조하기 위한 정제 공정 ("하류 공정")의 단계들을 나타낸 블럭도이다.
본 발명은, 단백질 농축 용액의 전달을 가능하게 할 수 있는 제제 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 구현예에서, 본원에 기술된 방법은, 전통적인 단백질 용액과 비교해, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질을 보다 낮은 점도의 액체 제제 또는 보다 높은 농도의 액체 제제로 만들 수 있다. 구현예에서, 본원의 방법은 전통적인 단백질 용액과 비교해 안정성이 개선된 액체 제제를 만들 수 있다. 안정한 제제는, 함유된 단백질이 물리적 및 화학적 안정성과, 저온 저장 환경, 실온 환경 또는 승온된 저장 환경이든 간에, 저장 환경에서 저장시 이의 치료학적 또는 비-치료학적 효능을 실질적으로 유지하는, 것이다. 유익하게는, 안정한 제제는 또한 제제에 용해된 단백질의 응집 또는 석출을 방지하는 보호를 제공할 수 있다. 예를 들어, 저온 저장 환경은 냉장고 또는 냉동고에서의 저장을 수반할 수 있다. 일부 예에서, 저온 저장 환경은 10℃ 이하의 온도에서의 저장을 수반할 수 있다. 부가적인 예에서, 저온 저장 환경은 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서의 저장을 수반한다. 다른 예에서, 저온 저장 환경은 약 4℃의 온도에서의 저장을 수반한다. 부가적인 예에서, 저온 저장 환경은 약 -20℃ 이하와 같은 동결 온도에서의 저장을 수반한다. 다른 예에서, 저온 저장 환경은 약 -20℃ 내지 약 0℃의 온도에서의 저장을 수반한다. 실온 저장 환경은 주위 온도, 예를 들어 약 10℃ 내지 약 30℃에서의 저장을 수반할 수 있다. 승온된 저장 환경은 일정 온도 보다 높은 온도에서의 저장을 수반할 수 있다. 승온된 온도에서의 안정성, 예를 들어, 약 30℃ 내지 50℃ 온도에서의 안정성은 전형적인 주위 (10-30℃) 조건에서 장기 저장을 예측하기 위한 가속화된 에이징 실험의 일부로서 이용될 수 있다.
용액 내 단백질은 얽힘 (entanglement)을 형성하는 경향이 있어, 단백질의 치료학적 또는 비-치료학적 효능을 방해하고 얽힌 체인들의 병진 이동성 (translational mobility)을 제한할 수 있다는 것은, 고분자 과학 및 공학 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 구현예에서, 본원에 기술된 부형제 화합물은 용액 내 부형제 화합물과 타겟 단백질 간의 특이적인 상호작용으로 인한 단백질 클러스터링을 억제할 수 있다. 본원에 기술된 부형제 화합물은 천연 또는 합성 물질일 수 있으며, 바람직하게는 FDA에서 지정한 일반적으로 안전한 물질 ("GRAS")로 인정되는 물질이다.
1. 정의
본원의 목적에서, 용어 "단백질"은 전형적으로 1-3000 kD 분자량을 가진 개별 3차 구조를 형성하기에 충분한 체인 길이를 가진 아미노산 서열을 의미한다. 일부 구현예에서, 단백질의 분자량은 약 50-200 kD이고; 다른 구현예에서, 단백질의 분자량은 약 20-1000 kD 또는 약 20-2000 kD이다. 용어 "단백질"과 대비하여, 용어 "펩타이드"는 개별 3차 구조를 가지지 않는 아미노산 서열을 의미한다. 매우 다양한 바이오폴리머가 용어 "단백질" 범위에 포함된다. 예를 들어, 용어 "단백질"은, 항체, 앱타머, 융합 단백질, 페길화된 단백질, 합성 폴리펩타이드, 단백질 단편, 지단백질, 효소, 구조 펩타이드 등을 비롯한, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질을 지칭할 수 있다.
비-제한적인 예로서, 치료 단백질은 호르몬 및 프로호르몬 (예, 인슐린 및 프로인슐린, 글루카곤, 칼시토닌, 갑상선 호르몬 (T3 또는 T4 또는 갑상선-자극 호르몬), 부갑상선 호르몬, 여포-자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자 등); 응고 및 항-응고 인자 (예, 조직 인자, 본 빌레브란드 인자 (von Willebrand's factor), 팩터 VIIIC, 팩터 IX, 단백질 C, 플라스미노겐 활성인자 (유로키나제, 조직-타입 플라스미노겐 활성인자), 트롬빈); 사이토카인, 케모카인 및 염증 매개인자; 인터페론; 콜로니-자극 인자; 인터루킨 (예, IL-1 ~ IL-10); 성장인자 (예, 혈관 내피 성장인자, 섬유모세포 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 형질전환 성장인자, 신경영양 성장인자, 인슐린-유사 성장인자 등); 알부민; 콜라겐 및 엘라스틴; 조혈 인자 (예, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴 등); 골유도 인자 (osteoinductive factor) (예, 골 형태형성 단백질); 수용체 (예, 인테그린, 카드헤린 등); 표면 막 단백질; 수송 단백질; 조절 단백질; 항원 단백질 (예, 항원으로서 작용하는 바이러스성 성분); 및 항체와 같은, 포유류 단백질을 포함할 수 있다. 본원에서 용어 "항체"는, 가장 넓은 의미로 사용되며, 비-제한적인 예로, 단일클론 항체 (예, 면역글로불린 Fc 영역을 가진 전장 항체), 단쇄 분자, 2중 특이성 및 다중 특이성 항체, 다이아바디, 항체-약물 접합체, 다중 에피토프 특이성을 가진 항체 조성물, 다클론 항체 (예, 면역-약화 환자에게 치료제로서 사용되는 다클론 면역글로불린), 항체 단편 (예, Fc, Fab, Fv 및 F(ab')2)을 포함하는 의미로 사용된다. 또한, 항체는 "면역글로불린"으로 지칭될 수 있다. 항체는 생물학적으로 중요한 물질인 특이 단백질 또는 비-단백질 "항원"을 겨냥하는 것으로 이해되며; 환자에게 항체를 치료학적 유효량으로 투여하면 항원과 복합체를 형성하여, 환자에서 치료학적 효과가 발휘되도록 생물학적 특성을 변형할 수 있다.
구현예에서, 단백질은 페길화되며, 즉, 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG") 및/또는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG") 유닛을 포함하는 것을 의미한다. 페길화된 단백질 또는 PEG-단백질 접합체는, 용해성, 약동학, 약력학, 면역원성, 신장 청소 및 안정성과 같은 유익한 특성으로 인해, 치료학적 용도로서의 용도를 가진다. 페길화된 단백질의 비-제한적인 예로는 페길화된 인터페론 (PEG-IFN), 페길화된 항-VEGF, PEG 단백질 접합체 약물, 아다겐 (Adagen), 페가스파가제 (Pegaspargase), 페그필그라스팀 (Pegfilgrastim), 페글로티카제 (Pegloticase), 페그비소만트 (Pegvisomant), 페길화된 에포에틴-β 및 세르톨리주맵 페골 (Certolizumab pegol)이 있다.
페길화된 단백질은, 하나 이상의 반응성 관능기를 가진 PEG 시약과 단백질의 반응 등의 다양한 방법으로, 합성할 수 있다. PEG 시약 상의 반응성 관능기가 라이신, 히스티딘, 시스테인 및 N-말단과 같은 타겟 단백질 부위에서 단백질과 연결을 형성할 수 있다. 전형적인 페길화 시약은, 단백질 상의 타겟화된 아미노산 잔기에 대해 특이적인 반응성을 가진, 알데하이드, 말레이미드 또는 숙신이미드 기와 같은 반응성 관능기를 가진다. 페길화된 시약은 PEG 및/또는 PPG 반복 유닛 약 1 내지 약 1000개로 된 PEG 체인 길이를 가질 수 있다. 다른 페길화 방법은, 단백질을 먼저 당화한 다음 당화된 잔기를 제2 단계에서 페길화하는, 글리코-페길화를 포함한다. 일부 페길화 공정은 시알릴트랜스퍼라제 및 트랜스글루타미나제와 같은 효소의 도움을 받아 진행된다.
페길화된 단백질은 천연의 비-페길화된 단백질에 비해 치료학적 이점을 제공할 순 있지만, 이러한 물질은 정제, 용해, 여과, 농축 및 투여를 어렵게 하는 물리적 또는 화학적 특성이 있을 수 있다. 단백질의 페길화는 천연 단백질과 비교해 용액의 점도를 더 높게 만들 수 있으므로, 일반적으로 페길화된 단백질 용액 제제는 보다 낮은 농도이어야 한다.
단백질 치료제는 최소 주사 부피로 환자에게 투여할 수 있도록 안정적이고 점도가 낮은 용액으로 제제화하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 약물의 피하 (SC) 또는 근육내 (IM) 주사는 일반적으로 작은 주입 부피, 바람직하게는 2 mL 미만이어야 한다. SC 및 IM 주사 경로는 자가-투여 관리에 매우 적합하며, 이는 비용이 적게 들고, 직접적인 의학적 감독 하에서만 수행되는 정맥내 (IV) 주사와 비교해 접근성이 보다 용이한 치료 형태이다. SC 또는 IM 주사용 제제는, 치료 용액이 게이지가 작은 바늘을 통해 쉽게 통과할 수 있도록, 용액의 점도가 낮아야 하며, 일반적으로 30 cP 미만, 바람직하게는 20 cP 미만이어야 한다. 작은 주사 부피와 저 점도의 조합은 SC 또는 IM 주사 경로에 페길화된 단백질 치료제를 사용하는데 문제를 제기한다.
치료 효능을 가진 단백질은 "치료 단백질"로 지칭될 수 있으며; 치료 단백질을 치료학적 유효량으로 포함하는 제제는 "치료 제제"로 지칭될 수 있다. 또한, 치료 제제에 함유된 치료 단백질은 이의 "단백질 활성 성분"으로 지칭될 수 있다. 전형적으로, 치료 제제는 단백질 활성 성분을 치료학적 유효량으로, 그리고 부형제를, 다른 선택 성분과 더불어 또는 다른 선택 성분 없이 포함한다. 본원에서, 용어 "치료"는 기존 장애의 치료 및 장애의 예방 둘다를 포함한다. 치료 단백질로는 예를 들어 베박시주맵 (bevacizumab), 트라스투주맵 (trastuzumab), 아달리무맵 (adalimumab), 인플릭시맵 (infliximab), 에타너셉트 (etanercept), 다르베포에틴 알파 (darbepoetin alfa), 에포에틴 알파 (epoetin alfa), 세투시맵 (cetuximab), 필그라스팀 (filgrastim) 및 리툭시맵 (rituximab)과 같은 단백질을 포함한다. 그외 치료 단백질은 당해 기술 분야의 당업자들에게 익숙할 것이다.
"치료"는, 장애의 증상의 개시 예방 또는 지연 및/또는 장애의 증상의 완화 또는 개선을 비롯하여, 장애를 치유, 치료, 완화, 개선, 구제 또는 유익하게 작용하도록 의도된 모든 조치를 포함한다. 치료가 필요한 환자는 특정 장애를 이미 앓고 있는 환자, 그리고 장애 예방이 필요한 환자 둘다를 포함한다. 장애는 급성 또는 만성 질환 등의 포유류의 항상성 웰빙에 영향을 미치는 임의 병태, 또는 급성 또는 만성 질환에 포유류를 취약하게 만드는 병리학적 병태이다. 장애에 대한 비-제한적인 예로는, 암, 대사 장애 (예, 당뇨병), 알레르기성 장애 (예, 천식), 피부 장애, 심혈관 장애, 호흡 장애, 혈액 장애, 근골격 장애, 염증성 또는 류마티스성 장애, 자가면역 장애, 위장 장애, 비뇨기계 장애, 생식 장애 (sexual and reproductive disorder), 신경 장애 등이 있다. 치료 목적에서, 용어 "포유류"는 인간, 가축, 애완 동물, 농장 동물, 스포츠 동물, 작업 동물 등을 비롯하여 포유류로서 분류되는 임의 동물을 지칭할 수 있다. "치료"는 따라서 수의학적 치료 및 인간 치료 둘다를 포함할 수 있다. 편의상, 이러한 "치료"가 진행 중인 포유류는 "환자"로 지칭될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 자궁 내 태아 동물 등의 모든 연령의 환자일 수 있다.
구현예에서, 치료는 필요한 포유류에게 치료 제제를 치료학적 유효량으로 제공하는 것을 포함한다. "치료학적 유효량"은, 관련 장애의 예방 또는 기존 장애의 치료를 달성하기 위한 (이러한 치료 또는 예방은 "치료학적 개입"임), 필요한 포유류에게 투여되는 치료 단백질의 적어도 최소 농도이다. 치료 제제에 활성 성분으로서 함유될 수 있는 다양한 치료 단백질의 치료학적 유효량은 당해 기술 분야에서 익숙할 수 있거나; 또는 이후 치료학적 개입에 적용되거나 또는 개발될 치료 단백질의 경우, 치료학적 유효량은, 통상적인 실험 범위내에서 당해 기술 분야의 당업자에 의해 수행되는 표준 기법에 의해 결정될 수 있다.
가정, 영양, 상업 및 공업적인 용도 등의 비-치료학적 목적 (즉, 치료를 수반하지 않는 목적)으로 사용되는 단백질은 "비-치료 단백질"로 지칭될 수 있다. 비-치료 단백질을 함유한 제제는 "비-치료 제제"로 지칭될 수 있다. 비-치료 단백질은 식물 소스, 동물 소스로부터 유래하거나 또는 세포 배양으로부터 생산할 수 있으며; 또한, 이는 효소 또는 구조 단백질일 수 있다. 비-치료 단백질은 촉매, 인간 및 동물 영양분, 가공 보조제, 클리너 및 폐기물 처리와 같이 가정, 영양, 상업 및 공업적인 용도로 사용될 수 있다.
비-치료학적 바이오폴리머의 주요 카테고리는 효소이다. 효소는 다수의 비-치료학적 용도, 예를 들어 촉매로서, 인간 및 동물의 영양 성분으로서, 가공 보조제로서, 클리너로서 및 폐기물 처리제로서 비-치료학적 용도를 가진다. 효소 촉매는 다양한 화학 반응을 가속화하기 위해 사용된다. 비-치료학적 용도의 효소 촉매의 예로는 카탈라제 (catalase), 옥시도리덕타제, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제 및 리가제 등이 있다. 효소의 인간 및 동물의 영양 측면에서의 용도로는, 기능성 식품 (nutraceutical), 단백질의 영양원, 미량영양소의 킬레이트화 또는 제어된 전달, 소화 보조제 및 보충제 등이 있으며; 이는 아밀라제, 프로테아제, 트립신, 락타제 등으로부터 유래될 수 있다. 효소 가공 보조제는 제빵, 양조, 발효, 쥬스 가공 및 와인 제조와 같은 공정에서 식품 및 음료 생산물의 제조를 개선하는데 사용된다. 이들 식품 및 음료 가공 보조제의 예로는 아밀라제, 셀룰라제, 펙티나제, 글루카나제, 리파제 및 락타제 등이 있다. 또한, 효소는 바이오 연료 제조에 사용될 수 있다. 바이오 연료용 에탄올은, 예를 들어, 셀룰로스 물질 및 리그노셀룰로스 물질과 같은 바이오매스 원료를 효소 분해함으로써, 지원될 수 있다. 이러한 원료 물질에 셀룰라제 및 리그니나제를 처리하면 바이오매스를 연료로 발효할 수 있는 물질로 변환된다. 그외 상업적인 용도로, 효소는 세탁, 식기 세척, 표면 세척 및 장비 세척 용도의 디터전트, 클리너, 얼룩 제거 보조제 (stain lifting aid)로서 사용된다. 이러한 목적에 전형적인 효소로는 프로테아제, 셀룰라제, 아밀라제 및 리파제 등이 있다. 또한, 비-치료학적 효소는 셀룰라제를 이용한 직물 연화, 가죽 가공, 폐기물 처리, 오염된 퇴적물 처리, 수 처리, 펄프 표백 및 펄프 연화 및 해리 (debonding)와 같은 다양한 상업적인 및 공업적인 공정에 사용된다. 이러한 목적에 전형적인 효소는 아밀라제, 자일라나제 (xylanase), 셀룰라제 및 리그니나제이다.
비-치료학적 바이오폴리머에 대한 다른 예로는 케라틴, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로인, 액틴, 튜불린 또는 이들의 가수분해된, 분해된 또는 유도체화된 형태 등의 섬유성 또는 구조 단백질 등이 있다. 이들 물질은 젤라틴, 아이스크림, 요거트 및 컨팩션과 같은 식품 성분의 제조 및 배합에 사용되며; 증점제로서, 유변성 개질제, 식감 개선제 및 영양 단백질의 소스로서 식품에 첨가된다. 코스메틱 및 퍼스널 케어 산업에서, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴 및 가수분해된 케라틴은 피부 관리 및 모발 관리 제품에 구성성분으로서 널리 사용된다. 비-치료학적 바이오폴리머에 대한 또 다른 예는 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민 및 혈청 알부민과 같은 유장 단백질이다. 이들 유장 단백질은 낙농 작업 (dairy operation)의 부산물로서 대량 생산되며, 다양한 비-치료학적 용도로 사용되고 있다.
2. 측정
구현예에서, 본원에 기술된 단백질-함유 제제는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 분석으로 측정된 바와 같이 모노머 감소 (monomer loss)에 저항성을 나타낸다. 본 발명의 SEC 분석에서, 주요 분석물 피크는 일반적으로 제제에 함유된 타겟 단백질에 의한 것이며, 이 단백질의 주 피크는 모노머 피크로 지칭된다. 모노머 피크는, 응집된 상태 (이량체, 삼량체, 올리고머 형태 등) 또는 단편화된 상태와는 반대되는, 타겟 단백질, 예를 들어 모노머 상태의 단백질 활성 성분의 양을 나타낸다. 모노머 피크 면적은 타겟 단백질과 관련된 모노머, 응집된 형태 및 단편 형태의 피크들의 총량과 비교할 수 있다. 즉, 단백질-함유 제제의 안정성은 경과 시간 (elapsed time) 후 모노머의 상대적인 함량에 의해 관찰할 수 있으며; 본 발명의 단백질-함유 제제의 안정성 개선은, 따라서, 부형제를 포함하지 않는 대조군 제제내 모노머 %와 비교해, 일정 경과 시간 후 더 높은 모노머 %로서 측정될 수 있다.
구현예에서, 이상적인 안정성은 SEC 분석에 의한 측정시 모노머 피크가 98 내지 100%인 것이다. 구현예에서, 본 발명의 단백질-함유 제제의 안정성 개선은, 대조군 제제를 동일한 스트레스 조건에 노출하였을 때 부형제 비-함유 대조군 제제의 모노머 %와 비교해, 스트레스 조건에 노출된 후 더 높은 모노머 %로서 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기 노출, 기포 노출, 전단 조건 (shear condition) 노출 또는 동결/해동 사이클 노출일 수 있다.
구현예에서, 본원에 기술된 단백질-함유 제제는 동적 광 산란 (DLS) 분석에 의한 측정시 단백질 입자 크기 증가에 저항성을 나타낸다. 본원에서, DLS 분석에서, 단백질-함유 제제 내 단백질의 입자 크기는 중간값 입자 직경 (median particle diameter)으로 관찰할 수 있다. 이상적으로는, 타겟 단백질의 중간값 입자 직경은, 응집 (이량체, 삼량체, 올리고머 등) 또는 단편화된 상태가 아닌, 모노머 상태의 활성 성분을 나타내는 것이므로, DLS 분석을 실시하였을 때 상대적으로 변동되지 않아야 한다. 증가된 중간값 입자 직경은 응집된 단백질을 나타내는 것일 수 있다. 즉, 단백질-함유 제제의 안정성은 경과 시간 후 중간값 입자 직경의 상대적인 변화에 의해 관찰할 수 있다.
구현예에서, 본원에 기술된 단백질-함유 제제는 동적 광 산란 (DLS) 분석에서 측정되는 바와 같이 다분산 입자 크기 분포를 형성하는데 저항성을 나타낸다. 구현예에서, 단백질-함유 제제는 콜로이드형 단백질 입자들의 단분산 입자 크기 분포를 포함할 수 있다. 구현예에서, 이상적인 안정성 결과는 제제의 초기 중간값 입자 직경과 비교해 중간값 입자 직경의 변화율이 10% 미만인 것이다. 구현예에서, 본 발명의 단백질-함유 제제의 안정성 개선은, 부형제 비-함유 대조군 제제에서의 중간값 입자 직경과 비교해, 일정한 경과 시간 후 중간값 입자 직경의 낮은 변화율 %로서 측정될 수 있다. 구현예에서, 본 발명의 단백질-함유 제제의 안정성 개선은, 스트레스 조건에 노출 후 중간값 입자 직경의 변화율 %가, 동일한 스트레스 조건에 노출된 부형제 비-함유 대조군 제제에서의 중간값 입자 직경의 변화율 %와 비교해, 적은 것으로 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기 노출, 기포 노출, 전단 환경에의 노출 또는 냉동/해동 사이클 노출일 수 있다. 구현예에서, 본 발명의 단백질-함유 제제 치료 제제의 안정성 개선은, DLS에 의한 측정시, 다분산 입자 크기 분포가, 동일한 스트레스 조건에 노출시켰을 때, 부형제 비-함유 대조군 제제에서의 입자 크기 분포의 다분산성과 비교해, 낮은 것으로서 측정될 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 단백질-함유 제제는 혼탁도, 광 산란 및/또는 입자 계수 분석에 의해 측정되는 바와 같이 석출에 저항성을 나타낸다. 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 분석에서, 낮은 값은 일반적으로 제제에 현탁된 입자의 개수가 더 적다는 것을 의미한다. 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 증가는, 타겟 단백질의 용액이 안정하지 않다는 것을 의미할 수 있다. 즉, 단백질-함유 제제의 안정성은 경과 시간 후 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수의 상대적인 결과에 의해 관찰할 수 있다. 구현예에서, 이상적인 안정성 결과는 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 값이 낮고 비교적 일정한 것이다. 구현예에서, 본 발명의 단백질-함유 제제의 안정성 개선은, 일정 시간 경과 후, 부형제 비-함유 대조군 제제의 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 값들과 비교해, 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수가 더 낮은 것으로 측정될 수 있다. 구현예에서, 본원에 기술된 단백질-함유 제제의 안정성 개선은, 스트레스 조건에 노출된 후, 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수가, 동일한 스트레스 조건에 노출된 부형제 비-함유 대조군 제제의 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수와 비교해, 낮은 것으로, 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기 노출, 기포 노출, 전단 환경에의 노출 또는 냉동/해동 사이클 노출일 수 있다.
3. 치료 제제
일 측면에서, 본원에 기술된 제제 및 방법은, 치료학적 유효량으로 치료 단백질과 부형제 화합물을 포함하는, 점도 개선 또는 감소된 안정한 액체 제제를 제공한다. 구현예에서, 제제는 활성 성분을 허용가능한 농도로, 그리고 허용가능한 점도를 제공하면서 동시에 안정성을 개선할 수 있다. 구현예에서, 제제는 대조군 제제와 비교해 안정성 개선을 제공하며; 본원의 목적에서, 대조군 제제는 부형제 화합물이 결핍된 것을 제외하고는 건조 중량 기준으로 치료 제제와 모든 방식으로도 동일한 단백질 활성 성분을 함유한 제제이다. 구현예에서, 단백질 함유 제제의 안정성 개선은, 대조군 제제와 비교해, 용해성 응집물, 미립자, 육안으로 보이지 않는 입자 (subvisible particle) 또는 겔 형태의 %가 낮은 경우에서이다.
단백질 액체 제제의 점도는, 비-제한적인 예로, 단백질 자체 (예, 효소, 항체, 수용체, 융합 단백질 등)의 특성; 이의 크기, 3차원 구조, 화학 조성 및 분자량; 제제 내 이의 농도; 제제의 단백질 이외의 구성성분; 바람직한 pH 범위; 제제의 저장 조건; 및 환자에의 제제의 투여 방법 등의, 다양한 인자들이 영향을 미칠 수 있다. 본원에 기술된 부형제 화합물과 함께 사용하기 가장 적합한 치료 단백질은, 바람직하게는, 본질적으로 순수하며, 즉 오염 단백질이 없다. 구현예에서, "본질적으로 순수한" 치료 단백질은, 조성물 내 치료 단백질과 오염 단백질의 총 중량을 기준으로, 치료 단백질을 90 중량% 이상, 또는 바람직하게는 95 중량% 이상, 또는 더 바람직하게, 99 중량% 이상으로 포함하는 단백질 조성물이다. 명확하게 하기 위해, 부형제로서 첨가되는 단백질은 이 정의에 포함되는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기술된 치료 제제는 약제-등급의 제제, 즉, 단백질 활성 성분의 원하는 치료학적 효과가 달성될 수 있는 형태로, 투여될 제제가 포유류에 독성인 구성성분을 함유하지 않고, 포유류를 치료하는데 사용하기 위한 용도의 제제로서, 사용하는 것으로 의도된다.
구현예에서, 치료 제제는 단백질 활성 성분을 25 mg/mL 이상으로 포함한다. 다른 구현예들에서, 치료 제제는 단백질 활성 성분을 100 mg/mL 이상으로 포함한다. 다른 구현예들에서, 치료 제제는 단백질 활성 성분을 200 mg/mL 이상으로 포함한다. 치료 제제 용액은 단백질 활성 성분을 300 mg/mL 이상으로 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 부형제 화합물은 치료 제제에 약 5 내지 약 300 mg/mL의 함량으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 10 내지 약 200 mg/mL의 함량으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 20 내지 약 100 mg/mL의 함량으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 부형제는 약 25 내지 약 75 mg/mL의 함량으로 첨가될 수 있다.
다양한 분자량의 부형제 화합물은, 제제에 단백질 활성 성분과 조합 사용되었을 때의 특별한 유익한 특성들을 위해, 선택된다. 부형제 화합물을 포함하는 치료 제제의 예들은 아래에 제공된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <5000 Da의 분자량을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <1000 Da의 분자량을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <500 Da의 분자량을 가진다.
구현예에서, 본원에 기술된 부형제 화합물은 점도-강하용 함량으로 치료 제제에 첨가된다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 10% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이며; 본원의 목적에서, 대조군 제제는 부형제 화합물이 없는 것을 제외하고는 건조 중량 기준으로 치료 제제와 모든 방식으로 동일한 단백질 활성 성분을 함유한 제제이다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 30% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 50% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 70% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 90% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다.
구현예에서, 점도-강하용 함량은 점도가 100 cP 미만인 치료 제제를 달성한다. 다른 구현예들에서, 치료 제제는 50 cP 미만의 점도를 가진다. 다른 구현예들에서, 치료 제제는 20 cP 미만의 점도를 가진다. 또 다른 구현예에서, 치료 제제는 10 cP 미만의 점도를 가진다. 본원에서, 용어 "점도"는 본원에 기술된 방법으로 측정하였을 때의 동점성 값 (dynamic viscosity value)을 의미한다.
본원에 따른 치료 제제는 특별한 유익한 특성을 가진다. 구현예에서, 치료 제제는 전단 저하 (shear degradation), 상 분리, 클라우딩 아웃 (clouding out), 산화, 탈아미드화, 응집, 석출 및 변성에 저항성을 나타낸다. 구현예에서, 치료 제제는, 대조군 제제와 비교해, 보다 효율적으로, 가공 처리, 정제, 저장, 시린징, 여과 및 원심분리된다. 구현예에서, 치료 제제는 환자에게 치료 단백질이 고 농도로 투여된다. 구현예에서, 치료 제제는, 치료학적 부형제가 없는 유사 제제를 이용한 경우에 겪게 되는 경우의 불편함이 거의 없이, 환자에게 투여된다. 구현예에서, 치료 제제는 데포 주사로서 투여된다. 구현예에서, 치료 제제는 체내 치료 단백질의 반감기를 연장시킨다.
본원에 기술된 치료 제제의 이러한 특성들은, 임상 상황, 즉, 환자의 근육내 주입 허용성이 IM/SC 목적에 전형적인 소구경 바늘의 사용과 허용가능한 (예, 2-3 cc) 주사 부피의 사용을 포함하고 이러한 조건으로 한 주사 부위에 1회 주사로 제제를 유효량으로 투여하게 되는 상황에서, 근육내 또는 피하 주사에 의한 상기한 제제의 투여를 허용할 것이다. 이와는 대조적으로, 통상적인 제제화 기법을 이용해 치료 단백질을 비슷한 투여량으로 주사하기가 통상적인 제제의 높은 점도로 인해 제한적일 것이므로, 통상적인 제제의 SC/IM 주사는 임상 상황에 적합하지 않을 것이다. 본원에 기술된 부형제 화합물을 첨가하여 제제화된 치료 단백질이 고 농도인 용액은 시린지 또는 사전 충전된 시린지를 사용해 환자에게 투여할 수 있다.
구현예에서, 치료학적 부형제는 치료 단백질을 산화적 손상으로부터 안정화하는 항산화 특성을 가진다. 구현예에서, 치료 제제는 주위 온도에서 또는 냉장 조건에서 연장된 기간 동안 치료 단백질의 인지가능한 효능 소실없이 저장된다. 구현예에서, 치료 제제는 필요시까지 저장하기 위해 건조 처리되며; 그런 후 적절한 용매, 예를 들어 물을 첨가하여 재구성된다. 유익하게는, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 제제는 연장된 시간 동안, 수개월 내지 수년간 안정적일 수 있다. 이례적으로 긴 저장 기간이 바람직할 경우, 제제는 단백질이 변성될 염려 없이 냉동고에서 보존될 수 있(으며, 향후 재활성화될 수 있)다. 구현예에서, 제제는 냉각없이 장기간 저장하도록 제조될 수 있다.
치료 제제의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자에게 익숙할 수 있다. 본 발명의 치료 제제는, 예를 들어, 치료 단백질을 용액에 첨가하기 전 또는 첨가한 후, 부형제 화합물을 제제에 첨가함으로써, 제조할 수 있다. 치료 제제는, 예를 들어, 치료 단백질과 부형제를 제1 (저) 농도로 조합하여 제조한 다음, 여과 또는 원심분리하여 제2 (고) 농도의 치료 단백질을 제조함으로써, 가공 처리될 수 있다. 치료 제제는 카오트로프 (chaotrope), 코스모트로프 (kosmotrope), 하이드로트로프 (hydrotrope) 및 염을 가지는 하나 이상의 부형제 화합물을 사용해 제조할 수 있다. 치료 제제는 캡슐화, 분산, 리포좀, 소포 (vesicle) 형성 등과 같은 기법을 이용해 하나 이상의 부형제 화합물들과 함께 제조될 수 있다. 본원에 기술된 부형제 화합물을 포함하는 치료 제제의 제조 방법은 부형제 화합물들의 조합을 포함할 수 있다. 구현예에서, 부형제들의 조합은 낮은 점도, 개선된 안정성 또는 주사 부위에서의 통증 감소에 유용할 수 있다. 보존제, 계면활성제, 당, 수크로오스, 트레할로스, 다당류, 아르기닌, 프롤린, 히알루로니다제, 안정화제, 완충제 등의 그외 첨가제가 제조 중에 치료 제제에 첨가될 수 있다. 본원에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제 화합물은 동물 및/또는 인간 투여에 적합하고 무독성인 물질이다.
4. 비-치료 제제
일 측면에서, 본원에 기술된 제제 및 방법은, 비-치료 단백질을 유효량으로 그리고 부형제 화합물을 포함하는, 점도가 개선 또는 감소된 안정적인 액체 제제를 제공한다. 구현예에서, 제제는 활성 성분의 허용가능한 농도 및 허용가능한 점성을 제공하면서도 안정성을 개선한다. 구현예에서, 제제는 대조군 제제와 비교해 안정성 개선을 제공하며; 본원의 목적에서, 대조군 제제는 부형제 화합물이 없는 비-치료 제제와 건조 중량 기준으로 모든 방식에서 동일한 단백질 활성 성분을 함유한 제제이다.
단백질 액체 제제의 점도는, 비-제한적인 예로, 단백질 자체의 특성 (예, 효소, 구조 단백질, 가수 분해 정도 등); 이의 크기, 3차 구조, 화학 조성 및 분자량; 이의 제제 내 농도; 단백질 이외의 제제의 구성 성분; 바람직한 pH 범위; 및 제제의 저장 조건 등의, 다양한 인자들에 영향을 받을 수 있는 것으로 이해된다.
구현예에서, 비-치료 제제는 단백질 활성 성분을 25 mg/mL 이상으로 포함한다. 다른 구현예들에서, 비-치료 제제는 단백질 활성 성분을 100 mg/mL 이상으로 포함한다. 다른 구현예들에서, 비-치료 제제는 단백질 활성 성분을 200 mg/mL 이상으로 포함한다. 다른 구현예에서, 비-액체 치료 제제는 단백질 활성 성분을 300 mg/mL 이상으로 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 부형제 화합물은 비-치료 제제에 약 5 내지 약 300 mg/mL의 함량으로 첨가된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 10 내지 약 200 mg/mL의 함량으로 첨가된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 20 내지 약 100 mg/mL의 함량으로 첨가된다. 구현예에서, 부형제는 약 25 내지 약 75 mg/mL의 함량으로 첨가된다.
다양한 분자량의 부형제 화합물들은, 제제 내 단백질 활성 성분과의 조합되었을 때의 특별한 유익한 특성들을 위해, 선택된다. 부형제 화합물을 포함하는 비-치료 제제의 예들은 아래에 제공된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <5000 Da의 분자량을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <1000 Da의 분자량을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <500 Da의 분자량을 가진다.
구현예에서, 본원에 기술된 부형제 화합물은 비-치료 제제에 점도-강하용 함량으로 첨가된다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 10% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이며; 본원의 목적에서, 대조군 제제는 건조 중량 기준으로 부형제 화합물이 없는 것을 제외하고는 치료 제제와 모든 방식으로 동일한 단백질 활성 성분을 함유한 제제이다. 구현예에서, 점도-강하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 30% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 저하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 50% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 저하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 70% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 저하용 함량은 대조군 제제와 비교해 제제의 점도를 90% 이상 낮추는 부형제 화합물의 양이다.
구현예에서, 점도-강하용 함량은 점도가 100 cP 미만인 비-치료 제제를 만든다. 다른 구현예들에서, 비-치료 제제는 50 cP 미만의 점도를 가진다. 다른 구현예들에서, 비-치료 제제는 20 cP 미만의 점도를 가진다. 또 다른 구현예에서, 비-치료 제제는 10 cP 미만의 점도를 가진다. 본원에서, 용어 "점도"는 동점성 값을 의미한다.
본 발명에 따른 비-치료 제제는 특정한 유익한 특성을 가질 수 있다. 구현예에서, 비-치료 제제는 전단 저하, 상 분리, 클라우딩 아웃, 산화, 탈아미드화, 응집, 석출 및 변성에 저항성을 나타낸다. 구현예에서, 치료 제제는 대조군 제제와 비교해 효과적으로 가공 처리, 정제, 저장, 펌핑, 여과 및 원심분리될 수 있다.
구현예에서, 비-치료학적 부형제는 비-치료 단백질을 산화 손상으로부터 안정화하는 항산화 특성을 가진다. 구현예에서, 비-치료 제제는 주위 온도에서 또는 냉장고 조건에서 연장된 기간 동안 비-치료 단백질의 인지가능한 효능 소실없이 저장된다. 구현예에서, 비-치료 제제는 필요시까지 저장하기 위해 건조 처리되며; 그런 후 적절한 용매, 예를 들어 물을 첨가하여 재구성할 수 있다. 유익하게는, 본원에 기술된 바와 같이 제조된 제제는 연장된 기간 동안, 수개월 내지 수년간 안정적이다. 이례적으로 긴 저장 기간이 바람직할 경우, 제제는 단백질이 변성될 우려없이 냉동고에서 보존될 수 있(으며, 향후 재활성화될 수 있)다. 구현예에서, 제제는 냉각하지 않고 장기간 저장하도록 제조된다.
본원에 기술된 부형제 화합물을 포함하는 비-치료 제제의 제조 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 익숙할 수 있다. 예를 들어, 부형제 화합물은, 비-치료 단백질을 용액에 첨가하기 전 또는 첨가한 후, 제제에 첨가할 수 있다. 비-치료 제제는 제1 (저) 농도로 제조한 다음, 여과 또는 원심분리에 의해 제2 (고) 농도로 만들어 진행할 수 있다. 비-치료 제제는 카오트로프 (chaotrope), 코스모트로프 (kosmotrope), 하이드로트로프 (hydrotrope) 및 염을 가진 하나 이상의 부형제 화합물을 사용해 제조할 수 있다. 비-치료 제제는 캡슐화, 분산, 리포좀, 비히클 형성 등과 같은 기법을 이용해 하나 이상의 부형제 화합물을 이용해 제조할 수 있다. 제조 중에 보존제, 계면활성제, 안정화제 등을 비롯한 기타 첨가제가 비-치료 제제에 첨가될 수 있다.
5. 부형제 화합물
하나 이상의 치료 단백질 또는 비-치료 단백질과 함께 사용하기 적합하며, 단백질(들)을 고 농도로 함유하도록 제제를 구성할 수 있는, 부형제 화합물 수종이 본원에 언급된다. 후술한 부형제 화합물 카테고리들 중 몇가지는 다음과 같다: (1) 힌더드 아민; (2) 음이온성 방향족; (3) 관능화된 아미노산; (4) 올리고펩타이드; (5) 단쇄 유기산; (6) 저 분자량 지방족 폴리산; 및 (7) 다이온 및 설폰. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 본원에 언급된 부형제 화합물은, 입자 간 (즉, 단백질-단백질) 상호작용에 참여하게 되는 치료 단백질의 특정 단편, 서열, 구조 또는 섹션과 회합 (association)하는 것으로 생각된다. 이들 부형제 화합물과 치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 회합은, 단백질이 용액의 점도를 과도하게 높이지 않으면서도 고 농도로 제제화될 수 있도록, 단백질 간의 상호작용을 마스킹할 수 있다. 부형제 화합물은 유익하게는 수용성일 수 있으며, 따라서, 수성 비히클과 함께 사용하기 적합하다. 구현예에서, 부형제 화합물은 >10 mg/mL의 수 용해성을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 >100 mg/mL의 수 용해성을 가진다. 구현예에서, 부형제 화합물은 >500 mg/mL의 수 용해성을 가진다. 치료 단백질에 유익하게는, 부형제 화합물은 생물학적으로 허용가능하고 비-면역원성인 물질로부터 유래될 수 있으며, 따라서 약제학적 용도로 적합하다. 치료학적 구현예에서, 부형제 화합물은 체내 대사되어, 생물학적으로 적합하고 비-면역원성인 부산물을 만들 수 있다.
a. 부형제 화합물 카테고리 1: 힌더드 아민
치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 고 농도 용액은 부형제 화합물로서 힌더드 아민 소분자를 사용해 제제로 제조할 수 있다. 본원에서, 용어 "힌더드 아민"은 아래 실시예와 부합되는 하나 이상의 벌키 또는 입체 장애 기를 함유한 소분자를 지칭한다. 힌더드 아민은 유리 염기 형태, 양성자화된 형태 (protonated form) 또는 이들의 조합으로 사용될 수 있다. 양성자화된 형태의 경우, 힌더드 아민은 클로라이드, 하이드록사이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 포르메이트, 포스페이트, 설페이트 또는 카르복실레이트와 같은 음이온성 반대이온과 조합될 수 있다. 부형제 화합물로서 사용가능한 힌더드 아민 화합물은, 부형제 화합물이 중성 pH의 수용액에서 양이온성 전하를 띠도록, 2차 아민, 3차 아민, 4차 암모늄, 피리디늄, 피롤리돈, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린 또는 구아니디늄 기를 포함할 수 있다. 또한, 힌더드 아민 화합물은, 사이클릭 방향족, 지환족, 사이클로헥실 또는 알킬 기와 같은, 하나 이상의 벌키 또는 입체 장애 기를 포함한다. 구현예에서, 입체 장애 기는 다이알킬아민, 트리알킬아민, 구아니디늄, 피리디늄 또는 4급 암모늄과 같이 기본적으로 아민 기일 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 힌더드 아민 화합물은, 양이온 파이 (pi) 상호작용에 의해, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신과 같은 단백질의 방향족 모이어티와 회합하는 것으로 생각된다. 구현예에서, 힌더드 아민의 양이온성 기는 단백질의 방향족 아미노산 잔기의 전자 풍부 파이 구조에 친화성일 수 있으며, 그래서 이는 단백질의 이러한 부위를 가려, 차폐된 단백질이 회합 및 응집되는 경향을 낮출 수 있다.
구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 이미다졸, 1-메틸이미다졸, 4-메틸이미다졸, 1-헥실-3-메틸이미다졸륨 클로라이드, 히스타민, 4-메틸히스타민, 알파-메틸히스타민, 베타히스틴, 베타-알라닌, 2-메틸-2-이미다졸린, 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 클로라이드, 요산, 포타슘 유레이트, 베타졸 (betazole), 카르노신, 아스파르탐, 사카린, 아세설팜 포타슘, 크산틴, 테오필린, 테오브로민, 카페인 및 안세린과 같은, 이미다졸, 이미다졸린 또는 이미다졸리딘 기 또는 이의 염을 포함하는 화학 구조를 가진다. 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 다이메틸에탄올아민, 다이메틸아미노프로필아민, 트리에탄올아민, 다이메틸벤질아민, 다이메틸사이클로헥실아민, 다이에틸사이클로헥실아민, 다이사이클로헥실메틸아민, 헥사메틸렌 비구아니드, 폴리(헥사메틸렌 비구아니드), 이미다졸, 다이메틸글리신, 아그마틴 (agmatine), 다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄, 테트라메틸에틸렌다이아민, N,N-다이메틸에탄올아민, 에탄올아민 포스페이트, 글루코사민, 염화콜린, 포스포콜린, 니아신아미드, 이소니코틴아미드, N,N-다이에틸 니코틴아미드, 니코틴산 소듐 염, 티라민, 3-아미노피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, 3-피리딘 메탄올, 니코틴아미드 아데노신 다이뉴클레오티드, 바이오틴, 모르폴린, N-메틸피롤리돈, 2-피롤리디논, 프로카인, 리도카인, 다이시안다이아미드-타우린 부가물, 2-피리딜에틸아민, 다이시안다이아미드-벤질 아민 부가물, 다이시안다이아미드-알킬아민 부가물, 다이시안다이아미드-사이클로알킬아민 부가물 및 다이시안다이아미드-아미노메탄포스폰산 부가물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 본원에 부합되는 힌더드 아민 화합물은 양성자화된 암모늄 염으로서 포뮬레이션된다. 구현예에서, 본원에 부합되는 힌더드 아민 화합물은 반대이온으로서 무기 음이온 또는 유기 음이온과의 염으로서 포뮬레이션된다. 구현예에서, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 고 농도 용액은 부형제 화합물로서 카페인 및 벤조산, 하이드록시벤조산 또는 벤젠설폰산의 조합과 함께 제제화다. 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 체내에서 대사되어 생물학적으로 친화적인 부산물을 형성한다. 일부 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 제제에 약 250 mg/ml 이하의 농도로 존재한다. 부가적인 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 제제에 약 10 mg/ml 내지 약 200 mg/ml의 농도로 존재한다. 부가적인 다른 측면에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 제제에 약 20 내지 약 120 mg/ml의 농도로 존재한다.
구현예에서, 특정 힌더드 아민 부형제 화합물은 다른 약리학적 특성이 있을 수 있다. 예를 들어, 크산틴은, 전신 흡수시, 자극제 특성 및 기관지 확장제 특성 등의 독립적인 약리학적 특성을 가진 힌더드 아민의 한가지 카테고리이다. 대표적인 크산틴으로는 카페인, 아미노필린, 3-이소부틸-1-메틸크산틴, 파라크산틴, 펜톡시필린 (pentoxifylline), 테오브로민, 테오필린 등이 있다. 메틸화 크산틴은 심장 수축력, 심박수 및 기관지 확장에 영향을 주는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 크산틴 부형제 화합물은 제제에 약 30 mg/ml 이하의 농도로 존재한다.
독립적인 약리학적 특성을 가진 힌더드 아민의 또 다른 카테고리는 국소 주사용 마취제 화합물이다. 국소 주사용 마취제 화합물은, (a) 친지성 방향족 고리, (b) 중간산물 에스테르 또는 아미드 연결 및 (c) 2차 또는 3차 아민으로 된 3원 분자 구조 (three-component molecular structure)를 가진, 힌더드 아민이다. 이 카테고리에 속하는 힌더드 아민은 소듐 이온의 유입을 저해함으로써 신경 전도를 방해하여 국소 마취를 유도하는 것으로 이해된다. 국소 마취제 화합물의 친지성 방향족 고리는 탄소 원자들 (예, 벤젠 고리)로 이루어질 수 있거나, 또는 이종원자 (예, 티오펜 고리)를 포함할 수 있다. 대표적인 국소 주사용 마취제 화합물로는, 비-제한적으로, 아밀로카인 (amylocaine), 아르티카인 (articaine), 부피비카인 (bupivicaine), 부타카인 (butacaine), 부타닐리카인 (butanilicaine), 클로르프로카인 (chlorprocaine), 코카인 (***e), 사이클로메티카인 (cyclomethycaine), 디메토카인 (dimethocaine), 에디토카인 (editocaine), 헥실카인 (hexylcaine), 이소부카인 (isobucaine), 레보부피바카인 (levobupivacaine), 리도카인 (lidocaine), 메타부테타민 (metabutethamine), 메타부톡시카인 (metabutoxycaine), 메피바카인 (mepivacaine), 메프릴카인 (meprylcaine), 프로폭시카인 (propoxycaine), 프릴로카인 (prilocaine), 프로카인 (procaine), 피페로카인 (piperocaine), 테트라카인 (tetracaine), 트리메카인 (trimecaine) 등이 있다. 국소 주사용 마취제 화합물은 점도 저하, 안정성 개선 및 주사시 통증 저하와 같은, 단백질 치료 제제에 여러가지 이점을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 국소 마취 화합물은 제제에 약 50 mg/ml 이하의 농도로 존재한다.
구현예에서, 독립적인 약리학적 특성을 가진 힌더드 아민은 본원에 기술된 제제 및 방법에 따라 부형제 화합물로서 사용된다. 일부 구현예에서, 독립적인 약리학적 특성을 가진 부형제 화합물은 약리학적 효과가 없거나 또는 치료학적으로 효과적이지 않은 양으로 존재한다. 다른 구현예들에서, 독립적인 약리학적 특성을 가진 부형제 화합물은 약리학적 효과를 가지거나 및/또는 치료학적으로 효과적인 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, 독립적인 약리학적 특성을 가진 힌더드 아민은 제제의 점도를 낮추도록 선택된 다른 부형제 화합물과 조합하여 사용되며, 여기서 독립적인 약리학적 특성을 가진 힌더드 아민은 약리학적 활성의 이점을 제공하기 위해 사용된다. 예를 들어, 국소 주사용 마취제 화합물은 제제의 점도를 낮추기 위해, 또한 제제의 주사시 통증을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 주사 통증 감소는 마취 특성에 의해 발생할 수 있으며; 또는 부형제에 의해 점도가 저하된 경우, 주사하는데 힘이 적게 들 수 있다. 다른 구현예에서, 국소 주사용 마취제 화합물은, 제제의 주사시 국소 감각을 줄이는 바람직한 약리학적 이점을 제공하기 위해, 제제의 점도를 낮추는 다른 부형제 화합물과 조합하여, 사용될 수 있다.
b. 부형제 화합물 카테고리 2: 음이온성 방향족 화합물
치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 고 농도 용액은 부형제 화합물로서 음이온성 방향족 소분자 화합물과 함께 제제화할 수 있다. 음이온성 방향족 부형제 화합물은 페닐, 벤질, 아릴, 알킬벤질, 하이드록시벤질, 페놀, 하이드록시아릴, 헤테로방향족 기와 같은 방향족 관능기, 또는 융합된 방향족 기를 포함할 수 있다. 음이온성 방향족 부형제 화합물은 또한 카르복실레이트, 옥사이드, 페녹사이드, 설포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 설파이드와 같은 음이온성 관능기를 포함할 수 있다. 음이온성 방향족 부형제는 산, 소듐 염 또는 기타로 기술될 수 있지만, 부형제는 다양한 염 형태로 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 단백질의 양이온성 부분과 회합하여 단백질의 이 부분을 가림으로써, 단백질-함유 제제의 점도를 야기하는 단백질 분자들 간의 상호작용을 감소시킬 수 있는, 벌키한 입체 장애 분자로, 간주된다.
구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물의 예로는 살리실산, 아미노살리실산, 하이드록시벤조산, 아미노벤조산, 파라-아미노벤조산, 벤젠설폰산, 하이드록시벤젠설폰산, 나프탈렌설폰산, 나프탈렌다이설폰산, 하이드로퀴논 설폰산, 설파닐산, 바닐린산, 바닐린, 바닐린-타우린 부가물, 아미노페놀, 안트라닐산, 신남산, 쿠마르산, 아데노신 모노포스페이트, 인돌 아세트산, 포타슘 우레이트, 푸란 다이카르복시산, 푸란-2-아크릴산, 2-푸란프로피온산, 소듐 페닐피루베이트, 소듐 하이드록시페닐피루베이트, 다이하이드록시벤조산, 트리하이드록시벤조산, 피로갈롤 (pyrogallol), 벤조산 및 전술한 산의 염과 같은 화합물 등이 있다. 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 이온화된 형태로 포뮬레이션된다. 구현예에서, 음이온성 방향족 화합물은, 다이메틸사이클로헥실암모늄 하이드록시벤조에이트와 같은, 힌더드 아민의 염으로서 포뮬레이션된다. 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 유기 양이온과 같은 다양한 반대이온과 함께 포뮬레이션된다. 구현예에서, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 고 농도 용액은 음이온성 방향족 부형제 화합물 및 카페인과 함께 제제화된다. 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 체내에서 대사되어, 생물학적으로 적합한 부산물을 형성된다.
c. 부형제 화합물 카테고리 3: 관능화된 아미노산
치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 고 농도 용액은 하나 이상의 관능화된 아미노산과 함께 제제화될 수 있으며, 이때 하나의 관능화된 아미노산 또는 하나 이상의 관능화된 아미노산을 포함하는 올리고펩타이드가 부형제 화합물로서 사용될 수 있다. 구현예에서, 관능화된 아미노산 화합물은 가수분해 또는 대사되어 아미노산이 될 수 있는 분자 ("아미노산 전구체")를 포함한다. 구현예에서, 관능화된 아미노산은 페닐, 벤질, 아릴, 알킬벤질, 하이드록시벤질, 하이드록시아릴, 헤테로방향족 기와 같은 방향족 관능기 또는 융합된 방향족 기를 포함할 수 있다. 구현예에서, 관능화된 아미노산 화합물은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 벤질, 사이클로알킬, 글리세릴, 하이드록시에틸, 하이드록시프로필, PEG 및 PPG 에스테르와 같은 에스테르화된 아미노산을 포함할 수 있다. 구현예에서, 관능화된 아미노산 화합물은 아르기닌 에틸 에스테르, 아르기닌 메틸 에스테르, 아르기닌 하이드록시에틸 에스테르 및 아르기닌 하이드록시프로필 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 관능화된 아미노산 화합물은 수용액 내 중성 pH에서 이온 화합물로 하전된다. 예를 들어, 하나의 아미노산은 아세테이트 또는 벤조에이트와 같은 에스테르를 형성함으로써 유도체화될 수 있으며, 가수분해 산물은 천연 물질인 아세트산 또는 벤조산 + 아미노산일 것이다. 구현예에서, 관능화된 아미노산 부형제 화합물은 체내에서 대사되어 생물학적으로 적합한 부산물을 형성한다.
d. 부형제 화합물 카테고리 4: 올리고펩타이드
치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 고 농도 용액은 부형제 화합물로서 올리고펩타이드와 함께 제제화될 수 있다. 구현예에서, 올리고펩타이드는 구조가 하전된 부분과 벌키한 부분을 가지도록 설계된다. 구현예에서, 올리고펩타이드는 펩타이드 서브유닛 2-10개로 구성된다. 올리고펩타이드는 2 관능성일 수 있으며, 예를 들어 비-극성 아미노산과 커플링된 양이온성 아미노산, 또는 비-극성 아미노산과 커플링된 음이온성 아미노산일 수 있다. 구현예에서, 올리고펩타이드는 펩타이드 서브유닛 2-5개로 구성된다. 구현예에서, 올리고펩타이드는 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 폴리-라이신, 폴리-아르기닌 및 폴리-히스티딘과 같은 호모펩타이드이다. 구현예에서, 올리고펩타이드는 순 양전하 (net cationic charge)를 가진다. 다른 구현예들에서, 올리고펩타이드는 Trp2Lys3와 같은 헤테로펩타이드이다. 구현예에서, 올리고펩타이드는 ABA 반복 패턴과 같은 교차 구조를 가질 수 있다. 구현예에서, 올리고펩타이드는 음이온성 및 양이온성 아미노산 둘다를 포함할 수 있으며, 예를 들어, Arg-Glu를 포함할 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 올리고펩타이드는, 고 점성의 용액을 야기하는 분자간 상호작용을 감소시키는 방식으로 단백질과 회합할 수 있는 구조를 포함하며; 예를 들어, 올리고펩타이드-단백질 회합은 단백질 주변의 수화 층 (hydration layer)의 수소 결합을 파괴하기 위해 얼마간의 비-극성 아미노산을 남기는 전하-전하 상호작용일 수 있으며, 이로써 점도가 감소된다. 일부 구현예에서, 올리고펩타이드 부형제는 조성물에 약 50 mg/ml 이하로 존재한다.
e. 부형제 화합물 카테고리 5: 단쇄 유기산
본원에서, 용어 "단쇄 유기산"은 C2-C6 유기산 화합물 및 이의 염, 에스테르 또는 락톤을 의미한다. 이 카테고리는 포화 및 불포화 카르복시산, 하이드록시 관능화된 카르복시산 및 선형, 분지형 또는 고리형 카르복시산을 포함한다. 구현예에서, 단쇄 유기산의 산 기는 카르복시산, 설폰산, 포스폰산 또는 이들의 염이다.
전술한 4가지 부형제 카테고리 외에도, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 고 농도 용액은, 부형제 화합물로서, 단쇄 유기산, 예를 들어, 소르브산, 발레르산, 프로피온산, 카프로익산 및 아스코르브산의 산 또는 염 형태와 함께 제제화될 수 있다. 이 카테고리에 속하는 부형제 화합물의 예로는 포타슘 소르베이트, 타우린, 칼슘 프로피오네이트, 마그네슘 프로피오네이트 및 소듐 아스코르베이트 등이 있다.
f. 부형제 화합물 카테고리 6: 저분자량 지방족 폴리산
치료학적 또는 비-치료학적 페길화된 단백질의 고 농도 용액은 용액의 점도를 낮출 수 있는 특정 부형제 화합물과 함께 제제화될 수 있으며, 이러한 부형제 화합물은 저분자량 지방족 폴리산이다. 본원에서, 용어 "저분자량 지방족 폴리산"은 분자량 < 약 1500 및 2 이상의 산성 기를 가진 유기 지방족 폴리산으로서, 산성 기는 프로톤-공여 (proton-donating) 모이어티로 이해된다. 산성 기에 대한 비-제한적인 예로는 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, 나이트레이트 및 나이트라이트 기 등이 있다. 저분자량 지방족 폴리산의 산성 기는 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, 나이트레이트 및 나이트라이트와 같은 음이온성 염 형태일 수 있으며; 이의 반대이온은 소듐, 포타슘, 리튬 및 암모늄일 수 있다. 본원에 기술된 페길화된 단백질과 상호작용하는데 유용한 저분자량 지방족 폴리산에 대한 구체적인 예로는 말레산, 타르타르산, 글루타르산, 말론산, 구연산, 에틸렌다이아민테트라아세트산 (EDTA), 아스파르트산, 글루탐산, 알렌드론산, 에티드론산 및 이들의 염 등이 있다. 음이온성 염 형태로서 저분자량 지방족 폴리산에 대한 추가적인 예로는 포스페이트 (PO4 3-), 하이드로겐 포스페이트 (HPO4 3 -), 다이하이드로겐 포스페이트 (H2PO4 -), 설페이트 (SO4 2-), 바이설페이트 (HSO4 -), 피로포스페이트 (P2O7 4 -), 카보네이트 (CO3 2-) 및 바이카보네이트 (HCO3 -) 등이 있다. 음이온성 염의 반대이온은 Na, Li, K 또는 암모늄 이온일 수 있다. 또한, 이들 부형제는 부형제들과 조합하여 사용될 수 있다. 본원에서, 저분자량 지방족 폴리산은, 또한, 제1 산성 기, 예를 들어, 글리콜산, 락트산 및 글루콘산 및 이들의 염에 인접한 하이드록시 기가 존재하는, 알파 하이드록시산일 수 있다. 구현예에서, 저분자량 지방족 폴리산은 산성 기를 2개 보다 많이 가진 올리고머 형태, 예를 들어 폴리아크릴산, 폴리포스페이트, 폴리펩타이드 및 이들의 염 형태이다. 일부 구현예에서, 저분자량 지방족 폴리산 부형제는 약 50 mg/ml 이하의 농도로 조성물에 존재한다.
g. 부형제 화합물 카테고리 7: 다이온 및 설폰
효과적인 점도-강하용 부형제는, 298K에서 1 g/L 이상까지 순수한 물 (pure water)에 용해되며 pH 7에서 순 중성 전하 (net neutral charge)를 띠는, 설폰, 설폰아미드 또는 다이온 관능기를 포함하는 분자일 수 있다. 바람직하게는, 이 분자는 1000 g/mol 미만, 더 바람직하게 500 g/mol 미만의 분자량을 가진다. 점도 강하에 효과적인 다이온 및 설폰은 복수의 이종 결합을 가지며, 수용성이며, pH 7에서 순 전하가 0이며, 강력한 수소 결합 공여체가 아니다. 이론으로 결부시키는 것은 아니지만, 이중 결합 특징이 단백질과의 약한 파이-스텍킹 상호작용 (pi-stacking interaction)을 허용할 수 있다. 구현예에서, 높은 단백질 농도에서, 그리고 고 농도에서만 고 점도를 발생시키는 단백질들 내에서는, 정전기 상호작용이 보다 긴 범위의 상호작용이기 때문에, 하전된 부형제가 효과적이지 않다. 용매화된 단백질 표면은 대개 친수성이어서, 이를 수용성이게 만든다. 단백질의 소수성 영역은 일반적으로 3차원 구조 안에 숨겨지지만, 그 구조는 계속적으로 전개되어, 언-폴딩 및 리-폴딩 (때때로 "브리딩 (breathing)")되며, 인접한 단백질의 소수성 영역과 서로 접촉하여 소수성 상호작용에 의한 응집을 유발할 수 있다. 다이온 및 설폰 부형제의 파이-스텍킹 특징은 이러한 "브리딩" 동안에 노출될 수 있는 소수성 패치 (hydrophobic patch)를 차폐할 수 있다. 부형제의 또 다른 중요한 역할은 근접하게 위치된 단백질들 간의 소수성 상호작용과 수소 결합을 파괴하는 것일 수 있으며, 이로써 용액의 점도를 효과적으로 낮출 수 있을 것이다. 이러한 내용에 부합되는 다이온 및 설폰 화합물로는 다이메틸설폰, 에틸 메틸 설폰, 에틸 메틸 설포닐 아세테이트, 에틸 이소프로필 설폰, 비스(메틸설포닐)메탄, 메탄 설폰아미드, 메티오닌 설폰, 1,2-사이클로펜탄다이온, 1,3-사이클로펜탄다이온, 1,4-사이클로펜탄다이온 및 부탄-2,3-다이온 등이 있다.
6. 단백질/부형제 용액: 특성 및 공정
특정 구현예에서, 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 또는 단쇄 유기산, 저분자량 지방족 폴리산, 및 다이온 및 설폰과 같은 전술한 부형제 화합물 또는 이들의 조합물 (이하, "부형제 첨가제")과 함께 제제화된, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질의 용액은, 단백질 확산 상호작용 파라미터 kD 또는 제2 바이러스 계수 B22에 의해 측정되는 바와 같이, 단백질-단백질 상호작용 특징을 개선하는 결과를 가져온다. 본원에서, 전술한 부형제 화합물 또는 이들의 조합물을 사용한 테스트 제제에 의해 달성되는 하나 이상의 단백질-단백질 상호작용 파라미터의 "개선"은, 특정 부형제 화합물 또는 부형제 첨가제를 함유하지 않는 상응하는 제제와 비슷한 조건에서 테스트 제제와 비교하였을 때, 끌어당기는 단백질-단백질 상호작용의 감소를 의미할 수 있다. 이러한 개선은 전체 공정 또는 이의 한 측면에 적용되는 특정 파라미터를 측정함으로써 식별할 수 있으며, 파라미터는 변형을 정량할 수 있으며 이전 상태 또는 대조군과 비교할 수 있는 공정에 부속된 임의의 측정 파라미터이다. 파라미터는 효율, 단가, 수율 또는 속도와 같이 공정 자체와 관련있을 수 있다.
또한, 파라미터는 보다 대규모 공정의 특징 측면과 관련된 프록시 파라미터일 수 있다. 예를 들어, kD 또는 B22 파라미터와 같은 파라미터는 프록시 파라미터로 지칭될 수 있다. kD 및 B22는 산업계에서 표준 기법을 이용해 측정을 수행할 수 있으며, 용액 내 단백질 안정성 또는 용액 특성 개선과 같은 공정-관련 파라미터의 지표 (indicator)일 수 있다. 이론으로 결부되는 것은 아니나, 높은 음의 kD 값은 단백질이 강한 끌어당기는 상호작용을 한다는 것을 의미하는 것일 수 있으며, 이는 응집, 불안정성 및 유변학적 문제를 유발할 수 있는 것으로 이해된다. 전술한 특정 부형제 화합물 또는 이들의 조합물의 존재 하에 제제화되었을 경우, 동일한 단백질은 보다 낮은 음의 kD 값 또는 0에 가까운 또는 0 보다 높은 kD 값인 개선된 프록시 파라미터를 가질 수 있으며, 이러한 개선된 프록시 파라미터는 공정-관련 파라미터의 개선과 관련있다.
구현예에서, 전술한 특정 부형제 화합물 또는 이들의 조합물, 예를 들어 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 관능화된 아미노산, 올리고펩타이드, 단쇄 유기산, 저분자량 지방족 폴리산, 및/또는 다이온 및 설폰은, 열 전달, 가스 전달, 원심분리, 크로마토그래피, 막 분리, 원심분리에 의한 농축, 접선 유동 여과, 반경류 여과 (radial flow filtration), 축류 여과 (axial flow filtration), 동결 건조 및 겔 전기영동에 의해, 여과, 시린징, 수송, 펌핑, 믹싱, 가열 또는 냉각과 같은 처리 방법을 이용한 단백질-함유 용액의 제조, 처리, 무균 충전, 정제 및 분석과 같은 단백질-관련 공정을 개선하는데 사용된다. 이러한 공정 및 관련 단백질-관련 공정에서, 가공 처리 장치를 통해 운반되는 용액에 대상 단백질이 용해된다. 본원에서 "담체 용액"으로서 지칭되는 이 용액은 (예, 분비된 대상 단백질 함유하는) 세포 배양 배지, 숙주 세포를 세포용해한 후 수득되는 세포용해액 (대상 단백질이 세포용해물에 존재하는 경우), (크로마토그래피 분리 후 대상 단백질을 함유하는) 용출액, 전기영동 용액, 대상 단백질을 가공 처리 장치의 관을 통해 수송하기 위한 수송 용액 등을 포함할 수 있다. 대상 단백질을 함유한 담체 용액은 또한 단백질-함유 용액 또는 단백질 용액으로 지칭될 수 있다. 아래에 더욱 상세히 기술한 바와 같이, 다양한 가공 처리 측면을 개선하기 위해, 단백질-함유 용액에 하나 이상의 점도-강하용 부형제를 첨가할 수 있다. 본원에서, 용어 "개선한다", "개선" 등은, 파라미터를 대조군 용액에서 측정한 동일한 파라미터와 비교하였을 때, 담체 용액에서의 대상 파라미터의 유익한 변화를 의미한다. 본원에서, "대조군 용액"은 점도-강화용 부형제는 없지만 담체 용액과 실질적으로 비슷한 용액을 의미한다. 본원에서, "대조군 공정", 예를 들어 대조군 여과 공정, 대조군 크로마토그래피 공정 등은 대상 단백질-관련 공정과 실질적으로 비슷하며 담체 용액 대신 대조군 용액으로 수행되는 단백질-관련 공정이다.
예를 들어, 단백질-함유 용액이 도관 (예, 유동 챔버, 파이프 또는 배관)을 통해 펌핑되는 공정에서, 펌핑 공정 이전 또는 도중에, 전술한 바와 같은 단백질 용액에 점도-강하용 부형제를 첨가하여, 용액 펌핑에 필요한 물리력 (forec) 및 파워를 실질적으로 줄일 수 있다. 유체는 일반적으로 유동 저항성, 즉 점성을 나타내며, 흐름을 도입 및 증폭시키기 위해 유체가 이러한 점성을 극복하도록 물리력이 적용되어야 하는 것으로 이해된다. 펌핑에 필요한 파워, P는 하기 식으로 나타낸 바와 같이 헤드 H 및 용량 Q으로 계산된다:
P ~ HQ (식 1)
점성 유체는 펌프에 필요한 파워를 증가시키고, 펌핑 효율을 낮추고, 펌프 헤드 및 용량을 감소시키고, 파이프내 마찰 저항을 높이는 경향을 가진다. 펌핑 전 또는 펌핑 중에 단백질 용액에 전술한 점도-강화 부형제를 첨가하면, 헤드 (H, 식 1) 또는 용량 (Q, 식 1) 또는 이 둘다가 감소됨으로써, 가공 처리 단가를 실질적으로 낮출 수 있다. 점도 저하 이점은, 예를 들어, 처리량 개선, 수율 증가 또는 가공 처리 시간 감소에 의해 나타날 수 있다. 또한, 도관을 통한 유체 전달로부터 마찰 감소는 이러한 유체 수송과 관련된 비용의 상당한 비율을 차지한다. 전술한 점도-강하 부형제를 단백질 용액에 펌핑 전 또는 펌핑 중에 첨가하면, 펌핑 공정에 수반되는 마찰을 감소시킴으로써 가공 처리 비용을 실질적으로 낮출 수 있다. 가공 처리 비용 측정은 점도-강하 부형제를 이용함으로써 개선할 수 있는 공정 파라미터이다.
이러한 단백질 용액의 공정 및 공정 방법은, 제조, 처리, 정제 및 분석 단계시 용액 내 단백질의 낮은 점도, 개선된 용해성 또는 개선된 안정성으로 인해, 효율이 개선될 수 있다. 용액 내 단백질의 점도, 용해성 또는 안정성과 같은 프록시 파라미터 측정 또는 공정 효율 측정은, 점도-강하 부형제를 이용함으로써 개선할 수 있는 공정 파라미터이다. 몇몇 다른 인자들이 공정 중에 단백질 점도, 용해성 및 안정성에 부정적으로 작용하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 단백질-함유 용액은, 비-제한적인 예로, 펌핑, 믹싱, 원심분리 및 여과 등의 전형적인 공정 조작을 통해 단백질 용액을 조작함으로써 발생되는 유의한 전단 스트레스를 포함하여, 제조 및 정제 중에 다양한 물리적 스트레스 요인에 노출되게 된다. 또한, 이러한 공정 단계 중에, 단백질이 흡착할 수 있는 유체 안에 기포가 포집될 수 있다. 공정 중에 직면하게 되는 전형적인 전단 스트레스와 커플링된, 이러한 계면 장력은, 흡착된 단백질 분자를 언-폴딩시켜 응집을 유발할 수 있다. 또한, 유의한 단백질 언-폴딩은 펌프 공동 현상 (pump cavitation event)시, 그리고 제조 중에 한외여과 및 정용여과 막과 같은 고체 표면에 노출시, 발생할 수 있다. 이러한 현상은 단백질 폴딩 및 산물 품질을 악화시킬 수 있다.
뉴턴 유체의 경우, 소정의 공정에 의해 부과된 스트레스 τ는, 아래 식으로 나타낸 바와 같이, 전단 속도 γ 및 유체의 점도 η으로 결정된다:
τ = γη (식 2)
단백질 용액을 하나 이상의 전술한 부형제 화합물 또는 이들의 조합물과 함께 제제화함으로써, 용액의 점도는 감소되며, 즉 단백질 용액이 노출되는 전단 스트레스는 감소한다. 감소된 전단 스트레스는, 예를 들어 공정 파라미터의 보다 나은 또는 우수한 바람직한 측정 결과에 의해 명확해지는 바와 같이, 처리 중인 제제의 안정성을 향상시킬 수 있다. 이러한 개선된 공정 파라미터는 단백질 응집, 입자 또는 육안으로 보이지 않는 입자 (subvisible) (거시적으로 혼탁도로서 확인됨)의 수준 감소, 생산 소실 저하 또는 전체 수율 개선과 같은 메트릭스 (metrics)를 포함할 수 있다. 개선된 공정 파라미터의 다른 예로서, 단백질-함유 용액의 점도 저하는 용액의 가공 처리 시간을 줄일 수 있다. 소정의 유닛 조작의 처리 시간은 일반적으로 전단 속도와 역비례한다. 따라서, 소정의 특정 스트레스에 대해, 전술한 부형제 화합물 또는 이의 조합물 첨가에 의한 단백질 용액의 점도 감소는, 전단 속도 (γ, 식 2) 증가, 즉 공정 시간 단축을 수반한다.
공정이 진행 중인 동안에, 용액 내 단백질은 바람직한 단백질 활성 성분, 예를 들어, 치료 단백질 또는 비-치료 단백질일 수 있는 것으로 이해된다. 본원에 언급된 부형제를 사용해 단백질 활성 성분의 가공 처리를 용이하게 만들면, 단백질 활성 성분의 생산 속도 또는 수율을 높일 수 있거나, 또는 특정 공정의 효율을 향상시키거나, 또는 에너지 사용을 감소시키는 등을 달성할 수 있으며, 이러한 임의 성과는 점도-강하용 부형제를 사용함으로써 개선되는 공정 파라미터이다. 또한, 단백질 오염 물질이 특정 가공 처리 기법 중에, 예를 들어 바이오프로세싱의 발효 및 정제 단계 중에 생길 수 있는 것으로 이해된다. 오염 물질을 더 빠르게, 더 철저하게 또는 더 효과적으로 제거한다면, 원하는 단백질, 즉 단백질 활성 성분의 가공 처리 역시 개선할 수 있으며; 이러한 성과는 점도-강하용 부형제 화합물 또는 첨가제를 사용함으로써 개선되는 공정 파라미터이다. 본원에 언급된 바와 같이, 용액의 점도를 낮추거나, 단백질 안정성을 개선하거나 및/또는 단백질 용해성을 높임으로써, 본원에 기술된 특정 부형제는 원하는 단백질 활성 성분의 전달을 개선할 수 있으며, 부적절한 단백질 오염 물질의 제거를 개선할 수 있으며; 이러한 2가지 효과는, 점도-강하용 부형제 또는 첨가제를 사용함으로써 개선되는 공정 파라미터로서, 이는 이러한 부형제 또는 첨가제가 단백질 제조의 전체 공정을 개선한다는 것을, 보여준다.
치료 단백질 생산 및 정제용 특수 플랫폼 유닛 조작은 본원에 기술된 점도-강하용 부형제의 유익한 사용에 대한 다른 예를, 그리고 이들 부형제 또는 첨가제가 공정 파라미터를 개선하는 또 다른 예를 제시해준다. 예를 들어, 전술한 점도-강화용 부형제 하나 이상을 이러한 생산 및 정제 공정에 도입하게 되면, 실질적인 분자 안정성 및 회수 개선과, 운영 비용 감소를 제공할 수 있다.
당해 기술 분야에서, 단일클론 항체와 같은 치료 단백질을 생산 및 정제하기 위해 널리 사용되는 기술은 일반적으로 발효 공정과 후속적인 일련의 정제 공정 단계로 구성되는 것으로 이해된다. 발효 또는 상류 공정 (upstream processing, USP)은, 치료 단백질을 전형적으로 박테리아 또는 포유류 세포주를 이용해 생물반응조에서 배양하는 단계를 포함한다. USP는, 구현예에서, 도 1에 나타낸 단계 등의 단계를 포함할 수 있다. 구현예에서, 정제 또는 하류 공정 (DSP)은 도 2에 나타낸 단계와 같은 단계를 포함할 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, USP는 마스터 세포 은행 (MCB) 유래의 바이얼을 해동하는 단계 (102)로 시작할 수 있다. MCB는 단계 (104)에 나타낸 바와 같이 증폭시켜, 워킹 세포 은행 (도시 안함)을 구축하거나, 및/또는 추가적인 생산을 위한 워킹 스톡을 만들 수 있다. 단계 (108) 및 (110)에 나타낸 바와 같이, 일련의 종균 (seed) 및 생산 생물반응조에서 세포를 배양하여 생물반응조 산물 (112)을 생산하고, 단계 (114)에 나타낸 바와 같이, 이로부터 원하는 치료 단백질을 수확할 수 있다. 수확 단계 (114) 후, 산물은 추가적으로 정제 (즉, 도 2에 기술되고, 상세하게 후술한 바와 같은, DSP)를 거치거나, 또는 이들 산물은 전형적으로 냉동 및 약 -80℃에서의 저장에 의해 벌크 저장될 수 있다.
구현예에서, 세포 배양 기술에 의한 단백질 생산은, 공정-관련 파라미터의 개선에 의해 확인되는 바와 같이, 전술한 부형제를 사용함으로써 개선될 수 있다. 구현예에서, 바람직한 부형제는 세포 배양 배지의 점도를 적어도 20% 감소시키는데 효과적인 양으로 USP 중에 첨가될 수 있다. 다른 구현예들에서, 바람직한 부형제는 세포 배양 배지의 점도를 적어도 30% 감소시키는데 효과적인 양으로 USP 중에 첨가될 수 있다. 구현예에서, 바람직한 부형제는 세포 배양 배지에 약 1 mM 내지 약 400 mM 함량으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 바람직한 부형제는 세포 배양 배지에 약 20 mM 내지 약 200 mM의 함량으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 바람직한 부형제는 세포 배양 배지에 약 25 mM 내지 약 100 mM의 함량으로 첨가될 수 있다. 바람직한 부형제 또는 부형제들의 조합은 세포 배양 배지에 직접 첨가될 수 있거나, 또는 이는 보다 복합적인 보충 배지의 구성 성분으로서, 예를 들어, 각각 제형화되어 세포 배양 배지에 첨가되는 영양분-함유 용액 또는 "공급 용액"의 구성 성분으로서 첨가될 수 있다. 구현예에서, 담체 용액에 제2 점도-강하 화합물이 직접 또는 보충 배지를 통해 첨가될 수 있으며, 제2 점도-강하 용액은 구체적인 대상 파라미터를 추가적으로 개선한다.
후술한 바와 같이, USP 중에 하나 이상의 점도-강하 부형제를 사용해 개선할 수 있는 수많은 공정-관련 파라미터들이 있다. 예를 들어, 구현예에서, 점도-강하 부형제의 사용은 접종원 증폭 (104) 및 세포 배양 (108 및 110) 단계 등의 단계에서 세포 증식 속도 및/또는 증식 수준과 같은 파라미터를 개선할 수 있거나, 및/또는 다양한 공정 파라미터의 개선과 상호 연관있는 프록시 파라미터를 개선할 수 있다. 예를 들어, 전술한 부형제는 USP 공정에 생산 생물반응조 단계 (110)와 같은 단계에서 첨가하면, 세포 배양 배지의 점도를 낮출 수 있으며, 따라서 열 전달 효율 및 기체 전달 효율을 개선할 수 있다. 세포 배양 공정에는 세포가 단백질을 발현할 수 있도록 하기 위해 산소 주입이 필요하며, 즉 세포내 산소 확산이 속도-제한 단계일 수 있으므로, 용액의 점도 저하에 따른 기체 전달 효율 개선에 의한 산소 흡수율 개선이 단백질 발현 속도 또는 양 및/또는 효율을 개선할 수 있다. 이와 관련하여, 산소 흡수율 및 기체 전달 효율과 같은 파라미터는, 개선이 공정 파라미터 개선, 즉 단백질 발현 개선 또는 공정 효율 개선과 관련있는, 프록시 파라미터로 간주될 수 있다. 다른 예로, 점도-강하용 부형제의 이용가능성은, 예를 들어, 접종원 증폭 단계 (104) 및 세포 배양 단계 (108 및 110) 중에, 단백질 발현에 필요한 단백질 성장인자의 용해성과 같은 프록시 파라미터의 개선을 통해, 공정을 개선할 수 있으며; 성장인자의 용해성 개선으로 인해, 세포는 이들 물질을 더 많이 이용할 수 있게 되며, 따라서 세포 증식을 촉진할 수 있다.
구현예에서, USP에서 단백질 회수량 또는 단백질 회수율과 같은 공정 파라미터는 여러가지 기전을 통해 USP 중의 점도를 낮춤으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 전술한 부형제를 사용함으로써, 완료된 세포 배양물로부터 수확하는 단계 (114)에서 세포 용해 과정을 종료한 시점에, 치료 단백질의 회수가 더 효율적이거나 또는 개선될 수 있다. 이론으로 결부시키는 것은 아니지만, 이러한 점도-강하용 부형제는, 발현된 단백질의 점도를 낮춤으로써, 치료 단백질이 다른 세포용해 성분들로부터 멀리 확산되는 효율을 높일 수 있다. 또한, 단백질-함유 상층액으로부터 막 및 그외 세포 파편의 분리는, 점도-강하용 부형제를 사용함으로써, 보다 빠른 분리 속도 또는 더 높은 상층액 순도로 달성될 수 있으며, 즉 공정의 USP 효율 파라미터를 개선할 수 있다. 또한, 원심분리 또는 여과 단계를 이용하는 단백질 분리 단계는, 부형제가 배지의 점도를 낮추기 때문에, 점도-강하용 부형제를 사용해 보다 신속하게 달성할 수 있다.
구현예에서, 부가적인 이점으로서, 세포 배양에 전술한 점도-강하용 부형제를 사용하면, 단백질 미스-폴딩 및 응집이 감소되므로, USP 시 단백질 수율과 같은 공정 파라미터를 증가시킬 수 있다. 세포 배양이 재조합 단백질의 최대 수율을 달성하도록 최적화되므로, 제조되는 단백질은 고 농도 방식으로 발현되어, 미스-폴딩을 유발할 수 있지만; 점도-강하용 부형제를 첨가하면 미스-폴딩 및 응집을 유발하는 유인성 단백질-단백질 상호작용을 감소시켜, 수확 (114) 시 이용가능한 완전한 재조합 단백질의 양을 높일 수 있는 것으로, 이해된다.
도 2에 나타낸 하류 공정 (DSP)은, 예시적인 구현예로서, 치료 단백질, 예를 들어 단일클론 항체, 생물 약제, 백신 및 기타 생물제의 회수 및 정제를 달성하는 일련의 단계들을 수반한다. USP 종료시, 치료학적 대상 단백질은 숙주 세포부터 분비되어, 세포 배양 배지에 용해될 수 있다. 또한, 치료 단백질은 USP 시퀀스 종료시 숙주 세포의 세포용해 후 유체 배지에 용해될 수 있다. DSP는 용해된 용액 (예, 배양 배지 또는 숙주 세포 세포용해 매질)으로부터 대상 단백질을 회수하고, 이를 정제하는 과정을 거친다. DSP 동안에, (i) 다양한 오염물질 (예, 불용성 세포 파편 및 미립자)이 배지로부터 제거되고, (ii) 단백질 산물이 추출, 석출, 흡착 또는 한외여과와 같은 기법을 통해 단리되며, (iii) 단백질 산물이 친화성 크로마토그래피, 석출 또는 결정화와 같은 기법을 통해 정제되고, (iv) 산물은 추가로 폴리싱 (polishing)되고, 바이러스 제거된다.
도 2에 나타낸 바와 같이, (또한 도 1에 나타낸) 세포 배양 수확물 (200)로부터 나온 공급 원료는 먼저 전형적으로 단백질 A 크로마토그래피 또는 그외 유사한 크로마토그래피 단계를 수반하는 친화성 크로마토그래피 (204)를 거친다. 바이러스 불활성화 단계 (208)는 전형적으로 공급 원료를 낮은 pH에서 유지시키는 것을 수반한다. 하나 이상의 폴리싱 크로마토그래피 단계 (210 및 212)가 숙주 세포 단백질 (HCP), DNA, 하전된 변이체 (charged variant) 및 응집물과 같은 불순물을 제거하기 위해 수행된다. 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피는 통상적으로 첫 폴리싱 크로마토그래피 단계 (210)로서 사용되지만, 제2 크로마토그래피 단계 (212)가 선행 또는 후행될 수 있다. 제2 크로마토그래피 단계 (212)는 숙주-세포 관련 불순물 (예, HCP 또는 DNA) 또는 응집물과 같은 산물 관련 불순물을 추가로 제거한다. 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)가 제2 크로마토그래피 단계 (212)로서 사용될 수 있다. 바이러스 제거를 달성하기 위해 바이러스 여과 (214)가 수행된다. 최종 정제 단계 (218)는 한외여과 및 정용여과를, 그리고 제제화를 위한 준비 (preparation)를 포함할 수 있다.
일반적으로 전술한 바와 같이, 발효 공정 후 정제 공정 또는 DSP는, (1) 세포 배양물 수확, (2) 크로마토그래피 (예, 단백질 A 크로마토그래피 및 폴리싱 크로마토그래피 단계, 예로, 이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피), (3) 바이러스 불활성화, 및 (4) 여과 (예, 단백질을 농축하고, 단백질을 제제 완충제로 교환하기 위한, 바이러스 여과, 무균 여과, 투석 및 한외여과와 정용여과 단계)를 포함할 수 있다. 이러한 정제 공정과 관련된 공정 파라미터를 개선하기 위해 본원에 기술된 점도-강하용 부형제를 사용하는 이점을 예시하는 예들을 아래에 기술한다. 점도-강하용 부형제 또는 이들의 조합물은, 이를 담체 용액에 첨가하거나 또는 임의의 다른 방식으로 대상 단백질과 부형제의 접촉을 용해성 또는 안정화된 형태로든 달성하게 함으로써, 임의의 DSP 단계에 도입할 수 있다. 구현예에서, 제2 점도-강하용 화합물은 DSP 중에 담체 용액에 첨가될 수 있으며, 제2 점도-강하용 화합물은 특정 대상 파라미터를 부가적으로 개선시킨다.
(1) 세포 배양물 수확: 세포 배양물 수확은 일반적으로 세포 파편을 단백질-함유 용액으로부터 물리적으로 제거하는, 원심분리 및 심층 여과 조작을 포함한다. 원심분리 단계는 점도-강하용 부형제 덕분에 세포 파편으로부터 용해성 단백질을 보다 완전하게 분리할 수 있다. 배치 또는 연속 가공 처리에 의해서든 간에, 원심분리에 의한 분리는 조밀상 (dense phase)을 가능한 많이 단단하게 만들어 타겟 단백질의 회수를 극대화하기 위해 필요하다. 구현예에서, 전술한 부형제 또는 이들의 조합물의 첨가는, 예를 들어, 원심분리에 의한 분리 공정의 조밀상으로부터 흘러나오는 단백질-함유 농축물의 수율을 증가시킴으로써, 공정 파라미터인 단백질 수율을 높일 수 있다. 심층 여과 단계는 점도-제한 단계이므로, 즉 용액 점도를 낮추는 부형제를 사용함으로써 더 효율적으로 만들 수 있다. 이러한 공정은 또한 단백질 용액에 기포 유입을 유발할 수 있는데, 이는 전단-유도 스트레스와 커플링되어 정제 중인 치료 단백질 분자를 불안정하게 만들 수 있다. 전술한 바와 같이, 점도-강하용 부형제를 단백질-함유 용액에 세포 배양물 수확 전 및/또는 수확 중에 첨가하면, 이러한 스트레스로부터 단백질을 보호하여, 공정 파라미터인 정량적인 산물 회수를 개선할 수 있다.
(2) 크로마토그래피: 원심분리 또는 여과에 의한 세포 배양물 수확 후, 전형적으로 크로마토그래피를 사용해 발효액 (fermentation broth)으로부터 치료 단백질을 분리한다. 치료 단백질이 항체인 경우, 단백질 A 크로마토그래피를 사용한다: 단백질 A는 IgG 항체에 선택적이므로, 이는 높은 유속과 용량에서 동력학적으로 결합할 것이다. 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피에 대한 비용-효율적인 대안책으로서 사용될 수 있다. CEX를 사용하는 경우, 공급물의 pH는 컬럼에 로딩하기 전 동력학적 결합 용량을 최적화하기 위해 적정하여, 이의 전도성을 낮추어야 한다. 또한, 모방 수지 (mimetic resin) 역시 단백질 A 크로마토그래피의 대안으로서 사용될 수 있다. 이들 수지는 면역글로불린, 예를 들어 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 Ig-결합 단백질, 합성 리간드, 또는 단백질 A-유사 다공성 폴리머에 결합하기 위한 리간드를 제공한다.
DSP에 다른 크로마토그래피 공정이 사용될 수 있다. 선행 공정 중에 유입된 불순물, 예를 들어 누출된 단백질 A, 세포주로부터 유래한 내독소 또는 바이러스, 잔류 숙주 세포 단백질 또는 DNA, 또는 배지 구성성분을 제거하기 위해, 이온 교환 크로마토그래피 (IEC)가 사용될 수 있다. IEC는, CEX든 또는 음이온 교환 크로마토그래피이든, 단백질 A 크로마토그래피 다음에 직접 사용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)는, 일반적으로 응집물을 제거하기 위한 폴리싱 단계로서 사용되는 IEC를 보완할 수 있다. 구현예에서, 전술한 부형제의 사용은 크로마토그래피 컬럼 로딩 단계에서 숙주 세포 단백질의 용해성을 증가시키고, 이의 점도를 낮출 수 있다. 구현예에서, 전술한 부형제의 사용은 크로마토그래피 컬럼 로딩 단계 및 용출 단계에서 치료 단백질의 용해성을 증가시키고, 이의 점도를 낮출 수 있다.
단백질 정제에서 크로마토그래피 공정은, (a) 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되는 동안의 낮은 pH 환경, (b) 크로마토그래피 수지의 포어-공간 (pore-space) 내 국소 단백질 농도 상승 (흔히 300-400 mg/mL 수준), (c) 이온 교환 크로마토그래피 중의 염 농도 상승, 및 (d) HIC 컬럼으로부터의 용출물 내 염석제 (salting-out agent) 농도 상승과 같은, 단백질 제제에 해로운 환경을 제공한다. 단백질-함유 용액에 점도-강하용 부형제를 크로마토그래피 이전 및/또는 이후에 전술한 바와 같이 첨가하면, 크로마토그래피 공정 단계들에 의해 기인하는 잠재적으로 유해한 환경에 덜 노출되도록, 단백질의 크로마토그래피 컬럼 통과를 용이하게 만들 수 있다. 또한, 컬럼 포어-공간 내 국소 단백질의 농도 상승은 이 공간 내 물질을 고 점성으로 만들어, 컬럼에 유의한 역압을 야기할 수 있다. 역압을 완화하기 위해, 상대적으로 큰 기공을 가진 매질이 일반적으로 사용된다. 그러나, 포어가 큰 매질은 해리능 (resolving power)이 포어가 작은 것 보다 낮다. 전술한 바와 같이 점도-변형 부형제를 투입하면, 포어가 더 작은 크로마토그래피 매질을 이용할 수 있게 만든다. 구현예에서, 단백질 A 크로마토그래피의 용출 단계는, 타겟 단백질의 용해성 저하 및 이의 응집 증가를 야기할 수 있는, 낮은 pH 환경에 치료 단백질을 노출시킨다: 부형제를 첨가하면 타겟 단백질의 용해성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 단백질 A 크로마토그래피 단계의 회수 수율은 개선된다. 다른 구현예들에서, 부형제를 사용하면, 단백질 A 수지로부터 타겟 단백질을 더 높은 pH에서 용출시킬 수 있으므로, 이는 타겟 단백질에 대한 화학적 스트레스를 감소시켜, 처리 공정 중에 발생되는 단백질 분해량을 줄여줌으로써 공정 파라미터인 단백질 수율을 개선할 수 있다.
(3) 바이러스 불활성화: 바이러스 불활성화 공정은 전형적으로 낮은 pH, 예를 들어 pH 4 미만에서 단백질 용액을 장기간 유지시키는 단계를 수반한다. 그러나, 이러한 환경이 치료 단백질을 불안정하게 만들 수 있다. 예를 들어, 바이러스 불활성화 공정 이전 및/또는 도중에, 점도-강하용 부형제를 첨가함으로써, 점도-강하용 부형제의 존재 하에 단백질을 포뮬레이션하면, 단백질 안정성 또는 용해성, 또는 이의 전체 수율과 같은 공정 파라미터를 개선할 수 있다.
(4) 여과: 여과 공정은 바이러스 입자를 제거하기 위한 바이러스 여과 공정 (나노여과) 및 단백질 용액을 농축하고 완충제 시스템을 교환하기 위한 한외여과/정용여과 공정을 포함한다.
(a) 바이러스 여과는, 재조합 인간 단일클론 항체의 2배 크기일 수 있는, 바이러스 입자를 제거함으로써 단백질 용액을 정제한다. 따라서, 바이러스 여과용 여과막은 나노-크기의 기공이어야 할 수 있다. 단백질이 통과해야 하는 기공의 크기가 작기 때문에, 여과 단계는 단백질에 스트레스를 야기할 수 있으며, 단백질 응집 입자로부터 발생되는 상당 수준의 막 파울링 (membrane fouling)을 수반한다. 점도-강하용 부형제를, 예를 들어, 여과 이전 및/또는 여과 도중에, 전술한 바와 같이, 첨가하면, 총체적인 확산계수 (collective diffusivity)를 증가시킴으로써, 여과 시스템에 역압과 같은 측정가능한 파라미터를 낮출 수 있으며, 막 파울링을 유발하는 단백질-단백질 상호작용을 완화함으로써 막 파울링 경향을 낮출 수 있다. 최종 결과는 이들 파라미터의 개선이며, 이는 단백질 정제시 바이러스 여과 유닛의 성능 개선을 의미한다.
(b) 한외여과 및 정용여과 (UF/DF) 공정은 대상 단백질 보다 작은 특정 분자량 컷오프를 가진 필터 막을 통해 단백질-함유 용액을 통과시킴으로써, 단백질 용액을 농축하고, 완충제 시스템을 교체한다. 이 단계에서, 단백질 용액은 필터 유닛 내에 높은 전단 스트레스, 단백질 농도 상승 및 UF/DF 공정에서 전형적으로 사용되는 소수성 막에 단백질이 흡착되는 현상에 노출되게 되며, 이들 모두 단백질 응집을 증가시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 점도-강하용 부형제를, 예를 들어, UF/DF 공정 이전 및/또는 도중에 첨가하면, 총체적인 확산계수 (예, kD 증가에 의해 측정됨)를 증가시켜 여과 시스템내 역압을 줄일 수 있다. 이는 막 전체 전단 스트레스를 줄일 뿐만 아니라 필터 막으로부터 역-확산 감소를 촉진하여, 막 계면에서 유효 단백질 농도를 낮추고, 투과 유량 (permeate flux)을 증가시킨다. 그 결과, 점도-강하용 부형제를 사용하여, 이들 여과 공정에서의 더 높은 처리량, 생산 소실 감소 및 총 수율 증가와 관련된 파라미터를 개선할 수 있다. 또한, 한외- 및 투석필터 (diafilter)를 통해 점성 유체를 통과시키면, 필터 장치 전체에 상당한 압력 강하 (pressure drop)가 발생하여, 분리가 비효율적이게 될 수 있다. 전술한 바와 같이 점도-강하용 부형제의 존재 하에 단백질 용액을 포뮬레이션하면, 필터 장치 전체에 대한 압력 강하를 실질적으로 줄일 수 있으며, 이로써 공정 파라미터인 운영 단가 (operation cost) 및 공정 시간을 모두 줄임으로써 이를 개선할 수 있다.
부형제를 첨가하여 상류 단백질 처리 또는 하류 정제를 완료한 후, 부형제는 약물 물질 혼합물의 일부로서 잔류하거나, 또는 단백질 활성 성분으로부터 분리될 수 있다. 단백질 활성 성분으로부터 부형제를 분리하기 위해, 완충제 교환, 이온 교환, 한외여과 및 투석과 같은 전형적인 소분자 분리 방법을 이용할 수 있다. 상기한 부형제의 사용은, 전술한 바와 같은 단백질 정제 공정에 유익한 효과 외에도, 단백질 제조, 가공 처리 및 정제에 사용되는 장치를 보호 및 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 장치-관련 공정, 예를 들어, 세척, 살균 및 단백질 처리 장치의 유지는, 단백질의 파울링 감소, 변성 저하, 낮은 점성 및 용해성 개선으로 인해, 전술한 부형제의 사용에 의해 용이해질 수 있으며, 이러한 처리 개선과 관련된 파라미터도 마찬가지로 개선된다.
상류 및/또는 하류 공정을 개선하기 위한 부형제 화합물의 사용이 본원에 광범위하게 기술되었지만, 대상 파라미터의 개선과 같은 바람직한 효과를 달성하기 위해 부형제들의 조합을 함께 첨가할 수 있는 것으로 이해된다. 용어 "부형제 첨가제"는 바람직한 효과 또는 파라미터 개선을 유도하는 하나의 부형제 화합물, 또는 바람직한 효과 또는 파라미터 개선을 달성하는 부형제 화합물들의 조합을 지칭할 수 있다.
실시예
재료:
· 보바인 감마 글로불린 (BGG), 순도 >99%, Catalog #G5009, Sigma Aldrich
· 히스티딘, Sigma Aldrich
· 이하 실시예에 언급된 기타 재료들은 달리 언급되지 않은 한 Sigma Aldrich 사로부터 구입함.
실시예 1: 부형제 화합물 및 시험 단백질을 함유한 제제 제조
제제는 부형제 화합물과 시험 단백질을 사용해 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제제에 사용될 비-치료 단백질을 모방하는 것으로 의도된다. 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 여러가지 부형제 화합물이 첨가된 50 mM 히스티딘 하이드로클로라이드 중에 제조하였다. 먼저, 증류수에 히스티딘 1.94 g을 용해하고, 1 M 염산 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 pH 약 6.0까지 적정한 다음, 메스 플라스크에서 증류수로 최종 부피 250 mL로 희석함으로써, 히스티딘 하이드로클로라이드를 먼저 제조하였다. 그런 후, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해하였다. 부형제 리스트는 실시예 4, 5, 6 및 7에 제공된다. 일부 경우에, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해하기 전에 pH 6으로 적정하였다. 이 경우, 부형제 화합물을 먼저 탈이온수에 약 5 wt%으로 용해한 다음, 염산 또는 수산화나트륨으로 pH 약 6.0으로 적정하였다. 제조한 염 용액을 컨벡션 실험실 오븐에 넣고 약 65℃에 두어, 물을 증발시키고, 고체 부형제를 단리하였다. 50 mM 히스티딘 HCl 중의 부형제 용액이 준비되면, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 부형제 용액 1 mL 당 BGG 약 0.336 g의 비율로 용해하였다. 이로써 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 달성되었다. 부형제가 첨가된 50 mM 히스티딘 HCl 중의 BGG 용액을 20 mL 바이얼에서 제조하고, 회전 진탕기 테이블 위에서 밤새 100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관에 넣고, IEC MicroMax 원심분리기에서 2300 rpm으로 10분간 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 공기를 제거하였다.
실시예 2: 점도 측정
실시예 1에 언급된 바와 같이 제조한 제제에 대한 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제는 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다.
실시예 3: 단백질 농도 측정
단백질 용액의 흡광도를 UV/VIS 분광기 (Perkin Elmer Lambda 35)에서 파장 280 nm 하에 측정하여, 실험 용액 내 단백질의 농도를 결정하였다. 먼저, pH 6의 50 mM 히스티딘 완충제를 사용해 장비를 흡광도 0으로 보정하였다. 그런 후, 단백질 용액을 동일한 히스티딘 완충제로 300배 희석하고, 280 nm에서 흡광도를 기록하였다. 용액 내 단백질의 최종 농도를 흡광 계수 1.264 mL/(mg x cm)를 사용해 계산하였다.
실시예 4: 힌더드 아민 부형제 화합물이 첨가된 제제
일부 샘플에는 부형제 화합물이 첨가된, 280 mg/mL BGG 제제들을 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 검사에서, 다이메틸사이클로헥실아민 (DMCHA), 다이사이클로헥실메틸아민 (DCHMA), 다이메틸아미노프로필아민 (DMAPA), 트리에탄올아민 (TEA), 다이메틸에탄올아민 (DMEA) 및 니아신아미드의 하이드로클로라이드 염을 힌더드 아민 부형제 화합물의 예로서 조사하였다. 또한, 타우린-다이시안다이아미드 부가물과 DMCHA의 하이드록시벤조산 염을 힌더드 아민 부형제 화합물의 예로서 조사하였다. 각 단백질 용액의 점도를 실시예 2에서와 같이 측정하고, 그 결과는 아래 표 1에 나타내었으며, 하기 표는 첨가된 부형제 화합물의 점도 강하 효과를 보여준다.
표 1
시험 번호 첨가 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소율
4.1 없음 0 79 0%
4.2 DMCHA-HCl 28 50 37%
4.3 DMCHA-HCl 41 43 46%
4.4 DMCHA-HCl 50 45 43%
4.5 DMCHA-HCl 82 36 54%
4.6 DMCHA-HCl 123 35 56%
4.7 DMCHA-HCl 164 40 49%
4.8 DMAPA-HCl 87 57 28%
4.9 DMAPA-HCl 40 54 32%
4.10 DCHMA-HCl 29 51 35%
4.11 DCHMA-HCl 50 51 35%
4.14 TEA-HCl 97 51 35%
4.15 TEA-HCl 38 57 28%
4.16 DMEA-HCl 51 51 35%
4.17 DMEA-HCl 98 47 41%
4.20 DMCHA-하이드록시벤조에이트 67 46 42%
4.21 DMCHA-하이드록시벤조에이트 92 42 47%
4.22 실시예 8의 산물 26 58 27%
4.23 실시예 8의 산물 58 50 37%
4.24 실시예 8의 산물 76 49 38%
4.25 실시예 8의 산물 103 46 42%
4.26 실시예 8의 산물 129 47 41%
4.27 실시예 8의 산물 159 42 47%
4.28 실시예 8의 산물 163 42 47%
4.29 니아신아미드 48 39 51%
4.30 N-메틸-2-피롤리돈 30 45 43%
4.31 N-메틸-2-피롤리돈 52 52 34%
실시예 5: 음이온성 방향족 부형제 화합물이 첨가된 제제
일부 샘플에 부형제 화합물이 첨가된, 280 mg/mL BGG 제제들을 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 각 용액의 점도를 실시예 2에서와 같이 측정하여 그 결과를 아래 표 2에 제시하며, 하기 표는 첨가된 부형제 화합물의 점도 강하 효과를 보여준다.
표 2
시험 번호 첨가 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소율
5.1 없음 0 79 0%
5.2 소듐 아미노벤조에이트 43 48 39%
5.3 소듐 하이드록시벤조에이트 26 50 37%
5.4 소듐 설파닐레이트 44 49 38%
5.5 소듐 설파닐레이트 96 42 47%
5.6 소듐 인돌 아세테이트 52 58 27%
5.7 소듐 인돌 아세테이트 27 78 1%
5.8 바닐린산, 소듐염 25 56 29%
5.9 바닐린산, 소듐염 50 50 37%
5.10 소듐 살리실레이트 25 57 28%
5.11 소듐 살리실레이트 50 52 34%
5.12 아데노신 모노포스페이트 26 47 41%
5.13 아데노신 모노포스페이트 50 66 16%
5.14 소듐 벤조에이트 31 61 23%
5.15 소듐 벤조에이트 56 62 22%
실시예 6: 올리고펩타이드 부형제 화합물이 첨가된 제제
N 말단이 유리 아민이고 C 말단이 유리산인 올리고펩타이드 (n=5)를 NeoBioLab Inc. (Woburn, MA) 사에서 >95% 순도로 합성하였다. 다이펩타이드 (n=2)는 LifeTein LLC (Somerset, NJ) 사에서 95% 순도로 합성하였다. 일부 샘플에 부형제 화합물이 첨가된, 280 mg/mL BGG 제제들을 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 각 용액의 점도를 실시예 2에서와 같이 측정하여 그 결과를 아래 표 3에 제시하며, 하기 표는 첨가된 부형제 화합물의 점도 강하 효과를 보여준다.
표 3
시험 번호 첨가 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소율
6.1 없음 0 79 0%
6.2 ArgX5 100 55 30%
6.3 ArgX5 50 54 32%
6.4 HisX5 100 62 22%
6.5 HisX5 50 51 35%
6.6 HisX5 25 60 24%
6.7 Trp2Lys3 100 59 25%
6.8 Trp2Lys3 50 60 24%
6.9 AspX5 100 102 -29%
6.10 AspX5 50 82 -4%
6.11 다이펩타이드 LE (Leu-Glu) 50 72 9%
6.12 다이펩타이드 YE (Tyr-Glu) 50 55 30%
6.13 다이펩타이드 RP (Arg-Pro) 50 51 35%
6.14 다이펩타이드 RK (Arg-Lys) 50 53 33%
6.15 다이펩타이드 RH (Arg-His) 50 52 34%
6.16 다이펩타이드 RR (Arg-Arg) 50 57 28%
6.17 다이펩타이드 RE (Arg-Glu) 50 50 37%
6.18 다이펩타이드 LE (Leu-Glu) 100 87 -10%
6.19 다이펩타이드 YE (Tyr-Glu) 100 68 14%
6.20 다이펩타이드 RP (Arg-Pro) 100 53 33%
6.21 다이펩타이드 RK (Arg-Lys) 100 64 19%
6.22 다이펩타이드 RH (Arg-His) 100 72 9%
6.23 다이펩타이드 RR (Arg-Arg) 100 62 22%
6.24 다이펩타이드 RE (Arg-Glu) 100 66 16%
실시예 8: 구아닐 타우린 부형제 합성
구아닐 타우린을 미국 특허 2,230,965에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 타우린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 3.53 부를 다이시안다이아미드 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 1.42 부와 혼합한 다음, 막자사발 및 유봉으로 균질한 혼합물이 수득될 때까지 분쇄하였다. 그런 후, 혼합물을 플라스크에 넣어, 4시간 동안 200℃에서 가열하였다. 산물은 추가적인 정제없이 사용하였다.
실시예 9: 부형제 화합물을 함유한 단백질 제제
제제들을 부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용해 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제제에 사용될 비-치료 단백질을 모방하는 것으로 의도하였다. 이들 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 여러가지 부형제 화합물이 첨가된 50 mM 히스티딘 하이드로클로라이드 완충제 수용액으로 제조하였다. 먼저, 증류수에 히스티딘 1.94 g을 용해하고, 1 M 염산 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 pH 약 6.0까지 적정한 다음, 메스 플라스크에서 증류수로 최종 부피 250 mL로 희석함으로써, 히스티딘 하이드로클로라이드 완충액을 먼저 제조하였다. 그런 후, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl 완충액에 용해하였다. 부형제 리스트는 실시예 4에 나타낸다. 일부 경우에, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl 완충액에 용해하고, 모델 단백질을 용해하기 전에 수득한 용액을 소량의 수산화나트륨 또는 염산으로 적정하여 pH 6으로 만들었다. 일부 경우, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해하기 전 pH 6으로 적정하였다. 이 경우, 부형제 화합물을 먼저 탈이온수에 약 5 wt%으로 용해한 다음, 염산 또는 수산화나트륨으로 pH 약 6.0으로 적정하였다. 제조한 염 용액을 컨벡션 실험실 오븐에 넣어 약 65℃ 하에 두어, 물을 증발시키고, 고체 부형제를 단리하였다. 50 mM 히스티딘 HCl 중의 부형제 용액이 준비되면, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 달성되는 비율로 용해하였다. 부형제가 첨가된 50 mM 히스티딘 HCl 중의 BGG 용액을 20 mL 바이얼에서 제조하여, 회전 진탕기 테이블 위에서 밤새 100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관에 넣고, IEC MicroMax 원심분리기에서 2300 rpm으로 10분간 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 공기를 제거하였다.
상기와 같이 제조한 제제들에 대한 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다. 부형제 함유 용액의 점도를 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대해 표준화 (normalization)하였다. 표준화된 점도는 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제 함유 모델 단백질 용액의 점도의 비이다.
표 4
시험 번호 첨가 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 표준화된 점도 (cP) 점도 감소율
9.1 DMCHA-HCl 120 0.44 56%
9.2 니아신아미드 50 0.51 49%
9.3 이소니코틴아미드 50 0.48 52%
9.4 티라민 HCl 70 0.41 59%
9.5 히스타민 HCl 50 0.41 59%
9.6 이미다졸 HCl 100 0.43 57%
9.7 2-메틸-2-이미다졸린 HCl 60 0.43 57%
9.8 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 클로라이드 100 0.48 52%
9.9 프로카인 HCl 50 0.53 47%
9.10 3-아미노피리딘 50 0.51 49%
9.11 2,4,6-트리메틸피리딘 50 0.49 51%
9.12 3-피리딘 메탄올 50 0.53 47%
9.13 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 20 0.56 44%
9.15 소듐 페닐피루베이트 55 0.57 43%
9.16 2-피롤리디논 60 0.68 32%
9.17 모르폴린 HCl 50 0.60 40%
9.18 아그마틴 설페이트 55 0.77 23%
9.19 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 아이오다이드 60 0.66 34%
9.21 L-안세린 나이트레이트 50 0.79 21%
9.22 1-헥실-3-메틸이미다졸륨 클로라이드 65 0.89 11%
9.23 N,N-다이에틸 니코틴아미드 50 0.67 33%
9.24 니코틴산, 소듐염 100 0.54 46%
9.25 바이오틴 20 0.69 31%
실시예 10: 부형제 조합물과 시험 단백질을 함유한 제제의 제조
제제는 제1 부형제 화합물, 제2 부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용해 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제제에 사용될 비-치료 단백질을 모방하는 것으로 의도하였다. 제1 부형제 화합물은 아래 표 5에 열거한 바와 같이 음이온성 및 방향족 관능기를 둘다 가진 화합물로부터 선택하였다. 제2 부형제 화합물은 아래 표 5에 열거한 바와 같이 pH 6에서 비-이온성 또는 양이온성 전하 및 이미다졸린 또는 벤젠 고리를 가진 화합물들로부터 선택하였다. 이들 부형제로 된 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 50 mM 히스티딘 하이드로클로라이드 완충액 중에 준비하였다. 먼저, 증류수에 히스티딘 1.94 g을 용해하고, 1 M 염산 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 pH 약 6.0까지 적정한 다음, 메스 플라스크에서 증류수로 최종 부피 250 mL로 희석함으로써, 히스티딘 하이드로클로라이드를 제조하였다. 그런 후, 제1 또는 제2 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해하였다. 제1 부형제와 제2 부형제의 조합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해하고, 모델 단백질을 용해하기 전에 수득한 용액을 소량의 수산화나트륨 또는 염산으로 적정하여 pH 6으로 만들었다. 부형제 용액을 상기와 같이 제조한 후, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 각 시험 용액에 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 달성되는 비율로 용해하였다. 부형제가 첨가된 50 mM 히스티딘 HCl 중의 BGG 용액을 20 mL 바이얼에서 제조하여, 회전 진탕기 테이블 위에서 밤새 100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관에 넣고, IEC MicroMax 원심분리기에서 2300 rpm으로 10분간 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 공기를 제거하였다.
상기와 같이 제조한 제제들에 대한 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다. 부형제 함유 용액의 점도를 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대해 표준화하여, 아래 표 5에 요약 개시하였다. 표준화된 점도는 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제 함유 모델 단백질 용액의 점도의 비이다. 본 실시예는, 제1 부형제와 제2 부형제의 조합물이 단일 부형제 보다 우수한 결과를 제공할 수 있음을, 보여준다.
표 5
제1 부형제
제2 부형제
표준화된 점도
시험 번호 명칭 농도 (mg/mL) 명칭 농도 (mg/mL)
10.1 살리실린산 30 없음 0 0.79
10.2 살리실린산 25 이미다졸 4 0.59
10.3 4-하이드록시벤조산 30 없음 0 0.61
10.4 4-하이드록시벤조산 25 이미다졸 5 0.57
10.5 4-하이드록시벤젠 설폰산 31 없음 0 0.59
10.6 4-하이드록시벤젠 설폰산 26 이미다졸 5 0.70
10.7 4-하이드록시벤젠 설폰산 25 카페인 5 0.69
10.8 없음 0 카페인 10 0.73
10.9 없음 0 이미다졸 5 0.75
실시예 11: 부형제 조합물과 시험 단백질을 함유한 제제의 제조
제제는 제1 부형제 화합물, 제2 부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용해 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제제에 사용될 비-치료 단백질을 모방하는 것으로 의도하였다. 제1 부형제 화합물은 아래 표 6에 열거한 바와 같이 음이온성 및 방향족 관능기를 둘다 가진 화합물로부터 선택하였다. 제2 부형제 화합물은 아래 표 6에 열거한 바와 같이 pH 6에서 비-이온성 또는 양이온성 전하 및 이미다졸린 또는 벤젠 고리를 가진 화합물들로부터 선택하였다. 이들 부형제로 된 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 증류수 중에 준비하였다. 제1 부형제와 제2 부형제의 조합물을 증류수에 용해하고, 수득한 용액을 모델 단백질의 용해 전 소량의 수산화나트륨 또는 염산으로 적정하여 pH 6으로 만들었다. 증류수 중의 부형제 용액을 제조한 후, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 달성되는 비율로 용해하였다. 부형제가 첨가된 증류수 중의 BGG 용액을 20 mL 바이얼에서 제조하여, 회전 진탕기 테이블 위에서 밤새 100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관에 넣고, IEC MicroMax 원심분리기에서 2300 rpm으로 10분간 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 공기를 제거하였다.
상기와 같이 제조한 제제들에 대한 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다. 부형제 함유 용액의 점도를 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대해 표준화하여, 아래 표 6에 요약 개시하였다. 표준화된 점도는 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제 함유 모델 단백질 용액의 점도의 비이다. 본 실시예는, 제1 부형제와 제2 부형제의 조합물이 단일 부형제 보다 우수한 결과를 제공할 수 있음을, 보여준다.
표 6
제1 부형제 제2 부형제 표준화된
점도
시험 번호 명칭 농도 (mg/mL) 명칭 농도 (mg/mL)
11.1 살리실린산 20 없음 0 0.96
11.2 살리실린산 20 카페인 5 0.71
11.3 살리실린산 20 니아신아미드 5 0.76
11.4 살리실린산 20 이미다졸 5 0.73
실시예 12: 부형제 화합물과 PEG를 함유한 제제의 제조
재료: 모든 재료는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 사에서 구입하였다. 제제는 부형제 화합물과 PEG를 사용해 제조하였으며, PEG는 치료 제제에 사용된 페길화된 치료 단백질을 모방하도록 의도되었다. 이들 제제는 PEG 용액을 부형제 용액과 동일 부피로 혼합하여 제조하였다. 이들 2가지 용액은 10 mM Tris, 135 mM NaCl, 1 mM 트랜스-신남산으로 구성된 트리스 완충제 (pH 7.3) 중에 제조하였다.
PEG 용액은 평균 Mw ~1,000,000의 폴리(에틸렌 옥사이드) (Aldrich Catalog # 372781) 3 g을 트리스 완충액 97 g과 혼합하여 제조하였다. 혼합물은 밤새 교반하여 완전히 용해시켰다.
부형제 용액의 제조 일예는 다음과 같다: 구연산 (Aldrich cat. # 251275) 0.4 g을 트리스 완충액 5 mL에 용해하고, 최소량의 10 M NaOH를 사용해 pH 7.3으로 적정하여, 트리스 완충제 중의 구연산 약 80 mg/mL 용액을 제조하였다.
PEG 용액 0.5 mL과 부형제 용액 0.5 mL을 혼합하여 PEG 부형제 용액을 제조한 다음 이를 수초간 볼텍스를 이용해 혼합하였다. 대조군 샘플은, PEG 용액 0.5 mL을 트리스 완충액 0.5 mL과 혼합하여, 제조하였다.
실시예 13: 부형제 화합물과 PEG 함유 제제의 점도 측정
제조한 제제들에 대한 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다.
표 7에 나타낸 결과는 첨가된 부형제 화합물의 점도 강하 효과를 보여준다.
표 7
시험 번호 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소율
13.1 없음 0 104.8 0%
13.2 구연산 Na 염 40 56.8 44%
13.3 구연산 Na 염 20 73.3 28%
13.4 글리세롤 포스페이트 40 71.7 30%
13.5 글리세롤 포스페이트 20 83.9 18%
13.6 에틸렌 다이아민 40 84.7 17%
13.7 에틸렌 다이아민 20 83.9 15%
13.8 EDTA/K 염 40 67.1 36%
13.9 EDTA/K 염 20 76.9 27%
13.10 EDTA/Na 염 40 68.1 35%
13.11 EDTA/Na 염 20 77.4 26%
13.12 D-글루콘산/K 염 40 80.32 23%
13.13 D-글루콘산/K 염 20 88.4 16%
13.14 D-글루콘산/Na 염 40 81.24 23%
13.15 D-글루콘산/Na 염 20 86.6 17%
13.16 젖산/K 염 40 80.42 23%
13.17 젖산/K 염 20 85.1 19%
13.18 젖산/Na 염 40 86.55 17%
13.19 젖산/Na 염 20 87.2 17%
13.20 에티드론산/K 염 24 71.91 31%
13.21 에티드론산/K 염 12 80.5 23%
13.22 에티드론산/Na 염 24 71.6 32%
13.23 에티드론산/Na 염 12 79.4 24%
실시예 14: BSA 분자 당 PEG 체인 1개를 가진 페길화된 BSA 제조
비이커에, 포스페이트 완충화된 염수 (Aldrich Cat. # P4417) 200 mL과 BSA (Aldrich Cat. # A7906) 4 g을 첨가하고, 자기 막대로 혼합하였다. 그런 후, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드, MW=5,000, (Aldrich Cat. # 63187) 400 mg을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 반응시켰다. 다음날, 0.1 M HCl 20 방울을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 반응 산물을 SDS-PAGE 및 SEC로 특징을 규명하였으며, 페길화된 BSA를 명확하게 관찰하였다. 반응 혼합물을 분자량 컷오프 (MWCO) 30,000의 Amicon 원심분리관에 넣고, 수 ㎖로 농축하였다. 그런 후, 샘플을 약 pH 6의 50 mM 히스티딘 완충제로 20배 희석한 다음, 고 점성의 유체가 수득될 때까지 농축하였다. 단백질 용액의 흡광도를 280 nm에서 측정하고, BSA 여기 계수 0.6678을 이용해, 단백질 용액의 최종 농도를 구하였다. 그 결과, 용액 내 BSA의 최종 농도는 342 mg/mL인 것으로 확인되었다.
실시예 15: BSA 분자 당 PEG 체인을 여러 개 가진 페길화된 BSA 제조
BSA 0.5 g을 완충제 100 mL과 혼합하여, pH 7.2의 25 mM 포스페이트 완충제 중의 5 mg/mL BSA (Aldrich A7906) 용액을 제조하였다. 그런 후, 메톡시 PEG 프로피온알데하이드 Mw=20,000 (JenKem Technology, Plano, TX 75024) 1 g을 첨가한 다음, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich 156159) 0.12 g을 첨가하였다. 다음날, 반응 혼합물을 트리스 완충제 (10 mM Tris, 135 mM NaCl, pH=7.3)로 13배 희석하고, MWCO 30,000의 Amicon 원심분리관을 사용해 약 150 mg/mL 농도에 도달할 때까지 농축하였다.
실시예 16: 리소자임 분자 당 PEG 체인을 여러 개 가진 페길화된 리소자임 제조
리소자임 0.5 g을 완충제 100 mL과 혼합하여, pH 7.2의 25 mM 포스페이트 완충제 중의 5 mg/mL 리소자임 (Aldrich L6876) 용액을 제조하였다. 그런 후, 메톡시 PEG 프로피온알데하이드 Mw=5,000 (JenKem Technology, Plano, TX 75024) 1 g을 첨가한 다음, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich 156159) 0.12 g을 첨가하였다. 반응은 밤새 실온에서 진행하였다. 다음날, 반응 혼합물을 pH 7.2의 25 mM 포스페이트 완충제로 49배 희석하고, MWCO 30,000의 Amicon 원심분리관을 사용해 농축하였다. 단백질 용액의 흡광도를 280 nm에서 측정하고, 리소자임 여기 계수 2.63을 이용해, 단백질 용액의 최종 농도를 구하였다. 그 결과, 용액 내 리소자임의 최종 농도는 140 mg/mL으로 확인되었다.
실시예 17: BSA 분자 당 PEG 체인 1개를 가진 페길화된 BSA의 점도에 대한 부형제의 영향
부형제 염 6 또는 12 mg을 페길화된 BAS 용액 0.3 mL에 첨가하여, 부형제가 첨가된 (실시예 14의) 페길화된 BSA 제제를 제조하였다. 용액을 부드럽게 교반하여 혼합하고, 전단 속도 500 sec-1에서 A10 채널 (100-미크론 깊이)이 장착된 RheoSense microVisc에 의해 점도를 측정하였다. 점도계 측정은 주위 온도에서 완료하였다.
표 8에 나타낸 결과는 첨가된 부형제 화합물의 점도 강하 효과를 보여준다.
표 8
시험 번호 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소율
17.1 없음 0 228.6 0%
17.2 알파-사이클로덱스트린 황산화 Na 염 20 151.5 34%
17.3 K 아세테이트 40 89.5 60%
실시예 18: BSA 분자 당 PEG 체인을 여러 개 가진 페길화된 BSA의 점도에 대한 부형제의 영향
부형제 염 8 mg을 페길화된 BAS 용액 0.2 mL에 첨가하여, 부형제로서 구연산 Na 염이 첨가된 (실시예 15의) 페길화된 BSA 제제를 제조하였다. 용액을 부드럽게 교반하여 혼합하고, 전단 속도 500 sec-1에서 A10 채널 (100-미크론 깊이)이 장착된 RheoSense microVisc에 의해 점도를 측정하였다. 점도계 측정은 주위 온도에서 완료하였다. 표 9에 나타낸 결과는 첨가된 부형제 화합물의 점도 강하 효과를 보여준다.
표 9
시험 번호 첨가 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소율
18.1 없음 0 56.8 0%
18.2 구연산 Na 염 40 43.5 23%
실시예 19: 리소자임 분자 당 PEG 체인을 여러 개 가진 페길화된 리소자임의 점도에 대한 부형제의 영향
부형제 염 6 mg을 페길화된 리소자임 용액 0.3 mL에 첨가하여, 부형제로서 포타슘 아세테이트가 첨가된 (실시예 16의) 페길화된 리소자임 제제를 제조하였다. 용액을 부드럽게 교반하여 혼합하고, 전단 속도 500 sec-1에서 A10 채널 (100-미크론 깊이)이 장착된 RheoSense microVisc에 의해 점도를 측정하였다. 점도계 측정은 주위 온도에서 완료하였다. 아래 표에 나타낸 결과는 첨가된 부형제 화합물의 점도 강하 효과를 보여준다.
표 10
시험 번호 부형제 부형제 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소율
19.1 없음 0 24.6 0%
19.2 K 아세테이트 20 22.6 8%
실시예 20: 부형제 조합물을 함유한 단백질 제제
부형제 화합물 또는 부형제 화합물 2종 및 시험 단백질을 사용해 제제를 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질을 모방하도록 의도하였다. 이들 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 여러가지 부형제 화합물들을 첨가하여 20 mM 히스티딘 완충제 중에 제조하였다. 부형제 조합물을 20 mM 히스티딘에 용해하고, 수득한 용액을 모델 단백질 용해 전 소량의 수산화나트륨 또는 염산으로 적정하여 pH 6으로 만들었다. 본 실시예에 사용된 부형제 화합물들은 아래 표 11에 나타낸다. 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 되는 비율로 용해하였다. 부형제 용액 중의 BGG 용액을 5 mL 무균 폴리프로필렌 시험관에서 제조하고, 회전 진탕기 테이블 위에서 밤새 80-100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관에 넣고, IEC MicroMax 원심분리기에서 2300 rpm으로 10분간 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 공기를 제거하였다.
상기에서 제조한 제제들에 대한 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다. 부형제 함유 용액의 점도를 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대해 표준화하였으며, 그 결과를 아래 표 11에 나타낸다. 표준화된 점도는 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제 함유 모델 단백질 용액의 점도의 비이다.
표 11
시험 # 부형제 A 부형제 B 표준화된 점도
명칭 농도 (mg/mL) 명칭 농도 (mg/mL)
20.1 없음 0 없음 0 1.00
20.2 아스파르탐 10 없음 0 0.83
사카린 60 없음 0 0.51
20.4 아세설팜 K 80 없음 0 0.44
20.5 테오필린 10 없음 0 0.84
20.6 사카린 30 없음 0 0.58
20.7 아세설팜 K 40 없음 0 0.61
20.8 카페인 15 타우린 15 0.82
20.9 카페인 15 티라민 15 0.67
실시예 21: 점도 및 주사 통증을 줄이기 위해 부형제를 함유한 단백질 제제
부형제 화합물, 제2 부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용해 제제를 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질을 모방하도록 의도하였다. 제1 부형제 화합물, 부형제 A는 국소 마취 특성을 가진 화합물 군에서 선택하였다. 제1 부형제, 부형제 A 및 제2 부형제, 부형제 B는 표 12에 열거한다. 이들 제제는, 다음과 같은 방식으로 부형제 A 및 부형제 B를 사용해 20 mM 히스티딘 완충제 중에 제조하였으며, 이의 점도를 측정할 수 있었다. 표 12에 나타낸 함량의 부형제들을 20 mM 히스티딘에 용해하고, 수득한 용액을 모델 단백질 용해 전 소량의 수산화나트륨 또는 염산으로 적정하여 pH 6으로 만들었다. 부형제 용액이 제조된 후, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 부형제 용액에 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 달성되는 비율로 용해하였다. 부형제 용액 중의 BGG 용액을 5 mL 무균 바이얼에서 제조하여, 회전 진탕기 테이블 위에서 밤새 80-100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관에 넣고, IEC MicroMax 원심분리기에서 2300 rpm으로 10분간 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 공기를 제거하였다.
상기와 같이 제조한 제제들에 대한 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다. 부형제 함유 용액의 점도를 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대해 표준화하여, 아래 표 12에 나타낸다. 표준화된 점도는 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제 함유 모델 단백질 용액의 점도의 비이다.
표 12
시험 # 부형제 A 부형제 B 표준화된 점도
명칭 농도 (mg/mL) 명칭 농도 (mg/mL)
21.1 없음 0 없음 0 1.00
21.2 리도카인 45 없음 0 0.73
21.3 리도카인 23 없음 0 0.74
21.4 리도카인 10 카페인 15 0.71
21.5 프로카인 HCl 40 없음 0 0.64
21.6 프로카인 HCl 20 카페인 15 0.69
실시예 22: 부형제 화합물 및 PEG 함유 제제
부형제 화합물 및 PEG를 사용해 제제를 제조하였으며, PEG는 치료 제제에 사용될 페길화된 치료 단백질을 모방하도록 의도하였으며, 부형제 화합물은 표 13에 열거된 양으로 제공하였다. 이들 제제는 PEG 용액을 부형제 용액과 동일 부피로 혼합하여 제조하였다. 이들 2가지 용액은 탈이온 (DI) 수 중에 제조하였다.
PEG 용액은, 평균 Mw ~100,000의 폴리(에틸렌 옥사이드) (Aldrich Catalog # 181986) 16.5 g을 탈이온수 83.5 g과 혼합하여 제조하였다. 혼합물은 밤새 교반하여 완전히 용해시켰다.
부형제 용액은 일반적인 방법에 의해 아래 표 13에 상세히 기술된 바와 같이 제조하였다: 포타슘 포스페이트 0.05 g을 탈이온수에 용해하여, 탈이온수 중의 약 20 mg/mL 포타슘 포스페이트 트리베이직 (Aldrich Catalog # P5629) 용액을 제조하였다. PEG 용액 0.5 mL을 부형제 용액 0.5 mL과 혼합하여 PEG 부형제 용액을 제조한 다음 이를 수초간 볼텍스를 이용해 혼합하였다. 대조군 샘플은, PEG 용액 0.5 mL을 탈이온수 0.5 mL과 혼합하여, 제조하였다. 점도를 측정하였으며, 그 결과는 아래 표 13에 기록한다.
표 13
시험 번호 부형제 부형제 농도
(mg/mL) 		점도 (cP) 점도
감소율 (%)
22.1 없음 0 79.7 0
22.2 구연산 Na 염 10 74.9 6.0
22.3 포타슘 포스페이트 10 72.3 9.3
22.4 구연산 Na 염/포타슘 포스페이트 10/10 69.1 13.3
22.5 소듐 설페이트 10 75.1 5.8
22.6 구연산 Na 염/소듐 설페이트 10/10 70.4 11.7
실시예 23: 단백질 용액의 부형제를 이용한 가공 처리 개선
BGG 고체 0.25 g을 완충액 4 ml에 혼합하여 BGG 용액 2개를 만들었다. 샘플 A: 완충액은 20 mM 히스티딘 완충제 (pH=6.0)이다. 샘플 B: 완충액은 15 mg/ml 카페인 (pH=6)을 포함하는 20 mM 히스티딘 완충제이다. 샘플을 회전 진탕기 테이블 위에서 100 rpm으로 교반하여, BGG 고체를 용해시켰다. 카페인 부형제를 함유한 완충제 용액이 단백질이 더 빨리 용해되는 것으로 관찰되었다. 카페인 부형제가 첨가된 샘플 (샘플 B)의 경우, BGG는 15분내에 완전히 용해되었다. 카페인 무첨가 샘플 (샘플 A)의 경우, 용해되는데 35분이 소요되었다.
다음날, 샘플을 분자량 컷오프 30,000의 Amicon 울트라 4 원심분리 필터 유닛 2개에 넣고, 샘플을 10분 간격으로 2,500 rpm으로 원심분리하였다. 각 10분씩 원심분리 후 회수되는 여과물 부피를 기록하였다. 표 14의 결과는 샘플 B에서 여과물이 더 빠르게 회수됨을 보여준다. 또한, 샘플 B는 매 원심분리에 따라 농축되었지만, 샘플 A는 최고 농도 지점에 도달하였으며, 추가적인 원심분리에서 추가적인 샘플 농축은 발생하지 않았다.
표 14
원심분리 시간 (분) 샘플 A의 수집된 여과물 (mL) 샘플 B의 수집된 여과물 (mL)
10 0.28 0.28
20 0.56 0.61
30 0.78 0.88
40 0.99 1.09
50 1.27 1.42
60 1.51 1.71
70 1.64 1.99
80 1.79 2.29
90 1.79 2.39
100 1.79 2.49
실시예 24: 복수의 부형제를 함유한 단백질 제제
본 실시예는, 부형제로서 카페인과 아르기닌의 조합물이 BGG 용액의 점도를 낮추는데 유익한 효과를 가지는 지를, 보여준다. BGG 고체 0.18 g을 pH 6의 20 mM 히스티딘 완충제 0.5 mL과 혼합하여, BGG 용액 4개를 제조하였다. 각 완충액은 아래 표에 나타낸 바와 같이 서로 다른 부형제 또는 부형제들의 조합물을 함유하였다. 용액의 점도를 이전 실시예에서와 같이 측정하였다. 그 결과, 힌더드 아민 부형제, 카페인을 아르기닌과 같은 공지의 부형제와 조합할 수 있으며, 조합물이 개별 부형제 단독 보다 우수한 점도 강하 특성을 가지는 것으로, 확인되었다.
표 15
샘플 첨가 부형제 점도 (cP) 점도 감소율 (%)
A 없음 130.6 0
B 카페인 (10mg/ml) 87.9 33
C 카페인 (10mg/ml) / 아르기닌 (25 mg/ml) 66.1 49
D 아르기닌 (25 mg/ml) 76.7 41
pH 6의 히스티딘 완충제 중의 280 mg/mL BGG 용액에 아르기닌을 첨가하였다. 50 mg/mL 보다 높은 농도에서는, 아르기닌을 더 첨가하더라도 표 16에 나타낸 바와 같이 점도를 더 이상 감소시키지 못하였다.
표 16
아르기닌 첨가량 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소 ( % )
0 79.0 0%
53 40.9 48%
79 46.1 42%
105 47.8 40%
132 49.0 38%
158 48.0 39%
174 50.3 36%
211 51.4 35%
pH 6의 히스티딘 완충제 중의 280 mg/mL BGG 용액에 카페인을 첨가하였다. 10 mg/mL 보다 높은 농도에서는, 카페인을 더 첨가하더라도 표 17에 나타낸 바와 같이 점도는 더 이상 감소하지 않았다.
표 17
카페인 첨가량 (mg/mL) 점도 (cP) 점도 감소 ( % )
0 79 0%
10 60 31%
15 62 23%
22 50 45%
실시예 25: TFF 농축 공정에서의 카페인 효과
본 실시예에서, 보바인 감마 글로불린 (BGG) 용액을 접선 유동 여과 (TFF)를 사용해 카페인 첨가 및 비-첨가 하에 농축하였다. EMD Millipore (Billerica, MA) 사에서 생산하는 Labscale TFF 시스템을 사용해, 실험을 수행하였다. 이 시스템에, 30 kDa 분자량 컷오프 (EMD Millipore, Billerica, MA)의 Ultracel 막을 포함하는 Pellicon XL TFF 카세트를 장착하였다. 공칭 막 표면적은 50 cm2이었다. 카세트에 공급되는 압력은 30 psi으로 유지시켰으며, 잔류물 압력 (retentate pressure)은 10 psi로 유지시켰다. 여과물 유량 (filtrate flux)을 시간에 따른 중량 측정에 의해 실험 내내 모니터링하였다. BGG 약 12 g을, pH 6으로 적정한, 15 mg/mL 카페인, 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘 함유 완충제 500 mL에 용해하였다. BGG 약 12 g을, pH 6으로 적정한, 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘 함유 완충제 500 mL에 용해하여, 대조군 샘플을 제조하였다. 완충제 구성 성분들은 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였다. 2가지 용액 모두 TFF 공정 전, 0.2 ㎛ PES 필터 (VWR, Radnor, PA)를 통해 여과하였다. 물질 이동 계수 (mass transfer coefficient)에 의해 시험 샘플과 대조군 샘플의 성능을 TFF 중에 측정하였다. 물질 이동 계수는 하기 식으로 각 샘플에서 구하였다 (J. Hung, A. U. Borwankar, B. J. Dear, T. M. Truskett, K. P. Johnston, High concentration tangential flow ultrafiltration of stable monoclonal antibody solutions with low viscosities. J. Memb. Sci. 508, 113-126 (2016)):
J = kcln(Cw/Cb) (식 3)
식 3은 여과물 유량 (filtrate flux) J를 나타내며, 식에서 kc는 물질 이동 계수이고, Cw는 막 주변 단백질 농도이고, Cb는 액체 벌크 내 농도이므로, 식 3에 의해 물질 이동 계수 kc를 계산할 수 있다. ln(Cb)에 따른 유량 계산값 J에 대한 그래프는 기울기 -kc의 선형 곡선을 나타낸다. 여기서, 유량 J는 여과물 중량을 시간으로 미분하여 계산되며, Cb는 물질 수지 (mass-balance)를 이용해 계산한다. 가장 적합한 물질 이동 계수를 표 18에 열거한다. 15 mg/mL 카페인을 첨가하면, 물질 이동 계수가 22.5에서 25.4 Lm-2hr-1 (LMH)으로 13% 증가하였다.
표 18
샘플 물질 이동 계수 k c ( LMH )
대조군 22.5 ± 0.1
15 mg/mL 카페인 25.4 ± 0.1
실시예 26: TFF 농축 공정에서의 카페인 효과
본 실시예에서, 보바인 감마 글로불린 (BGG) 용액을 접선 유동 여과 (TFF)를 사용해 카페인 첨가 및 비-첨가 하에 농축하였다. EMD Millipore (Billerica, MA) 사에서 생산하는 Labscale TFF 시스템을 사용해, 실험을 수행하였다. 이 시스템에, 30 kDa 분자량 컷오프 (EMD Millipore, Billerica, MA)의 Ultracel 막을 포함하는 Pellicon XL TFF 카세트를 장착하였다. 공칭 막 표면적은 50 cm2이었다. 초기 BGG 농도가 공칭 25.1 mg/mL이 되도록, BGG 약 14.6 g을, pH 6으로 적정한, 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘 함유 완충제 582 mL에 용해하여 대조군 샘플을 제조하였다. 물질을 0.2 ㎛ PES 필터 (VWR, Radnor, PA)를 통해 여과한 다음 TFF 장치에서 처리하였다. 펌프 속도는 공급 압력이 처음에 30 psi이도록 조정하였으며, 체류물 밸브 (retentate valve)는 체류물 압력이 처음에 10 psi이도록 조정하였다. 펌프 속도 또는 체류물 밸브를 조정하지 않고 4.1시간 동안 물질을 농축하였다. 초기 농도 및 최종 농도는 브래드포드 분석에 따르면 아래 표 19에 나타낸 바와 같이 각각 25.4 ± 0.6 및 159 ± 6 mg/mL으로 결정되었다. 카페인-함유 샘플은, pH 6으로 적정된, 15 mg/mL 카페인, 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘 함유 완충제 566 mL에 BGG 14.2 g을 용해하여, 처음 BGG 농도가 공칭 25.1 mg/mL이 되도록, 제조하였다. 물질을 0.2 ㎛ PES 필터 (VWR, Radnor, PA)를 통해 여과한 다음 TFF 장치에서 처리하였다. 펌프 속도 및 체류물 밸브는 이전과 동일한 수준으로 설정하였다. 공급 압력 및 체류물 압력은 이전과 같이 각각 30 psi 및 10 psi인 것으로 확인되었다. 펌프 속도 또는 체류물 밸브를 조정하지 않고 4.1시간 동안 물질을 농축하였다. 초기 농도 및 최종 농도는 브래드포드 분석에 따르면 아래 표 19에 나타낸 바와 같이 각각 24.4 ± 0.5 및 225 ±10 mg/mL로 결정되었다. TFF 공정에 카페인을 사용하였을 때, 최종 단백질의 농도가 159에서 225 mg/mL로, 대조군과 비교해 약 42% 증가하였다.
표 19
샘플 초기 농도 (mg/mL) 최종 농도 (mg/mL)
대조군 25.4 ± 0.6 159 ± 6
15 mg/mL 카페인 24.4 ± 0.5 225 ± 10
실시예 27: BGG 용액의 무균 여과시 카페인 효과
보바인 감마 글로불린 (BGG), L-히스티딘 및 카페인을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, 각각 제품명 G5009, H6034 및 C7731)에서 구입하였다. 탈이온 (DI) 수는 EMD Millipore (Billerica, MA) 사의 Direct-Q 3 UV 정제 시스템을 사용해 수돗물로부터 제조하였다. 0.2 ㎛ 포어 크기의 25-mm 폴리에테르설폰 (PES) 필터는 GE Healthcare (Chicago, IL, 카다로그 번호 6780-2502) 사에서 구입하였다. 1 mL 루어-록 시린지는 Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, 참조 번호 309628) 사에서 구입하였다. 20 mM 히스티딘 완충제, pH 6.0은 L-히스티딘, 탈이온수를 사용해 제조하고, 1 M HCl을 첨가하여 pH 6.0으로 적정하였다. 카페인 15 mg/mL 용액은 히스티딘 완충제를 사용해 제조하였다. 카페인 비-함유 및 카페인 함유 완충제를 사용해, BGG를 최종 농도 약 280 mg/mL로 재구성하였다. 단백질 농도 c를 하기 식으로 계산하였다:
(식 4)
식에서, m p 는 단백질 중량이고, b는 완충제 첨가 부피이고, ν는 BGG의 부분 비용적 (partial specific volume)으로서, 여기서는 0.74 mL/g으로 간주한다. 각 샘플의 점도를 23℃에서 전단 속도 250 s-1로 microVisc 유량계 (RheoSense, San Ramon, CA)를 사용해 측정하였다. 100 N 로드 셀 (Instron, Needham, MA, 부품 번호 2519-103)이 장착된 인장 압축 검사기 (TCT, Instron, Needham, MA, 부품 번호 3343)를 사용해 BGG 용액이 멸균 필터를 통과하는데 드는 에너지를 측정하였다. 주사기 플런저를 50 mm 거리에 대해 159 mm/min 속도로 밀었다. TCT에 의해 측정된 로드-대-연장 곡선 (load-versus-extension curve)을 적분하여 에너지 요구량을 계산하였으며, 그 결과를 아래 표 20에 요약 개시한다.
표 20
샘플 단백질 농도 (mg/mL) 카페인 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 에너지 요구량 (mJ)
1 280 0 106 198
2 280 15.1 68.9 181
실시예 28: 단백질 A 크로마토그래피 용출을 개선하기 위한 부형제
실험 등급의 바이오시밀러 항체 4종, 이필리무맵 (ipilimumab), 우스테키누맵 (ustekinumab), 오말리주맵 (omalizumab) 및 톡실리주맵 (tocilizumab)을 Bioceros (Utrecht, The Netherlands) 사에서 구입하였다. 이들 항체는 40 mM 소듐 아세테이트 수용액, 50 mM 트리스-HCl 완충제, pH 5.5 중에 각각 단백질 농도 20, 26, 15 및 23 mg/mL로 냉동된 분액으로서 제공받았다. 단백질 용액은 측정하기 전 실온에서 해동한 다음 0.2 ㎛ 폴리에테르설폰 필터를 통해 여과하였다. 여과한 단백질 스톡 용액을 단백질 스톡 용액 : 결합 완충제의 1:1 비율로 혼합하였다. 단백질 A 수지에 항체 결합을 촉진하기 위해 사용한 결합 완충제는, 탈이온 (DI) 수 중의 0.1 M 소듐 포스페이트 및 0.15 소듐 클로라이드, pH 7.2으로 구성하였다. 탈이온수는 EMD Millipore (Billerica, MA) 사의 Direct-Q 3 UV 정제 시스템을 사용해 수돗물로부터 제조하였다. IgG 스크리닝용 PIERCETM 단백질-A 스핀 플레이트 (ThermoFisher Scientific catalog # 45202)를 이용한 단백질 A 결합 및 용출 실험에, 이들 용액을 사용하였다. 플레이트는 96웰을 구비하고 있으며, 각 웰에 단백질 A 수지 50 ㎕가 수용되어 있다. 각 웰에 결합 완충제 200 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 1분간 1000 x g로 원심분리한 다음 플로우-스루는 버림으로써, 수지를 결합 완충제로 세척하였다. 후속적인 원심분리단계들 모두 1분간 1000 x g로 수행하였다. 이 세척 절차를 1번 반복 실시하였다. 이러한 첫 세척 단계 후, 희석한 단백질 샘플, 즉 이필리무맵, 우스테키누맵, 오말리주맵 및 톡실리주맵을 함유한 샘플들을 플레이트의 웰에 첨가하였다 (웰 당 200 ㎕). 그런 후, 플레이트를 Daigger Scientific (Vernon Hills, IL) Labgenius 회전 진탕기 위에 배치하여, 30분간 260 rpm으로 교반한 다음, 플레이트를 원심분리하고, 플로우-스루를 제거하였다. 그런 후, 각 웰에 결합 완충제 500 ㎕을 첨가하고, 플레이트를 원심분리한 다음 플로우-스루를 제거하여, 웰을 세척하였다. 이러한 세척 단계를 2번 반복 실시하였다. 이러한 세척 단계 후, 여러가지 부형제들이 첨가된 용출 완충제를 사용해 플레이트로부터 단백질을 용출시켰다. 각각의 용출시, 1 M 소듐 포스페이트 pH 7로 구성된 중화 완충제 50 ㎕를 수집 플레이트 각 웰에 첨가한 다음, 용출 완충제 200 ㎕를 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1분간 260 rpm로 교반한 다음 원심분리하였다. 분석을 위해 플로우-스루를 회수하였다. 이 용출 단계를 1번 반복하였다. 부형제 비-함유 대조군 완충제는 20 mM 사이트레이트를 포함하며, pH 2.6이었다. 단백질 A 용출 완충제는 종종 약간의 염을 함유하므로, 사이트레이트 완충제 중의 100 mM NaCl 용출 완충제를 제2 대조군으로 준비하였다.
표 21은 본 실시예에 사용된 부형제 용액, 이의 농도 및 용출 완충제의 최종 pH를 열거한다. 이들 부형제 모두 Sigma Aldrich (St. Louis, MO) 사에서 구입하였으며, 단 아스파르탐은 Herb Store USA (Los Angeles, CA) 사에서, 트레할로스는 Cascade Analytical Reagents and Biochemicals (Corvallis, OR) 사에서, 수크로오스는 Research Products International (Mt. Prospect, IL, product number S24060) 사에서 구입하였다. 부형제 적정 정량을 염-프리 사이트레이트 완충제 대조군 약 10 mL에 혼합하여, 부형제-함유 용출 완충제들을 모두 제조하였다. 용출 완충제는 부형제 약 100 mM 수준으로 제조하였다. 그러나, 부형제들 모두 이 농도에서 용해성인 것은 아니며; 따라서, 표 21은 전체 부형제의 사용 농도를 열거한다. 각 용출 완충제의 pH는, 필요에 따라 염산 또는 수산화나트륨을 사용해 pH 약 2.6 ± 0.1로 적정하였다.
각 단백질 샘플에 대해, HPLC 워크스테이션 (Agilent HP 1100 system)에 연결된 TSKgel SuperSW3000 컬럼 (30 cm x 4.6 mm ID, Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA)을 사용해, ASD 고 성능 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 분석을 수행하였다. 분리는 실온에서 유속 0.35 mL/min으로 수행하였다. 이동상은 100 mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로라이드, pH 7로 구성된 완충 수용액이었다. 단백질 농도는 Agilent 1100 Series G1315B 다이오드 어레이 검출기를 사용해 280 nm에서 흡광도를 측정하여 모니터링하였다. 각 단백질, 즉, 이필리무맵, 우스테키누맵, 오말리주맵 및 톡실리주맵에 대해, 단백질 A 수지로부터 용출되는 단백질의 총 양을 크로마토그램을 적분하여 추정하였다. 각 단백질, 즉, 이필리무맵, 우스테키누맵, 오말리주맵 및 톡실리주맵에 대한 적분한 피크 면적을 표 22-25에 나타낸다. 또한, 표 22-25는 실험 피크 면적을 염-프리 및 염-함유 대조군의 피크 면적과 비교하였다. 100% 보다 높은 값은 용출 완충제가 단백질 A 수지로부터 단백질을 대조군 보다 더 많이 회수됨을 의미하고, 100% 미만의 값은 용출 완충제가 단백질 A 수지로부터 대조군과 비교해 더 적게 회수됨을 의미한다.
표 21. 실시예 28에 사용된 부형제들
부형제 부형제의 Sigma- Aldrich 제품 번호 부형제 농도 (mM) pH
카페인 C7731 79 2.6
아세설팜 포타슘 04054 110 2.5
1-메틸-2-피롤리돈 M6762 117 2.6
아스파르탐 N/A 20 2.6
타우린 T8691 114 2.5
트레할로스 N/A 100 2.7
수크로오스 N/A 101 2.7
니아신아미드 N5535 99 2.7
소듐 클로라이드 대조군 S7653 117 2.6
대조군 N/A N/A 2.5
표 22. 단백질 A 수지로부터의 이필리무맵 회수
부형제 피크 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 염 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%)
사이트레이트 3409 77.9 83.6
아세설팜 포타슘 1567 35.8 38.4
1-메틸-2-피롤리돈 386 8.8 9.5
아스파르탐 4012 91.7 98.3
타우린 3958 90.4 97.0
트레할로스 3667 83.8 89.9
수크로오스 4585 104.8 112.4
니아신아미드 4295 98.2 105.3
소듐 클로라이드 대조군 4080 93.2 100.0
대조군 4376 100.0 107.2
표 23. 단백질 A 수지로부터의 우스테키누맵 회수
부형제 피크 적분 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 염 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%)
카페인 2301 86.6 75.2
아세설팜 포타슘 307 16.2 14.0
아스파르탐 417 17.4 15.1
1-메틸-2-피롤리돈 2952 108.8 94.4
타우린 3257 118.6 103.0
트레할로스 1549 56.6 49.1
수크로오스 1274 51.2 44.4
니아신아미드 3204 116.1 100.8
소듐 클로라이드 대조군 3176 115.2 100.0
표 24. 단백질 A 수지로부터의 오말리주맵 회수
부형제 피크 적분 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 염 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%)
카페인 4040 105.5 117.5
아세설팜 포타슘 3620 94.5 105.3
1-메틸-2-피롤리돈 3334 87.0 97.0
아스파르탐 3605 94.1 104.8
타우린 4337 113.2 126.1
트레할로스 3571 93.2 103.8
수크로오스 3639 95.0 105.8
니아신아미드 4812 125.6 139.9
소듐 클로라이드 대조군 3439 89.8 100.0
대조군 3831 100.0 111.4
표 25. 단백질 A 수지로부터의 토실리주맵 회수
부형제 피크 적분 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 ( % )
카페인 3120 111.2 100.3
아세설팜 포타슘 3083 109.9 99.1
1-메틸-2-피롤리돈 261 9.3 8.4
아스파르탐 556 19.8 17.9
타우린 3054 108.8 98.2
트레할로스 2781 99.1 89.4
수크로오스 1037 37.0 33.3
니아신아미드 2550 90.9 82.0
소듐 클로라이드 대조군 3111 110.9 100.0
대조군 2806 100.0 90.2
실시예 29: 단백질 A 크로마토그래피 용출을 개선하기 위한 부형제
본 실시예에서 사용된 시험 단백질은 실시예 28에서의 단백질과 동일하며, 즉, 이필리무맵, 우스테키누맵, 오말리주맵 및 톡실리주맵이다. 단백질 A 결합 및 용출 실험을 실시예 28과 동일한 플레이트를 사용해 수행하였다. 단백질 A 플레이트로부터 항체 로딩 및 용출 방법은 용출 단계를 제외하고는 실시예 28과 동일하다. 실시예 28에서는 용출 세척을 2번 수행하였다. 그러나, 본 실시예에서는 단 1번만 세척하였다. 실시예 28에서와 같이, 용출 완충제는 20 mM 사이트레이트, pH 2.6 대조군 완충제로 제조하였다. 용출 완충제를 아래 표 26에 나타낸다. 부형제들 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 사에서 구입하였다. 회수한 단백질은 실시예 28과 동일한 방식으로 HPLC에 의해 분석하였으며, 각 단백질, 즉, 이필리무맵, 우스테키누맵, 오말리주맵 및 톡실리주맵의 단백질 회수 결과를 아래 표 27-30에 기재한다.
표 26. 실시예 29에 사용된 부형제들
부형제 Sigma- Aldrich 제품 번호 부형제 농도 (mM) pH
대조군 N/A N/A 2.5
소듐 클로라이드 대조군 S7653 117 2.6
니아신아미드 N5535 99 2.7
타우린 T8691 114 2.5
이미다졸 I5513 100 2.6
4-하이드록시벤젠설폰산 171506 107 2.6
카페인 C7731 79 2.6
표 27. 단백질 A 수지로부터의 이필리무맵 회수
부형제 피크 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 염 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%)
대조군 4841 100.0 88.3
소듐 클로라이드 대조군 5485 113.3 100.0
니아신아미드 6300 130.1 114.8
타우린 7557 156.1 137.8
이미다졸 6071 125.4 110.7
4-하이드록시벤젠설폰산 5836 120.6 106.4
카페인 6051 125.0 110.3
표 28. 단백질 A 수지로부터의 우스테키누맵 회수
부형제 피크 적분 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 염 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%)
대조군 4572 100.0 107.9
소듐 클로라이드 대조군 4238 92.7 100.0
니아신아미드 5848 127.9 138.0
타우린 4744 103.8 112.0
이미다졸 4617 101.0 108.9
4-하이드록시벤젠설폰산 4132 90.4 97.5
카페인 5084 111.2 120.0
표 29. 단백질 A 수지로부터의 오말리주맵 회수
부형제 피크 적분 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 염 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%)
대조군 4194 100.0 91.7
소듐 클로라이드 대조군 4574 109.1 100.0
니아신아미드 5748 137.0 125.7
타우린 4676 111.5 102.2
이미다졸 2589 61.7 56.6
4-하이드록시벤젠설폰산 3190 76.1 69.7
카페인 5807 138.5 127.0
표 30. 단백질 A 수지로부터의 토실리주맵 회수
부형제 피크 적분 면적 (mAU*min) 염-프리 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%) 염 대조군에 대해 표준화한 피크 면적 (%)
대조군 4667 100.0 97.5
소듐 클로라이드 대조군 4786 102.6 100.0
니아신아미드 5225 111.9 109.2
타우린 5396 115.6 112.7
이미다졸 4754 101.9 99.3
4-하이드록시벤젠설폰산 4539 97.3 94.8
카페인 5656 121.2 118.2
실시예 30: 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터 오말리주맵 용출을 개선하는 부형제
실험-등급의 오말리주맵은 Bioceros (Utrecht, The Netherlands) 사에 구입하였으며, 40 mM 소듐 아세테이트 수용액, 50 mM tris-HCl 완충제, pH 5.5 중의 15 mg/mL로 냉동 상태로 제공받았다. 단백질은 측정하기 전 실온에서 해동한 다음 0.2 ㎛ 폴리에테르설폰 필터를 통해 여과하였다. 여과한 물질을, 탈이온수 중의 20 mM 소듐 포스페이트 pH 7로 구성된 결합 완충제와 1:1의 비율로 혼합하였다. 수돗물을 EMD Millipore (Billerica, MA) 사의 Direct-Q 3 UV 정제 시스템을 사용해 정제하여, 탈이온수를 수득하였다. GE Healthcare (Chicago, IL, 제품 번호 29048576) 사의 HiTrap 단백질-A HP 1 mL 컬럼을 사용해 단백질 A 정제를 수행하였다. 각 실험에서, 컬럼을 먼저 결합 완충제 10 mL로 평형화하였다. 평형화한 다음, 단백질 30 mg을 단백질 A 컬럼에 로딩하였다. 그런 후, 컬럼을 결합 완충제 5 mL로 헹구었다. 컬럼 세척 후, 결합된 오말리주맵을 아래 표 31에 열거된 용출 완충제 중 하나를 일부 사용해 컬럼으로부터 용출시켰다. 용출 완충제는 20 mM 사이트레이트 완충제, pH 4.0에 지정된 부형제를 용해하여 제조하였다. 용출 완충제들 모두 pH 4.0로 적정하였다. 1 mL 분획 5개를 수집하였다. 마지막으로, 컬럼을 100 mM 사이트레이트, pH 3.0 완충제 5 mL로 세척하여, 단백질 A를 재생시켰다. 각 단계의 유속은 1 mL/min이었으며, Fusion 100 주입 펌프 (Chemyx, Stafford, TX)를 사용해 유지시켰다. 10 mL NormJect 루어 록 시린지 (Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany, 참조 번호 4100-000V0)를 사용하였다.
용출 분획 E1, E2, E3, E4 및 E5를 대상으로 고 성능 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 분석을 통해 총 단백질 함량을 분석하였다. SEC 분석은 HPLC 워크스테이션 (Agilent HP 1100 system)과 연결된 TSKgel SuperSW3000 컬럼 (30 cm x 4.6 mm ID, Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA)을 사용해 수행하였다. 분리는 실온에서 유속 0.35 mL/min으로 수행하였다. 이동상은 100 mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로라이드, pH 7로 된 완충 수용액이다. Agilent 1100 Series G1315B 다이오드 어레이 검출기를 사용해 280 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 모니터링하였다. 단백질 A 수지로부터 용출되는 단백질의 총 양을 크로마토그램을 적분하여 추정하였다.
사이트레이트는 단백질 A 크로마토그래피에 사용되는 일반적인 부형제이므로, 본원에서 대조군으로 사용하였다. 대조군 샘플의 용출 분획들은, 석출상 형성에 의해 확인되는 바와 같이, 4℃에서 밤새 보관하였을 때 불용성 응집물이 관찰되었다. 이에, 아래 표 31에 기록된 피크 면적은 용출 분획들의 용해성 단백질 총 양을 표시한다. 불용성 응집물은 대조군 샘플에서만 관찰되었고, 다른 샘플에서는 이러한 응집물이 관찰되지 않았다. (사이트레이트 부형제를 사용한) 대조군과 비교해 피크 면적이 더 높은 것은, 시험 부형제를 사용해 컬럼으로부터 단백질을 보다 효과적으로 분리시킬 수 있다는 것을 의미한다.
표 31. 단백질 A 컬럼으로부터 오말리주맵 용출
용출 부형제 용출 부형제 농도 (mM ) E1 피크 면적
(mAU*min) 		E2 피크 면적
(mAU*min) 		E3 피크 면적
(mAU*min) 		E4 피크 면적
(mAU*min) 		E5 피크 면적
(mAU*min) 		총 피크 면적
(mAU
*min)
사이트레이트
(대조군)		 103 352 9670 4098 4245 2953 21318
이미다졸 100 236 10224 7373 3894 2620 24348
타우린 125 408 17018 7676 3349 2211 30662
니아신아미드 102 228 14492 5307 2914 2014 24955
카페인 81 617 21965 8069 3301 1911 35863
실시예 31: 카페인 부형제를 여러가지 함량으로 포함하는 BGG 제제
제제는 여러가지 몰 농도의 카페인 (아래 표 32에 열거된 농도) 및 시험 단백질을 사용해 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질을 모방하도록 의도하였다. 본 실시예의 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 20 mM 히스티딘 완충제 중에 준비하였다. 카페인 0 및 80 mM 스톡 용액을 20 mM 히스티딘 중에 준비하고, 수득한 용액을 모델 단백질 용해 전 소량의 수산화나트륨 또는 염산으로 적정하여 pH 6으로 만들었다. 2종의 스톡 용액을 다양한 부피 비율로 혼합하여, 아래 표 32에 열거된 농도의 일련의 카페인-함유 용액들을 제공함으로써, 다양한 카페인 농도의 부가적인 용액들을 준비하였다. 이들 부형제 용액을 제조한 후, 각 부형제 용액 0.7 mL을 동결건조한 BGG 분말 0.25 g에 첨가하여, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 각 시험 용액에 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 달성되는 비율로 용해하였다. BGG-함유 용액은 5 mL 멸균 폴리프로필렌 시험관에서 제조하여, 회전 진탕기 테이블 위에서 밤새 100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, 이들 용액을 2 mL 미세원심분리관에 넣고, IEC MicroMax 원심분리기에서 2400 rpm으로 5분간 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 공기를 제거하였다.
상기와 같이 제조한 제제들에 대한 점도 측정은 microVisc 점도계 (RheoSense, San Ramon, CA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 100 미크론의 채널 깊이의 A-10 칩을 장착하고, 25℃에서 전단 속도 250 1/s으로 작동시켰다. 점도를 측정하기 위해, 시험 제제를 점도계에 로딩하였으며, 파이펫에서 기포를 모두 제거하도록 주의하였다. 로딩되는 샘플 제제를 함유한 파이펫을 장치에 배치하여, 약 5분간 측정 온도에서 인큐베이션하였다. 그런 후, 안정적인 점도 판독치로 확인되는 바와 같이, 채널이 시험 유체로 완전히 평형화될 때까지, 장치를 운영한 다음, 점도를 센티포아즈로 기록하였다. 수득한 점도 결과는 아래 표 32에 나타낸다.
표 32
카페인 농도 ( mM ) 점도 (cP) 표준화된 점도
0 83 1.00
5 67 0.81
10 70 0.84
20 77 0.92
30 63 0.76
40 65 0.78
50 65 0.78
60 57 0.69
70 50 0.60
80 50 0.60
실시예 32: 탈이온수 중의 공-용질 (co-solute) 용액 제조
수중 카페인 용해성을 높이기 위해 공-용질로서 사용되는 화합물을 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 사에서 구입하였으며, 이들 화합물은 니아신아미드, 프롤린, 프로카인 HCl, 아스코르브산, 2,5-다이하이드록시벤조산, 리도카인, 사카린, 아세설팜 K, 티라민 및 아미노벤조산이다. 건조 고체를 탈이온수에 용해하고, 일부 경우에는 필요에 따라 5 M 염산 또는 5 M 수산화나트륨을 사용해 pH를 약 6-8로 적정하여, 각 공-용질의 용액을 제조하였다. 그런 후, 용액을 클래스 A 메스 플라스크를 사용해 최종 부피 25 mL 또는 50 mL로 희석하고, 용해된 화합물의 중량과 용액의 최종 부피를 기준으로 농도를 기록하였다. 제조된 용액은 그대로 사용하거나 또는 탈이온수로 희석하였다.
실시예 33: 카페인 용해성 검사
주위 온도 (약 23℃)에서 카페인 용해성에 대한 여러가지 공-용질의 효과를 다음과 같은 방식으로 평가하였다. 건조 카페인 분말 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 20 mL 유리 신틸레이션 바이얼에 넣고, 카페인의 무게를 기록하였다. 일부 경우에는 실시예 32에 따라 제조한 공-용질 용액 10 mL을 카페인 분말에 첨가하였으며; 그외 경우에는, 공-용질과 탈이온수의 블랜드를 카페인 분말에 첨가하였으며, 최종 첨가 부피는 10 mL로 유지하였다. 건조 카페인 분말이 부피에 기여하는 정도는 이들 모든 혼합물들에서 미미한 것으로 추정되었다. 작은 자기 막대를 바이얼에 넣어, 용액을 약 10분간 교반 플레이트 상에 두어 왕성하게 혼합하였다. 약 10분 후, 바이얼에서 건조 카페인 분말의 용해를 관찰하였으며, 그 결과를 아래 표 33에 나타낸다. 이들 관찰 결과는, 니아신아미드, 프로카인 HCl, 2,5-다이하이드록시벤조산 소듐염, 사카린 소듐염 및 티라민 클로라이드 염 모두 보고된 카페인 용해 한계 (Sigma-Aldrich에 따르면, 실온에서, ~16 mg/mL임)로부터 적어도 약 4배까지 카페인을 용해시킬 수 있는 것으로, 나타났다.
표 33
시험 번호 공-용질 카페인 관찰 결과
명칭 농도 (mg/mL) (mg/mL)
33.1 프롤린 100 50 DND
33.2 니아신아미드 100 50 CD
33.3 니아신아미드 100 60 CD
33.4 니아신아미드 100 75 CD
33.5 니아신아미드 100 85 CD
33.6 니아신아미드 100 100 CD
33.7 니아신아미드 80 85 CD
33.8 니아신아미드 50 80 CD
33.9 프로카인 HCl 100 85 CD
33.10 프로카인 HCl 50 80 CD
33.11 니아신아미드 30 80 DND
33.12 프로카인 HCl 30 80 DND
33.13 니아신아미드 40 80 MD
33.14 프로카인 HCl 40 80 DND
33.15 아스코르브산, Na 50 80 DND
33.16 아스코르브산, Na 100 80 DND
33.17 2,5 DHBA, Na 40 80 CD
33.18 2,5 DHBA, Na 20 80 MD
33.19 리도카인 HCl 40 80 DND
33.20 사카린. Na 90 80 CD
33.21 아세설팜 K 80 80 DND
33.22 티라민 HCl 60 80 CD
33.23 Na 아미노벤조에이트 46 80 DND
33.24 사카린, Na 45 80 DND
33.25 티라민 HCl 30 80 DND
CD = 완전 용해; MD = 대부분 용해; DND = 용해되지 않음
실시예 34: HUMIRA ® 의 프로파일
HUMIRA® (AbbVie Inc., Chicago, IL)는, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론 질환, 궤양성 대장염, 중등도 내지 중증의 만성 건선 및 청소년 특발성 관절염과 같은 자가면역 질환의 염증 반응을 줄이기 위해 전형적으로 처방되는 TNF-α 차단제인, 치료 단일클론 항체 아달리무맵의 상업적으로 구입가능한 제제이다. HUMIRA®는 아달리무맵 40 mg, 염화나트륨 4.93 mg, 소듐 포스페이트 모노베이직 이수화물 0.69 mg, 소듐 포스페이트 다이베이직 이수화물 1.22 mg, 구연산나트륨 0.24 mg, 구연산 일수화물 1.04 mg, 만니톨 9.6 mg 및 폴리소르베이트 80 0.8 mg을 포함하는, 1회 투여량 0.8 mL로 시판되고 있다. 이 제제의 점도 대비 농도 프로파일을 다음과 같은 방식으로 구하였다. 30 kDa 분자량 컷오프 (EMD-Millipore, Billerica, MA)의 Amicon Ultra 15 원심분리 농축기에 탈이온수 약 15 mL를 충전하고, Sorvall Legend RT (ThermoFisher Scientific)에서 10분간 4000 rpm으로 원심분리하여 막을 세척하였다. 그 후, 잔류물을 제거한 다음 HUMIRA® 액체 제제 2.4 mL를 농축기 시험관에 첨가하여, 25℃에서 60분간 4000 rpm으로 원심분리하였다. 잔류물 10 ㎕를 탈이온수 1990 ㎕로 희석하고, 희석한 샘플을 280 nm에서 흡광도를 측정한 다음 희석 인수 및 흡광 계수 1.39 mL/mg-cm를 사용해 농도를 계산함으로써, 잔류물의 농도를 구하였다. 농축된 샘플의 점도를 A05 칩이 장착된 microVisc 점도계 (RheoSense, San Ramon, CA)에서 전단 속도 250 sec-1 및 23℃ 하에 측정하였다. 점도 측정 후, 샘플을 소량의 여과물로 희석하고, 농축 및 점도 측정을 반복 실시하였다. 이러한 과정을 이용해, 아래 표 34에 나타낸 바와 같이, 아달리무맵 농도 변동에 따른 점도 값을 구하였다.
표 34
아달리무맵 (mg/mL) 점도 (cP)
277 125
253 63
223 34
202 20
182 13
실시예 35: 점도-강하용 부형제를 첨가한 HUMIRA ® 제제의 재구성
아래 실시예는, HUMIRA®에 점도-강하용 부형제를 첨가하여 완충제 내에서 재구성하는 일반 공정을 기술한다. 히스티딘 약 0.15 g 및 카페인 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 0.75 g을 탈이온수에 용해하여, 점도-강하용 부형제 용액을 20 mM 히스티딘 중에 제조하였다. 제조한 용액의 pH를 5 M 염산을 사용해 약 5로 적정하였다. 그런 후, 용액에 탈이온수를 첨가하여 메스 플라스크에서 최종 부피 50 mL로 희석하였다. 제조한 완충화된 점도-강하 부형제 용액을 사용해 HUMIRA®를 mAb 고 농도로 재구성하였다. 다음으로, 30 kDa 분자량 컷오프의 Amicon Ultra 15 원심분리관을 세척하고, 여기에 HUMIRA® 약 0.8 mL을 첨가한 다음 Sorvall Legend RT에서 8-10분간 25℃에서 4000 rpm으로 원심분리하였다. 이후, 상기와 같이 완충화된 점도-강하용 부형제 용액 약 14 mL을 제조하여, 이를 원심분리 농축기에 배치된 농축된 HUMIRA®에 첨가하였다. 부드럽게 혼합한 다음, 샘플을 약 40-60분간 25℃에서 4000 rpm으로 원심분리하였다. 체류물은 점도-강하용 부형제가 첨가된 완충제 내에 재구성된 HUMIRA®의 농축 샘플이다. 샘플의 점도 및 농도를 측정하였으며, 일부 경우에는 보다 낮은 농도에서 점도를 측정하기 위해 소량의 여과물로 희석하였다. 점도 측정은 이전 실시예에서 농축 HUMIRA® 제제를 사용한 방법과 동일한 방식으로 microVisc 점도계를 사용해 완료하였다. 탈이온수 중에 희석한 HUMIRA® 스톡 용액으로 작성된 표준 곡선을 이용해, 브래드포드 분석으로 농도를 결정하였다. 점도-강하용 부형제를 이용하여 HUMIRA®를 재구성한 결과, 아래 표 35에 나타낸 바와 같이, 재구성하지 않은 시판 완충제 중에서 농축한 HUMIRA®의 점도 값과 비교해 점도가 30% 내지 60% 감소하였다.
표 35
아달리무맵 농도 (mg/mL) 점도 (cP)
290 61
273 48
244 20
205 14
실시예 36: 부형제로서 카페인을 사용한 아달리무맵 용액의 안정성 개선
샘플을 서로 다른 2가지 스트레스 환경에 노출시킨 후, 카페인 부형제가 첨가된 아달리무맵 용액 및 카페인 부형제가 비-첨가된 아달리무맵 용액의 안정성을 평가하였다: 교반 및 냉동-해동. 실시예 34에서 보다 상세하게 기술된 특성을 가진 아달리무맵 약물 제제 HUMIRA® (AbbVie)를 이용하였다. HUMIRA® 샘플을 실시예 39에 기술한 바와 같이 오리지날 완충액에서 200 mg/mL 아달리무맵 농도로 농축하였으며; 이 농축한 샘플을 "샘플 1"로 명명하였다. 제2 샘플은 실시예 40에 기술한 바와 같이 아달리무맵 ~200 mg/mL 및 카페인 첨가량 15 mg/mL을 사용해 제조하였으며; 카페인이 첨가된 이 농축 샘플을 "샘플 2"로 명명하였다. 이들 2가지 샘플을 다음과 같이 희석제를 첨가하여 아달리무맵 최종 농도 1 mg/mL로 희석하였다: 샘플 1 희석제는 오리지날 완충액이고, 샘플 2 희석제는 20 mM 히스티딘, 15 mg/mL 카페인, pH=5이다. HUMIRA® 희석물 2종을 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 희석한 샘플마다, 각각 300 ㎕씩 배치 3개를 층류 후드 하 2 mL 에펜도르프 튜브 안에 넣어 제조하였다. 샘플들을 다음과 같은 스트레스 환경에 노출시켰다: 교반의 경우, 샘플을 회전 진탕기에서 91시간 동안 300 rpm 하에 두었으며; 동결-해동의 경우, 샘플을 조건 당 평균 6시간 동안 -17 내지 30℃에서 7번의 사이클을 실시하였다.
표 36
샘플 # 첨가 부형제 스트레스 환경
1-C 없음 없음
1-A 없음 교반
1-FT 없음 동결-해동
2-C 15 mg/mL 카페인 없음
2-A 15 mg/mL 카페인 교반
2-FT 15 mg/mL 카페인 동결-해동
실시예 37: 동적 광 산란 (DLS)에 의한 안정성 평가
Brookhaven Zeta Plus 동적 광 산란 장치를 사용해 실시예 36의 샘플에서 아달리무맵 분자의 유체역학 반경 (hydrodynamic radius)을 측정하고, 응집물 개체군 형성의 증거를 확인하였다. 표 37은 실시예 36에 따라 제조한 샘플 6개에 대한 DLS 결과를 나타낸 것으로: 이들 중 일부 (1-A, 1-FT, 2-A 및 2-FT)는 스트레스 환경에 노출시키고 ("스트레스 노출 샘플"); 그외 샘플 (1-C 및 2-C)은 노출시키지 않았다. 표 37의 DLS 데이터는 카페인이 함유되지 않은 스트레스 노출 샘플 내 단일클론 항체가 멀티모달 입자 크기 분포를 형성함을 보여준다. 부형제로서 카페인이 첨가되지 않은 경우, 스트레스 노출 샘플 1-A 및 1-FT는 스트레스 비-노출 샘플 1-C 보다 유효 직경이 더 크게 관찰되었으며, 또한 이는 현저하게 큰 직경을 가진 제2 입자 집단을 의미하며; 이러한 직경이 더 큰 입자 그룹은 육안으로 보이지 않는 입자로 응집된 증거이다. 카페인을 함유한 스트레스 노출 샘플 (샘플 2-A 및 2-FT)만, 스트레스 비-노출 샘플 2-C와 비슷한 입자 직경을 가진 한가지 입자 집단을 형성하였다. 이러한 결과는, 샘플에 카페인 첨가가 응집물 또는 육안으로 보이지 않는 입자의 형성을 감소시킨다는 것을, 입증해준다.
표 37
샘플 # 유효 직경 (nm) 집단 1의 직경 (nm) 집단 1의 농도 에 의한 % 집단 2의 직경 (nm) 집단 2의 농도에 의한 %
1-C 10.9 10.8 100 - -
1-A 11.5 10.8 87 28.9 13
1-FT 20.4 11.5 66 112.2 44
2-C 10.5 10.5 100 - -
2-A 10.8 10.8 100 - -
2-FT 11.4 11.4 100 - -
표 38A 및 표 38B는 입자 크기 분포를 보여주는, 실시예 36의 아달리무맵 샘플의 DLS 원 데이터를 나타낸다. 이들 표에서, G(d)는 농도-가중 차등 크기 분포 (intensity- weighted differential size distribution)이다. C(d)는 누적 농도-가중 차등 크기 분포 (cumulative intensity-weighted differential size distribution)이다.
표 38A
표 38B
실시예 38: 크기-배제 크로마토그래피 (SEC)에 의한 안정성 평가
크기 배제 크로마토그래피를 이용해, 실시예 36에 나타낸 스트레스 노출된 아달리무맵 샘플 및 스트레스 비-노출된 아달리무맵 샘플에서, 크기가 약 0.1 미크론 미만인 육안으로 보이지 않는 미립자를 검출하였다. SEC를 수행하기 위해 가이드 컬럼이 장착된 TSKgel SuperSW3000 컬럼 (Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA)을 사용하였으며, 용출물을 280 nm에서 모니터링하였다. 실시예 36의 스트레스 노출 샘플 및 비-노출 샘플 각각에서 총 10 ㎕를, pH 6.2 완충제 (100 mM 포스페이트, 325 mM NaCl)를 유속 0.35 mL/min으로 사용해 등용매에 의해 용출시켰다. 아달리무맵 모노머의 체류 시간은 약 9분이었다. 카페인 부형제가 포함된 샘플에서는 검출가능한 응집물은 식별되지 않았으며, 샘플 3종 모두에서 모노머 함량이 일정하게 유지되었다.
실시예 39: HERCEPTIN ® 제제의 점도 저하
단일클론 항체 트라스투주맵 (trastuzumab) (HERCEPTIN®, Genentech)을 동결건조된 분말로 입수하여, 탈이온수 중의 21 mg/mL로 재구성하였다. 제조한 용액을 Amicon Ultra 4 원심분리 농축기 튜브 (분자량 컷오프, 30 kDa)에서 1.5시간 동안 3500 rpm으로 원심분리하여 그대로 농축하였다. 샘플을 적정 완충제에 200배 희석한 다음 280 nm에서 흡광도를 측정하고 흡광 계수 1.48 mL/mg를 적용하여, 농도를 측정하였다. 점도는 RheoSense microVisc 점도계를 사용해 측정하였다.
히스티딘과 부형제를 증류수에 용해한 다음 pH를 적정 수준으로 조정하여, 살리실산과 카페인을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 부형제 완충제를 제조하였다. 완충제 시스템 1 및 2의 조건을 표 39에 요약 개시한다.
표 39
완충제 시스템 # 살리실린산 농도 카페인 농도 삼투질 농도 (mOsm/kg) pH
1 10 mg/mL 10 mg/mL 145 6
2 0 15 mg/mL 86 6
HERCEPTIN® 용액을 부형제 완충제에 ~1:10 비율로 희석하고, Amicon Ultra 15 (MWCO 30 kDa) 농축기 튜브에서 농축하였다. 브래드포드 분석으로 농도를 구하고, 이를 스톡 HERCEPTIN® 샘플로부터 작성한 표준 캘리브레이션 곡선과 비교하였다. RheoSense microVisc 점도계를 사용해 점도를 측정하였다. 다양한 HERCEPTIN® 용액들의 농도 및 점도 측정치를 아래 표 40에 나타내며, 여기서 완충제 시스템 1 및 2는 표 39에 나타낸 완충제이다.
표 40
부형제 무첨가 대조군 용액 완충제 시스템 1: 10 mg /mL 카페인 + 10 mg /ml 살리실린산 첨가 용 액 완충제 시스템 2: 15 mg /mL 카페인 첨가 용액
점도 (cP) 항체 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 항체 농도 (mg/mL) 점도 (cP) 항체 농도 (mg/mL)
37.2 215 9.7 244 23.4 236
9.3 161 7.7 167 12.2 200
3.1 108 2.9 122 5.1 134
1.6 54 2.4 77 2.1 101
살리실산과 카페인을 둘다 포함하는 완충제 시스템 1은, 대조군 샘플과 비교해, 215 mg/mL 조건에서 최고 점도 감소율 76%를 나타내었다. 카페인만 함유한 완충제 시스템 2는 200 mg/mL 조건에서 최대 59%의 점도 감소를 나타내었다.
실시예 40: AVASTIN ® 제제의 점도 저하
AVASTIN® (단일클론 항체 베박시주맵 제제, Genentech)을 히스티딘 완충제 중의 25 mg/mL 용액으로 제공받았다. 이 샘플을 Amicon Ultra 4 원심분리 농축기 튜브 (MWCO 30 kDa)에서 3500 rpm으로 농축하였다. RheoSense microVisc 점도계로 점도를 측정하고, 280 nm (흡광 계수, 1.605 mL/mg)에서 흡광도를 측정하여 농도를 결정하였다. 10 mg/mL 카페인을 25 mM 히스티딘 HCl과 함께 첨가하여 부형제 완충제를 제조하였다. AVASTIN® 스톡 용액을 부형제 완충제로 희석한 다음, Amicon Ultra 15 원심분리 농축기 튜브 (MWCO 30 kDa)에서 농축하였다. 부형제 샘플의 농도를 브래드포드 분석으로 결정하고, 점도를 RheoSense microVisc 점도계를 사용해 측정하였다. 결과는 아래 표 41에 나타낸다.
표 41
농도 (mg/mL) 부형제 무첨가시 점도 (cP) 10 mg /mL 카페인 부형제 첨가시 점도 (cP) 부형제에 의한 점도 감소율%
266 297 113 62%
213 80 22 73%
190 21 13 36%
AVASTIN®은, 10 mg/mL 카페인을 첨가하여 213 mg/mL로 농축하였을 때, 대조군 AVASTIN® 샘플과 비교해, 73%의 최고 점도 감소율을 나타내었다.
실시예 41: 카페인, 제2 부형제 및 시험 단백질을 함유한 제제 제조
부형제 화합물로서 카페인 또는 카페인과 제2 부형제 화합물의 조합물 및 시험 단백질을 사용해 제제를 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질을 모방하도록 의도하였다. 이들 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 여러가지 부형제 화합물을 첨가하여 20 mM 히스티딘 완충제 중에 제조하였다. 부형제 조합물 (아래 표 28에 나타낸, 부형제 A 및 B)을 20 mM 히스티딘에 용해하고, 수득한 용액을 모델 단백질을 용해하기 전 수산화나트륨 또는 염산을 소량 첨가하여 pH 적정하여, pH 6으로 만들었다. 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 최종 단백질 농도 약 280 mg/mL이 달성되는 비율로 용해하였다. 부형제 용액 중의 BGG 용액을 20 mL 유리 신틸레이션 바이얼에서 제조한 다음 회전 진탕기 테이블 위에 배치하여 밤새 80-100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관으로 이동시켜, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 약 10분간 2300 rpm으로 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 기포를 제거하였다.
상기와 같이 제조한 제제의 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 아래 표 42에 기록하였다. 부형제 함유 용액의 점도를 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도를 기준으로 표준화하였다. 표준화된 점도는 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제 함유 모델 단백질 용액의 점도의 비이다.
표 42
부형제 A 부형제 B 표준화된 점도
명칭 농도 (mg/mL) 명칭 농도 (mg/mL)
- 0 - 0 1.00
카페인 15 - 0 0.77
카페인 15 소듐 아세테이트 12 0.77
카페인 15 소듐 설페이트 14 0.78
카페인 15 아스파르트산 20 0.73
카페인 15 CaCl2 이수화물 15 0.65
카페인 15 다이메틸 설폰 25 0.65
카페인 15 아르기닌 20 0.63
카페인 15 루신 20 0.69
카페인 15 페닐알라닌 20 0.60
카페인 15 니아신아미드 15 0.63
카페인 15 에탄올 22 0.65
실시예 42: 다이메틸 설폰과 시험 단백질을 함유한 제제의 제조
부형제 화합물로서 다이메틸 설폰 (Jarrow Formulas, Los Angeles, CA) 및 시험 단백질을 사용해 제제를 제조하였으며, 시험 단백질은 치료 제제에 사용될 치료 단백질을 모방하도록 의도하였다. 이들 제제는 다음과 같은 방식으로 점도를 측정하기 위해 20 mM 히스티딘 완충제 중에 제조하였다. 다이메틸 설폰을 20 mM 히스티딘에 용해하고, 수득한 용액에 수산화나트륨 또는 염산을 소량 첨가하여 pH 6으로 적정한 다음, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과한 후, 모델 단백질을 용해하였다. 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 보바인 감마 글로불린 (BGG)을 약 280 mg/mL 농도로 용해하였다. 부형제 용액 중의 BGG 용액을 20 mL 유리 신틸레이션 바이얼에서 제조한 다음 회전 진탕기 테이블 위에 배치하여 밤새 80-100 rpm으로 교반하였다. 그런 후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리관으로 이동시켜, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 약 10분간 2300 rpm으로 원심분리하여, 점도 측정 전 포집된 기포를 제거하였다.
상기와 같이 제조한 제제의 점도 측정은 DV-IIT LV 점도계 (cone & plate viscometer) (Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용해 수행하였다. 점도계에 CP-40 cone을 장착하고, 3 rpm 및 25℃에서 작동시켰다. 제제를 0.5 mL 부피로 점도계에 로딩하고, 소정의 전단 속도 및 온도에서 3분간 인큐베이션한 다음 20초간 측정값을 수집하였다. 그런 후, 전단 인큐베이션 1분 후 측정값 수집 기간 20초로 이루어진 부가적인 2 단계를 수행하였다. 수집한 데이터 포인트 3개의 평균을 구하여, 샘플의 점도로서 기록하였다. 부형제 함유 용액의 점도를 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도를 기준으로 표준화하였다. 표준화된 점도는 부형제 비-함유 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제 함유 모델 단백질 용액의 점도의 비이다.
표 43
다이메틸 설폰 농도 (mg/mL) 표준화된 점도
0 1.00
15 0.92
30 0.71
50 0.71
30 0.72
균등물
본 발명의 특정 구현예들이 본원에 기술되었으나, 상기 설명은 예시적이며, 제한되는 것은 아니다. 본 발명이 바람직한 구현예를 들어 구체적으로 기술 및 기재되었지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 첨부된 청구항에 포함되는 본 발명의 범위로부터 이탈하지 않으면서, 형태 및 세부 사항들에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 상세 내용을 숙지하였을 때, 본 발명에 대한 다수의 변형들이 자명해질 것이다. 달리 언급되지 않은 한, 명세서 및 청구항에 사용된, 반응 조건, 구성 성분들의 양 등을 나타내는 모든 수치들은, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 반대로 언급되지 않은 한, 본원에 언급된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 바람직한 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.

Claims (39)

  1. 단백질 생산 공정의 파라미터를 개선하는 방법으로서,
    상기 방법은 점도-강하용 함량(viscosity-reducing amount)의 이미다졸, 타우린, 니아신아미드 또는 카페인에서 선택되는 하나 이상의 부형제를 단백질 조성물에 첨가하여 부형제-단백질 조성물을 제조하는 단계, 및 상기 부형제-단백질 조성물을 단백질 생산 공정에 적용하는 단계를 포함하고,
    상기 파라미터는 여과 속도, 응집된 단백질 생산, 이동 효율(transfer efficiency) 또는 단백질 수율을 포함하고, 상기 파라미터는 대조군 용액에 대해 단백질 생산 공정을 수행하는 것과 비교하여 개선되며, 상기 대조군 용액은 상기 점도-강하용 함량의 상기 하나 이상의 부형제를 함유하지 않는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 파라미터가 단백질 생산 단가 또는 단백질 생산율을 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 생산 공정이 크로마토그래피 공정을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 크로마토그래피 공정이 단백질-A 크로마토그래피 공정을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 파라미터가 단백질 수율을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질 생산 공정이 여과 공정을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 여과 공정이 바이러스 제거 여과 공정 또는 한외여과/정용여과 공정인 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 여과 공정이 개선된 여과-관련 파라미터를 특징으로 하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 개선된 여과-관련 파라미터가 대조군 용액의 여과 속도보다 더 빠른 여과 속도인 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 개선된 여과-관련 파라미터가 대조군 용액에 대한 여과 공정에 의해 생산되는 응집된 단백질의 양보다 더 적은 양의 응집된 단백질의 생산인 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 개선된 여과-관련 파라미터가 대조군 용액에 대한 여과 공정의 물질 이동 효율(mass transfer efficiency)보다 더 높은 물질 이동 효율인 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 개선된 여과-관련 파라미터가 대조군 용액에 대한 여과 공정에 의해 생산되는 타겟 단백질의 농도 또는 수율보다 더 높은 농도 또는 더 높은 수율인 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 점도-강하용 함량이 1 mg/mL 내지 100 mg/mL의 상기 하나 이상의 부형제인 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 점도-강하용 함량이 1 mM 내지 400 mM의 상기 하나 이상의 부형제인 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 점도-강하용 함량이 2 mM 내지 150 mM의 함량인 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 부형제-단백질 조성물이 보존제, 당(sugar), 다당류, 아르기닌, 프롤린, 계면활성제, 안정화제 및 완충제로 이루어진 군에서 선택되는 부가적인 물질을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 단백질 조성물이 치료 단백질을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 치료 단백질이 단일클론 항체, 다클론 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 페길화된 단백질(PEGylated protein), 항체-약물 접합체, 합성 폴리펩타이드, 단백질 단편, 지단백질, 효소 및 구조 펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 치료 단백질이 재조합 단백질인 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 제2 점도-강하용 부형제를 상기 부형제-단백질 조성물에 첨가하는 단계를 더 포함하고, 상기 제2 점도-강하용 화합물을 첨가하는 단계가 상기 파라미터에 부가적인 개선을 부여하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제2 점도-강하용 부형제가 테오필린, 티라민, 프로카인, 리도카인, 이미다졸, 아스파르탐, 사카린, 아세설팜 포타슘, 니아신아미드 또는 이소니코틴아미드인 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 부형제가 이미다졸을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 부형제가 타우린을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 부형제가 니아신아미드을 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 부형제가 카페인을 포함하는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 상기 파라미터가 여과 속도를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 파라미터가 응집된 단백질 생산을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항에 있어서, 상기 파라미터가 이동 효율을 포함하는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 파라미터가 단백질이 멸균 필터를 통과하는데 요구되는 에너지를 더 포함하는 것인 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 파라미터가 단백질 용출을 더 포함하는 것인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 점도-강하용 함량의 카페인이 22 mg/ml 이하인 것인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 점도-강하용 함량의 카페인이 15 mg/ml 이하인 것인 방법.
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