ES2869339T3 - Polipéptidos del factor von Willebrand truncados para el tratamiento de la hemofilia - Google Patents

Polipéptidos del factor von Willebrand truncados para el tratamiento de la hemofilia Download PDF

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Abstract

Un polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado y un resto que extiende la vida media, para el uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que tiene un trastorno de la coagulación de la sangre y tiene el factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el plasma humano normal (NHP), en donde el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4, y donde el polipéptido es capaz de unirse al FVIII endógeno, en donde el factor von Willebrand (VWF) truncado proporciona la capacidad del polipéptido para unirse al FVIII endógeno; en donde el polipéptido es un dímero y la afinidad de dicho dímero a FVIII es mayor que la afinidad de un polipéptido monomérico a dicho FVIII, teniendo dicho polipéptido monomérico la misma secuencia de aminoácidos que una subunidad monomérica del polipéptido dimerico; en donde el polipéptido tiene una afinidad de unión a FVIII caracterizada por una constante de disociación KD de menos de 1 nM; en donde el resto que extiende la vida media es una secuencia heteróloga del aminoácido fusionada al VWF truncado o se conjuga al polipéptido; y en donde el nivel del FVIII endógeno aumenta después de la administración de dicho polipéptido y en donde - (i) dicho polipéptido se administra para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico, en donde a) dicho tratamiento o no comprende la administración conjunta del FVIII exógeno, o b) dicho tratamiento comprende que se administra un FVIII exógeno y que, por lo tanto, se proporciona el FVIII endógeno en dicho sujeto; o - (ii) dicho polipéptido se administra conjuntamente con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para tratamientos de seguimiento se administra dicho polipéptido sin la administración conjunta del FVIII exógeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos del factor von Willebrand truncados para el tratamiento de la hemofilia
Campo de la invención
La presente invención se refiere a productos y procedimientos para mejorar el tratamiento de los trastornos de coagulación de la sangre.
Antecedentes de la invención
Existen varios trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación de la sangre. Los trastornos más comunes son las hemofilias A y B, que son el resultado de deficiencias de los factores VIII (FVIII) y IX de la coagulación de la sangre, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand (EvW).
En el plasma, el FVIII existe principalmente como un complejo no covalente con factor von Willebrand (VWF), y su función coagulante es acelerar la conversión dependiente del factor IX de los factores X a Xa.
La hemofilia clásica o hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el resultado de una deficiencia ligada al cromosoma X de la coagulación de la sangre FVIII, y afecta casi exclusivamente a los seres humanos con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. El defecto del cromosoma X es transmitido por vehículos femeninos que no son hemofílicos. La manifestación clínica de la hemofilia A es una tendencia a una hemorragia creciente.
En la hemofilia A grave, los pacientes sometidos a tratamiento profiláctico, el FVIII debe administrarse por vía intravenosa (i.v.) unas 3 veces por semana debido a la corta vida media en plasma del FVIII de aproximadamente 12 a 14 horas. Cada administración es engorrosa, va asociada al dolor y conlleva el riesgo de una infección, especialmente porque la llevan a cabo principalmente en casa los propios pacientes o los padres de los niños que han sido diagnosticados de hemofilia A. Por lo tanto, sería muy deseable aumentar la vida media del FVIII para que las composiciones farmacéuticas que contienen tal FVIII tuvieran que ser administradas con menor frecuencia.
Se han hecho varios intentos de prolongar la vida media del FVIII no activado, ya sea reduciendo su interacción con receptores celulares (WO 03/093313 A2, WO 02/060951 A2), uniendo covalentemente polímeros al FVIII (WO 94/15625, WO 97/11957 y US 4970300), encapsulando FVIII (WO 99/55306), introduciendo nuevos sitios de unión de metales (WO 97/03193), asociando covalentemente el dominio A2 al dominio A3 mediante enlace peptídico (WO 97/40145 y WO 03/087355) o disulfuro (WO 02/103024A2) o mediante la unión covalente del dominio A1 al dominio A2 (WO2006/108590).
Otro enfoque para aumentar la vida media funcional del FVIII o VWF es por medio de pegilación del FVIII (WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923) o por medio de pegilación de VWF (WO 2006/071801). El aumento de la vida media de VWF pegilado también realzaría indirectamente la vida media del FVIII presente en el plasma. También se han descrito proteínas de fusión del FVIII (WO 2004/101740, WO2008/077616 y WO 2009/156137).
El VWF, que falta, presenta defectos funcionales o solo está disponible en cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (EvW), es una glucoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma de los mamíferos, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el VWF actúa como mediador entre los receptores específicos de la superficie plaquetaria y los componentes de la matriz extracelular, tales como el colágeno. Además, el VWF sirve como proteína portadora y estabilizante para el FVIII procoagulante. El VWF es sintetizado en células endoteliales y megacariocitos como una molécula precursora de aminoácidos 2813. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc del VWF de tipo silvestre se desvelan en Collins et al 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, consiste en un péptido señal N-terminal de 22 restos, seguido por un pro-péptido de 741 restos y el polipéptido de 2050 restos que se encuentra en el VWF de plasma maduro (Fischer et al., f Eb S Lett. 351: 345-348, 1994). Después de la escisión del péptido de señal en el retículo endoplasmático se forma un puente disulfuro C-terminal entre dos monómeros de VWF. Durante el transporte posterior a través de la vía secretora se agregan 12 cadenas laterales de carbohidratos N-ligados y 10 o-ligados. Más importante aún, los dímeros de VWF son multimerizados a través de puentes de disulfuro N-terminal y el propéptido de 741 aminoácidos de longitud se escinde por la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardío.
Una vez secretada en plasma, la proteasa ADAMTS13 puede escindir multímeros del VWF de peso molecular elevado dentro del dominio A1 del VWF. Por lo tanto, el plasma VWF consiste en una gama completa de multímeros que van desde dímeros únicos de 500 kDa hasta multímeros que consisten en hasta más de 20 dímeros de un peso molecular de más de 10.000 kDa. El VWF-HMWM tiene la actividad hemostática más fuerte, que puede medirse en la actividad del cofactor ristocetina (VWF:RCO). Cuanto mayor sea la relación entre el VWF y el antígeno RCO/VWF, mayor será la cantidad relativa de multímeros de peso molecular elevado.
En el plasma, el FVIII se une con alta afinidad al VWF, lo que lo protege de la eliminación prematura y, por lo tanto, desempeña además de su papel en la hemostasia primaria un papel crucial para estabilizar el FVIII, regular los niveles plasmáticos del FVIII y, como consecuencia, también es un factor central para controlar la hemostasia secundaria. La vida media del FVIII no activado ligado al VWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en plasma. En la enfermedad de von Willebrand tipo 3, donde no hay o casi no hay ningún VWF, la vida media del FVIII es de solo 2 a 6 horas, lo que provoca síntomas de hemofilia A A leve moderada en los pacientes de este tipo debido a la disminución de las concentraciones del FVIII. El efecto estabilizador del VWF sobre el FVIII también se ha usado para ayudar a la expresión recombinante del FVIII en las células CHO (Kaufman et al 1989, Mol Cell Biol 9:1233-1242). La enfermedad de von Willebrand de tipo 2N se caracteriza por niveles bajos del FVIII debido a mutaciones en el VWF que afectan a la unión del FVIII al VWF. Los niveles del FVIII en pacientes con EvW tipo 2N están en un intervalo entre aproximadamente 3 UI/dL y 30 UI/dL, normalmente por debajo de 20 UI/dL, dependiendo de la mutación específica en VWF. La enfermedad de von Willebrand tipo 1 se caracteriza por un nivel de actividad del FVIII endógeno reducido en comparación con el nivel de actividad del FVIII endógeno en el plasma humano normal (Sadler J.E. and Blinder M., Von Willebrand Disease: Diagnosis, Classification, and Treatment; in: Hemostasis and Thrombosis, eds. Colman, Marder, Clowes, George, Aird, and Goldhaber, Lippincott Williams & Wilkins 2006, pp 905-921).
Se han descrito polipéptidos derivados del VWF, en particular fragmentos del VWF, para estabilizar el FVIII in vitro e in vivo. WO 2013/106787 A1 está dirigido a proteínas quiméricas que comprenden ciertos fragmentos del VWF y una proteína FVIII. Esos heterodímeros quiméricos del FVIII y del fragmento del VWF tienen una relación molar fija del VWF a FVIII de 1:1. Los documentos WO 2014/198699 A2 y WO 2013/083858 A2 describen los fragmentos del VWF y su uso en el tratamiento de la hemofilia. Se encontró que la biodisponibilidad de los FVIII puede mejorar significativamente en la administración conjunta extravascular con cantidades molares similares de fragmentos del VWF. Se dicho un exceso molar alto del VWF sobre FVIII no era deseable, y en experimentos con fragmentos del VWF administrados conjuntamente con FVIII se encontró que la dosis del VWF no era crítica para la biodisponibilidad del FVIII. Así, las relaciones molares de los fragmentos del VWF sobre FVIII se limitaron a 50:1 como máximo y los intervalos preferidos a 1,5:1 como máximo. El documento WO 2011/060242 A2 revela polipéptidos de fusión que comprenden ciertos fragmentos del VWF y una región FC de anticuerpos que proponen relaciones molares específicas del fragmento del VWF sobre FVIII de hasta 10:1. El documento WO2013/093760 A2 describe un procedimiento para preparar una proteína, que comprende polipéptidos co-expresantes del FVIII o VWF, incluyendo formas truncadas del VWF, con una a-2,3-sialiltransferasa recombinante. Yee et al (2014) Blood 124(3):445-452 encontró que un fragmento del VWF que contiene los dominios D'D3 es suficiente para estabilizar el factor VIII en ratones con deficiencia del VWF. Sin embargo, aunque una proteína de fusión del VWF D'D 3-FC mostró una supervivencia marcadamente prolongada cuando se transfundió en ratones con deficiencia del FVIII, la proteína de fusión del VWF D'D3-FC no prolongó la supervivencia del FVIII co-transfusida.
Existe la necesidad continua de procedimientos que aumenten la vida media de los productos FVIII y FVIII con una frecuencia de administración reducida.
Sumario de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones. Los inventores han descubierto que la vida media in vivo del factor VIII endógeno puede prolongarse mediante la administración de un polipéptido VWF (polipéptido de la invención) truncado y de vida media extendido. También se ha encontrado que la vida media in vivo del factor VIII endógeno puede incluso ser prolongada mediante la administración de dicho polipéptido de la invención sin la administración conjunta necesaria del FVIII exógeno. Los pacientes tienen un nivel reducido del FVIII endógeno antes del tratamiento con dicho polipéptido en relación con el nivel del FVIII en plasma humano normal (NHP). El nivel del FVIII endógeno en dichos pacientes es de al menos el 0,5 % del nivel del FVIII endógeno en el plasma humano normal (NHP). El polipéptido de la invención es capaz de elevar los niveles endógenos FVIII. Esto permite el tratamiento profiláctico de los pacientes, sin la necesaria administración conjunta del FVIII exógeno. Si el FVIII exógeno es administrado conjuntamente, el tratamiento de seguimiento de un evento de hemorragia puede hacerse con el polipéptido de la invención solamente, es decir, sin la administración conjunta continua del FVIII exógeno. También han encontrado los inventores que los pacientes podrían beneficiarse de un tratamiento con el polipéptido de la invención mediante la administración de un FVIII exógeno y, por lo tanto, proporcionando un FVIII endógeno a dicha persona se prolonga la vida media in vivo de tal factor VIII endógeno.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona:
[1] Un polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado y un resto que extiende la vida media, para el uso en el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que tiene un trastorno de coagulación de la sangre y tiene un factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos del 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP), en donde el polipéptido es capaz de unirse a FVIII endógeno y en donde el nivel del FVIII endógeno se incrementa después de la administración de dicho polipéptido y en donde
o (i) dicho polipéptido se administra para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico, en donde
1. A) dicho tratamiento o bien no comprende la administración conjunta del FVIII exógeno, o 2. b) dicho tratamiento que comprende la administración de un FVIII exógeno y que, por lo tanto, proporciona el FVIII endógeno en dicho sujeto; o.
o (ii) dicho polipéptido es administrado conjuntamente junto con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para los tratamientos de seguimiento dicho polipéptido se administra sin administración conjunta del FVIII exógeno.
La presente invención en particular proporciona la ventaja de que un paciente puede beneficiarse de un nivel residual bajo del FVIII endógeno que puede ser estabilizado por el polipéptido de la invención. La estabilización del FVIII endógeno podría permitir niveles plasmáticos de protección más altos del FVIII. Según un cierto aspecto de la invención el polipéptido opcionalmente permite para una administración extravascular de dicho polipéptido que comprende un VWF truncado y un resto que extiende la vida media. Además, la frecuencia de la administración puede reducirse aplicando el polipéptido de la invención. La administración del polipéptido permite un aumento de los niveles de actividad del FVIII endógeno que pueden aumentarse hasta un intervalo fisiológico o prolongarse en un intervalo fisiológico. Mediante la administración del polipéptido pueden reducirse los valores patológicos de aPTT a valores fisiológicos. Dado que el FVIII exógeno no necesariamente necesita ser administrado de acuerdo con la terapia de la invención, el potencial de formación de inhibidores contra el FVIII podría ser reducido. Así, los pacientes pueden beneficiarse de un tratamiento con el polipéptido de la invención incluso sin la administración conjunta necesaria del FVIII.
[2] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [1], en donde el factor von Willebrand (VWF) truncado proporciona la capacidad de la unión del polipéptido al FVIII endógeno.
[3] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [1] o la realización [2], en donde el nivel FVIII endógeno se incrementa después de la administración de dicho polipéptido a un nivel de al menos 1 %, o preferentemente al menos 2 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, Al menos el 90 % o al menos el 100 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP).
[4] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el factor von Willebrand (VWF) truncado es un factor von Willebrand (VWF) truncado humano.
[5] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido es inferior al 80 %, menos del 60 %, menos del 40 %, menos del 30 %, Menos del 20 % o menos del 10 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
[6] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto es de al menos 1 %, al menos 2 %, al menos 3 %, al menos 4 % o al menos 5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
[7] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde dicho trastorno de coagulación de la sangre es hemofilia A o enfermedad de von Willebrand, preferentemente enfermedad de von Willebrand tipo 2N, enfermedad de von Willebrand tipo 3 o enfermedad de von Willebrand tipo 1.
[8] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde dicho trastorno de coagulación de la sangre es hemofilia A moderada, que se caracteriza normalmente por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes o sin tratamiento que se encuentra entre el 1 % y el 5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
[9] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [8], en donde se aplica la opción de tratamiento (i) a) o la opción de tratamiento (ii).
[10] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [1] a [7], en donde dicho trastorno de coagulación de la sangre es hemofilia A leve, Normalmente caracterizado por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes o sin tratamiento que sea superior al 5 % y hasta el 40 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
[11] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [10], en donde se aplica la opción de tratamiento (i) a) o la opción de tratamiento (ii).
[12] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [1] a [7], en donde dicho trastorno de coagulación de la sangre es la enfermedad de von Willebrand tipo 3, Normalmente caracterizado por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes o sin tratamiento que se encuentra generalmente en un intervalo entre aproximadamente 1 UI/dL y alrededor de 20 UI/dL nivel de actividad del FVIII correspondiente a aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP. La mayoría de los pacientes tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior a 10 UI/dL, por lo que un nivel inferior al 10 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
[13] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [1] a [7], en donde dicho trastorno de coagulación de la sangre es la enfermedad de von Willebrand tipo 2N, Normalmente caracterizado por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes o sin tratamiento que se encuentra en un intervalo entre aproximadamente 3 UI/dL y alrededor de 30 UI/dL nivel de actividad del FVIII, que corresponde a aproximadamente 3 % hasta aproximadamente 30 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP. La mayoría de los pacientes tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior a 20 UI/dL, por lo que un nivel inferior al 20 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP. Por lo tanto, los sujetos con enfermedad de von Willebrand tipo 2N tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,03 UI/ml a 0,3 UI/ml en plasma, normalmente por debajo de 0,2 UI/ml.
[14] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [1] a [7], en donde dicho trastorno de coagulación de la sangre es enfermedad de von Willebrand tipo 1 normalmente caracterizado por un nivel endógeno de actividad del FVIII antes o sin tratamiento que está reducido en comparación con el nivel endógeno de actividad del FVIII en NHP.
[15] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [12] a [14], en donde se aplican la opción de tratamiento (i) a) o la opción de tratamiento (ii).
[16] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [1] a [7], en donde se aplica la opción de tratamiento (i) b).
[17] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [16], en donde dicho trastorno de coagulación de la sangre es la hemofilia A.
[18] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [17], en donde el trastorno de coagulación es hemofilia grave A normalmente caracterizado por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes o sin tratamiento que está por debajo del 1 % de la actividad del FVIII endógeno en el NHP.
[19] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [17] o [18], en donde dicho FVIII exógeno ha sido administrado antes o después de la administración de dicho polipéptido; o en donde dicho FVIII exógeno está siendo administrado simultáneamente con dicho polipéptido.
[20] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [19], en donde dicho FVIII exógeno ha sido administrado antes de dicho polipéptido.
[21] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el sujeto está siendo tratado actualmente o ha sido tratado por medio de una terapia génica FVIII o un enfoque de transferencia génica FVIII para la provisión de actividad del FVIII endógeno, y considerando que los niveles de actividad del FVIII endógeno están preferentemente por debajo de uno de los niveles de actividad del FVIII tal como se define en la realización [5].
[22] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [21], en donde se aplica la opción de tratamiento (i) b), mientras que el FVIII "exógeno" es proporcionado por la terapia génica FVIII o el procedimiento de transferencia génica FVIII, proporcionando así el FVIII endógeno.
[23] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [16] a [20], en donde el nivel de actividad del FVIII dentro del plasma del sujeto resultante de un FVIII exógeno administrado y el nivel de actividad del FVIII dentro del plasma del sujeto formado por el sujeto endógenamente, si el sujeto forma algún FVIII, se considera que juntos presentan al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP). Con otras palabras, de acuerdo con esta realización, el FVIII endógeno al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP) puede ser una mezcla del FVIII procedente del FVIII exógeno, preferentemente previamente administrado FVIII, y el FVIII endógeno formado por el sujeto o puede ser simplemente un FVIII restante previamente administrado en caso de que el sujeto no forme ningún FVIII.
[24] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido se administra por vía intravenosa y/o extravascular. En caso de administración extravascular, se prefiere la administración subcutánea.
[25] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [16] a [23], en donde el FVIII exógeno se administra por vía intravenosa, es decir, proporcionando FVIII endógeno.
[26] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización de [25], en donde dicho polipéptido se administra a través de una vía de administración diferente a la del FVIII, preferentemente dicho polipéptido se administra subcutáneamente.
[27] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [16] a [25], en donde dicho polipéptido se administra por vía intravenosa.
[28] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el sujeto es un ser humano.
[29] el polipéptido es un dímero.
[30] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el VWF truncado comprende (a) los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NO:4 o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, al menos 95 %; Al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % a los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NO:4.
[31] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el VWF truncado comprende (a) los aminoácidos 766 a 864 de SEQ ID NO:4 o (b) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, al menos 95 %; Al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % a los aminoácidos 766 a 864 de SEQ ID NO:4.
[32] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el VWF truncado comprende los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4.
[33] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el VWF truncado consiste de (a) los aminoácidos 764 a 1242 de s Eq ID NO:4, (b) una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4.
[34] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el VWF truncado carece de los aminoácidos 1243 a 2813 de SEQ ID NO:4.
[35] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el resto que extiende la vida media es una secuencia heteróloga de aminoácidos fusionada al VWF truncado.
[36] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [35], en donde dicha secuencia de aminoácidos heterólogos comprende o consiste de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en transferrina y sus fragmentos, el péptido C-terminal de gonadotropina coriónica humana, una secuencia XTEN, repeticiones de homoaminoácidos (HAP), repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), albúmina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a regiones constantes de albúmina o inmunoglobulina, polipéptidos capaces de unirse al receptor FC neonatal (FcRn), en particular las regiones constantes de inmunoglobulina y sus porciones, preferentemente la porción FC de inmunoglobulina, y sus combinaciones. La región o las partes de la constante de inmunoglobulina es preferentemente un fragmento FC de inmunoglobulina G1, un fragmento FC de inmunoglobulina G2 o un fragmento FC de inmunoglobulina A.
[37] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el resto que extiende la vida media se conjuga con el polipéptido.
[38] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [37], en el que se selecciona dicho resto que extiende la vida media del grupo que consiste en hidroxietil almidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA), polipéptidos similares a la elastina, polímeros de heparosan, ligandos de unión al ácido hialurónico y a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos o péptidos de unión a la albúmina, y sus combinaciones.
[39] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde los parámetros farmacocinéticos del FVIII endógeno son mejorados por la administración del polipéptido, en particular, cuando se aumenta el tiempo medio de residencia (MRT) del FVIII endógeno y/o se prolonga la vida media del FVIII endógeno y/o se reduce el aclaramiento del FVIII endógeno.
[40] el uso de un polipéptido tal como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores [1] a [39] para estabilizar y/o aumentar la vida media en plasma del FVIII endógeno.
[41] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [1] a [40], siempre que se aplique la opción de tratamiento (ii) y dicho polipéptido se administre junto con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para los tratamientos de seguimiento dicho polipéptido se administra sin administración conjunta del FVIII exógeno, en donde la relación molar del polipéptido a ser administrado conjuntamente al FVIII exógeno es mayor de 50. El FVIII exógeno administrado conjuntamente puede ser derivado del plasma o de cualquier FVIII recombinante. El FVIII exógeno recombinante puede ser, por ejemplo, un factor VIlI de una sola cadena, preferentemente consistente en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No :5.
[42] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [1] a [41], en caso de que se aplique la opción de tratamiento (i) b) o la opción de tratamiento (ii), en donde la relación molar entre el polipéptido y la FVIII exógeno es de al menos 50.
[43] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [42], en donde la relación molar del polipéptido con el FVIII exógeno es de al menos 75.
[44] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [42], en donde la relación molar entre el polipéptido y el FVIII exógeno es de al menos 100.
[45] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [42], en donde la relación molar entre el polipéptido y el FVIII exógeno es de al menos 200.
[46] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [42], en donde la relación molar entre el polipéptido y el FVIII exógeno es de al menos 300.
[47] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [42], en donde la relación molar entre el polipéptido y el FVIII exógeno es de al menos 400 o al menos 500.
[48] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido es una glicoproteína que comprende N-glicanos, y en donde al menos el 75 % de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico.
[49] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [48], en donde al menos el 85 % de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico.
[50] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [49] en donde al menos el 95 % de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico.
[51] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido es un dímero, preferentemente un homodímero que comprende dos polipéptidos (monómeros) tal como se define en una de las realizaciones aquí reveladas, Y los dos monómeros que forman el dímero están covalentemente vinculados entre sí a través de uno o más puentes disulfuro formados por restos de cisteína dentro del VWF truncado.
[52] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [51], en donde los restos cisteína que forman uno o más puentes disulfuro es/son seleccionados del grupo que consiste en Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, Cys-1227 y combinaciones de los mismos, preferentemente Cys-1099 y Cys-1142, en donde la numeración de aminoácidos se refiere a SEQ ID NO 4.
[53] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [51] a [52], en donde la afinidad de dicho polipéptido dimerico a FVIII (ya sea exógeno o FVIII endógeno) es mayor que la afinidad de un polipéptido monomérico a dicho FVIII, dicho polipéptido monomérico que tiene la misma secuencia de aminoácidos que una subunidad monomérica del polipéptido dimerico.
[54] el polipéptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [51] a [53], en donde la relación dímero: monómero del polipéptido de la invención es al menos 1,5, preferentemente al menos 2, más preferentemente al menos 2,5 o al menos 3. La mayoría, preferentemente la totalidad de los polipéptidos de la invención están presentes como dímeros.
[55] el polipéptido tiene una afinidad de unión a FVIII caracterizada por una constante de disociación Kd inferior a 1 Nm, preferentemente inferior a 500 pM, inferior a 200 pM, inferiora 100 pM, inferior a 90 pM o inferior a 80 pM.
[56] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [55], en donde la constante de disociación Kd oscila entre 0,1 pM y 500 pM, de 0,5 pM a 200 pM, de 0,75 pM a 100 pM o más preferentemente de 1 pM a 80 pM.
[57] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [51] a [56], en donde el polipéptido dimerico tiene una afinidad de unión a FVIII caracterizada por una constante de disociación KDy dicha constante de disociación Kd del polipéptido dimerico está reducido en comparación con la constante de disociación Kd de un polipéptido monomérico, preferentemente por un factor de al menos 10, por un factor de al menos 100, por un factor de al menos 500 o por un factor de al menos 1000.
[58] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde los parámetros farmacocinéticos del FVIII endógeno son mejorados por la administración del polipéptido, preferentemente cuando se aumente el tiempo medio de residencia (MRT) del FVIII endógeno y/o se prolongue la vida media del FVIII endógeno y/o se reduzca el aclaramiento del FVIII endógeno, particularmente cuando se compara con los parámetros farmacocinéticos del FVIII correspondientes en el plasma humano normal (NHP) o cuando se compara con los parámetros farmacocinéticos del FVIII correspondientes en un sujeto que no recibe el polipéptido.
[59] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [58], en donde dicho aumento en el MRT y/o la vida media terminal del FVIII endógeno es al menos del 50 %.
[60] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [59], en donde dicho aumento en el MRT y/o la vida media terminal del FVIII endógeno es al menos del 100 %.
[61] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [58], en donde la eliminación del FVIII endógeno se reduce por la administración del polipéptido y dicha disminución es de al menos el 25 %.
[62] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [61], donde dicha disminución es por lo menos del 50 %.
[63] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [62], donde dicha disminución es por lo menos del 100 %.
[64] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la vida media en plasma de dicho polipéptido se incrementa cuando se compara con la vida media en plasma del VWF endógeno y/o cuando se compara con la vida media en plasma del VWF del plasma humano normal (NHP).
[65] el polipéptido para su uso según la realización [64], en donde la vida media en plasma de dicho polipéptido es al menos un 25 % más alta, en particular, al menos un 50 % más alta, Al menos un 75 % más alta o al menos un 100 % más alta que la vida media del VWF endógeno y/o la vida media del VWF del plasma humano normal (VWF).
[66] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el MRT del polipéptido se incrementa, en particular, al menos un 25 % más alto, al menos un 50 % más alto, Al menos un 75 % más alto o al menos un 100 % más alto cuando se compara con el MRT del VWF endógeno y/o cuando se compara con el MRT del VWF de plasma humano normal (NHP).
[67] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la vida media del polipéptido de MRT y/o del plasma aumenta cuando se compara con la de un polipéptido de referencia que es idéntico a dicho polipéptido excepto en que el polipéptido de referencia carece del resto que extiende la vida media.
[68] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido aumenta la concentración máxima (Cmax) del factor VIII endógeno en comparación con los sujetos no tratados.
[69] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [68], en donde después de la administración de dicho polipéptido, el Cmáx para FVIII asciende a al menos 10 mUI/ml, al menos 25 mUI/ml, al menos 50 mUI/ml, al menos 100 mUI/ml, al menos 200 mUI/ml, al menos 300 mUI/ml o al menos 400 mUI/ml.
[70] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido aumenta el área de pico debajo de la curva de tiempo-concentración en plasma de cero al último punto temporal medido (AUC) del factor VIII endógeno en comparación con los sujetos no tratados.
[71] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [70], en donde después de la administración del polipéptido, el AUC para el FVIII endógeno se aumenta a un nivel de al menos 1000 mUI*h/ml, de al menos 2000 mUI*h/ml, de al menos 3000 mUI*h/ml, de al menos 5000 mUI*h/ml, de al menos 10000 mIU*h/ml o de al menos 20000 mIU*h/ml de actividad cromogénica FVIII.
[72] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde al menos un aminoácido del polipéptido es sustituido en comparación con la secuencia de aminoácidos del VWF de tipo salvaje, en donde la afinidad de unión de tal polipéptido modificado a FVIII está siendo aumentada aún más por la introducción de dicho al menos una sustitución en comparación con la afinidad de unión de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos excepto para dichas modificaciones.
[73] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [72], en donde dicha al menos una sustitución dentro del VWF truncado tiene la capacidad de aumentar aún más la vida media del FVIII endógeno después de la administración del polipéptido y/o puede permitir la reducción de la dosis a ser administrada del polipéptido recombinante.
[74] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones [72] a [73], en donde las sustituciones se seleccionan del grupo de combinaciones que consisten en S764G/S766y , s 764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R, S764P/S766L, y S764E/S766Y/V1083A, refiriéndose a la secuencia de SEQ ID NO:4 con respecto a la numeración de aminoácidos.
[75] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [74], en donde dicha sustitución son las combinaciones S764E/S766Y o S764E/S766Y/V1083A.
[76] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde dicho polipéptido se administra de forma extravascular, en particular subcutáneamente, y tras la administración, el polipéptido presenta una biodisponibilidad de al menos el 20 %, preferentemente de al menos el 30 %, de al menos el 40 %, de al menos el 50 %, de al menos el 60 %, de al menos el 70 % o de al menos el 80 %.
[77] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde después de la administración del polipéptido se logra un aumento del nivel endógeno de actividad del FVIII del sujeto, preferentemente el nivel endógeno de actividad del FVIII se incrementa hasta el nivel fisiológico FVIII (100 % = 1 UI/ml) o no se ha aumentado sustancialmente por encima del nivel fisiológico del FVIII tras la administración del polipéptido, lo que da como resultado preferentemente un aumento del nivel endógeno de actividad del FVIII que no supera el 300 % = 3 UI/ml, preferentemente que no supera el 250 % = 2,5 UI/ml, no supera el 200 % = 2 UI/ml, inferior o igual al 150 % = 1,5 UI/ml o inferior o igual al 120 % = 1,2 UI/ml del nivel medio de actividad del FVIII en plasma de plasma humano normal, respectivamente.
[78] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde después de la administración del polipéptido se impide que el sujeto que sufre de un trastorno de coagulación de la sangre experimente un aumento del riesgo trombogénico.
[79] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [78], en donde la prevención de un riesgo trombogénico se determina o se logra mediante un aumento limitado del nivel de actividad del FVIII endógeno en el sujeto tras la administración del polipéptido, Preferentemente, el nivel de actividad del FVIII endógeno se incrementa hasta el nivel fisiológico FVIII (100 % = 1 UI/ml) o no aumenta sustancialmente por encima del nivel fisiológico FVIII tras la administración del polipéptido, lo que da como , preferentemente, un aumento del nivel de actividad del FVIII endógeno que no supere el 300 % = 3 UI/ml, Más preferentemente no superior al 250 % = 2,5 UI/ml, inferior o igual al 200 % = 2 UI/ml, inferior o igual al 150 % = 1,5 UI/ml o inferior al 120 % = 1,2 UI/ml del nivel medio de actividad del FVIII en plasma de plasma humano normal, respectivamente.
[80] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde después de la administración de dicho polipéptido la concentración máxima (Cmax) para el polipéptido es de al menos 20 nmol/kg, al menos 40 nmol/kg, al menos 60 nmol/kg, al menos 80 nmol/kg o al menos 160 nmol/kg.
[81] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde después de la administración de dicho polipéptido el área debajo de la curva de concentración en el tiempo de t=0 a t=~ (AUCü-inf) para el polipéptido administrado es de al menos 2 nmol * h/ml, al menos 3 nmol * 420/ml, al menos 40 * nmol/ml, o al menos * 80 nmol/ml.
[82] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde después de la administración de dicho polipéptido el valor de aclaramiento (CL) para el polipéptido se reduce en un factor de al menos 2, al menos 5, o por lo menos 10, en comparación con un tratamiento de referencia, en donde dicho tratamiento de referencia es idéntico a dicho tratamiento, excepto en que el polipéptido que debe ser administrado no comprende un resto que extiende la vida media.
[83] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido se administra en una cantidad de al menos 0,01 mg/kg, al menos 0,1 mg/kg, al menos 0,2 mg/kg, al menos 0,5 mg/kg, al menos 1 mg/kg o al menos 3 mg/kg polipéptido.
[84] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en las que el polipéptido recombinante se administra en una cantidad no superior a 20 mg/kg, no superior a 15 mg/kg, no superior a 10 mg/kg, o inferior o igual a 5 mg/kg del polipéptido.
[85] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde después de la administración del polipéptido fisiológicamente activado se alcanzan los valores de tiempo parcial de trombina (aPTT), en particular, los valores patológicos de aPTT se reducen a los valores fisiológicos.
[86] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [85], en donde después de la administración del polipéptido el tiempo de trombina parcial activada (aPTT) se reduce por un factor de al menos 1,5, al menos 2, al menos 2,5, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 10.
[87] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el polipéptido se administra de manera repetida, preferentemente con una dosis de una vez al mes, una vez cada tres semanas, una vez cada dos semanas, una vez cada siete días, dos veces por semana o una vez cada dos días.
[88] el polipéptido para su uso de acuerdo con la realización [87], en donde después de dicha repetición, es decir múltiple, de la administración del polipéptido, se alcanza un nivel de estado estable de actividad del FVIII endógeno en el sujeto, en donde el estado estable FVIII nivel de actividad preferentemente proporciona un nivel de depresión de más de 1 %, preferentemente un nivel de canaleta superior al 5 %, preferentemente un nivel de canaleta superior al 10 %, más preferentemente un nivel de canaleta superior al 20 %, Más preferentemente un nivel de depresión de más del 50 % e incluso más preferentemente el nivel de actividad del FVIII en estado estable está esencialmente dentro de un intervalo del nivel de actividad del FVIII fisiológica.
[89] el polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de la realización [87] a [88], en donde después de dicha repetición, es decir múltiple, de la administración se logra una reducción sostenida del tiempo de trombina parcial activada (aPTT) en el sujeto, en donde el aPTT preferentemente está esencialmente dentro de un intervalo fisiológico para aPTT.
[90] un procedimiento para tratar un trastorno de coagulación de la sangre, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un polipéptido tal como se define en cualquiera de las realizaciones [1] a [89] sin administrar conjuntamente FVIII, a dicho paciente que tiene el factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho paciente antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho paciente sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad de la endógena FVIII en plasma humano normal (NHP) y por el cual el nivel endógeno del FVIII se incrementa después de la administración de dicho polipéptido. Dicho polipéptido se administra preferentemente para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico, en donde dicho tratamiento no comprende la administración conjunta del FVIII exógeno o dicho polipéptido se administra conjuntamente con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para los tratamientos de seguimiento dicho polipéptido se administra sin administración conjunta del FVIII exógeno.
[91] un procedimiento para tratar un trastorno de coagulación de la sangre, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un polipéptido tal como se define en cualquiera de las realizaciones [1] a [89], a dicho paciente que tiene factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho paciente antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho paciente sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP) y por el cual el nivel endógeno del FVIII se incrementa después de la administración de dicho polipéptido. Dicho tratamiento comprende que se administra un FVIII exógeno y, por lo tanto, se prevé el FVIII endógeno en dicho sujeto. Dicho polipéptido se administra preferentemente para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico. Según una realización preferida, el polipéptido se administra por vía subcutánea y el FVIII se administra por vía intravenosa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la exposición a la 3a-FP, la actividad del FVIII y el aPTT en ratas CD después de la administración de la 3a-FP, tal como se describe en el ejemplo 1,1.
La figura 1A muestra la rD'D3-FP cuantificada a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2-3 ratas por punto temporal;
La figura 1B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en UI/ml, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 ratas por punto temporal (excepto los datos de predosis: n=7). Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis. Las líneas punteadas marcadas como ULN presentan el límite superior de normal;
La figura 1C muestra el FVIII cuantificado como actividad de coagulación FVIII en % de la norma, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 ratas por punto temporal (excepto para los datos de predosis: n=7). Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis. Las líneas punteadas marcadas como ULN presentan el límite superior de normal;
La figura 1D muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica o de coagulación FVIII tal como se ha indicado anteriormente. El AUC se calculó como área pico debajo de la curva de tiempo-concentración en plasma desde el tiempo cero hasta el día 14;
La figura 1E muestra el tiempo de trombina parcial activada mediante Pathromtin® SL, y los datos se dan como media ± d.e para n=1-3 ratas por punto temporal (excepto los datos de predosis: n=7). Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis;
La figura 2 muestra la exposición a los 3-FP de la rd'D, la actividad del FVIII y la ATTP en conejos después de la administración de los 3-FP de la rd'D, tal como se describe en el ejemplo 1,2.
La figura 2A muestra la rD'D3-FP cuantificada a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 conejos por punto temporal;
La figura 2B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en IU/ml, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 conejos por punto temporal. Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis;
La figura 2C muestra el FVIII cuantificado como actividad de coagulación FVIII en % de la norma, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 conejos por punto temporal. Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis;
La figura 2D se muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica o de coagulación FVIII tal como se ha indicado anteriormente. El AUC se calculó como área de pico debajo de la curva de tiempoconcentración en plasma desde el tiempo cero hasta el día 10;
La figura 2E muestra el tiempo de trombina parcial activada usando ACTIN® FSL, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 conejos por punto temporal. Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis;
La figura 3 muestra la exposición a la rD'D3-FP y la actividad del FVIII en monos después de la administración de la rD'D3-FP, tal como se describe en el ejemplo 1,3.
La figura 3A muestra la rD'D3-FP cuantificada frente a un estándar cuantificado a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=3 monos por punto temporal;
La figura 3B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en % de la norma, y los datos se dan como media ± d.e. para n=3 monos por punto temporal. Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis, la línea punteada representa la media de los datos de predosis (datos de predosis: n=22).
La figura 4 muestra la exposición a la 3a-FP, la actividad del FVIII y el aPTT en ratas con VWF desactivado tras la administración de la 3a-FP, tal como se describe en el ejemplo 1,4.
La figura 4A muestra la rD'D3-FP cuantificada a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-4 ratas por punto temporal;
La figura 4B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en UI/ml, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-4 ratas por punto temporal (excepto para los datos de predosis: n < 8). Los datos de predosis en ratas con WF desactivados están por debajo del límite de cuantificación. El área sombreada representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratas CD sanas; las líneas punteadas marcadas como ULN presentan el límite superior de lo normal;
La figura 4C muestra el FVIII cuantificado como actividad de coagulación FVIII en % de la norma, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-4 ratas por punto temporal (excepto para los datos de predosis: n < 8). El área sombreada representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratas CD sanas; las líneas punteadas marcadas como ULN presentan el límite superior de lo normal;
La figura 4D se muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica o de coagulación FVIII tal como se ha indicado anteriormente. El AUC se calculó como área de pico debajo de la curva de tiempoconcentración en plasma desde el tiempo cero hasta el día 10;
La figura 4E muestra el tiempo de trombina parcial activada mediante Pathromtin® SL, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 ratas por punto temporal (excepto los datos de predosis: n < 7). Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de los datos de predosis de las ratas Con VWF desactivado. El área sombreada representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratas CD sanas;
La figura 5 muestra la exposición a la rD'D3-FP y la actividad del FVIII en ratones con el VWF desactivadodespués de la administración de la rD'D3-Fp, tal como se describe en el ejemplo 1,5.
La figura 5A muestra la rD'D3-FP cuantificada a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=3 ratones por punto temporal;
La figura 5B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en mUI/ml, y los datos se dan como media ± d.e. para n=3 ratones por punto temporal. Los datos del vehículo en ratones con VWF desactivado están por debajo del límite de cuantificación (LLOQ). El área sombreada representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratones NMRI sanos;
La figura 5C muestra el FVIII cuantificado como actividad de coagulación FVIII en % de la norma, y los datos se dan como media ± d.e. para n=3-4 ratones por punto temporal. Los datos del vehículo en ratones con VWF desactivado están por debajo del límite de detección;
La figura 5D muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica o de coagulación FVIII tal como se ha indicado anteriormente. El AUC se calculó como área de pico debajo de la curva de tiempo-concentración en plasma desde el tiempo cero hasta el día 7;
La figura 6 muestra la exposición a la variante rD'D3 y la actividad del FVIII en ratas con el VWF desactivado después de la administración de las variantes rD'D3, tal como se describe en el ejemplo 1,6.
La figura 6A muestra la rD'D3-FP WT, rD'D3-FP EY, rD'D3-FP EYA o rD'D3-CTP cuantificados en ratas con el VWF desactivado a través de su componente de albúmina (rD'D3-FP) o a través del componente D'D3 (rD'D3-CTP), y los datos se dan como media ± d.e. SD para n=3-4 ratas por punto temporal. Las líneas punteadas presentan el límite de detección para la albúmina y la rD'D3-CTP, respectivamente;
La figura 6B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en mUI/ml en ratas con el VWF desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-4 ratas por punto temporal;
La figura 6C muestra el FVIII cuantificado como actividad de coagulación FVIII en % de la norma en ratas con el VWF desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-4 ratas por punto temporal;
La figura 6D muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica o de coagulación FVIII tal como se ha indicado anteriormente. El AUC se calculó como área de pico debajo de la curva de tiempo-concentración en plasma desde el tiempo cero hasta el día 10;
La figura 7 muestra la exposición a la rD'D3-FP en ratones con el FVIII desactivado, ratones con el VWF desactivado y ratones NMRI, y ratas con el VWF desactivado o ratas CD o cerdos después de la administración de la rD'D3-FP, tal como se describe en el ejemplo 1,7.
La figura 7A-1 muestra la rD'D3-FP cuantificada en ratones con el FVIII desactivado, con el VWF desactivado y NMRI a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 ratones por punto temporal;
La figura 7A-2 muestra la rD'D3-FP cuantificada en ratas con el VWF desactivado y ratas CD a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2-4 ratas por punto temporal. La línea punteada representa el límite de detección para la rD'D3-FP;
La figura 7A-3 muestra la rD'D3-FP cuantificada en cerdos a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=1-3 cerdos por punto temporal. La línea discontinua representa el límite de detección para rD'D3-FP;
La figura 7B-1 muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en ratas con el VWF desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2-4 ratas por punto temporal. Las líneas punteadas presentan el mínimo y el máximo de datos de ratas con CD sanas sin tratar;
La figura 7B-2 muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en cerdos, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2-3 cerdos por punto temporal. Las líneas punteadas presentan el intervalo que proviene de los valores de predosis de los cerdos;
La figura 8 muestra la exposición a la 3a-FP y la actividad cromogénica del FVIII en ratones con el FVIII desactivado, ratones con el VWF desactivado y ratones NMRI y ratas con el VWF desactivado o ratas CD o cerdos después de la administración de la rD'D3-FP de IV o s.c., tal como se describe en el ejemplo 1,8. La figura 8A muestra la rD'D3-FP cuantificada en ratas con el VWF desactivado a través de su componente de albúmina, y los datos se dan como media ± d.e. para n=3 ratas por punto temporal. La línea discontinua representa el límite de detección para rD'D3-FP;
La figura 8B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII en ratas con el VWF desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2-3 ratas por punto temporal. El tono gris con líneas punteadas representa el mínimo y el máximo de datos de ratas CD sanas no tratadas;
La figura 8C muestra el FVIII cuantificado como actividad de coagulación FVIII en ratas con el VWF desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2 ratas por punto temporal. La sombra gris representa el intervalo mínimo a máximo de datos de ratas CD sanas no tratadas;
La figura 8D muestra el tiempo de trombina parcial activada usando Pathromtin® SL en ratas con el VWF desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2 ratas por punto temporal. La sombra gris representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de las ratas con el VWF desactivado. El área sombreada representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratas CD sanas;
La figura 9 muestra la exposición a los 3-FP y a los FVIII en ratas con FVIII desactivado después de la administración y/o combinada con la administración s.c. de los 3-FP, tal como se describe en el ejemplo 1,9.
La figura 9A muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII desactivado en ratas con el FVIII desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=3 ratones con el FVIII desactivado por punto temporal. El límite de detección representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratas CD saludable;
La figura 9B muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII desactivado en ratas con el FVIII desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2-3 ratones con el FVIII desactivado por punto temporal. El límite de detección representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratas CD saludable;
La figura 9C muestra el FVIII cuantificado como actividad cromogénica del FVIII desactivado en ratas con el FVIII desactivado, y los datos se dan como media ± d.e. para n=2-3 ratones con el FVIII desactivado por punto temporal. El límite de detección representa el mínimo y el máximo de los datos de predosis de ratas CD saludable;
Descripción detallada
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende (i) un factor von Willebrand (VWF) truncado y (ii) un resto que extiende la vida media, para el uso en el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que sufre de un trastorno en la coagulación de la sangre y que tiene factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP), siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP), y por lo cual el nivel endógeno del FVIII se incrementa después de la administración de dicho polipéptido y dicho polipéptido se administra para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico, en donde dicho tratamiento no comprende la administración conjunta del FVIII exógeno.
En un segundo aspecto, la presente invención pertenece a un polipéptido que comprende (i) un factor von Willebrand (VWF) truncado y (ii) un resto que extiende la vida media, para el uso en el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que sufre de un trastorno de la coagulación de la sangre y que tiene factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP), siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP) y por lo cual el nivel endógeno del FVIII se incrementa después de la administración de dicho polipéptido y en donde dicho polipéptido es administrado conjuntamente junto con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para los tratamientos de seguimiento dicho polipéptido se administra sin administración conjunta del FVIII exógeno.
Un tercer aspecto se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende (i) un factor von Willebrand (VWF) truncado y (ii) un resto que extiende la vida media, para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que sufre de un trastorno de la coagulación de la sangre y que tiene factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP), y por lo cual el nivel endógeno del FVIII se incrementa después de la administración de dicho polipéptido y dicho polipéptido se administra para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico, en donde dicho tratamiento no comprende la administración conjunta del FVIII exógeno.
Un cuarto aspecto se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que comprende (i) un factor von Willebrand (VWF) truncado y (ii) un resto que extiende la vida media, para su uso en el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que sufre de un trastorno de la coagulación de la sangre y que tiene factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP) y por lo cual el nivel endógeno del FVIII se incrementa después de la administración de dicho polipéptido y en donde dicho polipéptido es administrado conjuntamente junto con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para los tratamientos de seguimiento dicho polipéptido se administra sin administración conjunta del FVIII exógeno.
Un quinto aspecto se refiere al uso de un polipéptido recombinante que comprende (i) un factor von Willebrand (VWF) truncado y (ii) un resto que extiende la vida media para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que sufre de un trastorno de la coagulación de la sangre y que tiene factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP), y por lo que el nivel FVIII endógeno se incrementa después de la administración de dicho polipéptido y en donde
• dicho polipéptido o bien se administra para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico, en donde dicho tratamiento no comprende la administración conjunta del FVIII exógeno, o
• dicho polipéptido es administrado conjuntamente junto con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para los tratamientos de seguimiento dicho polipéptido se administra sin administración conjunta del FVIII exógeno.
El polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado y un resto que extiende la vida media se referirá aquí como "polipéptido de la invención".
El VWF truncado
El término "factor von Willebrand" (VWF), tal como se usa en el presente documento, incluye el VWF natural (nativo), pero también las variantes de los mismos que conservan al menos la actividad de unión a FVIII del VWF natural, por ejemplo, variantes de secuencia en las que se han insertado, suprimido o sustituido uno o más restos. La actividad de unión del FVIII se determina mediante un ensayo de unión del FVIII-VWF, tal como se describe en el ejemplo 2.
El VWF de acuerdo con esta invención es un VWF humano representado por la secuencia de aminoácido mostrado en SEQ ID NO:4, y es un VWF truncado. La codificación de ADNc SEQ ID NO:4 se muestra en SEQ ID NO:3.
El gen que codifica el VWF nativo humano se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un pre-propolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El pre-propolipéptido contiene un péptido señal N-terminal de 22 aminoácidos, seguido de un pro-polipéptido de 741 aminoácidos (aminoácidos 23-763 de SEQ ID NO:4) y la subunidad madura (aminoácidos 764-2813 de SEQ ID NO:4). La escisión del propolipéptido de 741 aminoácidos desde el extremo N da como resultado un VWF maduro que consiste en 2050 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del pre-propolipéptido de VWF nativo humano se muestra en SEQ ID NO:4. A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los restos de VWF en esta solicitud se refiere al SEQ ID NO:4, incluso si la molécula de VWF no comprende todos los restos de SEQ ID NO:4.
El propolipéptido del VWF nativo comprende múltiples dominios. Se pueden encontrar diferentes anotaciones de dominio en la literatura (ver, por ejemplo, Zhou et al (2012) Blood 120(2): 449-458). En la presente solicitud se aplica la siguiente anotación de dominio del pre-propolipéptido nativo de VWF:
D1 -D2-D'-D3-A1 -A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK
Con referencia a SEQ ID NO:4, el dominio D' consiste en los aminoácidos 764-865; y el dominio D3 consiste en los aminoácidos 866-1242.
La característica "truncado" significa que el polipéptido no comprende la secuencia completa de aminoácidos del VWF maduro (aminoácidos 764-2813 del SEQ ID NO:4). Normalmente, el VWF truncado no comprende todos los aminoácidos 764-2813 de SEQ ID NO:4 sino solamente un fragmento de los mismos. Un VWF truncado también puede ser designado com fragmento de VWF, o en plural como fragmentos de VWF.
El VWF truncado es capaz de unirse a un factor VIII. Preferentemente, el VWF truncado es capaz de unirse a la forma madura del factor VIII humano nativo. El VWF truncado es capaz de unirse a los factores VIII endógeno y/o exógeno En ciertas realizaciones, el VWF truncado es capaz de unirse a un FVIII recombinante administrado conjuntamente, preferentemente a un FVIII tal como se describe aquí, más preferentemente a un factor VIII de una sola cadena que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:5. La unión del VWF truncado al factor VIII puede determinarse mediante un ensayo de unión a FVIII-VWF tal como se describe en el ejemplo 2.
El VWF truncado de la presente invención comprende preferentemente o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90 % con los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NO:4 y es capaz de unirse a FVIII. En las realizaciones preferentes, el VWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, con los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NO:4 y es capaz de unirse a FVIII. De manera preferente, el VWF truncado comprende o consiste en los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NO:4. Salvo indicación en contrario, las identidades de secuencia se determinan a lo largo de toda la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, los aminoácidos 776 a 805 de SEQ ID NO:4).
El VWF truncado de la presente invención comprende preferentemente o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de por lo menos el 90 % con los aminoácidos 766 a 864 de SEQ ID NO:4 y es capaz de unirse a FVIII. En las realizaciones preferentes, el VWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %, con los aminoácidos 766 a 864 de SEQ ID NO:4 y es capaz de unirse a FVIII. De manera preferente el VWF truncado comprende o consiste en los aminoácidos 766 a 864 de SEQ ID NO:4.
En otra realización preferida, el VWF truncado consiste en (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4, que el VWF truncado todavía es capaz de unir a FVIII. Más preferentemente, el VWF truncado consiste en (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos eñ 99 %, con los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4, o b) un fragmento de éste, siempre que el VWF truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Lo más preferible es que el VWF truncado esté formado por (a) los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID siempre que el VWF truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Como se describe más detalladamente a continuación, el polipéptido puede prepararse mediante un procedimiento que usa células que comprenden un ácido nucleico que codifica el polipéptido que comprende el VWF truncado. El ácido nucleico se introduce en las células huésped adecuadas mediante técnicas que se conocen per se.
En una realización preferida, el ácido nucleico en la célula huésped codifica (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 1 a 1242 de SEQ ID NO:4, o b) un fragmento de éste, siempre que el VWF maduro truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Más preferentemente, el ácido nucleico codifica (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, con los aminoácidos 1 a 1242 de SEQ ID NO:4, o b) un fragmento de éste, siempre que el VWF truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Lo más preferible es que el ácido nucleico codifique (a) los aminoácidos 1 a 1242 de SEQ ID NO:4, o (b) un fragmento del mismo, siempre que el VWF truncado sea todavía capaz de unirse a FVIII. Especialmente si el polipéptido de acuerdo con esta invención es un dímero, el ácido nucleico comprenderá una secuencia que codifica los aminoácidos 1 a 763 de VWF (por ejemplo SEQ ID NO:4), incluso si el VWF truncado en el polipéptido no comprende los aminoácidos 1 a 763 del VWF (por ejemplo SEQ ID NO:4).
En otras realizaciones, el VWF truncado comprende o consiste en una de las siguientes secuencias de aminoácidos, cada una de las cuales se refiere a SEQ ID NO:4:
776-805; 766-805; 764-805; 776-810; 766-810; 764-810; 776-815; 766-815; 764-815; 776-820; 766-820; 764-820; 776­ 825 ; 766-825 ; 764-825 ; 776-830 ; 766-830 ; 764-830 ; 776-835 ; 766-835 ; 764-835 ; 776-840 ; 766-840 ; 764-840; 776­ 845 ; 766-845 ; 764-845 ; 776-850 ; 766-850 ; 764-850 ; 776-855 ; 766-855 ; 764-855 ; 776-860 ; 766-860 ; 764-860; 776­ 864 ; 766-864 ; 764-864 ; 776-865 ; 766-865 ; 764-865 ; 776-870 ; 766-870 ; 764-870 ; 776-875 ; 766-875 ; 764-875; 776­ 880 ; 766-880 ; 764-880 ; 776-885 ; 766-885 ; 764-885 ; 776-890 ; 766-890 ; 764-890 ; 776-895 ; 766-895 ; 764-895; 776­ 900 ; 766-900 ; 764-900 ; 776-905 ; 766-905 ; 764-905 776-910 766-910 764-910 776-915 766-915 764-915 776­ 920 ; 766-920 ; 764-920 ; 776-925 ; 766-925 ; 764-925 ; 776-930 ; 766-930 ; 764-930 ; 776-935 ; 766-935 ; 764-935; 776­ 940 ; 766-940 ; 764-940 ; 776-945 ; 766-945 ; 764-945 ; 776-950 ; 766-950 ; 764-950 ; 776-955 ; 766-955 ; 764-955; 776­ 960 ; 766-960 ; 764-960 ; 776-965 ; 766-965 ; 764-965 ; 776-970 ; 766-970 ; 764-970 ; 776-975 ; 766-975 ; 764-975; 776­ 980 ; 766-980 ; 764-980 ; 776-985 ; 766-985 ; 764-985 ; 776-990 ; 766-990 ; 764-990 ; 776-995 ; 766-995 ; 764-995; 776­ 1000; 766-1000; 764-1000; 776-1005; 766-1005; 764-1005; 776-1010; 766-1010; 764-1010; 776-1015; 766-1015; 764­ 1015; 776-1020; 766-1020; 764-1020; 776-1025; 766-1025; 764-1025; 776-1030; 766-1030; 764-1030; 776-1035; 766­ 1035; 764-1035; 776-1040; 766-1040; 764-1040; 776-1045; 766-1045; 764-1045; 776-1050; 766-1050; 764-1050; 776­ 1055; 766-1055; 764-1055; 776-1060; 766-1060; 764-1060; 776-1065; 766-1065; 764-1065; 776-1070; 766-1070; 764­ 1070; 776-1075; 766-1075; 764-1075; 776-1080; 766-1080; 764-1080; 776-1085; 766-1085; 764-1085; 776-1090; 766­ 1090; 764-1090; 776-1095; 766-1095; 764-1095; 776-1100; 766-1100; 764-1100; 776-1105; 766-1105; 764-1105; 776­ 1110; 766-1110; 764-1110; 776-1115; 766-1115; 764-1115; 776-1120; 766-1120; 764-1120; 776-1125; 766-1125; 764 1125; 776-1130; 766-1130; 764-1130; 776-1135; 766-1135; 764-1135; 776-1140; 766-1140; 764-1140; 776-1145; 766­ 1145; 764-1145; 776-1150; 766-1150; 764-1150; 776-1155; 766-1155; 764-1155; 776-1160; 766-1160; 764-1160; 776­ 1165; 766-1165; 764-1165; 776-1170; 766-1170; 764-1170; 776-1175; 766-1175; 764-1175; 776-1180; 766-1180; 764­ 1180; 776-1185; 766-1185; 764-1185; 776-1190; 766-1190; 764-1190; 776-1195; 766-1195; 764-1195; 776-1200; 766­ 1200; 764-1200; 776-1205; 766-1205; 764-1205; 776-1210; 766-1210; 764-1210; 776-1215; 766-1215; 764-1215; 776­ 1220; 766-1220; 764-1220; 776-1225; 766-1225; 764-1225; 776-1230; 766-1230; 764-1230; 776-1235; 766-1235; 764­ 1235; 776-1240; 766-1240; 764-1240; 776-1242; 766-1242; 764-1242; 764-1464; 764-1250; 764-1041; 764-828; 764­
865; 764-1045; 764-1035; 764-1128; 764-1198; 764-1268; 764-1261; 764-1264; 764-1459; 764-1463; 764-1464; 764­
1683; 764-1873; 764-1482; 764-1479; 764-1672; y 764-1874.
En ciertas realizaciones, el VWF truncado tiene una deleción interna relativa al VWF maduro de tipo salvaje. Por
ejemplo, los dominios A1, A2, A3, D4, C1, C2, C3, C4, C5, C6, CK o combinaciones de los mismos pueden ser
suprimidos, y se conservan el dominio D' y/o el dominio D3. En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende
los sitios de unión para la glucoproteína plaquetaria Iba (GPIba), colágeno y/o integrina aIIbpIII (secuencia RGDS
dentro del dominio C1). En otras realizaciones, el VWF truncado no comprende el sitio de la escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13 que se encuentra en el dominio central A2 del v W f . En otra realización, el VWF truncado
no comprende los sitios de unión para GPIba, y/o no comprende el sitio de unión para colágeno, y/o no comprende el
sitio de unión para integrina aIIbpIII, y/o no comprende el sitio de escisión (Tyr1605-Met1606) para ADAMTS13, que
se encuentra en el dominio central a 2 de VWF.
En otras realizaciones, el VWF truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una
identidad de secuencia de al menos 90 %, o al menos 91 %, o al menos 92 %, o al menos 93 %, o al menos 94 %, o
al menos 95 %, o al menos el 96 %, o al menos el 97 %, o al menos el 98 %, o al menos el 99 %, a una de las
secuencias de aminoácidos recitadas en el párrafo anterior, siempre que el VWF truncado sea capaz de unirse al
FVIII.
Un polipéptido de la invención se denomina un "dímero" en la presente invención si dos monómeros de polipéptido de
la invención están unidos por un enlace covalente. Preferentemente, las dos subunidades monoméricas se conectan
covalentemente a través de al menos un puente disulfuro, por ejemplo, por uno, dos, tres o cuatro puentes disulfuro.
Los restos de cisteína que forman al menos un puente disulfuro están preferentemente situados dentro de la porción
truncada del VWF del polipéptido de la invención. En una realización, estos restos de cisteína son Cys-1099, Cys-1142, Cys-1222, Cys-1225, o Cys-1227 o combinaciones de los mismos.
El dímero es preferentemente un homo-dímero, por lo que cada monómero comprende preferentemente un resto que
extiende la vida media como se desvela. El VWF truncado comprende preferentemente, o consiste en dos polipéptidos
cada uno con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los
aminoácidos 764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225 o los
aminoácidos 764 a 1227 de SEQ ID NO:4 y es capaz de unirse a FVIII. En las realizaciones preferentes, el VWF
truncado comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos
el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, con los aminoácidos 764 a 1099,
aminoácidos 764 a 1142, aminoácidos 764 a 1222, aminoácidos 764 a 1225 o los aminoácidos 764 a 1227 de SEQ
ID NO:4 y es capaz de unirse a FVIII. De manera preferente el VWF truncado comprende o consiste los aminoácidos
764 a 1099, los aminoácidos 764 a 1142, los aminoácidos 764 a 1222, los aminoácidos 764 a 1225, los aminoácidos
764 a 1227 o los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4.
El VWF truncado puede ser cualquiera de los fragmentos de VWF divulgados en los documentos WO 2013/106787
A1, WO 2014/198699 A2, WO 2011/060242 A2 o WO 2013/093760 A2, cuya divulgación es i Z a la que se hace
referencia aquí. De acuerdo con otras realizaciones preferentes, el VWF truncado tal como se ha desvelado
anteriormente puede comprender al menos una de las sustituciones de aminoácidos según se rdesvela en el
documento WO 2016/000039 A1. Las versiones modificadas del VWF truncado comprenden al menos una sustitución
de aminoácidos dentro de su dominio D', en comparación con la secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF
de tipo salvaje según SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de las versiones modificadas del VWF truncado
puede tener una o más sustituciones de aminoácidos en relación con la secuencia de tipo silvestre respectiva. La
secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF truncado modificado tiene preferentemente una o 2 sustituciones
de aminoácidos en relación con el dominio D' del SEQ ID NO:4. Se prefiere que S en la posición 764 del SEQ ID NO:4,
correspondiente a la posición 1 del SEQ ID NO:2, sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que
consiste en G, P, V, E, y, A y L. También se prefiere que S en la posición 766 del SEQ ID NO:4, correspondiente a la
posición 3 del SEQ ID NO:2, sea sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en y, I, M, V, F, H,
R y W. las combinaciones preferentes de sustituciones incluyen S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M,
S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K,
S766Y/P769N, S766Y/P769R y S764P/S766L, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO:4. La afinidad de unión del
polipéptido de la presente invención a FVIII puede ser aumentada aún más por medio de la introducción de dichas
sustituciones en comparación con la afinidad de unión de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia
de aminoácidos excepto para dichas modificaciones. Dichas sustituciones dentro del VWF truncado pueden contribuir
a aumentar aún más la vida media del FVIII endógeno o la vida media del FVIII administrado conjuntamente y/o pueden
permitir la reducción de la dosis del polipéptido recombinante de la invención que debe ser administrado.
Resto que extiende la vida media
La vida media del VWF endógeno en plasma humano es de aproximadamente 16h (Lenting PJ, Christophe OD, Denis CV. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: connecting the far ends. Blood. 2015.125(13):2019-28).
Además del VWF truncado, el polipéptido de la invención comprende un resto que extiende la vida media. El resto que extiende la vida media puede ser una secuencia heteróloga de aminoácidos fusionada al VWF truncado. Alternativamente, el resto que extiende la vida media puede ser conjugad químicamente al polipéptido que comprende el VWF truncado por un enlace covalente diferente de un enlace peptídico.
En ciertas realizaciones de la invención, la vida media del polipéptido de la invención es extendida por modificación química, por ejemplo fijación a un resto que amplia la vida media tal como polietilenglicol (pegilación), PEG glicosilado, almidón de etil hidroxílico (HESilación), ácidos polisiálicos, polipéptidos similares a elatina, polímeros heparosan o ácido hialurónico. En otra realización, el polipéptido de la invención es conjugado a un HLEP tal como albúmina a través de un enlazador químico. El principio de esta tecnología de conjugación ha sido descrito de manera ilustrativa por Conjuchem LLC (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 7.256.253).
En otras realizaciones, el resto que extiende la vida media es una proteína que extiende la vida media (HLEP). Preferentemente, el HLEP es una albúmina o un fragmento de la misma. El extremo N-terminal de la albúmina puede fusionarse con el extremo C-terminal del VWF truncado. Alternativamente, el terminal C de la albúmina puede fusionarse con el extremo N-terminal del VWF truncado. Uno o más HLEP pueden ser fusionados a los extremos N- o C-terminal de VWF siempre que no interfieran con, o supriman la capacidad de unión del VWF truncado a FVIII.
El polipéptido recombinante comprende además, preferentemente, un enlace químico o una secuencia enlazante situada entre el VWF truncado y el HLEM.
Dicha secuencia del enlazador puede ser un enlazador peptídico que consiste en uno o más aminoácidos, en particular de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (p. ej 1,2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Preferentemente, la secuencia del enlazador no está presente en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Los aminoácidos preferidos presentes en la secuencia del enlazador mencionada incluyen Gly y Ser. La secuencia del enlazador debe ser no inmunogénica. Los enlazadores preferidos pueden estar compuestos de restos de glicina y serina alternos. Los enlazadores adecuados se describen por ejemplo en el documento WO2007/090584.
En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre el resto truncado de VWF y e1HLEM consiste en secuencias peptídicas, que sirven como enlazadores naturales de interdominio en proteínas humanas. Preferentemente, tales secuencias de péptidos en su entorno natural se localizan cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunológico para que uno pueda asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en el documento WO 2007/090584. Las secuencias del enlazador se describen, por ejemplo, en el documento WO 2013/120939 A1.
En una realización preferida del polipéptido recombinante, el enlazador entre el VWF truncado y e1HLEM es un enlazador glicina/serina peptídico que tiene, o consiste en la secuencia de aminoácidos 480 - 510 de SEQ ID NO:2.
En una realización el polipéptido tiene la siguiente estructura:
tVWF - L1 -H , [fórmula 1]
En donde tVWF es el VWF truncado, L1 es un enlace químico o una secuencia enlazante y H es un HLEP.
L1 puede ser un enlace químico o una secuencia enlazante compuesta de uno o más aminoácidos, por ejemplo de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (p. ej 1 , 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por lo general, las secuencias del enlazador no están presentes en la posición correspondiente en el VWF de tipo salvaje. Ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible. Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos de restos alternantes de glicina y serina tal como se ejemplifica en el documento WO2007/090584. En otra realización de la invención el enlazador peptidico entre el resto truncado de VWF y el resto de albúmina consiste en secuencias de péptidos, que sirven como enlazadores naturales de interdominios en proteínas humanas. Preferentemente, tales secuencias de péptidos en su entorno natural se localizan cerca de la superficie de la proteína y son accesibles al sistema inmunológico para que uno pueda asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan algunos ejemplos en el documento WO2007/090584. Las secuencias del enlazador escindible se describen, por ejemplo, en el documento WO 2013/120939 A1.
Las secuencias HLEP preferentes se describen más adelante. Igualmente abarcado por la invención son fusiones al "aminoácido N-terminal" exacto o al "aminoácido C-terminal" exacto del respectivo HLEP, o fusiones a la "parte N-terminal" o a la "parte C-terminal" del respectivo HLEP, que incluye deleciones en posición N-terminal de uno o más aminoácidos del HLEP. El polipéptido puede comprender más de una secuencia de HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias de HLEP. Estas múltiples secuencias HLEP pueden fusionarse en la parte C-terminal del VWF en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.
Polipéptidos que extienden la vida media (HLEP)
Preferentemente, el resto que extiende la vida media es un polipéptido que extiende la vida media (HLEP), más preferentemente HLEP se selecciona de albúmina o fragmentos de ella, la región constante de inmunoglobulina y partes de ella, por ejemplo el fragmento FC, las cadenas aleatorias solvatadas con un volumen hidrodinámico grande (por ejemplo XTEN (Schellenberger et al 2009; Nature Biotechniol. 27:1186-1190), repeticiones de homo-aminoácidos (HAP) o repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión de vitamina D, transferrina o variantes de la misma, péptido carboxilo-terminal (CTP) de la subunidad de gonadotropina-p coriónica humana, polipéptidos o lípidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a albúmina o inmunoglobulina constante.
Un "polipéptido que extiende la vida media" tal como se usa en este documento se selecciona preferentemente del grupo compuesto por albúmina, un miembro de la familia de la albúmina, la región constante de la inmunoglobulina G y sus fragmentos, la región y los polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina, a los miembros de la familia de la albúmina, así como a las porciones de una región constante de inmunoglobulina. Puede ser una proteína de longitud completa que mejora la vida media descrita en este documento (por ejemplo, albúmina, un miembro de la familia de la albúmina o la región constante de la inmunoglobulina G) o uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación. Tales fragmentos pueden ser de 10 o más aminoácidos de longitud o pueden incluir por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 50, por lo menos 100, o más aminoácidos contiguos de la secuencia de HLEP o pueden incluir parte o todos los dominios específicos de1HLEP respectivo, siempre y cuando el fragmento de HLEP proporcione una extensión funcional de la vida media de al menos el 25 % en comparación con el polipéptido respectivo sin el HLEP.
La porción HLEP del polipéptido de la invención puede ser una variante de un tipo salvaje HLEP. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, conservadoras o no conservadoras, en las que tales cambios no alteran sustancialmente la actividad de fijación del FVIII del VWF truncado.
En particular, las construcciones propuestas de fusión del HLEP de VWF de la invención pueden incluir variantes polimórficas de HLEP que están presentes en la naturaleza y fragmentos de HLEP. E1HLEP puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo ser humano, mono, vaca, ovejas, o cerdo. Los HLEP no mamíferos incluyen, pero no se limitan a gallina y salmón.
Según ciertas realizaciones de la presente revelación, el resto que extiende la vida media, en particular un HLEP, la porción del polipéptido de la invención puede especificarse con el término alternativo "FP". Preferentemente, el término "FP" representa una albúmina humana si no se indica lo contrario.
De acuerdo con ciertas realizaciones preferentes, el polipéptido es una proteína de fusión. Una proteína de fusión en términos de la presente invención es una proteína creada por unión dentro del marco de por lo menos dos secuencias de ADN que codifican el VWF truncado así como el HLEP. La persona experta entiende que la traducción de la secuencia de ADN de la proteína de fusión dará lugar a una secuencia de proteínas única. Como resultado de una inserción dentro del marco de lectura de una secuencia de ADN que codifica un enlazador peptídico de acuerdo con una realización más preferida, puede obtenerse una proteína de fusión que comprende el v W f truncado, un enlazador adecuado y el HLEP.
Albúmina como HLEP
Los términos "albúmina sérica humana" (HSA) y "albúmina humana" (HA) y "albúmina" (ALB) se usan indistintamente en esta solicitud. Los términos "albúmina" y "albúmina sérica" son más amplios y abarcan la albúmina sérica humana (y sus fragmentos y variantes), así como la albúmina de otras especies (y sus fragmentos y variantes).
Tal como se usa en este documento, "albúmina" se refiere colectivamente a la secuencia de polipéptido o de aminoácido de albúmina, o a un fragmento o a una variante de albúmina, que tienen una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de albúmina. En particular, la "albúmina" se refiere a la albúmina humana o a sus fragmentos, especialmente a la forma madura de albúmina humana tal como se muestra en SEQ ID NO:6 o a la albúmina de otros vertebrados o fragmentos de éstos, o a análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de éstos.
De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente divulgación, el término alternativo "FP" se usa para identificar el HLEP, en particular para definir la albúmina como HLEP.
En particular, los polipéptidos propuestos de la invención pueden incluir variantes polimórficas naturales de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. En términos generales, un fragmento o una variante de albúmina será de al menos 10, preferentemente de al menos 40, preferentemente de más de 70 aminoácidos de longitud.
Realizaciones preferentes de la invención incluyen variantes de albúmina usadas como un HLEP del polipéptido de la invención con un enlace mejorado al receptor FcRn. Estas variantes de albúmina pueden conducir a una vida media en plasma más larga de una proteína de fusión de la variante de albúmina de VWF truncada en comparación con una fusión de VWF truncada con una albúmina de tipo salvaje.
La porción de albúmina de los polipéptidos de la invención puede comprender por lo menos un subdominio o un dominio de HA o modificaciones conservadoras del mismo.
Inmunoglobulinas como HLEP
Las regiones constantes de inmunoglobulina G (IgG) (FC) son conocidas en la técnica para aumentar la vida media de las proteínas terapéuticas (Dumont J A et al 2006. BioDrugs 20:151-160). La región constante de IgG de la cadena pesada consta de 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede derivarse de cualquier mamífero, o de las subclases lgG1, lgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. Los fragmentos de IgG e IgG sin un dominio de unión al antígeno también pueden usarse como HLEP. La porción terapéutica del polipéptido se conecta a la IgG o a los fragmentos de IgG preferentemente a través de la región bisagra del anticuerpo o un enlazador peptídico, que puede incluso ser escindible. Varias patentes y solicitudes de patente describen la fusión de proteínas terapéuticas en regiones constantes de inmunoglobulina para mejorar la vida media in vivo de la proteína terapéutica. Los documentos US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen proteínas de fusión de dominios FC o al menos porciones de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la vida media del péptido, que de otro modo se eliminarían rápidamente in vivo. Se describieron proteínas de fusión FC-LFN-p que lograron una mayor actividad biológica, una vida media en circulación prolongada y una mayor solubilidad (WO 2006/000448). Se han desvelado proteínas FC-EPO con vida media sérica prolongada y potencia in vivo aumentada (WO 2005/063808), así como fusiones de FC con G-CSF (WO 2003/076567), péptido tipo glucagón-1 (WO 2005/000892), factores de coagulación (WO 2004/101740) e interleucina-10 (U.S. Pat. 6.403.077), todo con propiedades que extienden la vida media.
Varios HLEP que pueden usarse de acuerdo con la presnete invención se describen en detalle en el documento WO 2013/120939 A1.
N-glicanos y sialilación del polipéptido de la invención
El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y por lo menos el 75 %, preferentemente por lo menos el 85 %, más preferentemente por lo menos el 90 % de dicho N-glicanos comprenden, en promedio, por lo menos un resto de ácido siálico. En las realizaciones preferentes, por lo menos el 91 %, por lo menos el 92 %, por lo menos el 93 %, por lo menos el 94 %, por lo menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, de dichos N-glicanos comprenden, en promedio, al menos un resto de ácido siálico. Los inventores encontraron que los polipéptidos que comprenden fragmentos del VWF altamente sialilados no solo tienen una vida media prolongada, sino que también son capaces de ampliar la vida media del FVIII administrada conjuntamente. En otras palabras, la administración del polipéptido de la invención conduce a una vida media extendida y/o a una eliminación reducida del FVIII administrado conjuntamente.
El polipéptido de la invención comprende preferentemente N-glicanos, y por lo menos el 50 % de los grupos sialilo de los N-glicanos de las glucoproteínas son grupos a-2,6-sialilo vinculados. En general, los grupos de sialilo terminales pueden conectarse a los grupos de galactosa a través de un enlace 2,6-2,3 o a través de un enlace a-a. Normalmente, los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden más grupos sialilo con enlace a-2,6 que grupos sialilo con enlace a-2,3. Preferentemente, al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 % de los grupos sialilo de los N-glicanos son grupos sialilo con enlace a-2,6. Estas realizaciones pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la co-expresión de a-2,6-sialiltransferasa humana en células de mamíferos.
En una realización, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %, de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprenden al menos un grupo de ácido siálico. En otra realización, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos 98 % o al menos el 99 %, de los N-glicanos del polipéptido de la invención comprende al menos un grupo de ácido siálico.
En otra realización, menos del 15 %, menos del 12 %, menos del 10 %, o menos del 8 %, o menos del 6 %, o menos del 5 %, o menos del 4 %, o menos del 3 % o menos de 2 % o incluso menos de 1 % de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir son N-glicanos que carecen de un grupo de ácido siálico. En otra realización, menos del 15 %, menos del 12 %, menos del 10 %, o menos del 8 %, o menos del 6 % o menos del 5 %, o menos del 4 %, o menos del 3 %, o menos de 2 % o incluso menos de 1 % de los N-glicanos del polipéptido de la invención son asialo-N-glicanos, es decir, no tienen un grupo de ácido siálico.
Los procedimientos adecuados para producir tales glicoproteínas se describen en el documento pendiente PCT/EP2016/061440. En consecuencia, se describe un procedimiento de producción de una glicoproteína que comprende N-glicanos con mayor sialilación, que comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado, y (ii) cultivar dichas células a una temperatura inferior a 36,0 °C. Además, se describe un procedimiento para producir un dímero de una glicoproteína que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado, o para aumentar la dimerización de dicha glicoproteína, que consiste en (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la glicoproteína, y ii) cultivar dichas células a una temperatura inferior a 36,0 °C. Además, se describe un procedimiento de producción de una glicoproteína que comprende N-glicanos con mayor sialilación, que comprende (i) proporcionar células que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado y un ácido nucleico recombinante que codifica una a-2,6-sialiltransferasa, y ii) cultivar las células en condiciones que permitan la expresión de la glucoproteína y de la a-2,6-sialiltransferasa.
Las realizaciones descritas anteriormente pueden combinarse entre sí. Cualquier porcentaje de N-glicanos mencionado anteriormente, o cualquier indicación del grado de sialilación, debe entenderse como porcentajes o grados medios, es decir, se refieren a una población de moléculas, no a una sola molécula. Está claro que la glicosilación o la sialilación de las moléculas individuales de glicoproteína dentro de una población de glicoproteínas mostrará cierta heterogeneidad.
Dímeros
Los polipéptidos de esta invención tienen preferentemente una alta relación de dímeros. El polipéptido de la invención está presente, por lo tanto, en forma de dímero. En una realización, al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 % de los polipéptidos están presentes como dímeros. En otra realización, la relación dímero:monómero del polipéptido de la invención es por lo menos de 1,5, preferentemente por lo menos de 2, más preferentemente por lo menos de 2,5 o por lo menos de 3. Más preferentemente, todos los péptidos de la invención están presentes como dímeros. El uso de dímeros es favorable, ya que el dímero tiene una afinidad mejorada con el factor VIII en comparación con el monómero. El contenido de dímeros, y la relación de dímero a monómero del polipéptido de la invención puede determinarse como se describe en los ejemplos.
En una realización, la afinidad del polipéptido de la invención hacia el factor VIII es mayor que la del VWF nativo humano hacia la misma molécula de factor VIII. La afinidad del factor VIII puede referirse al factor VIII nativo humano, o a la molécula del factor VIII caracterizada por el SEQ ID NO:5.
Se ha encontrado que las preparaciones del polipéptido de esta invención con una relación alta de dímeros tienen una afinidad aumentada hacia el factor VIII Tal afinidad aumentada hacia el factor VIII conduce a una estabilización mejorada del factor VIII por los polipéptidos de la presente invención. Alternativamente, o en combinación con un aumento de la relación de dímeros, también polipéptidos de acuerdo con la invención con mutaciones dentro del dominio de unión del factor VIII que aumentan la afinidad hacia el factor VIII, son realizaciones preferentes de la invención. Se desvelan mutaciones adecuadas, por ejemplo, en el documento WO 2013/120939 A1.
Preparación del polipéptido
El ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención puede ser preparado de acuerdo a los procedimientos conocidos en la técnica. Basándose en la secuencia de ADNc de VWF (SEQ ID NO:3), se puede diseñar y generar ADN recombinante que codifica las construcciones truncadas de VWF o los polipéptidos de la invención mencionados anteriormente.
Incluso si el polipéptido que segregan las células huésped no comprende los aminoácidos 1 a 763 de VWF, es preferible que el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, o al menos el 99 %, a los aminoácidos 23 a 763 o preferentemente a los aminoácidos 1 a 763 de SEQ ID NO:4. Lo más preferible es que el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN) que codifica el precursor intracelular del polipéptido comprenda una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos 23 a 763 del SEQ ID NO:4, o los aminoácidos 1 a 763 del SEQ ID NO:4.
Las construcciones en las que el ADN contiene todo el marco de lectura abierto insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión, se pueden usar para la expresión de las proteínas. Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondientes al ácido nucleico insertado en las células que llevan plásmidos. También pueden incluir un origen de secuencia de replicación que permita su replicación autónoma dentro del organismo anfitrión, y secuencias que aumentan la eficiencia con la que se traduce el ARNm sintetizado. Los vectores estables a largo plazo pueden mantenerse como entidades que se replican libremente mediante el uso de elementos reguladores de, por ejemplo, virus (por ejemplo, las secuencias OriP del genoma del virus de Epstein Barr). También se pueden producir líneas celulares que han integrado el vector en el ADN genómico, y de esta manera el producto genético se produce de manera continua.
Normalmente, las células que se proporcionarán se obtienen introduciendo el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención en células huésped de mamíferos.
Cualquier célula huésped susceptible de cultivo celular, y a la expresión de glicoproteínas, puede ser usada de acuerdo con la presente invención. En ciertas realizaciones, una célula huésped es d mamífero. Ejemplos no limitantes de células de mamíferos que pueden usarse de conformidad con la presente invención incluyen BALB/c línea de mieloma de ratón (NSO/ 1, Ec Ac C no: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (Crucell, Leiden, Países Bajos); línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea renal embrionaria humana (293 o 293 células subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión,Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); células renales de cría de hámster (BHK ATC CCL10); células de ovario de hámster chino /- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:4216, 1980); células de Sartoli de ratón (TM4,Mather, Biol. Reprod., 23:243 251, 1980); células renales de mono (CV1 ATCC c Cl 70); células renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (Hela, ATCC CCL 2); células renales caninas (Md CK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATc C 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); célulasTRI (Mather et al., Annals NY. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células PS4; células amniocíticas humanas (c Ap ); y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Preferentemente, la línea celular es una línea celular de roedores, especialmente una línea celular de hámster tal como CHO o BHK.
Los procedimientos adecuados para introducir ácidos nucleicos suficientes para lograr la expresión de una glicoproteína de interés en las células hospedantes de mamíferos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981;Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson et al EP 117.060; y EP 117.058. Para las células de mamíferos, los procedimientos comunes de introducción de material genético en las células de mamíferos incluyen el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978) o el procedimiento lipofectamine™ (Gibco BRL) de Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993). Aspectos generales de las transformaciones del sistema huésped de células de mamíferos han sido descritos por Axel en EE.UU. Pat. 4.399.216. Para varias técnicas para introducir material genético en células de mamíferos, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 1989, Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990 y Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988.
Las células se cultivan en condiciones que permiten la expresión del polipéptido. El polipéptido se puede recuperar y purificar usando procedimientos que son conocidos para el experto.
Concentración máxima y área debajo de la curva tiempo-concentración del FVIII endógeno
Según un aspecto preferido de la invención, el polipéptido tal como se ha definido anteriormente es usado para aumentar el Cm axo el AUC del factor VIII endógeno en comparación con sujetos no tratados mediante la administración del polipéptido de la invención solo, es decir, sin administración conjunta del FVIII.
La concentración máxima (Cmax) es el valor de concentración en plasma más alto medido. Tras la administración de dicho polipéptido recombinante, el Cmáx para FVIII puede ser de al menos 10 mUI/ml, de al menos 25 mUI/ml, de al menos 50 mUI/ml, de al menos 100 mUI/ml, de al menos 200 mUI/ml, de al menos 300 mUI/ml o de al menos 400 mUI/ml.
El AUCü -tes el área de pico debajo de la curva de tiempo-concentración en plasma desde cero hasta el último punto temporal medido. Tras la administración del polipéptido recombinante, el AUC para el aumento endógeno del FVIII puede ser de al menos 1000 mUI*h/ml, de al menos 2000 mUI*h/ml, de al menos 3000 mUI*h/ml, de al menos 5000 mUI*h/ml, de al menos 10000 mIU*h/ml o de al menos 20000 mIU*h/ml de actividad cromogénica del FVIII.
Biodisponibilidad de rD’D3-FP después de la administración subcutánea
Un aspecto adicional de la invención se refiere a proporcionar o mejorar la biodisponibilidad subcutánea del polipéptido tal como se definió anteriormente.
El término biodisponibilidad, tal como se usa en este documento, se define como el porcentaje del AUCü-inf de polipéptido de la invención después de la administración s.c., en relación con el AUCü-inf de polipéptido de la invención después de la administración i.v. El AUC^ inf es el área debajo de la curva tiempo-concentración en plasma de cero a infinito. Para la evaluación de los datos farmacocinéticos para el cálculo de AUC0-M se aplicó un modelo bicompartimental (perfil farmacocinético bifásico).
Según ciertas realizaciones, la biodisponibilidad del polipéptido recombinante en ausencia del FVIII administrado conjuntamente es de al menos 30 %, preferentemente de al menos 35 %, más preferentemente de al menos 40 %, de al menos 45 % o de al menos 50 %.
Según ciertas realizaciones, la biodisponibilidad del polipéptido recombinante tras la administración conjunta con FVIII es de al menos el 30 %, preferentemente de al menos el 35 %, más preferentemente de al menos el 40 %, de al menos del 45 % o de al menos el 50 %.
Tratamiento del trastorno de la coagulación
Un aspecto adicional de esta invención es un procedimiento de tratamiento de un desorden de coagulación de la sangre, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un polipéptido tal como se ha definido anteriormente.
Los polipéptidos de la invención son útiles para tratar trastornos de coagulación de la sangre, incluyendo hemofilia A y enfermedad de von Willebrand. El término "hemofilia A" se refiere a una deficiencia en el FVIII de coagulación funcional, que generalmente se hereda. La enfermedad de von Willebrand se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de von Willebrand tipo 2N, la enfermedad de von Willebrand tipo 3 y la enfermedad de von Willebrand tipo 1.
En otra realización, el trastorno de coagulación de la sangre es la enfermedad de von Willebrand tipo 1 caracterizada por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes del tratamiento está reducido en comparación con el nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
El paciente que hay que tratar puede tener una actividad y/o un nivel del FVIII endógeno reducidos en comparación con el FVIII endógeno en el NHP. La actividad del FVIII endógeno en el paciente puede ser inferior al 80 %, o inferior al 70 %, o inferior al 60 %, o inferior al 50 %, o inferior al 40 %, o inferior al 30 %, o inferior al 20 %, o inferior al 20 %, o inferior al 10 %, o menos del 5 % de la actividad del FVIII endógeno en el NHP. La actividad del FVIII endógeno en el paciente que se va a tratar puede ser inferior a 0,8 UI/ml, inferior a 0,7 UI/ml, inferior a 0,6 UI/ml, inferior a 0,5 UI/ml, inferior a 0,4 UI/ml, inferior a 0,3 UI/ml o inferior a 0,2 UI/ml, o menos de 0,1 UI/ml, o menos de 0,05 UI/ml de sangre completa.
El polipéptido de la invención debe ser administrado a un paciente que tiene una actividad del FVIII endógeno de por lo menos 0,005 UI/mL. En ciertas realizaciones, el polipéptido de la invención debe ser administrado a un paciente que tiene una actividad del FVIII endógeno de 0,01 a 0,4 IU/ml, o 0,02 a 0,3 IU/ml, o 0,03 a 0,2 IU/ml, o 0,04 a 0,1 IU/ml de sangre entera.
En una realización, el trastorno de la coagulación de la sangre es hemofilia A moderada. La hemofilia A moderada se caracteriza preferentemente por un nivel endógeno de actividad del FVIII que va de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 % del nivel endógeno de actividad del FVIII en el NHP. Por lo general, los sujetos con hemofilia A moderada tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,01 a 0,05 UI/ml en plasma.
En otra realización, el trastorno de la coagulación de la sangre es hemofilia A leve. la hemofilia A leve se caracteriza preferentemente por un nivel endógeno de actividad del FVIII que va de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 40 % del nivel endógeno de actividad del FVIII en el NHP. Por lo general, los sujetos con hemofilia A leve tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,05 a 0,4 UI/ml en plasma.
En otra realización, el trastorno de coagulación de la sangre es hemofilia A grave. La hemofilia A grave se caracteriza por un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior al 1 % de la actividad del FVIII endógeno en el NHP.
En otra realización, el trastorno de la coagulación de la sangre es la enfermedad de von Willebrand tipo 2N. La enfermedad de von Willebrand tipo 2N se caracteriza preferentemente por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes del tratamiento que se encuentra en un intervalo de entre aproximadamente 3 UI/dL y alrededor de 30 UI/dL FVIII nivel de actividad, que corresponde a aproximadamente el 3 % a aproximadamente el 30 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP. La mayoría de los pacientes tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior a 20 UI/dL, por lo tanto un nivel inferior al 20 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP. Por lo tanto, los sujetos con enfermedad de von Willebrand tipo 2N tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno de 0,03 UI/ml a 0,3 UI/ml en plasma, normalmente por debajo de 0,2 UI/ml.
En otra realización, el trastorno de la coagulación de la sangre es la enfermedad de von Willebrand tipo 3, Preferentemente caracterizado por un nivel de actividad del FVIII endógeno antes del tratamiento que por lo general está en un intervalo de entre aproximadamente 1 UI/dL y alrededor de 20 UI/dL nivel de actividad del FVIII correspondiente a aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 20 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en NHP. La mayoría de los pacientes tienen un nivel de actividad del FVIII endógeno inferior a 10 UI/dL, por lo tanto un nivel inferior al 10 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
El polipéptido de la invención es preferentemente administrado a un sujeto para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico. Este tratamiento no comprende la administración de ningún FVIII exógeno. El polipéptido de la invención también puede ser administrado a un sujeto para el tratamiento de un evento hemorrágico. En ese caso, el polipéptido de la invención puede ser administrado conjuntamente con FVIII exógena. Después de un tratamiento de este tipo del evento hemorrágico, el tratamiento de seguimiento se lleva a cabo sin la administración conjunta del FVIII exógeno. Es decir, el tratamiento de seguimiento se hace con el polipéptido de la invención solamente.
Normalmente, el tratamiento con el polipéptido de la invención solo, es decir, sin administración conjunta del FVIII exógeno, se continúa hasta que ocurre un evento hemorrágico. La duración del tratamiento con el polipéptido de la invención solo, es decir, sin administración conjunta de FVIII exogenous, no está particularmente limitado, se continúa generalmente por al menos una semana, o por lo menos dos semanas, o por lo menos tres semanas, o por lo menos cuatro semanas, o al menos dos meses.
El tratamiento de una enfermedad comprende el tratamiento de los pacientes ya diagnosticados de alguna forma de la enfermedad en cualquier etapa clínica o manifestación, el retraso de la aparición o la evolución o el agravamiento o el deterioro de los síntomas o de los signos de la enfermedad y/o la prevención y/o la reducción de la gravedad de la enfermedad.
Un "sujeto" o "paciente" a quien se administra un polipéptido de la invención es preferentemente un ser humano. En ciertos aspectos, el ser humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el ser humano es un paciente adulto.
Aquí se describen las composiciones que comprenden un polipéptido de la invención y, opcionalmente, FVIII. Las composiciones suelen suministrarse como parte de una composición estéril y farmacéutica que incluye un vehículo farmacológicamente aceptable. Esta composición puede ser de cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado de administrarla a un paciente).
Los términos "factor VIII" y "FVIII" se usan indistintamente en este documento y abarcan tanto el FVIII derivado del plasma como el FVIII recombinante. El FVIII recombinante comprende, sin limitación, variantes de FVIII de longitud completa, así como variantes suprimidas o truncadas de dominio B de dos cadenas, así como variantes suprimidas o truncadas de dominio B de cadena única, por ejemplo, las descritas en el documento WO 2004/067566 y otras variantes de FVIII con mutaciones fuera del dominio B pero que tienen la actividad biológica del FVIII.
El polipéptido de la invención puede ser administrado a un paciente por varias vías, tales como oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, tópicamente o localmente. La vía más adecuada para la administración en un caso determinado dependerá del polipéptido particular, el sujeto, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad y la condición física del sujeto. Normalmente, un polipéptido de la invención será administrado por vía intravenosa.
De acuerdo con la presente invención, el paciente que está siendo tratado con el polipéptido de la invención puede también ser tratado con el factor VIIIl de coagulación de la sangre, siempre que el tratamiento de seguimiento se haga con el polipéptido de la invención solo, es decir sin administración conjunta de FVIII exógeno. El polipéptido de la invención y el factor VIII pueden ser administrados simultáneamente o de una manera secuencial, estando ambos modos de administración abarcados por el término "terapia de combinación" y "administración conjunta". El polipéptido de la invención y el factor VIII pueden ser administrados como una mezcla, es decir, dentro de la misma composición, o por separado, es decir, como composiciones separadas.
El polipéptido y, opcionalmente, el FVIII se administran preferentemente por vías intravenosa o subcutánea.
En una primera realización, tanto el polipéptido como, opcionalmente, el FVIII se administran por vía intravenosa. En una segunda realización, tanto el polipéptido como, opcionalmente, el FVIII se administran por vía subcutánea.
En otra realización, el FVIII se administra por vía intravenosa, y el polipéptido se administra por una vía diferente. En más realizaciones, el polipéptido se administra por vía subcutánea y el FVIII se administra por una vía diferente. Por ejemplo, el polipéptido puede administrarse por vía subcutánea y el FVIII puede administrarse por vía intravenosa.
En más realizaciones, el FVIII se administra por vía subcutánea, y el polipéptido se administra por vía diferente. En otras realizaciones, el polipéptido se administra por vía intravenosa, y el FVIII se administra por vía diferente. Por ejemplo, el polipéptido puede administrarse por vía intravenosa y el FVIII puede administrarse por vía subcutánea.
La determinación del número total de dosis y la duración del tratamiento con un polipéptido de la invención, está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica La dosis del polipéptido de la invención que hay que administrar puede depender de las concentraciones del FVIII endógeno, de la concentración del VWF endógeno en el paciente que hay que tratar o de ambos. Una dosificación eficaz basada en las relaciones descritas aquí puede ser determinada por la persona experta, teniendo en cuenta el peso molecular del polipéptido de la invención. Las dosis típicas para el FVIII pueden variar de aproximadamente 20 U/kg de peso corporal a aproximadamente 100 U/kg de peso corporal.
La concentración del factor VIII en la composición usada se encuentra normalmente en el intervalo de 10-10.000 UI/mL. En diferentes realizaciones, la concentración del FVIII en las composiciones de la invención está en el intervalo de 10-8.000 IU/mL, o 10-5.000 IU/mL, o 20-3.000 IU/mL, o 50-1.500 IU/mL, o 3.000 IU/mL, o 2.500 UI/ml, o 2.000 UI/ml, o 1.500 Ul/ml, o 1.200 Ul/ml, o 1.000 Ul/ml, o 800 Ul/ml, o 750 Ul/ml, o 600 Ul/ml, o 500 Ul/ml, o 400 Ul/ml, o 300 Ul/ml, o 250 Ul/ml, o 200 Ul/ml, o 150 Ul/ml, o 125 Ul/ml, o 100 lU/ml, o 62,5 lU/ml, o 50 lU/ml, siempre que se cumplan los requisitos relativos a la relación con respecto al polipéptido VWF de la invención tal como se define aquí.
"Unidad Internacional", o "Ul", es una unidad de medición de la actividad de coagulación de la sangre (potencia) del FVIII medida por un ensayo de actividad del FVIII, tal como un ensayo de coagulación de una etapa o un ensayo de actividad del FVIII de sustrato cromogénico, usando un patrón calibrado contra una preparación estándar internacional calibrada en "Ul". Los ensayos de coagulación de una etapa son conocidos en la técnica, tal como el descrito en N Lee, Martin L, Et al., An Effect of Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates, Thrombosis Research (Pergamon Press Ltd.) 30, 511 519 (1983). Principio del ensayo de una etapa: la prueba se ejecuta como una versión modificada del ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT): incubación del plasma con fosfolípidos y un activador de superficie conduce a la activación de factores del sistema de coagulación intrínseca. La adición de iones de calcio desencadena la cascada de coagulación. Se determina el tiempo hasta la formación de un coágulo de fibrina mensurable. El ensayo se realiza en presencia de plasma deficiente en factor VIII. La capacidad de coagulación del plasma deficiente se restablece mediante el factor VIII de coagulación incluido en la muestra que se va a analizar. El acortamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la cantidad de factor VIII presente en la muestra. La actividad del factor VIII de coagulación se cuantifica en unidades internacionales mediante comparación directa con una preparación estándar con una actividad conocida del factor VIII.
Otro ensayo estándar es un ensayo de sustrato cromogénico. Los ensayos de sustrato cromogénicos pueden adquirirse comercialmente, como el kit de prueba Coamatic FVIII (Chromogenix-lnstrumentation Laboratory Spa V. le Monza 338 - 20128 Milano, Italia). Principio del ensayo cromogénico: En presencia de calcio y fosfolípidos, el factor X es activado por el factor IXa al factor Xa. Esta reacción es estimulada por factor Villa como cofactor. La FVIIIa está formada por bajas cantidades de trombina en la mezcla de reacción del FVIII en la muestra que se va a medir. Cuando se usan las concentraciones óptimas de Ca2+, fosfolípido y factor IXa y una cantidad excesiva de factor X, la activación del factor X es proporcional a la potencia del factor VIII. El factor X activado libera el cromóforo PNA del sustrato cromogénico S-2765. La liberación de PNA, medida a 405 nm, es por lo tanto proporcional a la cantidad de FXa formado y, por lo tanto, también a la actividad del factor VIII de la muestra.
De acuerdo con algunas de las realizaciones preferentes del uso del polipéptido, el nivel endógeno del FVIII se incrementa después de la administración de dicho polipéptido a un nivel de al menos el 1 %, o preferentemente al menos el 2 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 100 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP).
En otra realización preferida se aumenta el nivel endógeno del FVIII tras la administración de dicho polipéptido a un nivel que se encuentra en un intervalo de entre el 1 % y el 500 %, preferentemente de entre el 1 % y el 400 %, de entre el 1 % y el 300 %, de entre el 1 % y el 200 %, de entre el 1 % y el 150 % o de entre el 1 % y el 100 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP).
En otra realización preferente se aumenta el nivel del FVIII endógeno tras la administración de dicho polipéptido a un nivel que se encuentra en un intervalo de entre el 5 % y el 400 %, preferentemente de entre el 5 % y el 300 %, de entre el 10 % y el 200 %, de entre el 10 % y el 150 %, de entre el 20 % y el 150 % o de entre el 40 % y el 150 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en plasma humano normal (NHP).
En otra realización preferida, el nivel FVIII endógeno se incrementa después de la administración de dicho polipéptido a un nivel tal como se describe aquí, Por lo que se ajusta la dosis del polipéptido administrado y/o la frecuencia de administración del polipéptido para alcanzar dichos niveles del FVIII endógeno en el sujeto.
Relaciones
En ciertas realizaciones, el polipéptido de la invención es administrado conjuntamente junto con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para la iniciación de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para los tratamientos de seguimiento dicho polipéptido se administra sin administración conjunta de FVIII exógeno. Para aquellas realizaciones que comprenden la administración conjunta del polipéptido de la invención junto con el FVIII exógeno, el polipéptido de la invención es administrado preferentemente en una dosis tal que la relación molar entre el polipéptido que se va a administrar conjuntamente y el FVIII exógeno es mayor de 50.
El polipéptido de la invención puede ser un monómero, un dímero o una mezcla de ellos. Cualquier relación molar de acuerdo con la invención se refiere a una relación de la concentración molar de la subunidad monomérica del polipéptido de la invención, si está realmente presente como monómero o como dímero. Las relaciones se forman sobre la concentración molar del FVIII endógeno, o, al menos para ciertas realizaciones, del FVIII administrado conjuntamente o sobre la concentración molar de las subunidades endógenas del VWF, si están presentes. Cualquier relación de polipéptido de la invención sobre FVIII en esta solicitud se refiere a la cantidad de monómeros comprendidos en el polipéptido de la invención, que preferentemente está presente como un dímero, que se va a administrar (en moles), dividido por la cantidad del FVIII que se va a administrar (en moles), a menos que se indique lo contrario. A modo de ejemplo no limitante, la administración conjunta de 100 |jm de un polipéptido monomérico de la invención con 1 jm del FVIII significa una relación de 100. La misma relación de 100 se obtiene si 50 jm de un polipéptido dimerico de la invención son administrado conjuntamentes con 1 jm del FVIII.
El VWF endógeno es, si está presente, el VWF presente en el plasma del animal o del ser humano a los que hay que administrar el polipéptido de la invención. Generalmente consiste en una gama de diferentes oligómeros de aproximadamente 2 a 40 subunidades monoméricas del VWF. A menos que se indique lo contrario, cualquier relación de polipéptido de la invención sobre VWF endógeno en esta solicitud se refiere a la concentración molar en plasma de polipéptido de la invención por kg peso corporal del sujeto tratado inmediatamente después de la administración del polipéptido de la invención, dividido por la concentración molar en plasma de VWF endógeno por kg de peso corporal del sujeto tratado. La concentración molar en plasma del polipéptido de la invención por kg peso corporal del sujeto tratado inmediatamente después de la administración del polipéptido de la invención se calcula suponiendo una dilución del polipéptido de la invención administrado directamente después de la administración en un volumen en plasma de 40 ml/kg. La cantidad del polipéptido de la invención, inmediatamente después de la administración cuando se administra por vía intravenosa, se supone para los fines de la invención que sea idéntica a la cantidad administrada.
Según un aspecto de la invención, la relación molar entre el polipéptido de la invención y el VWF endógeno es mayor de 0,5. La concentración del VWF endógeno en el plasma del sujeto que se va a tratar puede determinarse mediante un ensayo ELISA o/y de actividad, por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos. Normalmente, la concentración medida se dará en U/ml. Este valor se puede convertir en una molaridad tal como se describe a continuación.
El plasma humano normal (NHP) contiene VWF en una concentración de 1 U/ml o del 100 % por definición. Esto corresponde a una concentración de proteínas de aproximadamente 10jg/ml (Haberichter S.L. y Montgomery R.R., Structure and function of von Willebrand factor; in: Hemostasis and Thrombosis , eds Marder, Aird, Bennett, Schulman y White, Lippincott Williams & Wilkins 2013, pp 197-207). Sobre la base de esta concentración de VWF en NHP y un peso molecular del monómero maduro de VWF de aproximadamente 267.500 Da, incluido el 18-19 % de la glicosilación, se puede calcular una concentración molar en plasma de la unidad de monómero de VWF de aproximadamente 37 x 10 -9 mol/L.
Para el cálculo de las concentraciones molares de subunidades del VWF de rata o de conejo en plasma normal de rata o de conejo, respectivamente, se usó un peso molecular de la subunidad monomérica comparable al VWF humano (267.500 Da) junto con una actividad específica supuesta comparable (100 U/mg) y las actividades endógenas medidas del VWF en plasma de rata o de conejo (véanse también los ejemplos).
La concentración de VWF en la población humana varía de alrededor del 60 % a alrededor del 200 % de la concentración de VWF en el NHP. En ciertas realizaciones de la invención la concentración de VWF endógeno se define como la concentración en NHP. En otras realizaciones, la concentración del VWF endógeno se determina en el sujeto que se va a tratar y la dosis del polipéptido se basa en este valor individual.
La relación molar entre el polipéptido de la invención administrado y el VWF endógeno es preferentemente de por lo menos 2, o de por lo menos 3, o de por lo menos 4, o de por lo menos 5, o de por lo menos 6, o de por lo menos 7, o de por lo menos 8, o de por lo menos 9 o de por lo menos 10, más preferentemente de por lo menos 15, o de por lo menos 20, o de por lo menos 25, o de por lo menos 30, preferentemente de por lo menos 40, o de por lo menos 50, o de por lo menos 75.
La relación molar entre polipéptido de la invención que se va a administrar y el VWF endógeno puede variar de 0,5 a 1.000, o de 1 a 500, o de 2 a 400, o de 3 a 300, o de 4 a 250, o de 5 a 200, o de 6 a 150, o de 7 a 140, o de 8 a 130, o de 9 a 120, o de 10 a 110. Preferentemente, la relación molar entre polipéptido de la invención administrada y el VWF endógeno varía de 3 a 100, o de 4 a 90, o de 5 a 80, o de 6 a 75, o de 10 a 60.
La relación molar entre el polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII endógeno es preferentemente de por lo menos 2, o de por lo menos 5, o de por lo menos 10, o de por lo menos 20, o de por lo menos 30, o de por lo menos 40, o de al menos 50, más preferentemente la relación es mayor de 50, o al menos 75, al menos 100, o mayor de 100, o al menos 200, preferentemente al menos 300, o al menos 400, o al menos 500.
La relación molar entre el polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII endógeno puede variar de 2 a 10.000, o de 5 a 5.000, o de 10 a 4.000, o de 20 a 3.000, o de 30 a 2.000, o de 40 a 1.000. Preferentemente, la relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII endógeno varía de 60 a 2.500, o de 110 a 2.000, o de 150 a 1.500, o de 200 a 1.000.
La relación molar del polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII exógeno que se va a administrar conjuntamente es preferentemente de por lo menos 2, o de por lo menos 5, o de por lo menos 10, o de por lo menos 20, o de por lo menos 30, o de por lo menos 40, o al menos 50, más preferentemente la relación es mayor de 50, o al menos 75, al menos 100, o mayor de 100, o al menos 200, preferentemente al menos 300, o al menos 400, o al menos 500.
La relación molar entre el polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar conjuntamente puede variar de 2 a 10.000, o de 5 a 5.000, o de 10 a 4.000, o de 20 a 3.000, o de 30 a 2.000, o de 40 a 1.000. La relación molar entre el polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar conjuntamente puede preferentemente variar de 50 a 10.000, o de 50 a 5.000, o de 50 a 4.000, o de 50 a 3.000, o de 50 a 2.000, o de 50 a 1.000. Preferentemente, la relación molar entre el polipéptido de la invención que se va a administrar y el FVIII que se va a administrar conjuntamente varía de 60 a 2.500, o de 110 a 2.000, o de 150 a 1.500, o de 200 a 1.000.
Composiciones farmacéuticas
Las formulaciones terapéuticas del polipéptido de la invención, apropiadas en los procedimientos aquí descritos, se pueden preparar para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el polipéptido que tiene el grado deseado de pureza con los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales que se usan habitualmente en la técnica (todos los cuales se refieren aquí como "vehículos"), es decir, agentes tamponantes, agentes estabilizadores, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Estos aditivos no deben ser tóxicos para los receptores en las dosis y las concentraciones empleadas.
Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden presentarse en concentraciones que van desde unos 2 mM hasta unos 50 mM. Los agentes tamponantes adecuados incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sales de estos, tales como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato de monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de hidróxido sódico-ácido succínico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumáricofumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disodico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico, etc.) tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido lácticohidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato potásico, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido sódico, etc.). Además, se pueden usar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.
Los conservantes se pueden agregar para retrasar el crecimiento microbiano y se pueden agregar en cantidades que oscilan entre el 0,2 % y el 1 % (p/v). Entre los conservantes adecuados se incluyen fenol, alcohol bencílico, metacresol, metil parabeno, propil parabeno, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio y alquil parabenos tales como el metil parabeno o el propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Se pueden añadir isotonificadores a veces conocidos como "estabilizadores" para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas e incluir alcoholes de azúcar polhidricos, preferentemente alcoholes de azúcar trihidricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores pertenecen a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función desde un agente de volumen hasta un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del contenedor. Estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihidricos (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluidos los ciclitoles tales como el inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tioctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, a-monotioglicerol y sulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 restos o menos); proteínas tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona, monosacáridos tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacacaridos tales como la rafinosa; y polisacáridos como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de proteína activa del peso.
Se pueden añadir tensioactivos no iónicos o detergentes (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica frente a la agregación inducida por la agitación, lo cual permite también que se exponga la formulación a la superficie de deslizamiento sin causar desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184, 188 etc.), polioles plurónicos, monoéteres de sorbitán de polioxietileno (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.
Otros excipientes diversos incluyen agentes de aumento de volumen (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y cosolventos.
La formulación aquí contenida también puede contener un segundo agente terapéutico además de un polipéptido de la invención. Se proporcionan a continuación ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.
El programa de dosificaciones puede variar de entre una vez al mes y diario, dependiendo de varios factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al polipéptido de la invención. En algunas realizaciones, un polipéptido de la invención se administra, dos veces por semana, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo de entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, desde cada cuatro semanas hasta cada mes, desde cada 10 días hasta cada dos semanas, o desde dos a tres veces a la semana, etc.
La dosificación de un polipéptido de la invención que hay que administrar variará de acuerdo con el polipéptido particular, el sujeto, y la naturaleza y la gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se usa un segundo agente terapéutico), y la vía de administración seleccionada; la dosis adecuada puede ser determinada fácilmente por una persona cualificada en la técnica
Una persona experta en la técnica identificará que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosis individuales de un polipéptido de la invención vendrán determinados por la naturaleza y la extensión de la afección que se está tratando, la forma, la vía y el sitio de administración, y la edad y el estado del sujeto en particular que se está tratando, y que será en última instancia un médico quien determine las dosis apropiadas que se van a usar. Esta dosis se puede repetir con la frecuencia que sea apropiada. La cantidad y/o la frecuencia de las dosis se pueden alterar o reducir, de acuerdo con la práctica clínica normal, si se desarrollan efectos secundarios.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos que se muestran en el listado de secuencias se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1
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Los siguientes ejemplos ilustran la invención, pero no deben interpretarse que limitan la presente invención a las realizaciones específicas que se describen a continuación.
Ejemplos
Ejemplo 1: análisis del nivel del FVIII en plasma después de la administración de rD'D3-FP
El objetivo era caracterizar el impacto de la rD'D3-FP sobre los niveles del FVIII endógeno, apoyando así en general el tratamiento de pacientes con hemofilia A de leve a moderada o grave o con ciertos tipos de enfermedad de von Willebrand con v W f de bajo nivel y FVIII endógeno funcional. Se investigó este efecto bajo diferentes enfoques:
• Administración intravenosa a modelos con niveles normales de FVIII y VWF endógenos, es decir, ratas (ejemplo 1.1), conejos (ejemplo 1.2) y monos (ejemplo 1.3), para investigar un posible aumento adicional del FVIII endógeno después de la administración intravenosa (i.v.) de rD'D3-FP en un sujeto sano.
• Administración intravenosa a modelos con niveles bajos del FVIII debido a la deficiencia de VWF, es decir, ratas con VWF desactivado (ejemplo 1.4) y ratones con VWF desactivado (ejemplo 1.5), para investigar la magnitud del aumento del FVIII endógeno después de la administración i.v. de rD'D3-FP en un sujeto enfermo.
• Administración intravenosa a modelos con niveles bajos del FVIII debido a la deficiencia del VWF, es decir, ratas con el VWF desactivado, para investigar la magnitud del aumento del FVIII endógeno después de la administración i.v. de variantes de rD'D3-FP en un sujeto enfermo (ejemplo 1.6).
• Se investigó la administración subcutanosa a modelos con niveles normales o bajos del FVIII, es decir, cerdo, ratón con FVIII desactivado y con VWF desactivado y rata con FVIII desactivado y von VWF desactivado y (ejemplo 1.7) para comparar la biodisponibilidad i.v. y s.c. de rd'DD3-FP, así como los efectos sobre el FVIII endógeno.
• En un experimento final se investigaron los efectos de múltiples dosis de rD'D3-FP (i.v.) en ratas con el VWF desactivado (ejemplo 1.8).
• Investigación de la rD'D3-FP administrada por vía subcutánea y de la rVIII-cadena única administrada por vía intravenosa, en un modelo de hemofilia A, es decir, en ratas con el FVIII desactivado (ejemplo 1.9).
Materiales y procedimientos
Para los ejemplos, se usó un polipéptido que comprende un VWF truncado que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se define en SEQ ID NO:2. Esta proteína de fusión en particular consiste en una secuencia de aminoácidos N-terminal de 1 - 479, que representa la región D'D3 de VWF (aminoácidos 764 - 1242 del VWF nativo humano), seguida de un péptido enlazador de 31 aminoácidos glicina/serina y una secuencia de aminoácidos de albúmina humana C-terminal de 511 - 1095. Esta proteína de fusión que tiene una secuencia definida en SEQ ID NO:2 se denomina rD'D3-FP o rD'D3-FP WT en los siguientes casos.
Como alternativa para la albúmina como polipéptido de vida media extensible (HLEP), en algunos ejemplos se usa otra variante de vida media extendida de rD'D3 que tiene en lugar de albúmina un CTP (péptido C-terminal de la subunidad de gonadotropina p coriónica humana) fusionado con D'D3 a través de un enlazador de glicina/serina que en adelante se denomina rD'D3-CTP. La proteína de fusión rD'D3-CTP tiene una secuencia tal como se define en SEQ ID NO:7.
En algunos ejemplos se usaron variantes de alta afinidad de rD'D3-FP. Una variante particular de la proteína de fusión consiste en una secuencia de aminoácidos N-terminal de 1 - 479 que representa la región D'D3 del VWF (aminoácidos 764 - 1242 del VWF nativo humano), seguido de un péptido enlazador de 31 aminoácidos de glicina/serina y una secuencia de aminoácidos de albúmina humana C-terminal de 511 a 1095, siempre que dentro del dominio D' de dicho polipéptido estén presentes dos sustituciones de aminoácidos, es decir, S764e y S766Y. Esta proteína de fusión consiste en una secuencia definida en SEQ ID NO:2 que tiene dichas dos sustituciones, a saber, S764E y S766Y, dentro de la región D'D 3. El aminoácido S764 de VWF corresponde al aminoácido número 1 dentro de la secuencia de SEQ ID NO:2 (véase también la tabla 1). La variante rD'D3-FP EY se ha generado tal como se describe en el documento WO 2016/000039 A1. Dicha variante se denomina en adelante rD'D3-FP EY.
En algunos ejemplos se usó otra variante de alta afinidad de rD'D3-FP. Esta variante particular de la proteína de fusión consiste en una secuencia de aminoácidos N-terminal de 1 - 479 que representa la región D'D3 del VWF (aminoácidos 764 - 1242 del VWF nativo humano), Seguido de un péptido enlazador de 31 aminoácidos de glicina/serina y una secuencia de aminoácidos de albúmina humana C-terminal de 511 a 1095, siempre que dentro del dominio D'D 3 de dicho polipéptido estén presentes tres sustituciones de aminoácidos, es decir, S764E, S766Y y V1083A. Esta proteína de fusión consiste en una secuencia tal como se define en SEQ ID NO:2 que tiene dichas tres sustituciones S764E, S766Y, y V1083A dentro de la región D'D 3. Dicha variante se denomina en adelante rD'D3-FP EYA.
Análisis
En todos los ejemplos, la rD'D3-FP se aplicó a niveles de dosis cuantificados mediante un ELISA de albúmina humana, es decir, midiendo la parte de albúmina de la proteína. Este ensayo ELISA de rD'D3-FP se usó para la formulación y las muestras de plasma (excepto para las muestras de plasma de mono, que mostraron una relevante reactividad cruzada con albúmina humana).
En ejemplos en los que se usó la rD'D3-CTP como variante de la rD'D3, el polipéptido se aplicó a niveles de dosis cuantificados por medio de la medición de OD280, y se ajustó la cantidad de proteína a una molaridad en el mismo rango alto que la rD'D3-FP.
El ensayo ELISA ("estándar") rD'D3-FP usó un anticuerpo policlonal de captura de albúmina humana anti-cabra de Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, EE.UU.). La solución de detección consiste en una preparación de anticuerpos anti-detección de albúmina humana marcados con peroxidasa policlonal (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, EE.UU.). Una lectura cromogénica, es decir, TMB de Siemens Healthcare (Eschborn, Alemania) se usó para la cuantificación en un lector de microplacas a 450/650 nm (ELx808, BioTek, EE.UU.) directamente después de la parada. Como norma, se usó la formulación del fármaco que contenía la rD'D3-FP. Las cantidades de la rD'D3-FP se administran en mg de albúmina, es decir, no se realizó ningún ajuste para la parte D'D3 de la molécula.
El ensayo ELISA de rD'D3-FP para muestras de plasma de mono se estableció como ELISA mixto, donde se capturó el dominio D'D3 y se detectó el dominio de albúmina. En el ensayo se usó un anticuerpo de captura monoclonal anti-D'D3 (CSL Behring, en la preparación de grado de investigación interna). La solución de detección consiste en una preparación de anticuerpos anti-detección de albúmina humana marcados con peroxidasa policlonal (Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, EE.UU.). Una lectura cromogénica, es decir, TMB de Siemens Healthcare (Eschborn, Alemania) se usó para la cuantificación en un lector de microplacas a 450/650 nm (ELx808, BioTek Instruments Inc., Winooski, EE.UU.) directamente después de la parada. Como patrón, se usó la formulación del fármaco que contenía la rD'D3-FP. Las cantidades de la rD'D3-FP se dan en mg de albúmina, es decir, no se realizó ningún ajuste para la parte D'D3 de la molécula.
Las muestras de plasma del PK que contenían la rD'D3-CTP se midieron en un ELISA anti-D'D3. Este ensayo ELISA anti D'D 3 se realizó con dos anticuerpos monoclonales anti-humanos D'D3 en un formato sandwich. Ambos anticuerpos para captura y detección se derivaron de una preparación de investigación interna. El anticuerpo anti­ humano de detección de D'D3 fue marcado con peroxidasa. Una lectura cromogénica, es decir, TMB de Siemens Healthcare (Eschborn, Alemania) se usó para la cuantificación en un lector de microplacas a 450/650 nm (ELx808, BioTek Instruments Inc., Winooski, EE.UU.) directamente después de la parada. Como patrón, se usó la formulación del fármaco que contenía la rD'D3-CTP. Las cantidades de la rD'D3-CTP se dan como concentraciones de la rD'D3-CTP.
Los niveles del FVIII:AG en plasma humanos se determinaron con el kit de ensayo ELISA FVIII Asserachrom de Stago, S.A.S., Francia, de acuerdo con el manual de instrucciones del ensayo. El kit de ensayo Asserachrom contenía todos los reactivos con excepción de la solución de parada, que se obtuvo de Siemens Healthcare (Eschborn, Alemania). Como patrón, se usó la formulación de fármacos que contenía rVIII-SingleChain.
Los niveles en plasma de actividad cromogénica del FVIII fueron detectados por medio del ensayo COAMATIC® FVIII (ensayo cromogénico del FVIII:C, Chromogenix, Instrumentation Laboratory Spa, Milán, Italia) de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante en un analizador BCS XP de Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Alemania). Para la calibración, se usó plasma humano estándar. Alternativamente, se detectaron mediante el mismo ensayo COAMATIC® FVIII con dilución previa de las muestras en plasma humano con deficiencia del FVIII de Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Alemania), seguido de una lectura en el Infinite M200 ELISA-Reader de Tecan (Tecan Trading AG, Suiza). Para la calibración, se usó un factor de von Willebrand derivado de plasma humano y un producto que contenía FVIII, Haemate® P de CSL Behring. Las muestras se midieron a 405 nm sin referencia. En general, la actividad cromogénica del FVIII se abrevia como FVIII:C.
Los niveles en plasma de actividad de coagulación del FVIII se detectaron mediante un ensayo de coagulación en una etapa, que incluye Pathromtin® SL, plasma humano con deficiencia del FVIII y solución de cloruro de calcio, que están disponibles comercialmente en Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Alemania). Las medidas se realizaron en un analizador BCS XP de Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Alemania). Para la calibración, se usó plasma humano estándar. El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) se analizó en muestras de plasma usando el reactivo Pathromtin® SL (ratón y rata) o ACTIN® FSL (conejo) y solución de cloruro de calcio en un analizador BCS XP de Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Alemania). Todos los reactivos están disponibles comercialmente en Siemens Healthcare Diagnostics (Marburg, Alemania).
Animales de experimentación
Ratón con FVIII desactivado
Se eligieron ratones con el FVIII desactivado (que presentan un fenotipo de hemofilia A), ya que carecen de los exones 16 y 17 del gen FVIII, y por lo tanto no tienen actividad en plasma del factor VIII ( Bi L. et al, Nature genetics, 1995, Vol 10(1), 119-121 ; Bi L. et al, Blood, 1996, Vol 88(9), 3446-3450 ). Esto permite el análisis de los niveles de actividad del FVIII tras el tratamiento con FVIII mediante la cuantificación de la actividad del FVIII en el plasma de estos ratones.
Rata con FVIII desactivado
Ratas con el FVIII desactivado, que presentan un fenotipo de hemofilia A, fueron generadas en SAGE Labs (a Horizon Discovery Group Company, Saint Louis, MO 63146, EE.UU.) usando la tecnología CRISPR/Cas9. Se indujo una deleción de 2bp (pares de bases) y una inserción de 1bp en la posición 23471-23472 dentro del exón 18, lo que condujo a un codón de parada temprana. La mutación del FVIII desactivado generada dio como resultado una rata con FVIII desactivado con una función del FVIII interrumpida. Esto permite el análisis de los niveles de actividad del FVIII tras el tratamiento con FVIII mediante la cuantificación de la actividad del FVIII en el plasma de estas ratas.
Ratón con VWF desactivado
Se eligieron ratones con VWF desactivado (que presentan un fenotipo de VWD), ya que carecen de exones 4 y 5 del gen VWF, y por lo tanto no tienen actividad del VWF en plasma ( Denis C. etal, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1998, Vol 95, 9524-9529). Esto permite el análisis de polipéptidos D'D 3 en niveles de actividad del FVIII endógeno en el plasma de estos ratones.
Rata con VWF desactivado
Las ratas con el VWF desactivado, que presentan un fenotipo VWD, se generaron en Sigma Advanced Genetic Engineering (SAGE) Labs (Saint Louis, MO 63146, EE.UU.) usando la tecnología CompoZr™ Zinc Finger Nuclease (ZFN) y los procesos de producción de Knockout animal SAGEspeed™. Se indujo una deleción de 16bp (pares de bases) en las posiciones 33926bp-33941bp en la secuencia genómica dentro del exón 7 que dio lugar a un codón de parada temprana. La generación de ratas desactivadas en general usando la tecnología ZFN de Sigma Advanced Genetic Engineering (SAGE) Labs (Sigma-Aldrich Biotechnology) se describen en X. Cui et al (Nature Biotechnology, 2010), enMH. Porteus & D. Carroll (Nature Biotechnology, 2005). La mutación con el VWF desactivado generada dio como resultado una rata con el VWF desactivado con función VWF interrumpida. Esto permite el análisis de polipéptidos D'D 3 en niveles de actividad del FVIII endógeno en el plasma de estas ratas.
Generación de proteína de fusión de albúmina D'D 3 (D'D3-FP):
El casete de expresión para D'D3-FP que consiste en ADNc que codifica los aminoácidos de VWF 1 a 1242, un enlazador de glicina/serina y el ADNc de albúmina humana se prepararon por síntesis de genes personalizados (EurofINS Genomics, Ebersberg, Alemania). A través de los sitios de restricción de flancos (EcoRI, NOTL), el casete de expresión se escindió del vector de clonación suministrado y se insertó en un vector pIRESneo3 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) linealizado con EcoRI y NOTL. La expresión plasmídica resultante contenía secuencias de nucleótidos que codificaban el propéptido VWF, D' y D3 (aminoácidos VWF 1 a 1242 de SEQ ID NO: 4) fusionado a la secuencia de codificación de albúmina a través de una secuencia de codificación de enlazador corto bajo el control del promotor del CMV. La secuencia de nucleótidos de la secuencia de codificación se representa como SEQ ID NO: 1, la secuencia de aminoácidos del D'D3-FP maduro se muestra como SEQ ID NO: 2. La presencia del propéptido D1D2 VWF (741 aminoácidos) durante la expresión es crucial para la dimerización del polipéptido sintetizado.
Se usó un enfoque similar para generar un plásmido de expresión para una proteína de fusión D'D3 al péptido C-terminal de la subunidad de gonadotropina-p coriónica humana, unida a través de un enlace glicina/serina y marcada por medio de 8 histidines en el extremo C de la proteína de fusión. La secuencia de aminoácidos del rD'D3-CTP maduro se muestra como el SEQ ID NO: 7.
El plásmido de expresión descrito anteriormente se cultivó en XL10 Gold (Agilent Technologies) y se purificó mediante protocolos estándar (Qiagen, Hilden, Alemania).
Las células CHO K1 fueron transfectadas usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se cultivaron en medio sin suero (CD-CHO, Invitrogen) en presencia de 500-1000 pg/ml de Geneticin. Se co-transfectó un plásmido de expresión que codificaba PACE/furina (pFu-797), tal como se describe en el documento WO2007/144173, para maximizar la eficacia de la escisión de los propéptidos. Los clones derivados de células únicas se cultivaron y seleccionaron de acuerdo con su rendimiento de expresión de D'D3-FP, cuantificado mediante un inmunoensayo enzimático específico de albúmina (ver más abajo). La línea celular finalmente seleccionada para la fermentación de D'D3-FP se llamó T2050-CL3.
La producción de rD'D3-FP se realizó en biorreactores aplicando un proceso de fermentación en modo de perfusión. El proceso de fermentación para la producción de rD'D3-FP se inició con el deshielo de la línea celular T2050-CL3 seguido de la expansión celular en matraces de agitación y, finalmente, un proceso de fermentación en modo de perfusión usando el biorreactor Sartorius BioStat B-DCU de 5 l y los biorreactores de un solo uso BioStat STR de 50 l. Los BioSeps de 10 L o de 200 L (Applikon), respectivamente, se usaron como dispositivos de retención celular. Los medios de cultivo celular fueron PowerCHO3 (Lonza BESP1204) con 8 mm de L-glutamina y 1 |jm CUSO40 ProCHO5 (Lonza BESP1072) con 10 mM de L-glutamina y 1 jM CuSO4.
Los trenes de semillas en matraces de agitación se realizaron a 37 °C, 7,5 % de CO2 a una velocidad de agitación de 160 rpm.
En el biorreactor de 5 l se inoculó un VCD diana de 2,5 x 105células/ml. Las células se cultivaron en PowerCHO3 con 8 mm de L-glutamina y 1 jm de CuSO4 a una temperatura de 37,0 °C, un pH de 7,00, y a una saturación de oxígeno del 30 %. Se realizó un cambio de temperatura a 34,0 °C (intervalo evaluado 31 °C a 35 °C) después de haber obtenido las cosechas iniciales del ciclo del biorreactor a 37 °C. El pH se controló usando CO2 rociado como ácido y NaHCOacomo base. El caudal de exceso de aire se estableció en 0,5 l/min Se usó un aspersor de anillo como unidad de aspersión. La velocidad de agitación fue de 150 rpm con un impulsor de hoja de doble paso en modo de bajada.
En el biorreactor de 50 l se inoculó un VCD diana de 3,0 x 105células/ml. Las células se cultivaron en medio ProCHO5 con 10 mM de L-glutamina y 1 jM de CuSO4a una temperatura de 37,0 °C, un pH de 6,90, y a una saturación de oxígeno del 30 %. Se realizó un cambio de temperatura a 34,0 °C después de una o dos cosechas iniciales. El control del pH tal como se ha indicado anteriormente, el caudal de exceso de aire se estableció en 2 l/min. Se usó un microaspersor como unidad de aspersión. La velocidad de agitación fue de 90 rpm con un impulsor de hoja de doble paso en modo de bajada.
La perfusión se inició cuando el VCD en el biorreactor era >1,0 x 106 células/ml. La frecuencia de perfusión se estableció en 1,0 volumen/volumen/día. El BioSep funcionó en modo de flujo de retroceso con 5(10) minutos de tiempo de ejecución y 5 segundos de reflujo a una entrada de potencia de 7 (30) W (los números entre paréntesis se refieren al biorreactor de 50 l). El perfusado y el sangrado se filtraron en línea y se recogieron en bolsas durante 48 horas a de 2 a 8 °C. El VCD se controló por medio de sangrado activo usando una sonda de turbidez usando el consumo de glucosa como parámetro con una diana de 2 g/l de glucosa. La cosecha y el sangrado se filtraron en línea, el sistema de cosecha que consiste en un filtro desechable y una bolsa desechable se cambió cada segundo día.
Para preparar el material para los análisis de PK descritos más adelante, las cosechas se purificaron por cromatografía de afinidad y exclusión de tamaño. En resumen, la cosecha libre de células del biorreactor se concentró 30 veces usando un sistema de TFF (por ejemplo Pall Centramate 500 S) con una membrana de 30 kD (p. ej. Pall Centramate OS030T12). Ese concentrado se enriqueció con NaCl y EDTA hasta una concentración final de 0,75 M NaCl y 5 mM EDTA y se cargó durante la noche en una columna CaptureSelect Human Albumin (Life Technologies) que se equilibró previamente con tampón Tris de 20 mM de pH 7,4. Después de lavar la columna con tampón de equilibrio, se eluyó la rD'D3-FP con tampón de elución (20 mM Tris, 2 M MgCI2, pH 7,4). El eluido se concentró 10 veces y se dializó contra 50 mM de Tris, 150 mm de NaCl, pH 7,4 usando filtros Ultra Centrifugal con un corte de 30 kD (p. ej Amicon. UFC903024). Para separar el dímero rD'D3-FP de la porción de monómero que el material se cargó en una columna Superdex 200 pg (Código de GE Healthcare: 17-1069-01), se equilibró previamente con Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 y se combinaron las fracciones pico que contenían el dímero D'D3-FP. El área debajo de la curva para las fracciones pico de dímero y monómero se usó para calcular la relación de dímero a monómero. Los preparados de dímero de dicha proteína de fusión de albúmina D'D 3 se usaron para los experimentos farmacocinéticos en los ejemplos 1.1-1.6. Las preparaciones de dímero de este tipo se denominan D'D3-FP o rD'D3-FP en los siguientes casos, si no se indica lo contrario.
Las variantes EY y EYA de rD'D3-FP se han generado mediante unos pasos de procedimiento equivalentes.
Ejemplo 1.1: Impacto del tratamiento intravenoso con rD'D3-FP en los niveles de FVIII endógeno fisiológico en ratas
Animales
Las ratas LCR:CD (Sprague Dawley) en un intervalo de peso de 200-294 g fueron criadas en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). En nuestras instalaciones, los animales se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C bajo un ciclo de 12 h/12 h de luz-oscuridad. Los animales se alimentaron ad líbitum con dieta estándar de ratón y de rata (Esniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de los animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
Para el grupo de 1 mg/kg el tamaño del grupo fue de n=9, dividido en 3 cohortes, excepto para el control (n=3 animales solamente). El tamaño del grupo de 1 mg/kg fue de n=6, dividido en 2 cohortes. Por lo tanto, siempre se usaron n=3 animales por punto temporal.
Detalles experimentales
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una sola inyección en la vena lateral de la cola de las ratas (n=3 por grupo). La rD'D3-FP se aplicó a un nivel de dosis de 1 mg/kg o 3 mg/kg basado en valores de albúmina humana. Se tomaron muestras de sangre del grupo de 1 mg/kg retroorbitales (muestreo terminal en los días 10 y 14 por punción de la vena cava) en predosis, 6 h y 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10 y 14 días después de la administración (p. a.) después de la inyección intravenosa de un bolo. Se tomaron muestras de sangre del grupo de 3 mg/kg a los 0,083, 3, 8h y 1, 2, 3 y 4 días después de la administración. Se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron en plasma y se almacenaron a aprox. -70 °C para la determinación de la actividad de rD'D3-FP y/o de FVIII.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción mediante un ELISA de albúmina humana. Los niveles en plasma de actividad del FVIII se detectaron mediante un ensayo cromogénico, así como con un ensayo de coagulación en una etapa.
El cálculo de la superficie total de los picos debajo de la curva (AUC) se realizó con GraphPad Prism (GraphPad Software, la Jolla, California, EE.UU.) durante el período de 14 días usando los valores de pretratamiento como línea de base e identificando los picos con una distancia < 30 % de los valores mínimo a máximo.
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó hasta 4 d (3 mg/kg) o 14 d (1 mg/kg) p.a., y los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación (Fig. 1A). Se observó una dependencia lineal de la dosis para las 2 dosis probadas.
La actividad del FVIII se midió como actividad cromogénica y de coagulación en una etapa para el grupo tratado con 1 mg/kg de rD'D3-FP, y ambas pruebas de actividad del FVIII mostraron aumentos transitorios en los niveles del FVIII endógeno en comparación con el control de la solución salina después de la administración de rD'D3-FP (Fig. 1B y 1C), con un pico entre los días 2 (actividad cromogénica) o 1 (actividad de coagulación) al día 5 p.a. De nuevo para ambos ensayos, las concentraciones medias del FVIII apenas superaron los valores máximos de predosis, es decir, 3,1 UI/ml para la actividad cromogénica del FVIII y el 454 % (4,5 UI/ml) para la actividad de coagulación del FVIII. Deberá mencionarse que no se alcanzó el límite superior de normal (ULN) con la dilución de 1:4 usada para la cuantificación de las muestras para ninguno de los animales. De acuerdo con esto, la AUC (evaluado en los días 0 a 14 p. a.) tal como se muestra en la Fig. 1D aumentó con el cromogénico, así como con el ensayo de coagulación a una dosis de 1 mg/kg de rD'D3-FP.
En consonancia con el aumento de la actividad del FVIII, disminuyó el tiempo de trombina parcial activada fisiológica (aPTT) (Fig. 1E), comenzando inmediatamente después de la administración con un pico hasta aproximadamente el día 7 p.a. en comparación con los animales tratados con vehículos. De nuevo, los valores medios variaron dentro del intervalo de predosis, y solo en el día 1 p.a. los valores medios estuvieron por debajo del valor más bajo de predosis de 16,5 s.
Con la exposición dada a la rD'D3-FP durante al menos 14 días, se observó un ligero aumento de la actividad del FVIII. Se administró un valor máximo entre los días 1-5 p.a., que en cualquier caso fue 2x por encima de los animales tratados con solución salina (actividad cromogénica de FVIII: aumento máximo de ~1 UI/ml o 100 % a -3,5 UI/ml = 350 %; actividad de coagulación del FVIII: aumento máximo de -300 % a -700 %, principalmente de -100 % a -500 % - en concordancia con los valores basales más altos en estos animales en comparación con seres humanos) y principalmente dentro de la variación fisiológica. Este ligero aumento de la actividad del FVIII condujo a un acortamiento de aPTT, con valores medios solo ligeramente y poco por debajo del valor mínimo de predosis. Así, en ratas sanas, se observaron leves aumentos en los niveles del FVIII a una dosis de 1 mg/kg de rD'D3-FP, pero estos valores apenas variaron fuera del intervalo fisiológico.
Ejemplo 1,2: Impacto del tratamiento intravenoso con rD'D3-FP en los niveles de FVIII endógeno fisiológico en conejos
Animales
Se alojaron conejos CHB hembra con un intervalo de peso de 2,0-3,2 kg (Bauer, Neuental, Alemania) a razón de uno por jaula en jaulas de alambre-acero en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-23 °C y 50 % de humedad relativa bajo un ciclo de 12 h/12 h de luz-oscuridad. Los animales recibieron agua del grifo ad libitum y se alimentaron con pellets para conejos (Deukanin®, Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Alemania). El cuidado de los animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
Detalles experimentales
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una sola inyección en la vena lateral de la oreja de los conejos (n=3 por grupo). La rD'D3-FP se aplicó a un nivel de dosis de 1, 3 o 10 mg/kg basado en valores de albúmina humana. Se tomaron muestras de sangre de la arteria de la oreja antes de la dosis y a 1, 3 y 6 h, seguido de muestreo diario hasta 10 días después de la administración (p. a.) después de la inyección intravenosa del bolo.
Se anticoagularon con citrato de sodio (3,13 partes de citrato de sodio al 9 % 1 partes de sangre), se procesaron en plasma y se almacenaron a aprox. -70 °C para la determinación de la actividad de rD'D3-FP y/o FVIII.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción mediante un ELISA de albúmina humana. Los niveles plasmáticos de actividad del FVIII se detectaron mediante un ensayo cromogénico, así como un ensayo de coagulación en una etapa. Además, se cuantificó aPTT usando el ensayo de ACTIN® FSL. Se excluyó de la evaluación cualquier muestra coagulada.
El cálculo de la superficie total de los picos por dedebajo de la curva (AUC) se realizó con GraphPad Prism (GraphPad Software, la Jolla, California, EE.UU.) durante el período de 10 días usando los valores de pretratamiento como línea de base e identificando los picos con una distancia < 30 % de los valores mínimo a máximo.
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó hasta 10 días p.a., y los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección de 16 o 31 ng/ml durante todo el período de observación, excepto una caída observada en algunos animales a partir del día 7 o posterior (Fig. 2A). Esta caída repentina de la exposición se observó en animales individuales, comenzando en los días 7-10, y especialmente para las dosis más altas. Una causa potencial podría ser la formación de anticuerpos anti-drogas, en concordancia con la homología inferior de la región D'D3 en conejos y seres humanos en comparación con las otras especies analizadas.
La actividad del FVIII se midió como actividad cromogénica y de coagulación en una etapa, mostrando ambas aumentos en los niveles endógenos en comparación con el control de la solución salina (Fig. 2B y 2C). Los datos sugieren un ligero aumento de los niveles del FVIII endógeno después de la administración de la rD'D3-FP, con un pico entre los días 3-7 p.a. Sin embargo, los valores medios solo aumentaron de manera transitoria el intervalo de los valores de predosis de 2,8 UI/ml en el cromogénico y el 611 % de la norma (6,1 UI/ml) en la prueba de actividad del FVIII de coagulación. De acuerdo con esto, la AUC (evaluada en los días 0 a 10 p.a.) tal como se muestra en la Fig. 2D aumentado: Con el ensayo cromogénico, a partir de la dosis de 3 mg/kg, mientras que el efecto con el ensayo de coagulación fue visible solo con 10 mg/kg. Esto está potencialmente relacionado con la mayor variación de los valores basales en el ensayo de coagulación, que ya eran ligeramente superiores en los grupos tratados.
Aunque la actividad del FVIII mostró leves aumentos, no se observó disminución en el aPTT (Fig. 2E).
Con la exposición dada a la rD'D3-FP durante al menos 6 días, se observó un ligero aumento de la actividad del FVIII, que superó ligeramente los niveles observados en animales tratados con solución salina. Se administró un valor máximo entre los días 3-7 p.c., que fue 2x por encima de los animales tratados con solución salina (actividad cromogénica de FVIII: aumento máximo de ~1 UI/ml o 100 % a -3,5 UI/ml = 350 %; actividad de coagulación del FVIII: aumento máximo de -400 % a -900 % - en concordancia con los valores de referencia más altos en estos animales en comparación con los seres humanos). Estos niveles aumentados de actividad del FVIII solo superaron ligeramente los niveles fisiológicos en conejos en los días 3 a 6 a una dosis de 10 mg/kg, y no redujeron el aPTT. Así, en conejos sanos, solo se observaron cambios leves en los niveles del FVIII.
Ejemplo 1.3: Impacto del tratamiento intravenoso con rD'D3-FP en los niveles del FVIII endógeno fisiológico en monos
Animales
Se alojaron monos Cynomolgus macho, con un intervalo de peso de aproximadamente 4-7 kg y una edad de aproximadamente 5-6 años (obtenidos en Vietnam - la documentación incluye exámenes de salud y cualquier tratamiento administrado antes de su llegada - a Huntingdon Life Sciences, Cambridgeshire, Reino Unido) por parejas en jaulas diseñadas específicamente para alojar primates no humanos en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 15-24 °C y un 40-70 % de humedad relativa, bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h. Los animales recibieron agua del grifo ad libitum y se alimentaron con la dieta para los monos del Viejo Mundo (200 g diarios por animal) más una dieta suplementaria (dos suplementos de galletas, de aproximadamente 25 g cada una, y productos de fruta fresca).
Detalles experimentales
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una sola inyección en la vena safena de los monos (n=3 por grupo). La rD'D3-FP se aplicó a un nivel de dosis de 2,5 mg/kg, basado en los valores de albúmina humana. Se tomaron muestras de sangre de la vena femoral en la predosis y a 5, 30 min, 2, 6, 16, 30, 48, 72, 96, 120, 144, 168 horas p.a. después de la inyección intravenosa del bolo. Se las anticoaguló con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,2 % 9 partes de sangre), se procesaron en plasma y se almacenaron a unos -70 °C para la determinación de la actividad del FVIII y/o de rD'D3-FP.
La exposición de la rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción usando un anticuerpo que capturaba la parte D'D3 de la molécula y usando un anticuerpo de detección para la albúmina. Los niveles en plasma de la actividad cromogénica del FVIII se detectaron mediante el ensayo Chromogenix.
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó mediante un enlace en ELISA a ambos componentes, albúmina y D'3, y las mediciones se realizaron hasta 168 h (7 d) p.a. Los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación (Fig. 3A).
La actividad del FVIII se midió como actividad cromogénica, tal como se muestra en la Fig. 3B. Los niveles endógenos basales variaron de manera relevante, con un intervalo del 83,6-314,8 % de la norma (0,8-3,1 UI/ml = líneas punteadas en la Fig. 3B) y una media del 176,4 % de la norma (1,8 UI/ml, línea discontinua en la Fig. 3B). Al igual que en las ratas y en los conejos, solo se observó un pequeño aumento de los niveles del FVIII endógeno hasta un máximo medio del 258,9 % de la norma, y la variabilidad fue bastante alta. Sin embargo, se detectó un aumento de los niveles del FVIII endógeno de hasta ~ 1 UI/ml o -100 % de la norma (hasta -2,5 UI/ml o -2,5 UI/ml, en concordancia con valores iniciales más altos en estos animales en comparación con los seres humanos) en comparación con los valores individuales de dosis previas, que sin embargo (en promedio) no excedieron los niveles fisiológicos del FVIII de los monos.
Ejemplo 1.4: Impacto del tratamiento intravenoso con rD'D3-FP en los niveles del FVIII endógeno en ratas con el VWF desactivado
Animales
En los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania) se criaron ratas macho y hembra con el VWF desactivado, y con un intervalo de peso de 261-598 g. En nuestras instalaciones, los animales se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C y bajo un ciclo de 12 h/12 h de luz-oscuridad. Los animales se alimentaron ad líbitum con dieta estándar para ratones y ratas (Esniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
El tamaño del grupo de los grupos de 1 y 10 mg/kg fue de n=9, dividido en 3 cohortes, excepto para el control (n=3 animales solamente). Por lo tanto, se usaron n=3 animales por cada punto temporal para todos los vehículos, 1 y 10 mg/kg de rD'D3-FP por puntos de tiempo. Para el grupo de 3 mg/kg, el tamaño del grupo fue de n=4 por punto temporal.
Detalles experimentales
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una única inyección en la vena lateral de la cola, con un volumen total de 2 o 3 ml/kg. La rD'D3-FP se aplicó a niveles de dosis de 1, 3 o 10 mg/kg en función de los valores de albúmina humana. Las muestras de sangre se tomaron retroorbitalmente bajo anestesia a corto plazo en la predosis y a 6, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 336 h (1 y 10 mg/kg) p.a., usando un esquema de muestreo alterno, o de cada animal individual de la vena safena en predosis, y a 1,24, 48, 72, 120, 192, 240 y 336 h. (3 mg/kg) . El perfil PK se tomó de tres cohortes de ratas por grupo (1 y 10 mg/kg) o de animales individuales (3 mg/kg). Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron en plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación de la actividad del FVIII y/o de albúmina.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción con un ensayo ELISA de albúmina humana. Además, se midió la actividad cromogénica y coagulante del FVIII, así como el aPTT (este último solo en grupos tratados con 1 y 10 mg/kg de rD'D3-FP). El cálculo del área debajo de la curva (AUC) se realizó con MATLAB R2017a (Natick, Massachusetts, EE.UU.) usando el procedimiento trapezoidal desde cero hasta el día 10.
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó usando un ELISA frente a la albúmina humana, y las mediciones se realizaron hasta 14 d p.a. Todos los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación hasta el día 14 (Fig. 4A). Se demostró una dependencia lineal de la dosis de 1-10 mg/kg de rD'D3-FP.
La ctividad del FVIII medida como actividad cromogénica, tal como se muestra en la Fig. En 4B, no dio niveles relevantes del FVIII de referencia: 22 de las 23 muestras estaban por debajo del límite de detección (0,005 UI/ml o el 0,5 %) y un animal tenía un valor de 0,007 UI/ml. En las ratas con VWF desactivado (a diferencia de las ratas CD), se alcanzó el límite superior de normal (ULN, 4 UI/ml) con la dilución de 1:4 usada para la cuantificación de las muestras de ambas variedades de ratas: Después de la administración de rD'D3-FP, los niveles aumentaron en 2 días, con la dosis de 10 mg/kg incluso superando el límite superior de cuantificación del ensayo de 4 UI/ml (o 400 %). En ratas con el VWF desactivado, los niveles de actividad del FVIII después de la dosificación de 10 mg/kg - pero no 1 o 3 mg/kg -de rD'D3-FP superaron de manera transitoria los valores medidos en ratas CD sanas. Los valores de actividad cromogénica del FVIII después de la administración de 10 mg/kg de rD'D3-FP también fueron más altos que en las otras especies sanas, es decir, conejos (con dosis de hasta 10 mg/kg de rD'D3-FP) o monos (2,5 mg/kg de rD'D3-FP). El efecto en ratas después de la administración de 10 mg/kg de rD'D3-FP duró hasta 10 días. Incluso a una dosis de 1 mg/kg de rD'D3-FP, se alcanzó una concentración en plasma más alta de 2,36 UI/ml (o 236 %) el día 2, y el efecto se observó débilmente el día 7. De forma similar, con 3 mg/kg de rD'D3-FP, se alcanzó una concentración en plasma del FVIII más alta el día 1 (2,09 UI/ml o 209 %). Con estas 2 dosis más bajas, las concentraciones medias del FVIII estaban justo dentro del intervalo de niveles normales de ratas CD.
Cuando se midió la actividad del FVIII con el ensayo de coagulación tal como se muestra en la Fig. 4C, los niveles del FVIII basal eran mensurables (muestras no diluidas: Media 22,3 %, mínimo 11,7 % y máximo 40,9 % de la norma, n=17; y con un límite de detección del 40 %, 20 muestras permanecieron <40 %). Así, como en ratas CD y en conejos, los valores basales fueron altamente variables. Hay que mencionar que todas las muestras después de la administración de la rD'D3-FP necesitaban un paso de dilución de 1:8, generando así un ULN del 1186,4 % de la norma. Una vez más, después de la administración de rD'D3-FP a una dosis de 10 mg/kg, los niveles del FVIII endógeno aumentaron en 2 días incluso durante el ULN del ensayo, es decir, más altos que en conejos. Este efecto duró hasta 14 días a la dosis alta de 10 mg/kg de rD'D3-FP. Incluso a una dosis de 1 mg/kg, se alcanzó una concentración en plasma máxima del 388,8 % de la norma el día 2, y el efecto se observó todavía el día 7. De manera similar, a una dosis de 3 mg/kg, la concentración en plasma más alta medida en el día 2 fue del 435,2 % de la norma. Similar a la actividad cromogénica FVIII, el intervalo fisiológico de la actividad del FVIII se superó después de la administración de 10 mg/kg y se alcanzó justamente después de la administración de 1 o 3 mg/kg de rD'D3-FP.
Por lo tanto, los datos cromogénicos y los de actividad de coagulación son concordantes, con datos de actividad de coagulación que muestran respuestas ligeramente más intensas, al parecer relacionados con la medición del FVIII basal de rata frente a un patrón del FVIII humano. Se observó un aumento de la actividad del FVIII, que alcanzó niveles observados en ratas CD sanas (1 y 3 mg/kg) o los superó (10 mg/kg). Para la dosis de 10 mg/kg, los valores máximos estaban por encima del límite superior de detección, por lo que no se pudo determinar un aumento del factor de aumento por encima de los intervalos normales.
Esto está en concordancia con los aumentos calculados en AUC (días 0-10), mostrando aumentos después de una dosis de 1, 3 y 10 mg/kg de rD'D3-FP tal como se muestra en la Fig. 4D. Los aumentos después de las dosis con 1 y 3 mg/kg de rD'D3-FP fueron de 10 veces para la actividad cromogénica y de 80 veces para la actividad de coagulación del FVIII en comparación con el tratamiento con el vehículo, mientras que aquellos con 10 mg/kg de rd'D'3-FP alcanzaron 50 veces para los efectos cromogénicos y 430 veces para el AUC0-10d.
En concordancia con estos aumentos en los niveles del FVIII, el tiempo de trombina parcial activada (aPTT) disminuyó de manera relevante desde la predosis patológica o los datos del vehículo hasta un valor medio más bajo de 12,5 s en el grupo de la dosis de 10 mg/kg de rD'D3-FP (Fig. 4E). Esta disminución duró en ambos grupos de dosis medidas (1 y 10 mg/kg) hasta 14 días, y trajo los valores de aPTT a (1 mg/kg de rD'D3-FP) o ligeramente por debajo (10 mg/kg de rD'D3-FP) de un intervalo observado en ratas CD sanas (intervalo 16,5-36,6 s).
Ejemplo 1,5: Impacto del tratamiento intravenoso con rD'D3-FP en los niveles del FVIII endógeno en ratones con VWF desactivado
Animales
Los ratones con VWF desactivado macho y hembra, con un intervalo de peso de 30-45 g, se criaron en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). En nuestras instalaciones, los animales se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C bajo un ciclo de 12 h/12 h de luz-oscuridad. Los animales se alimentaron ad líbitum con dieta estándar para ratones y ratas (Esniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
El tamaño del grupo fue n=12, dividido en 4 cohortes, excepto para el control (n=4 animales). Por lo tanto, se usaron n=3-4 animales por punto temporal.
Detalles experimentales
Los artículos del ensayo (rD'D3-FP o vehículo (solución salina isotónica)) se administraron por vía intravenosa mediante una sola inyección en la vena lateral de la cola a un volumen total de 5 ml/kg. La rD'D3-FP se aplicó a un nivel de dosis de 10 mg/kg basado en los valores de albúmina humana. Las muestras de sangre se tomaron retroorbitalmente bajo anestesia a corto plazo a los 4, 7, 16, 24, 48, 72, 96 y 168 h p.a. usando un esquema de muestreo alterno de los animales a los que se administraba rD'D3-FP, y a las 4 y 168 h p.a. de los animales tratados con vehículos. El perfil PK se tomó de cuatro cohortes de ratones por grupo. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron en plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación de la actividad del FVIII y/o de albúmina.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción mediante un ELISA de albúmina humana. Además, se midieron las actividades cromogénicas y de coagulación del FVIII.
El cálculo de la superficie total de los picos por debajo de la curva (AUC) se realizó con GraphPad Prism (GraphPad Software, la Jolla, California, EE.UU.) durante el período de 7 días identificando los picos con una distancia < 10 % de los valores mínimo a máximo.
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó usando un ELISA frente a la albúmina humana, y las mediciones se realizaron hasta 7 d p.a. Todos los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación (Fig. 5A).
La actividad del FVIII medida como actividad cromogénica no dio niveles del FVIII iniciales relevantes: la totalidad de las 6 muestras medidas de animales tratados con vehículos estaban por debajo del límite de detección (10 mIU/ml o 1 %). Para la comparación, la actividad cromogénica de ratones NMRI sanos varió en alrededor de 96-300 mIU/ml, mediana de 230 mIU/ml, media de 206 mIU/ml (intervalo 10-30 % de la norma, datos no publicados), es decir, menor que la observada en otras especies animales o en seres humanos. De acuerdo con la Fig. 5b, después de la administración de rD'D3-FP, los niveles aumentaron rápidamente en el plazo de 4 horas hasta un valor medio de 138 UM/ml (14 %), y aumentaron aún más, alcanzando un máximo de 48 h p.A., con una media de 421 UM/ml (42 %) a 72 h p.a. (429 UI/ml o 43 %). En el último punto temporal a las 168 h (7 d) p.a., se midieron 194 UM/ml (20 %). Con esto, la actividad cromogénica del FVIII después del tratamiento con 10 mg/kg de rD'D3-FP superó ligeramente los niveles fisiológicos del FVIII en plasma medidos en ratones NMRI, y los efectos fueron comparables a los de ratas con el VWF desactivado.
Cuando se midió la actividad del FVIII con el ensayo de coagulación, se cuantificaron los niveles iniciales del FVIII (animales tratados con vehículos: media 31,1, mínimo 25,8 y máximo 41,8 % de la norma, n=8). Por lo tanto, lo mismo que en las otras especies, los valores de referencia fueron muy variables. Una vez más, después de la administración del rD'D3-FP, los niveles aumentaron rápidamente tal como se muestra en la Fig. 5C, y solo se pudo medir en una dilución de 1:60 (mientras que los animales tratados con vehículos, usados para la cuantificación de los valores de referencia, se midieron con una dilución de 1:10). En el primer punto de muestreo de 4 h p.a., los valores medios ya estaban en el 137 % de la norma y aumentaron hasta 16 h p.a., con una media del 218 % de la norma. La exposición máxima se alcanzó a las 72 h p.a. con una media del 304 % de la norma. En el último punto temporal a las 168 h (7 d) p.a., se midió todavía el 254 % de la norma.
Por lo tanto, los datos cromogénicos y de actividad de la coagulación estaban generalmente en concordancia con los datos de actividad de la coagulación que mostraban respuestas más intensas, al parecer relacionados con la medición del FVIII de ratón (en animales con el VWF desactivado) frente a un patrón del FVIII humano. Se observó un aumento de la actividad del FVIII, que superó <2 veces los niveles observados en ratones NMRI sanos (actividad cromogénica del FVIII: aumento máximo de 0,1 UI/ml = -10 % a -0,4 UI/ml = 40 % - en concordancia con valores basales inferiores en estos animales en comparación con los seres humanos; actividad de coagulación del FVIII: aumento máximo hasta -300 % (no se ha determinado el intervalo de ratones NMRI). Esto está en concordancia con los aumentos calculados en AUC (día 0-7), mostrando grandes aumentos después de una dosis de 10 mg/kg de rD'D3-FP en comparación con los animales tratados con vehículos, tal como se muestra en la Fig. 5D.
Ejemplo 1,6: Impacto del tratamiento intravenoso con diferentes polipéptidos de la rD'D3 en los niveles del FVIII endogeno en ratas con el VWF desactivado
Animales
Ratas macho y hembra con el VWF desactivado, con un intervalo de peso de 261-559 g, fueron criadas en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). En nuestras instalaciones, los animales se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C y bajo un ciclo de 12 h/12 h de luz-oscuridad. Los animales se alimentaron ad líbitum con dieta estándar para ratones y ratas (Esniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
El tamaño del grupo era n=4 para cada grupo.
Detalles experimentales
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una única inyección en la vena lateral de la cola a un volumen total de 3 ml/kg. La rD'D3-FP se aplicó a un nivel de dosis de 3 mg/kg basado en los valores de albúmina humana. Se tomaron muestras de sangre de la vena safena antes de la administración y a 1, 24, 48, 72, 120, 192, 240 y 336 h p.a. de los animales a los que se administró rD'D3-FP, y antes de la administración y a 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240 y 336 h de los animales tratados con rD'D3-CTP. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), se procesaron en plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación de la actividad del FVIII y/o de albúmina.
La exposición a la rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción mediante un ELISA de albúmina humana. La rD'D3-CTP se midió mediante una técnica ELISA usando anticuerpos frente a la D'D3 antihumana. Además, se midieron las actividades cromogénicas y de coagulación del FVIII.
El cálculo del área debajo de la curva (AUC) desde 0 hasta el día 10 se realizó con MATLAB R2017a (Mathworks, Natick, Massachusetts, Ee .UU.) usando el procedimiento trapezoidal.
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó usando un ELISA frente a la albúmina humana, y las mediciones se realizaron hasta 14 d p.a. Todos los datos medidos de las variantes del rD'D3-FP estaban muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación, mientras que la rD'D'3-CTP alcanzó los valores de referencia el día 14 (Fig. 6A). Se observó una ligera ventaja del WT de la rD'D3-FP en la recuperación en comparación con las variantes EY y EYA, Pero no se observó ninguna diferencia relevante con respecto al aclaramiento. La rD'D3-CTP se cuantificó usando un ELISA frente a la rD'D3 humana y las mediciones estuvieron muy por encima del límite de detección hasta el d 10 p.a. incluido (Fig. 6A).
La actividad del FVIII medida como actividad cromogénica no dio niveles relevantes del FVIII iniciales: la totalidad de las 18 muestras medidas, precias a la administración, estuvieron por debajo del límite de detección (20 mIU/ml o 2 %). De acuerdo con la Fig. 6B, después de la administración de las variantes de la rD'D3-FP, los niveles aumentaron ya a 1h p.a. (WT 197 ± 20 mIU/ml o 5 %, EY 171 ± 84 mIU/ml o 17 %, EYA 203 ± 117 mIU/ml o 20 % y CTP 110 ± 102 mIU/ml o 11 %) y aún más en los siguientes puntos de tiempo medidos. Se alcanzó un máximo entre el día 1 y el día 8 con medias de 2088 UM/ml (209 %) para WT, de 2889 UM/ml (289 %) para EY, de 1044 UM/ml (104 %) para EYA, y de 2214 UM/ml (221 %) para CTP. La última actividad del FVIII mensurable se observó para la w T en el día 10 (237 ± 225 UM/ml (24 %)), para EY en el día 10 (512 ± 603 UM/ml (51 %)), para EYA en el día 14 (último punto temporal medido, 179 ± 107 UM/ml (18 %), Y para CTP al día 14 (22 ± 4 UM/ml (2 %)). Esto llevó a la mayor AUC0-10d observada después de la administración i.v. para la variante 3-CTP de la rd'D (tab. 2, Fig. 6D).
Cuando se midió la actividad del FVIII con el ensayo de coagulación, los niveles iniciales del FVIII tampoco fueron mensurables (n=20 animales tratados predosis, límite de detección del 40 %). Como se muestra en la Fig. 6c, una vez más, después de la administración del rD'D3-HLP, los niveles aumentaron ya a 1h p.a. (WT 47 ± 4 %, EY 41 ± 1 %, EYA 45 ± 5 % y CTP 40 ± 1 %) y aún más en los siguientes tiempos medidos. Se alcanzó un máximo entre el día 1 y el día 8 con medias del 435 % para WT, del 453 % para el valor de EY, del 779 % para el valor de EYA, y del 358 % para el valor de CTP. La última actividad del FVIII mensurable se observó para la WT en el día 10 (85 ± 39 %), para lEY en el día 10 (130 ± 84 %), para EYA en el día 14 (último punto temporal medido, 46 ± 7 %) y para CTP en el día 7 (57 ± 29 %). El mayor AUC0-10d observado se alcanzó después de la administración por vía intravenosa con EYA de rD'D3-FPEYA (Tab. 2, Fig. 6D).
Por lo tanto, los datos cromogénicos y de actividad de coagulación estaban generalmente en concordancia de nuevo con los datos de actividad de coagulación, mostrando respuestas más intensas. Se observó un aumento de la actividad del FVIII hasta aproximadamente 1.5-2 UI/ml (150-200 %) para la actividad cromogénica del FVIII y hasta -300-700 % para la actividad de coagulación, y por lo tanto ligeramente por debajo de los valores en ratas CD para la actividad cromogénica del FVIII y ligeramente por encima de los valores en ratas CD para la actividad de coagulación del FVIII (ver Fig. 4B y Fig. 4C en el ejemplo 1,4) - en concordancia con los valores de referencia de estos animales que difieren de los de los seres humanos.
Tabla 2: AUC0-10d de la actividad de rD'D3 y FVIII después de la administración de las variantes de rD'D3 en ratas con el VWF desactivado
Figure imgf000037_0001
Por lo tanto, los datos cromogénicos y de actividad de coagulación estban generalmente en concordancia, con los datos de actividad de coagulación mostrando concentraciones absolutas del FVIII más altas relacionadas con valores absolutos de AUC 0-10d más altos. Hay que mencionar que los efectos sobre la actividad del FVIII fueron más intensos después de la administración de la rD'D3-CTP en el cromogénico en comparación con el ensayo de coagulación. Mientras que la totalidad de las 4 variantes de la rD'D3-FP mostraron una exposición comparable, la variante de la rD'D3-FP EYA con la afinidad de unión a FVIII más alta mostró efectos más largos y más altos sobre el FVIII endógeno.
Ejemplo 1.7: Disponibilidad subcutánea de rD'D3-FP en ratones con el FVIII desactivado, con el VWF desactivado y NMRI, y ratas CD y con VWF desactivado y cerdos , y su impacto en los niveles del FVIII endógeno en ratas con VWF desactivado y cerdos
Animales
Ratones con FVIII desactivado
Los ratones machos y hembras con el FVIII desactivado, con un intervalo de peso de 20-30 g, fueron criados en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). El tamaño del grupo fue n=12, dividido en 4 cohortes. Por lo tanto, se usaron n=3 animales por punto temporal.
Ratones con VWF desactivado
Los ratones machos y hembras con el VWF desactivado, con un intervalo de peso de 25-40 g, fueron criados en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). El tamaño del grupo fue n=12, dividido en 4 cohortes. Por lo tanto, se usaron n=3 animales por punto temporal.
Ratones NMRI
Los ratones NMRI hembra, con un intervalo de peso de 27-34 g, fueron criadas en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). El tamaño del grupo fue n=12, dividido en 4 cohortes. Por lo tanto, se usaron n=3 animales por punto temporal.
Ratas CD
Las ratas hembra Crl:CD (Sprague Dawley), con un intervalo de peso de 250-302 g, fueron criadas en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). El tamaño del grupo fue n=6, dividido en 2 cohortes. Por lo tanto, se usaron n=3 animales por punto temporal.
Ratas Con VWF desactivado
Las ratas machos y hembras con el VWF desactivado, con un intervalo de peso de 222-559 g, fueron criadas en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). El tamaño del grupo era n=4.
En nuestras instalaciones, ratones y ratas se mantuvieron en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 h. Los animales se alimentaron ad líbitum con dieta estándar de ratón y rata (Esniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea. Cerdos
Se eligieron cerdos ya que presentan un buen modelo de biodisponibilidad subcutánea con respecto a su predictividad para los seres humanos. El tamaño del grupo fue de 2 (intravenoso) o 3 (subcutáneo).
Se criaron cerdos macho, con un intervalo de peso de 23-27 kg, en Schlosser (Schwalmtal, Alemania). En nuestras instalaciones, los animales fueron mantenidos en un establo sobre paja a 18-21 °C. Los animales se alimentaron con grano troceado. El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
Detalles experimentales
Ratones con el FVIII desactivado, con el VWF desactivado y NMRI
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una sola inyección en la vena lateral de la cola a un volumen total de 5 ml/kg, o s.c. mediante una sola inyección en el cuello a un volumen total de 5 ml/kg. Las muestras de sangre se tomaron retroorbitalmente bajo anestesia a corto plazo usando un esquema de muestreo alterno a las 3, 8, 16, 24, 32, 48, 72 y 96 h p.a., e i.v. adicionalmente a 5 min p.a.
Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), procesadas a plasma y almacenadas a -70 °C.
La exposición a la rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la proteína mediante un ELISA de albúmina humana.
Ratas Con VWF desactivado
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una sola inyección en la vena lateral de la cola a un volumen total de 3 ml/kg o s.c. mediante una sola inyección en un lado del flanco a un volumen total de 2 ml/kg. Se tomaron muestras de sangre del grupo de s.c. de la vena safena antes de la administración y a las 4, 24, 48, 72, 96 y 168 h p.a. de cada animal, y del grupo de i.v. antes de la administración y a las 1,24, 48, 72, 120, 192, 240 y 336 h. .
Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), procesadas a plasma y almacenadas a -70 °C.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la proteína mediante un ELISA de albúmina humana. Además, se midieron las actividades cromogénicas del FVIII.
Ratas CD
Los artículos de ensayo se administraron por vía intravenosa mediante una sola inyección en la vena lateral de la cola a un volumen total de 3 ml/kg o s.c. mediante una sola inyección en un lado del flanco a un volumen total de 3 ml/kg. Las muestras de sangre se tomaron retroorbitalmente bajo anestesia a corto plazo usando un esquema de muestreo alterno a las 3, 8, 24, 48, 72 y 96 h p.a., e i.v. adicionalmente a las 5 min p.a.
Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (2 partes de citrato de sodio 3,13 % 8 partes de sangre), procesadas a plasma y almacenadas a -70 °C.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la proteína mediante un ELISA de albúmina humana.
Cerdos
Los artículos de ensayo se administraron s.c. en los flancos o i.v. en la vena de la oreja mediante una sola inyección, a un volumen total de 0,211 a 0,751 ml/kg.
Se tomaron muestras de sangre de la oreja o de la vena safena. Los puntos de tiempo en los grupos de 10 mg/kg de rD'D3-FP s.c. fueron antes de la administración y a 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h p.a. , y en el grupo de i. v. antes de la administración y a 5 min, 3, 12, 24, 32, 48, 72, 96, 120, 144 y 168 h p.a. Los puntos de tiempo en los grupos de 3 mg/kg de rD'D3-FP s.c. fueron antes de la administración y a 1, 3, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 y 264 h.
El perfil PK se tomó de animales individuales. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (1 parte de citrato de sodio al 3,13 % 9 partes de sangre), procesadas a plasma y almacenadas a -70 °C para la determinación del antígeno FVIII y la albúmina.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la proteína mediante un ELISA de albúmina humana. Además, se midieron las actividades cromogénicas del FVIII.
General
La rD'D3-FP se aplicó a un nivel de dosis de 3, 3,5 o 10 mg/kg basado en los valores de albúmina humana. En ratones, en algunos grupos, rVIII-SingleChain se administró conjuntamente a una dosis de 100 o 200 UI/kg. El perfil PK se tomó de cuatro cohortes de ratones o 2 cohortes de ratas por grupo, respectivamente, o de cerdos individuales.
El cálculo del área debajo de la curva (AUC) de 0 a infinito se realizó con MATLAB R2017a (Natick, Massachusetts, EE.UU.).
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó usando un ELISA frente a la albúmina humana, y las mediciones se realizaron hasta 4 d p.a. en ratones y 14 días p.a. en ratas y cerdos. Todos los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación (Fig. 7A).
La Fig. 7A-1 muestra perfiles PK de rD'D3-FP en diferentes variedades de ratones, sin impacto visual de la administración conjunta de rFVIII. Las curvas en las tres variedades fueron casi comparables, sin embargo en ratones NMRI, la exposición disminuyó más rápidamente que en animales con FVIII desactivado o con VWF desactivado.
AUCwnfy las biodisponibilidades resultantes de rD'D3-FP se resumen en la Tabla 3. Se demostró en ratones con el FVIII desactivado que la administración de rD'D3-FP con o sin rVIII-SingleChain no tuvo ningún impacto en el AUC0-inf de rD'D3-FP (con FVIII establecido en 100 % -> sin FVIII se calcula al 89 %). Por lo tanto, no hubo efecto relevante de rVIII-SingleChain en el perfil de 3er-FP PK en este experimento. La comparación de AUC0-inf en las diferentes variedades no sugiere ninguna diferencia importante entre las tres variedades, con una clasificación desde el FVIII desactivado (1590 h*|jg/ml), pasando por los animales con el VWF desactivado (1197 h*|jg/ml) hasta la AUCo-inf ligeramente inferior en los animales de RMN (940 h*jg/ml).
Los perfiles PK en ratas se muestran en la Fig. 7A-2, lo que sugiere un aclaramiento comparable del rD'D3-FP después de la administración s.c. e i.v en ratas CD y con VWF desactivado. Sin embargo, la disponibilidad de s.c. fue menor en las ratas con el VWF desactivado en comparación con las ratas CD. Fig. 7A-3 muestra perfiles PK en cerdos, sugiriendo una exposición comparable a las mismas dosis después de los 2 días más tarde, y ningún impacto de rVIII-SingleChain en el perfil PK de rD'D3-FP.
La tabla 4 resume las biodisponibilidades de la rD'D3-FP sobre las especies. En ratas, la evaluación de AUC0-inf (ratas CD) y AUC0-inf (ratas con el VWF desactivado) para el cálculo de la biodisponibilidad mostró valores del 40 % y del 11 %, respectivamente, es decir, se observó una mejor biodisponibilidad en ratas FVIII competentes en comparación con los animales con el VWF desactivado. Esto contrasta con las observaciones en la evaluación AUC0-inf de ratones, sugiriendo datos comparables de los animales con el VWF desactivado y NMRI. Si los ratones con VWF desactivado tienen mejor AUC0-inf en comparación con los ratones NMRI. En los cerdos, el AUC0-inf de la rD'D3-FP osciló entre el 59 y el 187 %. En conjunto, en la comparación entre las especies, el cerdo mostró la mayor biodisponibilidad de la tercera parte de la rD'D3-FP.
Tabla 3: AUC0-infde rD'D3-FP cuantificado como albúmina en diferentes variedades de ratones
Figure imgf000040_0001
Tabla 4: Biodisponibilidades de rD'D3-FP cuantificadas como albúmina en diferentes especies
Figure imgf000040_0002
La actividad cromogénica endógena del FVIII aumentó no solo después de la administración intravenosa (ver antes, ejemplos 1,1-1,5) sino también después de la administración subcutánea de la rD'D-FP (Fig. 7B).
La Fig. 7B-1 muestra que en ratas, los valores aumentaron con un máximo al día 1 (3 mg/kg i.v.) o al día 4 (10 mg/kg s.c.). Esto calcula una reducción en el efecto sobre FVIII AUCü-inf después de s.c. en comparación con la administración de i.v rD'D3-FP (independiente de la dosis de rD'D3-FP) al 17 % (cromogénico) y al 14 % (coagulación) de la actividad.
Este aumento ligero, pero sin embargo relevante, en la actividad del FVIII endógeno se observó para el tratamiento por vía intravenosa así como por vía subcutánea (principalmente entre -0,5-1 Ul/ml o 50-100 %), y por lo tanto, se situó ligeramente por debajo de los niveles alcanzados en ratas CD (comparar Fig. 4B).
En cerdos (Fig. 7B-2), se observó un aumento de la actividad cromogénica del FVIII a aproximadamente 1 día después de la administración s.c. de rD'D3-FP. Este efecto duró todo el período de 11 días. Este aumento se multiplicó como máximo 2 veces por encima de los valores de antes de la administración (aumento máximo de ~5 UI/ml o del 500 % a ~10 UI/ml = 1000 % - en concordancia con valores de referencia más altos en estos animales en comparación con los seres humanos, es decir, en concordancia con los pequeños efectos después de la administración de compuestos intravenosos a los animales FVIII competentes.
Por lo tanto, estos datos sugieren que el tratamiento con rD'D3-FP puede realizarse no solo usando administración i.v. sino también usando administración de compuestos s.c.
Ejemplo 1.8: Impacto de múltiples dosis intravenosas de rD'D3-FP en los niveles del FVIII endógeno en ratas con el VWF desactivado
Animales
Ratas macho y hembra con el VWF desactivado, con un intervalo de peso de 281-504 g, fueron criadas en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). El tamaño del grupo fue n=11, dividido en 4 cohortes. Por lo tanto, se usaron n=2-3 animales por punto temporal.
Enn nuestras instlaciones, los animales fueron mantenidos en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C bajo un ciclo de 12 h/12 h luz-oscuridad. Los animales se alimentaron ad líbitum con dieta estándar de ratón y rata (Esniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
Detalles experimentales
Los artículos de prueba se administraron por vía intravenosa mediante inyecciones múltiples en la vena lateral de la cola a un volumen total de 3 ml/kg el día 0 (cohorte 1), el día 0+7 (cohorte 2), 0+7+14+21 (cohorte 3) o el día 0+7+14 (cohorte 4). Se tomaron dos muestras de sangre por animal en forma retroorbitaria bajo anestesia a corto plazo en los puntos de tiempo específicos de la cohorte (cohorte 1: Predosis 7 días p.a., cohorte 2: 3 10 días p.a., cohorte 3: 17 24 días p.a., cohorte 4: 14 21 días p. a.). La rD'D3-FP se aplicó a un nivel de dosis de 3 mg/kg basado en los valores de albúmina humana. El perfil de PK se tomó de cuatro cohortes de ratas con el VWF desactivado. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (2 partes de citrato de sodio 3,13 % 8 partes de sangre), se procesaron en plasma y se almacenaron a -70 °C para la determinación de albúmina.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción mediante un ELISA de albúmina humana. Además, se midió la actividad cromogénica y coagulante del FVIII y el aPTT usando Pathromtin® SL.
Resultados
La rD'D3-FP se cuantificó usando un ELISA frente a la albúmina humana, y las mediciones se realizaron hasta el día 24 d. Todos los datos medidos estuvieron muy por encima del límite de detección durante todo el período de observación (Fig. 8A). Con las 4 administraciones, se observó una ligera acumulación en los niveles pico (al 151 %) así como en los mínimos (al 128 %).
Los niveles de actividad del FVIII cromogénico (Fig. 8b) se incrementaron partiendo de valores inferiores al límite de detección después de la 2a administración en el intervalo observado en ratas CD (aumento máximo a -1,8 UI/ml = 180 %). La actividad de coagulación FVIII (Fig. 8C) estaba incluso ligeramente por encima de los datos medidos en ratas CD (aumento máximo a -800 % - en concordancia con valores de referencia más altos en estos animales en comparación con los seres humanos). Sin embargo, no se observó acumulación en los dos ensayos de actividad del FVIII durante un período de 4 semanas.
En concordancia con esto, aPTT disminuyó desde valores por encima de lo normal de ratas CD a valores en el intervalo inferior del intervalo normal de ratas CD (Fig. 8D).
En conjunto, estos datos sugieren que se pueden realizar múltiples tratamientos con rD'D3-FP con una ligera acumulación de rD'D3-FP, pero sin acumulación de niveles del FVIII y con normalización de aPTT.
Ejemplo 1.9: Investigación de la RD'D3-FP administrada por vía subcutánea y la rVIII-SingleChain administrada por vía intravenosa en un modelo de hemofilia A, es decir, en ratas con el FVIII desactivado.
Animales
Las ratas macho y hembra con FVIII desactivado, con un intervalo de peso de 220-487 g, fueron criadas en los Laboratorios Charles River (Sulzfeld, Alemania). El tamaño del grupo fue n=6, dividido en 2 cohortes. Por lo tanto, se usaron n=3 animales por punto temporal.
En nuestras instalaciones, los animales fueron mantenidos en condiciones de alojamiento estándar, es decir, a 20-24 °C bajo un ciclo de 12 h/12 h luz-oscuridad. Los animales se alimentaron ad líbitum con dieta estándar de ratón y rata (Esniff-Versuchsdiaten, Soest, Alemania). El agua del grifo se suministraba ad libitum. La cría de animales y los procedimientos de estudio se ajustaron a la ley alemana de bienestar animal y a las normas de la Unión Europea.
Detalles experimentales
Los artículos de la prueba se administraron s.c. en el cuello (rD'D3-FP) o i.v. (RVIII-SingleChain) en la vena lateral de la cola de ratas con el FVIII desactivado por una sola inyección, a un volumen total de 3 ml/kg. Se aplicó rD'D3-FP s.c. en una dosis de 3 mg/kg basada en valores de albúmina humana 10 minutos antes de rVIII-SingleChain. Los animales fueron tratados por vía intravenosa con rVIII-SingleChain a una dosis de 200 Ul/kg de actividad cromogénica FVIII. RVIII-SingleChain se reconstituyó con agua para inyección y la rD'D3-FP se descongeló en un baño de agua. En todos los casos, se administró una dosis de 3 ml/kg, con tampón de dilución para FVIII (rVIII-SingleChain) o solución salina isotónica (rD'D3-FP) para la disolución de los compuestos según sea necesario.
Las muestras de sangre se tomaron por canulación de la vena de la cola. Los puntos de tiempo en los grupos fueron 0,083, 1,4, 8, 16, 24, 32, 48 y 72 h. El perfil PK se tomó de dos cohortes de ratas por grupo, y n=3 por punto temporal. Las muestras de sangre se anticoagularon con citrato de sodio (2 partes de citrato de sodio al 3,13 % 8 partes de sangre), procesadas a plasma y almacenadas a -70 °C para la determinación de la actividad del FVIII y el antígeno del FVIII.
La exposición a rD'D3-FP se determinó mediante la medición de la parte de albúmina de la construcción mediante un ELISA de albúmina humana. Además, se midió la actividad cromogénica del FVIII y el antígeno FVIII humano.
La estimación de la concentración máxima (Cmax), el área debajo de la curva de concentración a lo largo del tiempo de t=0 a t=~ (AUCü-inf), el tiempo medio de residencia (MRT), el aclaramiento (CL) y la vida media terminal (t-io) se realizó mediante modelización bicompartimental en los cálculos de i.v. y modelización bicompartimental en los cálculos de reabsorción. Para la estimación de los parámetros, se aplicó una función de coste de mínimos cuadrados ponderados. La biodisponibilidad se calculó como el porcentaje del AUCü-inf después de la administración s.c. en comparación con la administración i.v.. El tiempo hasta los niveles del 1, 5 y 10 % se calculó estableciendo la ecuación del modelo igual a 0,01, 0,05 o 0,1 UI/ml y resolviéndola para el tiempo.
Resultados
Evaluación de los datos D'D3
La rD'D3-FP se absorbió después de la administración s.c. La rD'D3-FP se pudo cuantificar durante todo el período de observación de 72 h; es decir, se mantuvo por encima del límite de detección de 27 ng/ml (Fig. 9A).
Cmax, AUC0-inf, clearance, MRT y t-i^se dan en la Tabla 5 y confirman la exposición relevante de la rD'D3-FP a lo largo del tiempo después de la administración subcutánea.
Tabla 5: Parámetros farmacocinéticos de la rD'D3-FP después de la administración s.c. de la rD'D3-FP seguida de la administración i.v. de rVIII-Sin leChain en ratas con el FVIII desactivado
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Evaluación de los datos del FVIII
El perfil del FVIII PK de rVIII-SingleChain después de la administración previa subcutánea de rD'D3-FP se prolongó en comparación con rVIII-SingleChain administrado solo para la actividad cromogénica del FVIII (Fig. 9B) así como el antígeno FVIII (Fig. 9C).
La actividad cromogénica del FVIII (Fig. 9B) estuvo muy por encima del límite de detección hasta el último punto temporal de 72 h p.a. cuando se administró previamente la rD'D3-FP, mientras que alcanzó el punto de referencia a las 72 h cuando se administró la FVIII sola. Visualmente, la exposición mejoró con la administración previa subcutánea de la rD'D3-FP a partir de las 32 h p.a.
Se hicieron observaciones similares para FVIII:AG (Fig. 9C), pero la exposición ya mejoró con la administración previa subcutánea de rD'D3-FP a partir de las 24 h p.a., y el valor basal ya se alcanzó a las 48 h p.a., con el FVIII administrado solo, probablemente relacionada con una menor variabilidad de las concentraciones medidas.
La dosificación previa de la rD'D3-FP mejoró el aclaramiento, MRT y t-i/2 para la actividad cromogénica de FVIII y FVIII.AG.
La AUC0-inf mejoró en un 41 % para la actividad cromogénica del FVIII (tabla 6) y en un 49 % para el FVIII:AG (tabla 8). Cmax mejoró un 30 % para la actividad cromogénica del FVIII y un 23 % para FVIII:AG (Tabla 6 y 8, respectivamente).
Se calculó el tiempo hasta el punto mínimo para ambos esquemas de administración con y sin rD'D3-FP para la actividad cromogénica (Tabla 7) y para FVIII:AG (Tabla 9). En cuanto a AUC0-inf, la dosificación previa de rD'D3-FP mostró también niveles de mínimo favorables para la actividad cromogénica, así como el antígeno FVIII. La prolongación fue del 6 % y del 18 % para el mínimo del 1 %, del 9 % y del 19 % para el mínimo del 5 % y del 8 % y del 18 % para el mínimo del 10 % para actividad cromogénica FVIII y FVIII:AG, respectivamente.
Tabla 6: Parámetros farmacocinéticos de la actividad cromogénica del FVIII después de la administración de rD'D3-FP s.c. se uida de la administración de i.v. de rVIII-Sin leChain en ratas con el FVIII desactivado
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Tabla 7: Tiempo hasta los niveles de la cadena rVIII-SingleChain (actividad cromogénica FVIII) después de la administración del subsuelo en ratas con el FVIII desactivado
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Tabla 8: Parámetros farmacocinéticos del antígeno FVIII después de la administración de rD'D3-FP s.c. seguido de la administración de i.v. de rVIII-Sin leChain en ratas con el FVIII desactivado
Figure imgf000043_0003
Tabla 9: Tiempo hasta los niveles de rVIII-SingleChain(antígeno FVIII) después de la administración s.c. en ratas con el FVIII desactivado
Figure imgf000043_0004
Conclusión de los experimentos con animales in vivo
Estos estudios demuestran que la administración por vía intravenosa o s.c. de la rD'D3-FP aumenta ligeramente los niveles del FVIII endógeno en ratas, conejos, cerdos y monos sanos, incluso con los niveles ya fisiológicos del FVIII en estos animales. Los valores de dosis previa apenas se excedieron, por lo que solo se observó un acortamiento leve o nulo del aPTT.
En los animales que presentan un tipo de hemofilia A (ratas con el VWF desactivado o ratones con el VWF desactivado, que tienen niveles de actividad del FVIII notablemente reducidos), este aumento de la actividad del FVIII endógeno es más intenso que en los animales sanos, con aumentos de los niveles absolutos del FVIII a niveles aproximadamente iguales o superiores a los de ratones y ratas sanos. En estos animales, los niveles fisiológicos se restablecieron (niveles dentro del extremo superior de la variabilidad fisiológica, por ejemplo, hasta el 200-300 % de la actividad cromogénica estándar FVIII después de la administración de 1 y 3 mg/kg de rD'D3-FP en ratas con el VWF desactivado - en concordancia con valores basales más altos en estos animales en comparación con los seres humanos) o se excedió el intervalo fisiológico (por ejemplo, >400 % de la actividad del FVIII cromogénica estándar después de la administración de 10 mg/kg de rD'D3-FP en ratas con el VWF desactivado). En el ratón con VWF desactivado como ejemplo con valores basales más bajos con respecto a la actividad del FVIII cromogénica en comparación con los seres humanos, se alcanzó el -40 % de la norma a una dosis de 10 mg/kg de rD'D3-FP, es decir, un aumento <2 veces por encima de los niveles observados en ratones NMRI sanos. Esto sugiere que en individuos con niveles inicialmente reducidos del FVIII, es decir, un fenotipo hemofilia A, un efecto elevante del FVIII puede ser potencialmente más fuerte que en sujetos sanos. Efectos similares se lograron mediante la administración conjunta de la variante EYA o EY de la rD'D3-FP, o mediante la 3-CTP de la rd'.
Múltiples dosis de rD'D3-FP en ratas con el VWF desactivado dieron lugar a una ligera acumulación de rD'D3-FP con el tiempo, mientras que la actividad del FVIII alcanzó niveles fisiológicos (actividad cromogénica) o ligeramente los excedió (actividad de coagulación) y la ATTP se restableció a valores normales.
Sin pretender quedar limitados a la teoría, esto puede explicarse por una regulación fisiológica negativa de la síntesis del FVIII en animales sanos con niveles del FVIII fisiológicos en comparación con las ratas y ratones con el VWF desactivado. Por lo tanto, se puede especular que el efecto sobre el FVIII en los pacientes de hemofilia A humana debe ser comparable al observado en ratas y ratones con el VWF desactivado, y por lo tanto debe alcanzar niveles fisiológicos duraderos. Estos efectos se han demostrado después de la administración de i.v. y s.c. Otras biodisponibilidades de la rD'D3-FP oscilaron entre el 11-187 %, dependiendo de la especie y del genotipo, con valores más altos alcanzados en cerdos, conocidos como un modelo bien predictivo para la biodisponibilidad de s.c. Por lo tanto, estos datos están sugiriendo que el tratamiento del s.c. también es factible.
Ejemplo 2: Determinación de la afinidad del FVIII con el dímero y el monómero de fragmentos del VWF
Se expresó un fragmento del VWF (1-1242) de fusión de albúmina (D'D3-FP) en un biorreactor; tras la purificación descrita anteriormente y el aislamiento del monómero y del dímero, se evaluó la afinidad del FVIII con estos preparados por medio resonancia en plasmones de superficie con un instrumento Biacore (T200, GE Healthcare).
Se acopló covalentemente un anticuerpo anti-albúmina (MA1-20124, Thermo Scientific) se acopló a través de su extremo N-terminal a un chip CM 3 activado por NHS (N-hidroxisuccinimida) y EDC (hidrocloruro de etanolamina), ambos contenidos en el kit de acoplamiento de aminas (BR1000-50) de GE Healthcare. Para la inmovilización, se diluyeron 3 pg/ml del anticuerpo en tampón de acetato de sodio (10 mM, pH 5,0) y la solución del anticuerpo se hizo pasar sobre el chip durante 7 min. a una velocidad de flujo de 10 pL/min. Tras el procedimiento de inmovilización, los filamentos de dextrano no acoplados se saturaron mediante solución de etanolamina fluyendo (1 M, pH 8,3) sobre el chip durante 5 min (a una velocidad de flujo de 10 pL/min). El objetivo de saturar la celda de flujo era minimizar la unión inespecífica de los analitos al chip. Se estableció una celda de flujo de referencia mediante la saturación de una celda de flujo vacía con etanolamina mediante el mismo procedimiento anterior.
Las proteínas D'3-FP diméricas y monoméricas, respectivamente, fueron inmovilizadas al anticuerpo anti-albúmina acoplado covalentemente por medio de un flujo de las proteínas D'3-FP (5 pg/ml) sobre el chip durante 3 min (flujo de 10 pL/min).
Para crear curvas de unión para FVIII, cada preparación de proteína D'D3-FP se diluyó en tampón (HBS-P+: 0,1 M HEPES, 1,5 M NaCl y 0,5 % v/v surfactante P20, pH 7,4; código de producto BR100671, GE Healthcare) a concentraciones de 0,25 Nm, 0,5 Nm, 1 Nm, 3Nm y 4 Nm. Mediante la realización de una cinética de ciclo único, las muestras con concentraciones ascendentes de cada dilución se hicieron pasar sobre el chip durante 2 min (caudal 30pL/min), seguido de un tiempo de disociación de 10 min. con tampón d HBS-P+. Todas las mediciones se realizaron dos veces. La temperatura para el procedimiento de medición se ajustó a 25 °C.
Los parámetros de enlace se calcularon usando el software BiaEvaluation. Los procedimientos de ajuste de curvas se basaron en ecuaciones de Langmuir. Los datos de entrada para los cálculos fueron la masa molar del analito FVIII (rVIII-SingleChain) de 170 kDa, otros parámetros como máx. RU y las pendientes se extrajeron automáticamente de

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende un factor von Willebrand (VWF) truncado y un resto que extiende la vida media, para el uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre, comprendiendo dicho tratamiento la administración del polipéptido a un sujeto que tiene un trastorno de la coagulación de la sangre y tiene el factor VIII (FVIII) endógeno, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido está reducido en relación con el nivel de actividad del FVIII en plasma humano normal (NHP) siempre que el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto sea al menos el 0,5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el plasma humano normal (NHP), en donde el VWF truncado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4, y donde el polipéptido es capaz de unirse al FVIII endógeno, en donde el factor von Willebrand (VWF) truncado proporciona la capacidad del polipéptido para unirse al FVIII endógeno; en donde el polipéptido es un dímero y la afinidad de dicho dímero a FVIII es mayor que la afinidad de un polipéptido monomérico a dicho FVIII, teniendo dicho polipéptido monomérico la misma secuencia de aminoácidos que una subunidad monomérica del polipéptido dimerico; en donde el polipéptido tiene una afinidad de unión a FVIII caracterizada por una constante de disociación Kode menos de 1 nM; en donde el resto que extiende la vida media es una secuencia heteróloga del aminoácido fusionada al VWF truncado o se conjuga al polipéptido; y en donde el nivel del FVIII endógeno aumenta después de la administración de dicho polipéptido y en donde
-(i) dicho polipéptido se administra para la prevención profiláctica de un evento hemorrágico, en donde a) dicho tratamiento o no comprende la administración conjunta del FVIII exógeno, o
b) dicho tratamiento comprende que se administra un FVIII exógeno y que, por lo tanto, se proporciona el FVIII endógeno en dicho sujeto; o
-(ii) dicho polipéptido se administra conjuntamente con el FVIII exógeno para el tratamiento de un evento hemorrágico o para el inicio de un régimen de tratamiento profiláctico, en donde para tratamientos de seguimiento se administra dicho polipéptido sin la administración conjunta del FVIII exógeno.
2. El polipéptido para su uso de la reivindicación 1, en donde, después de la administración de dicho polipéptido, el nivel del FVIII endógeno aumenta a un nivel de al menos el 1 %.
3. El polipéptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el factor von Willebrand (VWF) truncado es un factor von Willebrand truncado (VWF) humano.
4. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento con dicho polipéptido es inferior al 80 %, inferior al 60 %, inferior al 40 %, inferior al 30 %, inferior al 20 % o inferior al 10 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
5. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nivel de actividad del FVIII endógeno en dicho sujeto antes del tratamiento es preferentemente de al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 % o al menos el 5 % del nivel de actividad del FVIII endógeno en el NHP.
6. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el trastorno de la coagulación de la sangre se selecciona de hemofilia A y enfermedad de von Willebrand.
7. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sujeto es un sujeto humano.
8. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido se administra por vía intravenosa o extravascular.
9. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido tiene una afinidad de unión a FVIII caracterizada por una constante de disociación Kd de menos de 500 pM, preferentemente de menos de 200 pM, de menos de 100 pM, de menos de 90 pM o de menos de 80 pM.
10. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el VWF truncado consiste en (a) los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4, (b) una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos el 90 % con los aminoácidos 764 a 1242 de SEQ ID NO:4.
11. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el resto que extiende la vida media es una secuencia heteróloga del aminoácido fusionada al VWF truncado y en donde dicha secuencia heteróloga del aminoácido comprende o consiste en un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en albúmina o fragmentos de ella, transferrina o fragmentos de ella, el péptido C-terminal de gonadotropina coriónica humana, una secuencia XTEN, repeticiones de homo-aminoácidos (HAP), repeticiones de prolina-alanina-serina (PAS), afamina, alfa-fetoproteína, proteína de unión a la vitamina D, polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina o a las regiones constantes de inmunoglobulina, polipéptidos capaces de unirse al receptor FC neonatal (FcRn), en particular las regiones constantes de inmunoglobulina y sus porciones, preferentemente la porción FC de inmunoglobulina, y sus combinaciones.
12. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el resto que extiende la vida media está conjugado con el polipéptido y en donde dicho resto que extiende la vida media se selecciona del grupo que consiste en hidroxietil almidón (HES), polietilenglicol (PEG), ácidos polisiálicos (PSA), polipéptidos similares a la elastina, polímeros de heparosan, ligandos de unión al ácido hialurónico y a la albúmina, por ejemplo, cadenas de ácidos grasos o péptidos de unión a la albúmina, y sus combinaciones.
13. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los parámetros farmacocinéticos del FVIII endógeno se mejoran mediante la administración del polipéptido, en particular, en donde aumenta el tiempo medio de residencia (MRT) del FVIII endógeno y/o se prolonga la vida media del FVIII endógeno y/o se reduce el aclaramiento del FVIII endógeno.
14. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la vida media en plasma del polipéptido es mayor que la vida media en plasma del VWF endógeno y/o mayor que la vida media en plasma del VWF del plasma humano normal (NHP).
15. El polipéptido para su uso según la reivindicación 14, en la que la vida media en plasma del polipéptido es al menos un 25 % superior a la vida media del VWF endógeno y/o al menos un 25 % superior a la vida media del VWF del plasma humano normal (NHP).
16. El polipéptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde tras la administración del polipéptido se logra un aumento del nivel de actividad del FVIII endógeno del sujeto, preferentemente el nivel de actividad del FVIII endógeno aumenta hasta el nivel del FVIII fisiológico (100 % = 1 UI/ml) o no aumenta sustancialmente por encima del nivel del FVIII fisiológico tras la administración del polipéptido, lo que preferentemente da como resultado un aumento del nivel de actividad del FVIII endógeno que no supera el 300 % = 3 UI/ml, preferentemente que no supera el 250 % = 2,5 UI/ml, que no supera el 200 % = 2 UI/ml, que no supera el 150 % = 1,5 UI/ml o que no supera el 120 % = 1,2 UI/ml del nivel medio de actividad del FVIII en plasma de plasma humano normal, respectivamente.
ES17801641T 2016-11-11 2017-11-10 Polipéptidos del factor von Willebrand truncados para el tratamiento de la hemofilia Active ES2869339T3 (es)

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