JP7252890B2 - 血友病を処置するための切断型フォン・ヴィルブランド因子ポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、血液凝固障害の処置を改善するための製品及び方法に関する。
血液凝固因子の欠乏により引き起こされる様々な出血障害がある。最も一般的な障害は、それぞれ第VIII(FVIII)及び第IX血液凝固因子の欠乏により生じる血友病A及びBである。別の公知の出血障害はフォン・ヴィルブランド病(von Willebrand’s disease)(VWD)である。
内在性第VIII因子のインビボ半減期が、切断型半減期延長VWFポリペプチド(本発明のポリペプチド)の投与により延長され得るということが、本発明者らにより見出された。内在性第VIII因子のインビボ半減期が外来性FVIIIの同時投与を必要とすることなくとも本発明の上記ポリペプチドの投与により延長され得るということも見出された。患者は、正常ヒト血漿(NHP)におけるFVIIIのレベルと比べて上記ポリペプチドを用いた処置の前に減少したレベルの内在性FVIIIを有する。上記患者における内在性FVIIIのレベルは、正常ヒト血漿(NHP)における内在性FVIIIのレベルの少なくとも0.5%である。本発明のポリペプチドは、内在性FVIIIレベルを上昇させることができる。これは外来性FVIIIを同時投与する必要なく、患者の予防的処置を可能にする。外来性FVIIIが同時投与される場合、出血事象の経過観察処置を、本発明のポリペプチドのみを用いて、すなわち外来性FVIIIを継続した同時投与することなく行うことができる。外来性FVIIIの投与及びそれにより該被験体において内在性FVIIIを提供することにより、このような内在性第VIII因子のインビボ半減期が延長され、患者は本発明のポリペプチドを用いた処置から利益を得ることができるということも見出された。
[1] 血液凝固障害の処置における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)及び半減期延長部分を含むポリペプチドであって、該処置は、血液凝固障害を有しかつ内在性第VIII因子(FVIII)を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性FVIIIの活性レベルは、正常ヒト血漿(NHP)におけるFVIIIの活性レベルと比べて減少しているが、ただし該被験体における内在性FVIIIの活性レベルは正常ヒト血症(NHP)における内在性FVIIIの活性レベルの少なくとも0.5%であり、ここでポリペプチドは内在性FVIIIに結合することができ、そして内在性FVIIIレベルは、該ポリペプチドの投与後に増加し、そしてここで
- (i) 該ポリペプチドは、出血事象の予防のために投与され、ここで
a) 該処置はいずれも外来性FVIIIの同時投与を含まず、もしくは
b) 該処置は、外来性FVIIIが投与され、そしてそれにより該被験体において内在性FVIIIを提供することを含み;又は
- (ii) 該ポリペプチドは、出血事象の処置のため、又は予防的処置レジメンの開始のために外来性FVIIIと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性FVIIIを同時投与することなく投与される、
上記使用のためのポリペプチド。
第一の局面において、本発明は、血液凝固障害の処置における使用のための、(i)切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)及び(ii)半減期延長部分を含むポリペプチドに関し、該処置は、血液凝固障害に罹患しており、かつ内在性第VIII因子(FVIII)を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性FVIIIの活性レベルは、正常ヒト血漿(NHP)におけるFVIIIの活性レベルと比べて減少しているが、ただし該被験体における内在性FVIIIの活性レベルは、正常ヒト血漿(NHP)における内在性FVIIIの活性レベルの少なくとも0.5%であり、そしてそれにより内在性FVIIIレベルは、該ポリペプチドの投与後に増加し、そして該ポリペプチドは出血事象の予防のために投与され、ここで該処置は外来性FVIIIの同時投与を含まない。
- (i) 該ポリペプチドは出血事象の予防のために投与され、ここで
該処置は外来性FVIIIの同時投与を含まず;又は
- (ii) 該ポリペプチドは、出血事象の処置のため若しくは予防的処置レジメンの開始のために外来性FVIIIと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性FVIIIを同時投与することなく投与される。
本明細書で使用される用語「フォン・ヴィルブランド因子」(VWF)は、天然に存在する(天然)VWFを含むが、天然に存在するVWFのFVIII結合活性を少なくとも保持するその変異体、例えば1つ又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換されている配列変異体も含む。FVIII結合活性は、実施例2に記載されるFVIII-VWF結合アッセイにより決定される。
D1-D2-D’-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
配列番号4に関して、D’ドメインは、アミノ酸764~865からなり;そしてD3ドメインはアミノ酸866~1242からなる。
776-805;766-805;764-805;776-810;766-810;764-810;776-815;766-815;764-815;
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776-835;766-835;764-835;776-840;766-840;764-840;776-845;766-845;764-845;
776-850;766-850;764-850;776-855;766-855;764-855;776-860;766-860;764-860;
776-864;766-864;764-864;776-865;766-865;764-865;776-870;766-870;764-870;
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776-1175;766-1175;764-1175;776-1180;766-1180;764-1180;776-1185;766-1185;764-1185;
776-1190;766-1190;764-1190;776-1195;766-1195;764-1195;776-1200;766-1200;764-1200;
776-1205;766-1205;764-1205;776-1210;766-1210;764-1210;776-1215;766-1215;764-1215;
776-1220;766-1220;764-1220;776-1225;766-1225;764-1225;776-1230;766-1230;764-1230;
776-1235;766-1235;764-1235;776-1240;766-1240;764-1240;776-1242;766-1242;764-1242;
764-1464;764-1250;764-1041;764-828;764-865;764-1045;764-1035;764-1128;764-1198;
764-1268;764-1261;764-1264;764-1459;764-1463;764-1464;764-1683;764-1873;764-1482;
764-1479;764-1672;及び764-1874。
ヒト血漿における内在性VWFの半減期は約16時間である(Lenting PJ、Christophe OD、Denis CV. von Willebrand factor biosynthesis、secretion、and clearance:connecting the far ends. Blood. 2015.125(13):2019-28)。
tVWF-L1-H、[式1]
式中、tVWFは切断型VWFであり、L1は化学結合又はリンカー配列であり、そしてHはHLEPである。
好ましくは、半減期延長部分は半減期延長ポリペプチド(HLEP)であり、より好ましくはHLEPは、アルブミン又はそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及び部分、例えばFcフラグメント、大きい流体力学的体積を有する溶媒和されたランダム鎖(例えばXTEN (Schellenberger et al. 2009;Nature Biotechnol. 27:1186-1190)、ホモアミノ酸反復(HAP)又はプロリン-アラニン-セリン反復(PAS))、アファミン、アルファ-フェトプロテイン、ビタミンD結合タンパク質、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン-βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド(CTP)、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される。
用語「ヒト血清アルブミン」(HSA)及び「ヒトアルブミン」(HA)及び「アルブミン」(ALB)は、本出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広義であり、かつヒト血清アルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)、さらには他の種由来のアルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)を包含する。
免疫グロブリンG(IgG)定常領域(Fc)は、治療的タンパク質の半減期を増加させることが当該分野で公知である(Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160)。重鎖のIgG定常領域は3つのドメイン(CH1~CH3)及びヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、いずれかの哺乳動物由来、又はそれぞれサブクラスIgG1、IgG2、IgG3若しくはIgG4由来であり得る。抗原結合ドメインを含まないIgG及びIgGフラグメントもまた、HLEPとして使用され得る。治療的ポリペプチド部分は、好ましくは、切断可能であってもよい、抗体又はペプチドリンカーのヒンジ領域を介してIgG又はIgGフラグメントに接続される。いくつかの特許及び特許出願は、治療的タンパク質のインビボ半減期を増強するために免疫グロブリン定常領域に治療的タンパク質を融合させることを記載する。US 2004/0087778及びWO 2005/001025は、Fcドメイン又は免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部の、ペプチドの半減期を増加させる生物学的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載し、これは他の方法ではインビボで急速に排出される。Fc-IFN-β融合タンパク質は、増強された生物学的活性、延長された循環半減期及びより大きな溶解度を達成したと記載された(WO 2006/000448)。長い血清半減期及び増加したインビボ効力を有するFc-EPOタンパク質が開示され(WO 2005/063808)、さらに全て半減期増強特性を有する、G-CSF(WO 2003/076567)、グルカゴン様ペプチド-1(WO 2005/000892)、凝固因子(WO 2004/101740)及びインターロイキン-10(米国特許第6,403,077号)とのFc融合物も開示された。
本発明のポリペプチドは、好ましくはN-グリカンを含み、そして該N-グリカンの少なくとも75%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%は、平均して、少なくとも1つのシアル酸部分を含む。好ましい実施態様において、該N-グリカンの少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%は、平均して、少なくとも1つのシアル酸部分を含む。本発明者らは、高度にシアリル化されたVWFフラグエントを含むポリペプチドが、延長された半減期自体を有するだけでなく、同時投与されるFVIIIの半減期も延長することができるということを見出した。換言すれば、本発明のポリペプチドの投与は、同時投与されたFVIIIの延長された半減期及び/又は減少したクリアランスをもたらす。
本発明のポリペプチドは好ましくは高い比率のダイマーを有する。従って、本発明のポリペプチドは好ましくはダイマーとして存在する。従って、本発明のポリペプチドは好ましくはダイマーとして存在する。一実施態様において、ポリペプチドの少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%はダイマーとして存在する。別の実施態様において、本発明のポリペプチドのダイマー:モノマー比は、少なくとも1.5、好ましくは少なくとも2、より好ましくは少なくとも2.5又は少なくとも3である。最も好ましくは、本発明の全てのポリペプチドはダイマーとして存在する。ダイマーがモノマーと比較して第VIII因子に対する改善された親和性を有するので、ダイマーの使用は有利である。本発明のポリペプチドのダイマー含有量、及びモノマーに対するダイマーの比は、実施例に記載されるように決定することができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の方法に従って製造され得る。VWFのcDNA配列(配列番号3)に基いて、上述の切断型VWF構築物又は本発明のポリペプチドをコードする組み換えDNAを設計し生成することができる。
本発明の好ましい局面によれば、本明細書の上で定義されたポリペプチドは、本発明のポリペプチド単独での、すなわちFVIIIを同時投与しない投与により、未処置の被験体と比較して内在性第VIII因子のCmax又はAUCを増加させるために使用される。
本発明のさらなる局面は、本明細書の上で定義されるポリペプチドの皮下バイオアベイラビリティを提供するか又は改善することに関する。
本発明のさらなる局面は、それを必要とする患者に有効量の本明細書の上で定義されるポリペプチドを投与することを含む、血液凝固障害を処置する方法である。
特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、出血事象の処置のために、又は予防的処置レジメンの開始のために外来性FVIIIと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、上記ポリペプチドは外来性FVIIIを同時投与することなく投与される。本発明のポリペプチドを外来性FVIIIと一緒に同時投与することを含むこれらの実施態様について、本発明のポリペプチドは、好ましくは、同時投与しようとするポリペプチドの外来性FVIIIに対するモル比が50より大きくなるような用量で投与される。
本明細書に記載される方法において適した本発明のポリペプチドの治療用製剤は、当該分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は安定剤(これらは全て本明細書で「担体」と呼ばれる)、すなわち、緩衝化剤、安定剤、保存料、等張化剤(isotonifiers)、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及び他の種種雑多な添加物と、所望の程度の純度を有するポリペプチドを混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての貯蔵のために製造され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences、16th edition(Osol、ed. 1980)を参照のこと。このような添加物は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。
我々は、内在性FVIIIレベルに対するrD’D3-FPの影響を特徴づけし、それにより、軽度から中程度若しくは重症の血友病Aの患者又は低レベルVWF及び機能的内在性FVIIIを有する特定の型のフォン・ヴィルブランド病の処置を広く支持することを目的とした。我々はこの影響を様々なアプローチで調べた:
- 健常被験体において静脈内(i.v.)rD’D3-FP投与後の内在性FVIIIの潜在的なさらなる増加を調べるための、正常内在性FVIII及びVWFレベルを有するモデル、すなわちラット(実施例1.1)、ウサギ(実施例1.2)及びサル(実施例1.3)への静脈内投与
- 病気の被験体におけるi.v. rD’D3-FP投与後の内在性FVIIIの増加の大きさを調べるための、VWF欠乏に起因して低FVIIIレベルを有するモデル、すなわちVWF koラット(実施例1.4)及びVWF koマウス(実施例1.5)への静脈内投与。
- 病気の被験体におけるrD’D3-FP変異体のi.v.投与後の内在性FVIIIの増加の大きさを調べるための、VWF欠乏に起因して低FVIIIレベルを有するモデル、すなわちVWF koラットへの静脈内投与(実施例1.6)。
- 正常又は低いFVIIIレベルを有するモデル、すなわちブタ、FVIII ko及びVWF koマウス並びにFVIII ko及びVWF koラット及び(実施例1.7)への皮下投与を、rD’D3-FPのi.v.及びs.c.バイオアベイラビリティさらには内在性FVIIIに対する効果を比較するために調べた。
- 最終実験は、VWF koラットにおける複数回rD’D3-FP用量(i.v.)の効果を調べた(実施例1.8)。
- 血友病Aモデル、すなわちFVIII koラットにおいて皮下投与されたrD’D3-FP及び静脈内投与されたrVIII-単鎖の調査(実施例1.9)。
実施例について、配列番号2において定義されるアミノ酸配列を有する切断型VWFを含むポリペプチドを使用した。この特定の融合タンパク質は、VWF D’D3領域を表すN末端アミノ酸配列1~479(ヒト天然VWFのアミノ酸764~1242)、続いて31アミノ酸のグリシン/セリンリンカーペプチド及びC末端ヒトアルブミンアミノ酸配列511~1095からなる。配列番号2において定義される配列を有するこの融合タンパク質は、以下においてrD’D3-FP又はrD’D3-FP WTと呼ばれる。
全ての実施例において、rD’D3-FPは、ヒトアルブミンELISAにより定量された用量レベルで適用され、すなわちタンパク質のアルブミン部分を測定した。このrD’D3-FP ELISAを製剤及び血漿サンプルに使用した(関連するヒトアルブミン交差反応性を示したサル血漿サンプルを除く)。
FVIII koマウス
FVIII遺伝子のエクソン16及び17を欠失し、したがって血漿第VIII因子活性を有していないので(Bi L. et al、Nature genetics、1995、Vol 10(1)、119-121;Bi L. et al、Blood、1996、Vol 88(9)、3446-3450)、(血友病A表現型を表す)FVIII koマウスを選択した。これは、これらのマウスの血漿におけるFVIII活性を定量することによりFVIIIを用いた処置後のFVIII活性レベルの分析を可能にする。
血友病A表現型を表すFVIII koラットを、SAGE Labs (A Horizon Discovery Group Company、Saint Louis、MO 63146、USA)にてCRISPR/Cas9技術を使用して生成した。エクソン18内の位置23471~23472に2bp(塩基対)欠失及び1bp挿入を導入し、初期終止コドンをもたらす。生成されたFVIII ko変異は、FVIII機能を破壊されたFVIII koラットを生じた。これは、これらのラットの血漿におけるFVIII活性の定量化によりFVIIIを用いた処置後のFVIII活性レベルの分析を可能にする。
VWF遺伝子のエクソン4及び5を欠いており、したがって血漿VWF活性を有していないので(Denis C. et al、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1998、Vol 95、9524-9529)、VWFノックアウト(ko)マウス(VWD表現型を表す)を選択した。これは、これらのマウスの血漿における内在性FVIII活性でのD’D3ポリペプチドの分析を可能にする。
VWD表現型を表すVWF koラットを、Sigma Advanced Genetic Engineering (SAGE) Labs (Saint Louis、MO 63146、USA)でCompoZrTM 亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)技術及びSAGEspeedTM動物ノックアウト製造プロセスを使用して生成した。ゲノム配列における位置33926bp~33941bpでの16bp(塩基対)欠失を、エクソン7内に誘導し初期終止コドンを生じた。一般にZFN技術を使用してSigma Advanced Genetic Engineering (SAGE) Labs (Sigma-Aldrich Biotechnology)によるノックアウトラットの生成は、X. Cui et al. (Nature Biotechnology、2010)、MH. Porteus & D. Carroll (Nature Biotechnology、2005)に記載される。生成されたVWF ko変異は、VWF機能が破壊されたVWF koラットを生じた。これは、これらのラットの血漿における内在性FVIII活性レベルに対するD’D3ポリペプチドの分析を可能にする
VWFアミノ酸1~1242をコードするcDNA、グリシン/セリンリンカー及びヒトアルブミンのcDNAからなるD’D3-FPの発現カセットを、カスタム遺伝子合成(Eurofins Genomics、Ebersberg、Germany)により製造した。隣接する制限部位(EcoRI、NotI)を介して発現カセットを供給されたクローニングベクターから切除し、そしてEcoRI及びNotIと線状化したpIRESneo3ベクター(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ、USA)に挿入した。得られた発現プラスミドは、VWFプロペプチド、CMVプロモーター制御下にある短いリンカーコード配列を介してアルブミンコード配列に融合されたD’及びD3(配列番号4のVWFアミノ酸1~1242)をコードするヌクレオチド配列を含有していた。コード配列のヌクレオチド配列は配列番号1として表示され、成熟D’D3-FPのアミノ酸配列を配列番号2として示す。発現の間のD1D2 VWFプロペプチド(741アミノ酸)の存在は、合成されたポリペプチドの二量体化に不可欠である。
動物
200~294gの体重範囲の雌性Crl:CD(スプラーグドーリー)ラットをCharles River Laboratories(Sulzfeld、Germany)で飼育した。社内でこれらの動物を標準的飼育条件、すなわち20~24℃にて12時間/12時間明-暗サイクル下に維持した。動物に自由に標準的マウス及びラット食餌を与えた(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
1mg/kg群について、群サイズはn=9であり、コントロール(n=3動物のみ)を除いて3つのコホートに分けた。1mg/kg群の群サイズはn=6であり、2つのコホートに分けた。したがって、1時点あたりn=3の動物を常に使用した。
試験品をラット(群あたりn=3)の外側尾静脈への単回注射により静脈内(i.v.)投与した。rD’D3-FPをヒトアルブミン値に基づいて1mg/kg又は3mg/kgの用量レベルで適用した。1mg/kg群の血液サンプルを後眼窩で(大動脈穿刺による10及び14日目の終末サンプリング)投薬前、静脈内ボーラス注射後の投与後(p.a.)6時間(h)並びに1、2、3、4、5、7、10及び14日後に採取した。3mg/kg群の血液サンプルを投与の0.083、3、8h並びに1、2、3及び4日後に採取した。これらをクエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてrD’D3-FP及び/又はFVIII活性の決定のために約ー70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。FVIII活性血漿レベルを、発色アッセイ、さらには一段階凝固アッセイを使用して検出した。
曲線下総ピーク面積(AUC)の計算をGraphPad Prism (GraphPad Software、La Jolla、California、USA)を用いて14日間の期間の間にわたって、ベースラインとして処置前の値を使用し、そして最小値から最大値までの距離が≦30%であるピークを同定して行った。
rD’D3-FPを投与後(p.a.)4日(d)(3mg/kg)又は14d(1mg/kg)まで定量し、そして測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった(図1A)。線形用量依存性が2つの試験された用量で観察された。
FVIII活性を1 mg/kg rD’D3-FPで処置された群について発色及び一段階凝固活性として測定し、そして両方のFVIII活性試験は、rD’D3-FPの投与後に食塩水コントロールと比較して、投与後2日目(発色活性)又は1日目(凝固活性)と5日目との間のピークで、内在性FVIIIレベルの一時的な増加を示した(図1B及び1C)。再び両方のアッセイについて、平均FVIII濃度は、投薬前最大値、すなわち発色FVIII活性について3.1IU/mL及び凝固FVIII活性について454%(4.5IU/mL)をほとんど超えることはなかった。サンプルの定量のために使用される1:4希釈を用いた正常値上限(ULN)にはいずれの動物も達しなかったということに言及するべきだろう。これと一致して、図1Dに示されるようにAUC(投与後0日目から14日目にわたって評価された)は、1mg/kg rD’D3-FPの用量で発色アッセイ、さらには凝固アッセイで増加した。
FVIII活性の増加と一致して、ビヒクル処置動物と比較して生理学的活性化部分トロンビン時間(aPTT)は減少し(図1E)、これは投与直後に始まり、投与後約7日目までピークを有していた。再び、平均値は投薬前範囲内の範囲に及び、そして投与後1日目にのみ、平均値は最低投薬前値16.5sを下回った。
少なくとも14日間のrD’D3-FPへの所定の曝露で、FVIII活性のわずかな増加が観察された。ピーク値は投与後1~5日後に得られ、これらはいずれの場合も食塩水処置動物よりも<2倍高く(FVIII発色活性:最大増加約1IU/mL又は100%から約3.5IU/mL=350%;FVIII凝固活性:最大増加約300%~約700%、大部分は約100%~約500% - ヒトと比較したこれらの動物におけるより高いベースライン値と一致)、そして大部分は生理的変動内であった。FVIII活性のこのわずかな増加はaPTTの短縮をもたらし、平均値は最小投薬前値よりわずかにかつ短期間低いだけであった。したがって、健常ラットにおいて、FVIIIレベルの僅かな増加は1mg/kg rD’D3-FPの用量で観察されたが、これらの値は生理的範囲外にはほとんど変化しなかった。
動物
2.0~3.2kgの体重範囲の雌性CHBウサギ(Bauer、Neuental、Germany)を、鋼線ケージで1ケージあたり1匹で標準的な飼育条件、すなわち20~23℃及び50%相対湿度で12時間/12時間明-暗サイクル下で飼育した。動物は水道水を自由に与えられ、そしてウサギペレット食餌を与えられた(Deukanin(R)、Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH&Co.KG、Duesseldorf、Germany)。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
試験品を、ウサギの外側耳介静脈(lateral ear vein)への単回注射によりi.v.投与した(群あたりn=3)。ヒトアルブミン値に基づいて1、3又は10mg/kgの用量でrD’D3-FPを適用した。血液サンプルを投薬前、静脈内ボーラス注射の後、投与後(p.a.)1、3及び6時間に採取し、続いて10日まで毎日サンプリングした。これらをクエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてrD’D3-FP及び/又はFVIII活性の決定のために約-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。FVIII活性血漿レベルを、発色アッセイさらには一段階凝固アッセイを使用して検出した。さらに、aPTTをActin(R)FSL試験を使用して定量した。いずれの凝固したサンプルも評価から除外した。
曲線下総ピーク面積(AUC)の計算を、GraphPad Prism (GraphPad Software、La Jolla、California、USA)を用いて10日の期間にわたってベースラインとして処置前の値を使用して行い、そして最小値から最大値まで≦30%の距離を有するピークを同定した。
rD’D3-FPを投与後10日目(10 d p.a.)まで定量し、そして測定されたデータは、7日目又はそれ以後にいくつかの動物において観察された低下を除いて、観察期間全体にわたって16又は31ng/mLの検出限界より十分高かった(図2A)。曝露のこの突然の低下は単一の動物において観察され、7~10日目に始まり、そして特により高い用量について観察された。一つの可能性のある原因は、試験した他の種と比較してウサギ及びヒトにおけるD’D3領域のより低い相同性と一致して、抗薬物抗体の形成であり得る。
FVIII活性を、発色及び一段階凝固活性として測定し、両方とも食塩水対照と比較して内在性レベルの増加を示した(図2B及び2C)。データは、rD’D3-FPの投与後に内在性FVIIIレベルのわずかな増加を示唆し、ピークは投与後3~7日目の間であった。それにもかかわらず、平均値は、発色FVIII活性試験において投薬前の値2.8IU/mL及び凝固FVIII活性試験において標準の611%(6.1IU/mL)の範囲を一時的に増加させたのみであった。このことと一致して、図2Dに示されるようにAUC(投薬後0~10日にわたって評価された)は増加した:発色アッセイでは、用量3mg/kgで開始したが、凝固アッセイでの効果は10mg/kgでしか見えななかった。このことは凝固アッセイにおけるベースライン値のより高い変動と関連している可能性があり、これは処置された群においてはすでにわずかにより高かった。
FVIII活性はわずかな増加を示したが、aPTTの減少は観察されなかった(図2E)。
少なくとも6日間rD’D3-FPに対する所定の曝露で、FVIII活性のわずかな増加が観察され、これは食塩水処置動物において観察されたレベルをわずかに超えていた。ピーク値は投薬後3~7日目に生じ、これは食塩水処置動物より<2倍高かった(FVIII発色活性:最大増加約1IU/mL又は100%~約3.5IU/mL=350%;FVIII凝固活性:最大増加約400%~約900%-ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースライン値と一致)。これらの増加したFVIII活性レベルは、10mg/kgの用量で3~6日目にウサギにおける生理的レベルをわずかに超えただけであり、そしてaPTTを低減しなかった。したがって健常ウサギにおいて、FVIIIレベルのわずかな変化しか観察されなかった。
動物
約4~7kgの体重範囲、年齢約5~6歳の範囲の雄性カニクイザル(ベトナムから入手 - 証拠書類は健康スクリーニング及び到着前に施されたいずれかの処置を含んでいた - Huntingdon Life Sciences、Cambridgeshire、UKへ)を、標準的飼育条件、すなわち15~24℃及び相対湿度40~70%で12時間明-暗サイクル下で非ヒト霊長類を飼育するために特別に設計されたケージにおいて2匹一組で飼育した。動物に水道水を自由に供給し、そして旧世界サル食餌(毎日動物1匹あたり200g)及び栄養補助食餌(2つのビスケット栄養補助食品、各約25g、及び新鮮な果実製品)を与えた。
試験品をサルの伏在静脈に単回注射により静脈内投与した(群あたりn=3)。rD’D3-FPをヒトアルブミン値に基づいて2.5mg/kgの用量レベルで適用した。投薬前、及び静脈内ボーラス注射の投薬の5、30分、2、6、16、30、48、72、96、120、144、168時間後に血液サンプルを大腿静脈から採取した。これらをクエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.2%+9部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてFVIII活性及び/又はrD’D3-FPの決定のために約-70℃で保存した。
分子のD’D3部分を捕捉する抗体を使用し、そしてアルブミンに対する抗体の検出を使用して構築物のアルブミン部分を測定することにより、rD’D3-FP曝露を決定した。FVIII発色活性血漿レベルをChromogenixアッセイにより検出した。
その成分の両方、アルブミン及びD’D3へのELISA結合を使用してrD’D3-FPを定量し、そして測定は投与後168時間(7日)までに行った。測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった(図3A)。
FVIII活性を図3Bに示されるように発色活性として測定した。基礎内在性レベルは関連して変化し、標準の83.6~314.8%の範囲(0.8~3.1IU/ml=図3Bにおける点線)及び標準の平均176.4%(1.8IU/mL、図3Bにおける破線)であった。ラット及びウサギにおけるように、標準の258.9%の平均最大値までの内在性FVIIIの小さな増加しか観察されず、そして変動性は非常に高かった。それにもかかわらず、個々の投薬前の値と比較して、約1IU/mL又は標準の約100%までの内在性FVIIIレベルの増加(約2.5IU/mL又は約2.5IU/mLまで - ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースラインと一致)が実証され、それにもかかわらずこれらは(平均として)サルの生理的FVIIIレベルを超えなかった。
動物
体重範囲261~598gの雄性及び雌性VWF koラットをCharles River Laboratories(Sulzfeld、Germany)で飼育した。社内で、動物を標準的飼育条件、すなわち20~24℃で12時間/12時間明-暗サイクル下に維持した。動物に標準的マウス及びラット食餌を自由に与えた(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
1及び10mg/kg群の群サイズはn=9であり、対照を除いて3つのコホートに分けた(n=3動物のみ)。したがって、時点あたりn=3の動物を全てのビヒクル、1及び10mg/kg rD’D3-FPの時点で使用した。3mg/kg群については、群サイズは時点あたりn=4であった。
試験品を総体積2又は3mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与した。rD’D3-FPを、ヒトアルブミン値に基づいて1、3又は10mg/kgの投薬レベルで適用した。血液サンプルを、投薬前、投薬の6、24、48、72、96、120、168、240、336時間後(1及び10mg/kg)に交互サンプリングスキームを使用して、又は各個々の動物から伏在静脈から投薬前、投薬の1、24、48、72、120、192、240及び336時間後に(3mg/kg)短期間麻酔下で後眼窩から採取した。群あたりラットの3つのコホートから(1及び10mg/kg)又は個々の動物から(3mg/kg)PKプロフィールを取った。血液サンプルを、クエン酸(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてFVIII活性及び/又はアルブミンの決定のために-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、FVIII発色及び凝固活性、さらにはaPTTを測定した(後者は1及び10mg/kg rD’D3-FPで処置された群においてのみ)。
曲線下面積(AUC)の計算を、MATLAB R2017a (Natick、Massachusetts、USA)を用いてゼロから10日目まで台形法を使用して行った。
rD’D3-FPを、ヒトアルブミンに対するELISAを使用して定量し、そして測定を投薬後14日目まで行った。全ての測定されたデータは、14日目までの観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった(図4A)。線形用量依存性が1~10mg/kg rD’D3-FPから示された。
FVIII活性が図4Cにおいて示されるように凝固アッセイを用いて測定された場合、ベースラインFVIIIレベルは測定可能であった(未希釈サンプル:平均 標準の22.3%、最小 11.7%及び最大 40.9%、n=17;及び検出限界40%で、20サンプルが残った<40%)。したがって、CDラット及びウサギにおけるように、ベースライン値は非常に変化しやすい。rD’D3-FPの投与後の全てのサンプルが1:8の希釈工程を必要とし、それにより標準の1186.4%のULNを生じるということに言及する必要がある。再び、10mg/kgの用量でのrD’D3-FPの投与後に、内在性FVIIIレベルは2日以内にアッセイのULNを超えさえし、すなわちウサギにおけるより高かった。この効果は14日目まで高用量の10mg/kg rD’D3-FPで続いた。1mg/kgの用量でさえ、標準の388.8%の最高血漿濃度に2日目に達し、そして効果は7日目にもなお見られた。同様に3mg/kgの用量で、2日目に測定された最高血漿濃度は標準の435.2%であった。発色FVIII活性と同様に、10mg/kgの投与後にFVIII活性の生理的範囲を超え、そして1又は3mg/kg rD’D3-FPの投与直後に達した。
したがって、発色及び凝固活性データは、凝固活性データと一致して、わずかにより強い応答を示し、おそらくヒトFVIII標準に対してベースラインラットFVIIIの測定と関連する。FVIII活性の増加が観察され、健常CDラットにおいて観察されたレベルに達し(1及び3mg/kg)、又はそれらを超えた(10mg/kg)。10mg/kg用量については、ピーク値は検出上限より高く、したがって正常範囲のx倍の増加は決定することができなかった。
このことは、AUC(0~10日)において計算された増加と一致し、図4Dに示されるように1、3及び10mg/kg rD’D3-FPの用量の後の増加を示す。1及び3mg/kg rD’D3-FPの用量の後の増加は、ビヒクル処置と比較して発色FVIII活性について約10倍そして凝固FVIII活性について約80倍であり、10mg/kg rD’D3-FPでは発色について約50倍そしてAUC0-10dに対して430倍の効果であった。
FVIIIレベルのこれらの増加と一致して、活性化部分トロンビン時間(aPTT)は、病的な投薬前又はビヒクルデータから10mg/kg rD’D3-FP用量群において最低平均値12.5秒(s)まで関連して減少した(図4E)。この減少は両方の測定された用量群(1及び10mg/kg)において14日目まで続き、そしてaPTT値を健常CDラットにおいて観察された範囲(範囲16.5~36.6s)に(1mg/kg rD’D3-FP)又はその範囲よりわずかに低く(10mg/kg rD’D3-FP)した。
動物
30~45gの体重範囲の雄性及び雌性VWF koマウスをCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)において飼育した。社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち、20~24℃で12時間/12時間明-暗サイクル下で飼育した。動物に標準的マウス及びラット食餌(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)を自由に与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
群サイズはn=12であり、対照(n=4匹の動物)を除いて4つのコホートに分けた。したがって、時点あたりn=3~4匹の動物を使用した。
試験品(rD’D3-FP又はビヒクル(等張食塩水))を、総体積5mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与した。rD’D3-FPをヒトアルブミン値に基づいて10mg/kgの用量レベルで適用した。血液サンプルを、短期間麻酔下で投与の4、7、16、24、48、72、96及び168時間後に交互サンプリングスキームを使用してrD’D3-FP投薬動物から、並びに投与の4及び168時間後にビヒクル処置動物から後眼窩で採取した。PKプロフィールを、群あたりマウスの4つのコホートから取った。血液サンプルを、クエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてFVIII活性及び/又はアルブミンの決定のために-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露をヒトアルブミンELISAを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、FVIII発色及び凝固活性を測定した。
曲線下総ピーク面積(AUC)の計算を、GraphPad Prism(GraphPad Software、La Jolla、California、USA)を用いて7日間の期間にわたって最小値から最大値までの距離≦10%を有するピークを同定して行った。
rD’D3-FPをヒトアルブミンに対するELISAを使用して定量し、そして測定を投与後7日目まで行った。全ての測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった(図5A)。
発色活性として測定されたFVIII活性は、関連するベースラインFVIIIレベルを生じなかった:ビヒクル処置動物からの全ての6つの測定されたサンプルは検出限界(10mIU/mL又は1%)未満であった。比較のために、健常NMRIマウスの発色活性は、約96~300mIU/mL、中央値230mIU/mL、平均206mIU/mL(標準の10~30%の範囲に及ぶ、未公開データ)の範囲に及び、すなわち他の動物種又はヒトにおいて観察されたよりも低かった。図5Bに従って、rD’D3-FPの投与後に、レベルは4時間以内に平均値138mU/mL(14%)まで急速に増加し、そしてさらに増加して投与48時間後に最大値に達し、平均421mU/mL(42%)で投与72時間後まで(429IU/ml又は43%)であった。投与168時間(7日)後の最後の時点に、なお194mU/mL(20%)が測定された。これを用いて、10 mg/kg rD’D3-FPを用いた処置後のFVIII発色活性は、NMRIマウスにおいて測定された生理的FVIII血漿レベルを超え、そして効果はVWF koラットに匹敵するものであった。
FVIII活性を凝固アッセイを用いて測定した場合、べースラインFVIIIレベルは測定可能であった(ビヒクル処置動物:標準の平均31.1、最小25.8及び最大41.8%、n=8)。したがって、他の種におけるように、ベースライン値は非常に変化しやすかった。再び、rD’D3-FPの投与後に、図5Cに示されるようにレベルは急速に増加し、そして1:60の希釈でしか測定することができなかった(一方、ベースライン値の定量のために使用されたビヒクル処置動物は1:10希釈で測定された)。投与4時間後の最初のサンプリング時点で、平均値はすでに標準の137%であり、そして投与16時間後までさらに増加し、平均で標準の218%であった。最大曝露に投与72時間後に達し、平均で標準の304%であった。投与168時間(7日)後の最後の時点で、なお標準の254%が測定された。
したがって、発色及び凝固活性データは、概してより強い応答を示す凝固活性データと一致しており、おそらくヒトFVIII標準に対するマウスFVIII(VWF ko動物において)の測定と関連していた。FVIII活性の増加が観察され、これは健常NMRIマウスにおいて観察されたレベルを<2倍超えた(FVIII発色活性:最大増加 0.1IU/mL=約10%~約0.4IU/ml=40% - ヒトと比較してこれらの動物におけるより低いベースラインと一致;FVIII凝固活性:約300%への最大増加(NMRIマウスからの範囲は決定されていない))。これは計算されたAUCの増加と一致し(0~7日目)、図5Dに示されるようにビヒクル処置動物と比較して10mg/kg rD’D3-FPの投薬後に大きな増加を示した。
動物
261~559gの体重範囲の雄性及び雌性VWF koラットをCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育した。社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち20~24℃で12時間/12時間明-暗サイクル下にて維持した。動物に自由に標準的マウス及びラット食餌(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)を与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
群サイズは各群についてn=4であった。
試験品を、総体積3mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与した。rD’D3-FPをヒトアルブミン値に基づいて3mg/kgの用量レベルで適用した。血液サンプルを、rD’D3-FP投薬動物から投薬前、投与の1、24、48、72、120、192、240及び336時間後に、そしてrD’D3-CTP処置動物から投薬前、1、24、48、72、96、168、240及び336時間後に伏在静脈から採取した。血液サンプルをクエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)を用いて抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてFVIII活性及び/又はアルブミンの決定のために-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。rD’D3-CTPをELISA技術により抗ヒトD’D3に対する抗体を使用して決定した。さらに、FVIII発色及び凝固活性を測定した。
0~10日目までの曲線下面積(AUC)の計算を、MATLAB R2017a(Mathworks、Natick、Massachusetts、USA)を用いて台形法を使用して行った。
rD’D3-FPをヒトアルブミンに対してELISAを使用して定量し、そして測定を投与14日後まで行った。rD’D3-FP変異体の全ての測定されたデータは、観察期間全体にわたって検出限界より十分高かったが、rD’D3-CTPは14日目にベースライン値に達した(図6A)。変異体EY及びEYAと比較してrD’D3-FP WTのわずかな有利性が回収率において観察されたが、クリアランスに関して関連する差異は見られなかった。rD’D3-CTPをヒトrD’D3に対してELISAを使用して定量し、そして測定値は投与後10日目を含めて10日目まで検出限界より十分高かった(図6A)。
発色活性として測定されたFVIII活性は、関連するベースラインFVIIIレベルを生じなかった:全18の測定された投薬前サンプルは検出限界(20mIU/mL又は2%)未満であった。図6Bによれば、rD’D3-FP変異体の投与後に、レベルは投与1時間後にすでに増加し(WT 197±20mIU/mL又は5%、EY 171±84mIU/mL又は17%、EYA 203±117mIU/mL又は20%及びCTP 110±102mIU/mL又は11%)、そしてさらに次の測定された時点でも増加した。1日目~8日目の間に最大に達し、WTについて2088mU/mL(209%)、EYについて2889mU/mL(289%)、EYAについて1044mU/mL(104%)、そしてCTPについて2214mU/mL(221%)の平均値であった。最後の測定可能なFVIII活性はWTについて10日目に(237±225mU/mL(24%))、EYについて10日目に(512±603mU/mL(51%))、EYAについて14日目に(最後の測定された時点、179±107mU/mL(18%)、及びCTPについて14日目に(22±4mU/mL(2%))観察された。これはrD’D3-CTP変異体の静脈内投与後に最も高い観察されたAUC0-10dをもたらした(表2、図6D)。
FVIII活性を凝固アッセイで測定した場合、ベースラインFVIIIレベルも測定可能ではなかった(n=20投薬前 処置された動物、検出限界40%)。図6Cに示されるように、再び、rD’D3-HLPの投与後に、レベルは投与の1時間後にすでに増加し(WT 47±4%、EY 41±1%、EYA 45±5%及びCTP 40±1%)、そしてさらに次の測定された時点でも増加した。WTについて435%、EYについて453%、EYAについて779%、そしてCTPについて358%の平均値で1日目~8日目の間に最大に達した。最後の測定可能なFVIII活性は、WTについて10日目に(85±39%)、EYについて10日目に(130±84%)、EYAについて14日目に(最後の測定された時点、46±7%)、そしてCTPについて7日目(57±29%)に観察された。最も高い観察されたAUC0-10dは、rD’D3-FP EYAの静脈内投与後に達成された(表2、図6D)。
動物
FVIII koマウス
20~30gの体重範囲の雄性及び雌性FVIII koマウスをCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育した。群サイズはn=12であり、4つのコホートに分けた。したがって、時点あたりn=3匹の動物を使用した。
25~40gの体重範囲の雄性及び雌性VWF koマウスをCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育した。群サイズはn=12であり、4つのコホートに分けた。したがって時点あたりn=3匹のマウスを使用した。
27~34gの体重範囲の雌性NMRIマウスをCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育した。群サイズはn=12であり、4つのコホートに分けた。したがって、時点あたりn=3匹の動物を使用した。
250~302gの体重範囲の雌性ラットCrl:CD (スプラーグドーリー)をCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育した。群サイズはn=6であり、2つのコホートに分けた。したがって、時点あたりn=3匹の動物を使用した。
222~559gの体重範囲の雄性及び雌性VWF koラットをCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育した。群サイズはn=4であった。
ヒトについてのその予測因子に関して皮下バイオアベイラビリティの良好なモデルを表すのでブタを選択した。群サイズは2(静脈内)又は3(皮下)であった。
FVIII ko、VWF ko及びNMRIマウス
試験品を、総体積5mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈内投与、又は総体積5mL/kgで頸部への単回注射により皮下投与した。血液サンプルを短期間麻酔下で交互サンプリングスキームを使用して投与の3、8、16、24、32、48、72及び96時間後に後眼窩で採取し、そしてさらに投与5分後に静脈内で採取した。
血液サンプルをクエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)で抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用してタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。
試験品を、総体積3mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈投与、又は総体積2mL/kgで側腹部の片側に単回注射により皮下投与した。
皮下群からの血液サンプルを、投薬前、投薬の4、24、48、72、96及び168時間後に各動物から、そして投薬前、投薬の1、24、48、72、120、192、240及び336時間後に静脈内群から伏在静脈から採取した。
血液サンプルを、クエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用するタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、FVIII発色活性を測定した。
試験品を、総体積3mL/kgで外側尾静脈への単回注射により静脈投与、又は総体積3mL/kgで腹側部の片側に単回注射により皮下投与した。
血液サンプルを、後眼窩で短期間麻酔下にて交互サンプリングスキームを使用して投与の3、8、24、48、72及び96時間後に、そしてさらに投与の5分後に静脈内で採取した。
血液サンプルを、クエン酸ナトリウム(2部クエン酸ナトリウム3.13%+8部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用したタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。
試験品を、0.211~0.751mL/kgの範囲に及ぶ総体積で単回注射により、側腹部に皮下投与又は耳静脈に静脈内投与した。
血液サンプルを耳又は伏在静脈から採取した。10mg/kg rD’D3-FP皮下群において時点は、投薬前、投薬の3、12、24、32、48、72、96、120、144及び168時間後であり、そして静脈内群では投薬前、投薬の5分、3、12、24、32、48、72、96、120、144及び168時間後であった。3mg/kg rD’D3-FP皮下群における時点は、投薬前、投薬の1、3、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240及び264時間後であった。
PKプロフィールを個々の動物から取った。血液サンプルをクエン酸ナトリウム(1部クエン酸ナトリウム3.13%+9部血液)を使用して抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして-70℃でFVIII抗原及びアルブミンの決定のために保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用したタンパク質のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、FVIII発色活性を測定した。
rD’D3-FPを、ヒトアルブミン値に基づいて3、3.5又は10mg/kgの用量レベルで適用した。マウスにおいて、いくつかの群において、rVIII-単鎖を100又は200IU/kgの用量で同時投与した。PKプロフィールを、それぞれ群あたりマウスの4つのコホート若しくはラットの2つのコホートから、又は個々のブタから取った。
0から無限大までの曲線下面積(AUC)の計算をMATLAB R2017a(Natick、Massachusetts、USA)で行った。
rD’D3-FPをヒトアルブミンに対してELISAを使用して定量し、そして測定をマウスにおいて投与4日後まで、そしてラット及びブタにおいて投与14日後まで行った。全ての測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった(図7A)。
図7A-1は、様々なマウス系統におけるrD’D3-FPのPKプロフィールを示し、rFVIII同時投与の視覚的な影響はなかった。全3つの系統における曲線はほぼ同様であったが、それにもかかわらずNMRIマウスでは、曝露はFVIII ko又はVWF ko動物よりも急速に減少した。
rD’D3-FPのAUC0-inf及び得られたバイオアベイラビリティを表3にまとめる。FVIII koマウスにおいて、rVIII-単鎖を伴うか又は伴わないrD’D3-FPの静脈内投与は、rD’D3-FPの AUC0-infに対して影響を有していないということが示された(FVIIIを100%に設定 -> FVIII無しは89%と算出された)。したがって、この実験においてrD’D3-FP PKプロフィールに対するrVIII-単鎖の関連効果はなかった。様々な系統におけるAUC0-infの比較は、3つの系統間に主要な差異を示さず、順位はVWF ko動物(1197 h*μg/mL)より高いFVIII ko(1590 h*μg/mL)から、再びNMRI動物におけるわずかに低いAUC0-inf(940 h*μg/mL)であった。
したがって、これらのデータは、rD’D3-FPを用いた処置が静脈内を使用するだけでなく皮下化合物投与を使用しても行われ得るということを示唆する。
動物
281~504gの体重範囲の雄性及び雌性VWF koラットをCharles River Laboratories(Sulzfeld、Germany)で飼育した。群サイズはn=11であり、4つのコホートに分けた。したがって、時点あたりn=2~3匹の動物を使用した。
社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち20~24℃で12時間/12時間明-暗サイクルに維持した。動物に標準的マウス及びラット食餌を自由に与えた(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
試験品を、0日目(コホート1)、0+7日目(コホート2)、0+7+14+21日目(コホート3)又は0+7+14日目(コホート4)に総体積3mL/kgで外側尾静脈への複数回注射により静脈内投与した。動物あたり2つの血液サンプルをコホートに特定の時点に短期間麻酔下で後眼窩で採取した(コホート1:投薬前+投与7日後、コホート2:投与3+10日後、コホート3:投与17+24日後、コホート:投与14+21日後)。
rD’D3-FPを、ヒトアルブミン値に基づいて3mg/kgの用量レベルで適用した。PKプロフィールをVWF koラットの4つのコホートから取った。血液サンプルをクエン酸ナトリウム(2部クエン酸ナトリウム3.13%+8部血液)を用いて抗凝固処理し、処理して血漿とし、そしてアルブミンの決定のために-70℃で保存した。
rD’D3-FP曝露を、ヒトアルブミンELISAを使用して構築物のアルブミン部分の測定により決定した。さらに、FVIII発色及び凝固活性並びにPathromtin(R)SLを使用してaPTTを測定した。
rD’D3-FPをヒトアルブミンに対するELISAを使用して定量し、そして測定を24日目まで行った。全ての測定されたデータは観察期間全体にわたって検出限界より十分高かった(図8A)。4回の投与で、ピーク(151%まで)さらにはトラフ(128%まで)レベルにおいてわずかな蓄積が観察された。
FVIII発色(図8B)活性レベルは、2回目の投与後に検出限界未満の値から検出限界まで、CDラットにおいて観察された範囲に増加した(約1.8IU/mL=180%への最大増加)。FVIII凝固活性(図8C)は、CDラットにおいて測定されたデータよりなおわずかに高かった(約800%への最大増加 - ヒトと比較してこれらの動物におけるより高いベースラインと一致)。それにもかかわらず、4週間の期間にわたって2つのFVIII活性アッセイについて蓄積は見られなかった。
これと一致して、aPTTはCDラットからの正常値の上からCDラットの正常範囲より低い範囲の値まで減少した(図8D)。
これらをもとに、これらのデータは、rD’D3-FPを用いた複数回処置はrD’D3-FPのわずかな蓄積とともに行われ得るが、FVIIIレベルの蓄積もaPTTの正常化もないということを示唆する。
動物
220~487gの体重範囲の雄性及び雌性FVIII koラットをCharles River Laboratories (Sulzfeld、Germany)で飼育した。群サイズはn=6であり、2つのコホートに分けた。したがって、時点あたりn=3匹の動物を使用した。
社内では、動物を標準的飼育条件、すなわち20~24℃で12時間/12時間明-暗サイクル下で維持した。動物に標準的マウス及びラット食餌(Ssniff-Versuchsdiaeten、Soest、Germany)を自由に与えた。水道水を自由に供給した。動物畜産及び研究手順は独国動物福祉法及び欧州連合規則を順守した。
試験品を、総体積3mL/kgで単回注射により、FVIII koラットの頸部に皮下投与(rD’D3-FP)又は外側尾静脈に静脈内投与(rVIII-単鎖)した。D’D3-FPを、ヒトアルブミン値に基づいて3mg/kgの用量で、rVIII-単鎖の10分前に適用した。動物を、rVIII-単鎖で200IU/kg発色FVIII活性の用量で静脈内処置した。rVIII-単鎖を注射用水で再構成し、そしてrD’D3-FPを水浴で解凍した。全ての場合に、用量体積3mL/kgを投与し、FVIII(rVIII-単鎖)について希釈緩衝液又は等張性食塩水(rD’D3-FP)を必要な場合に化合物の溶解のために使用した。
D’D3データの評価
rD’D3-FPは皮下投与後吸収された。rD’D3-FPを、72時間の観察期間全体にわたって定量することができ;すなわち、検出限界27ng/mLより高いままであった(図9A)。
Cmax、AUC0-inf、クリアランス、MRT及びt1/2を表5に示し、そしてこれらは皮下投与後の時間にわたるrD’D3-FPの関連する曝露を裏付ける。
rD’D3-FPの皮下前投与後のrVIII-単鎖のFVIII PKプロフィールは、FVIII発色活性(図9B)さらにはFVIII抗原(図9C)について単独で投与されたrVIII-単鎖と比較して延長された。
これらの研究は、rD’D3-FPの静脈内又は皮下投与が、健常なラット、ウサギ、ブタ及びサルにおけるFVIIIの内在性レベルを増加し、これらの動物における既存の生理的FVIIIレベルさえも増加するということを実証する。投薬前の値はほとんど超えなかったが、それによりaPTTのわずかな短縮しか観察されないか又は短縮は見られなかった。
VWFフラグメント(1~1242)アルブミン融合物(D’D3-FP)をバイオリアクターで発現させた;上記のように精製してモノマー及びダイマーを単離した後、これらの調製物に対するFVIIIの親和性を、Biacore機器(T200、GE Healthcare)により表面プラズモン共鳴により評価した。
Claims (14)
- 血液凝固障害の処置における使用のための、切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)及び半減期延長部分を含むポリペプチドを含む医薬組成物であって、該処置は、血液凝固障害を有しかつ内在性第VIII因子(FVIII)を有する被験体にポリペプチドを投与することを含み、ここで該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体における内在性FVIIIの活性レベルは、正常ヒト血症(NHP)におけるFVIIIの活性レベルと比べて減少しているが、ただし該被験体における内在性FVIIIの活性レベルは正常ヒト血症(NHP)における内在性FVIIIの活性レベルの少なくとも0.5%であり、
切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)は、配列番号4のアミノ酸764~1242に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ポリペプチドは内在性FVIIIに結合することができ、
切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)は、内在性FVIIIに結合するためのポリペプチドの能力を提供し、
半減期延長部分は、アルブミンおよびヒト絨毛性ゴナドトロピン-βサブユニットのC末端ペプチドからなる群より選択され、
該ポリペプチドはダイマーであり、
該ダイマーのFVIIIに対する親和性は、ダイマーポリペプチドのモノマーサブユニットと同じアミノ酸配列を有するモノマーポリペプチドの該FVIIIに対する親和性より高く、
そして内在性FVIIIレベルは、該ポリペプチドの投与後に増加し、そしてここで
- (i) 該ポリペプチドは、出血事象の予防のために投与され、ここで
a) 該処置はいずれも外来性FVIIIの同時投与を含まず、もしくは
b) 該処置は、外来性FVIIIが投与され、そしてそれにより該被験体において内在性FVIIIを提供することを含み;又は
- (ii) 該ポリペプチドは、出血事象の処置のため、又は予防的処置レジメンの開始のために外来性FVIIIと一緒に同時投与され、ここで経過観察処置のために、該ポリペプチドは外来性FVIIIを同時投与することなく投与される、
上記医薬組成物。 - 内在性FVIIIレベルは、該ポリペプチドの投与後に、少なくとも1%のレベルまで増加する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)はヒト切断型フォン・ヴィルブランド因子(VWF)である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 該ポリペプチドを用いた処置の前の該被験体の内在性FVIIIの活性レベルは、NHPにおける内在性FVIIIの活性レベルの80%未満、60%未満、40%未満、30%未満、20%未満又は10%未満である、請求項1~3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 処置前の上記被験体における内在性FVIIIの活性レベルは、好ましくはNHPにおける内在性FVIIIの活性レベルの少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%又は少なくとも5%である、請求項1~4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 血液凝固障害は血友病A及びフォン・ヴィルブランド病から選択される、請求項1~5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 被験体はヒト被験体である、請求項1~6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ポリペプチドは静脈内又は血管外のいずれかに投与される、請求項1~7のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ポリペプチドは、1nM未満、好ましくは500pM未満、200pM未満、100pM未満、90pM未満又は80pM未満の解離定数KDにより特徴づけられるFVIII結合親和性を有する、請求項1~8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 切断型VWFは、(a)配列番号4のアミノ酸764~1242、(b)配列番号4のアミノ酸764~1242に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントからなる、請求項1~9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 内在性FVIIIの薬物動態パラメーターはポリペプチドの投与により改善され、特にここで内在性FVIIIの平均滞留時間(MRT)は増加し、かつ/又は内在性FVIIIの半減期は延長され、かつ/又は内在性FVIIIのクリアランスは減少する、請求項1~10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ポリペプチドの血漿半減期は、内在性VWFの血漿半減期より長く、かつ/又は正常ヒト血漿(NHP)のVWFの血漿半減期より長い、請求項1~11のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- ポリペプチドの血漿半減期は、内在性VWFの半減期より少なくとも25%長く、かつ/又は正常ヒト血漿(NHP)の半減期より少なくとも25%長い、請求項12に記載の医薬組成物。
- ポリペプチドの投与後に、被験体の内在性FVIII活性レベルの増加が達成され、好ましくは内在性FVIII活性レベルは、生理的FVIIIレベル(100%=1IU/mL)まで増加するか、又はポリペプチドの投与後に生理的FVIIIレベルより高くは実質的に増加せず、好ましくはそれぞれ正常ヒト血漿の血漿中の平均FVIII活性レベ
ルの300%=3IU/mLを超えない、より好ましくは250%=2.5IU/mLを超えない、200%=2IU/mLを超えない、150%=1.5IU/mLを超えない、もしくは120%=1.2IU/mLを超えない内在性FVIII活性レベルの増加を生じる、請求項1~13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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