JP7240460B2 - プラズモン特異的結合パートナーアッセイにおけるシグナル増幅 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年8月13日に出願された米国仮出願第62/037,071号、及び、2014年11月20日に出願された米国仮出願第62/082,468号の優先権を主張する。これら仮出願の各々は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、試料中の標的分析物の検出システム及び検出方法に関する。とりわけ、本発明は、試料中の微量の標的分析物の検出が可能な局在プラズモン共鳴に基づく分析物検出システムを提供する。
[本発明1001]
以下を含む、分析物検出デバイス:
標的分析物に特異的に結合することができる結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート;
金属ナノ層を含有する表面;及び
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。
[本発明1002]
以下を含む、分析物検出デバイス:
標的分析物と結合している複合金属ナノ構造体を含む、複数の検出コンジュゲート;
金属ナノ層を含有する表面;及び
該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。
[本発明1003]
前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1004]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1005]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、金のコーティング及び銀のコアを含む、本発明1004の分析物検出デバイス。
[本発明1006]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属と第二の金属の合金である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1007]
前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子でありかつ約5nmから約200nmの直径を有する、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1008]
前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子でありかつ約10nmから約100nmの直径を有する、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1009]
前記複合金属ナノ構造体が、エッジ長が約10nmから約800nmでありかつ厚さが約1nmから約100nmのナノプレートである、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1010]
前記複数の検出コンジュゲートが、凍結乾燥されたペレットまたはビーズの形である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1011]
前記表面が、チップ、ウェル、ビーズ、またはキュベットの壁、蓋、及び/もしくは底部である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1012]
前記金属ナノ層が金属フィルムである、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1013]
前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1012の分析物検出デバイス。
[本発明1014]
前記金属フィルムが金を含む、本発明1012の分析物検出デバイス。
[本発明1015]
前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1016]
前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1015の分析物検出デバイス。
[本発明1017]
前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、本発明1015の分析物検出デバイス。
[本発明1018]
前記複合ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノチューブ、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1019]
前記結合パートナー及び/または捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、本発明1001の分析物検出デバイス。
[本発明1020]
前記結合パートナーが、標的分析物の第一のエピトープを認識する抗体であり、かつ前記捕捉分子が、標的分析物の第二のエピトープを認識する異なる抗体である、本発明1001の分析物検出デバイス。
[本発明1021]
前記捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、本発明1002の分析物検出デバイス。
[本発明1022]
前記標的分析物が、感染症、生理学的状態、または病理学的状態に関連するマーカーまたは抗原である、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1023]
前記標的分析物が、イヌ糸状虫、ネコ白血病ウイルス、イヌパルボウイルス、C反応性タンパク質、ジアルジア・ランブリア(Giardia lamblia)、エールリヒア属(Ehrlichia)抗原もしくは抗体、ボレリア属(Borrelia)抗原もしくは抗体、アナプラズマ属(Anaplasma)抗原もしくは抗体、がん抗原、心臓マーカー抗原、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トロポニン、または脳性ナトリウム利尿ペプチドである、本発明1001または1002の分析物検出デバイス。
[本発明1024]
以下の工程を含む、試料中の標的分析物の検出方法:
該試料を複数の検出コンジュゲートと混合する工程であって、該コンジュゲートが、結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含み、該結合パートナーが、該試料中に該標的分析物が存在する場合に該標的分析物に特異的に結合することができ、それにより分析物-検出コンジュゲート複合体が形成される、工程;
該混合物を、金属ナノ層を含有する表面に接触させる工程であって、該金属ナノ層上に複数の捕捉分子が固定化されており、かつ、該複数の捕捉分子が、該試料中に該標的分析物が存在する場合に該標的分析物に特異的に結合することができる、工程;
該表面を紫外‐可視‐赤外スペクトルの波長範囲内の光源に暴露する工程;及び
該表面からの光シグナルを測定する工程であって、該光シグナルの変化が、該試料中に該標的分析物が存在することを示す、工程。
[本発明1025]
前記光シグナルが、反射率、吸光度スペクトル、散乱スペクトル、または発光スペクトルである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記光シグナルの変化が、スペクトルピーク波長シフトを含む、本発明1024の方法。
[本発明1027]
ナノグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、本発明1024の方法。
[本発明1028]
ピコグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、本発明1024の方法。
[本発明1029]
フェムトグラム量の前記標的分析物の存在が検出される、本発明1024の方法。
[本発明1030]
前記表面が、遠心ロータに組み込まれるキュベットの壁または底部である、本発明1024の方法。
[本発明1031]
前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、本発明1024の方法。
[本発明1032]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、本発明1024の方法。
[本発明1033]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、金のコーティング及び銀のコアを含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記複合金属ナノ構造体の各々が、第一の金属と第二の金属の合金である、本発明1024の方法。
[本発明1035]
前記金属ナノ層が金属フィルムである、本発明1024の方法。
[本発明1036]
前記金属フィルムが金を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、本発明1024の方法。
[本発明1038]
前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記複合ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノチューブ、ナノシェル、ナノロッド、ナノアイランド、ナノドット、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、本発明1024の方法。
[本発明1040]
以下の工程を含む、複合金属ナノ構造体の調製方法:
ポリマーと塩化金酸の混合物を含む第一の溶液を調製する工程;
銀または銅ナノ構造体を含む第二の溶液を調製する工程;及び
該第一の溶液と該第二の溶液を一定期間インキュベートする工程であって、得られる混合物が、金でコーティングされた銀ナノ構造体または金でコーティングされた銅ナノ構造体を含む、工程。
[本発明1041]
前記第二の溶液が、銀ナノ構造体を含み、かつ、約550~750nmのピーク吸光度を有する、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリエチレングリコール、またはポリエチレンイミンである、本発明1040の方法。
[本発明1043]
以下を含む、アッセイ複合体:
結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含む検出コンジュゲート;
標的分析物;及び
捕捉分子が固定化された金属ナノ層でコーティングされたビーズであって、該検出コンジュゲート中の該結合パートナーが該標的分析物上の第一のエピトープと結合し、かつ、該捕捉分子が該標的分析物上の第二のエピトープと結合し、それによって、該検出コンジュゲート、標的分析物、及び該捕捉分子を含む複合体が形成される、ビーズ。
[本発明1044]
前記結合パートナーが抗体であり、かつ、前記捕捉分子が異なる抗体である、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1045]
前記金属ナノ層が金属フィルムである、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1046]
前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1045のアッセイ複合体。
[本発明1047]
前記金属フィルムが金を含む、本発明1046のアッセイ複合体。
[本発明1048]
前記金属ナノ層が、前記ビーズに固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1049]
前記複数の金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの複合材料を含む、本発明1048のアッセイ複合体。
[本発明1050]
前記複数の金属ナノ構造体が金ナノ構造体である、本発明1049のアッセイ複合体。
[本発明1051]
前記複合金属ナノ構造体が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、鉄、ニッケル、及び亜鉛から選択される少なくとも2種の金属を含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1052]
前記複合金属ナノ構造体が、第一の金属からなるコア及び第二の金属からなるコーティングを含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1053]
前記複合金属ナノ構造体が、金のコーティング及び銀のコアを含む、本発明1043のアッセイ複合体。
[本発明1054]
前記複合金属ナノ構造体が、第一の金属と第二の金属の合金である、本発明1043のアッセイ複合体。
金ナノ層フィルムが堆積したプラスチックチップを用意することによって、分析物検出システムを調製した。この金ナノ層フィルムにヒトIgGタンパク質(100μg/ml)を固定化してセンサー表面を作製した。対照のセンサーは、この金ナノ層フィルムにウシ血清アルブミンを固定化することで構成した。これら2種類のセンサー表面を、金ナノ層表面への光の照射及び前記表面からの反射光の収集を行う発光集光ファイバーを備えた機器内に配置した。
本実施例は、金ナノ粒子複合体での局在表面プラズモン共鳴シグナルの増幅が、標的分析物が金ナノ粒子に直接コンジュゲートされないサンドイッチアッセイ形式でも実現されうるかどうかを評価するために設計された一連の実験を示す。金ナノ層チップ表面は、実施例1に記載の通りに調製した。このチップ表面に堆積した金ナノ層フィルムに、C反応性タンパク質(CRP)(100μg/ml)に対するC7抗体を固定化して、抗CRPセンサーを作製した。このC7抗体と異なる、CRPの非重複エピトープを認識するC6抗体を、いくつかの実験については金コロイドナノ粒子にコンジュゲートさせ(C6-CGC)、他の実験については非標識の形で使用した。
結合パートナーを標識するために使用される金属の種類を変えることがLSPRシグナルの増幅に影響したかどうかを調べるため、複合金属ナノ構造体を調製した。具体的には、金でコーティングされた銀ナノ構造体を以下のようにして調製した。室温で激しく攪拌しながら50.0mLの脱イオンH2O、500.0μLのクエン酸三ナトリウム(75mM)、200μLのAgNO3(200mM)、及び500.0μLのH2O2(27%)を添加することによって、銀ナノ構造体を調製した。その後、この水溶液に500μLアリコートのNaBH4(200mM)を速やかに注入し、淡黄色への変色を引き起した。数分にわたり、暗黄色から赤色、紫色へと変色が続き、最終的に青色で安定した。UV/可視スペクトルは、当該溶液のピーク吸光度を604.5nmに決定した。
以下の試薬を、示した順番に混合し、最終体積1mlの金ナノ粒子を調製した:0.1mlの1%PVP-10(1%wt/wt)、0.2mlの0.1M塩化金、0.1mlの5N NaOH、0.4mlの水、及び0.2mlの1Mアスコルビン酸。反応混合物は、毎添加後に混合した。この反応の大部分は室温で24時間後に完結したことが、分光計測によって示された。本プロトコルによって、LSPRピーク約535nmと、対応する光学濃度約80/mlを示す球状金ナノ粒子が得られた。さらなる金または銀の積層は、あらかじめ形成された金ナノ粒子に硝酸銀または塩化金を添加して行った。過剰の試薬は30,000gでの1~2時間の遠心分離によって除去した。
Claims (34)
- 以下を含む、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)アッセイ複合体:
各コンジュゲートが結合パートナーと結合している複合金属ナノ構造体を含み、該結合パートナーは標的分析物に特異的に結合することができ、該複合金属ナノ構造体が銀のコアおよび金のコーティングを含む、複数の検出コンジュゲート;
金属ナノ層を含有する表面;及び
各捕捉分子が該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。 - 前記複合金属ナノ構造体が、約5nmから約200nmの範囲の直径を有する球状ナノ粒子である、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複合金属ナノ構造体が、約10nmから約100nmの範囲の直径を有する球状ナノ粒子である、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複合金属ナノ構造体が、約10nmから約800nmの範囲のエッジ長および約1nmから約100nmの範囲の厚さを有するナノプレートである、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複数の検出コンジュゲートが、凍結乾燥されたペレットまたはビーズの形である、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記表面が、チップ、ウェル、ビーズ、またはキュベットの壁、蓋、もしくは底部上の表面である、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの組合せを含む、請求項7に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属フィルムが金を含む、請求項7に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複数の金属ナノ構造体の各々が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの組合せを含む、請求項10に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複数の金属ナノ構造体の各々が金ナノ構造体である、請求項10に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノチューブ、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記結合パートナーが、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記結合パートナーが、前記標的分析物の第一のエピトープを認識する抗体であり、かつ前記捕捉分子が、前記標的分析物の第二のエピトープを認識する異なる抗体である、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記標的分析物が、感染症、生理学的状態、または病理学的状態に関連するマーカーまたは抗原である、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記標的分析物が、イヌ糸状虫の寄生虫抗原、ネコ白血病ウイルスのウイルス抗原、イヌパルボウイルスのウイルス抗原、C反応性タンパク質、ジアルジア・ランブリア(Giardia lamblia)の寄生虫抗原、エールリヒア属(Ehrlichia)抗原もしくは抗体、ボレリア属(Borrelia)抗原もしくは抗体、アナプラズマ属(Anaplasma)抗原もしくは抗体、がん抗原、心臓マーカー抗原、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トロポニン、または脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項1に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 以下を含む、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)アッセイ複合体:
各コンジュゲートが標的分析物と結合している複合金属ナノ構造体を含み、該複合金属ナノ構造体が銀のコアおよび金のコーティングを含む、複数の検出コンジュゲート;
金属ナノ層を含有する表面;及び
各捕捉分子が該金属ナノ層上に固定化されておりかつ該標的分析物に特異的に結合することができる、複数の捕捉分子。 - 前記複合金属ナノ構造体が、約5nmから約200nmの範囲の直径を有する球状ナノ粒子である、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複合金属ナノ構造体が、約10nmから約100nmの範囲の直径を有する球状ナノ粒子である、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複合金属ナノ構造体が、約10nmから約800nmの範囲のエッジ長および約1nmから約100nmの範囲の厚さを有するナノプレートである、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複数の検出コンジュゲートが、凍結乾燥されたペレットまたはビーズの形である、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記表面が、チップ、ウェル、ビーズ、またはキュベットの壁、蓋、もしくは底部上の表面である、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属ナノ層が金属フィルムである、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属フィルムが、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの組合せを含む、請求項25に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属フィルムが金を含む、請求項25に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記金属ナノ層が、前記表面に固定化された複数の金属ナノ構造体を含む、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複数の金属ナノ構造体の各々が、金、銀、銅、白金、パラジウム、カドミウム、亜鉛、またはそれらの組合せを含む、請求項28に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複数の金属ナノ構造体の各々が金ナノ構造体である、請求項28に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記複合金属ナノ構造体が、球状ナノ粒子、ピラミッド形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノチューブ、ナノロッド、ナノドット、ナノアイランド、ナノワイヤ、またはそれらの組合せから選択される形状を有する、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記捕捉分子が、抗体、抗原、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、アプタマー、リガンド、受容体、またはハプテンである、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記標的分析物が、感染症、生理学的状態、または病理学的状態に関連するマーカーまたは抗原である、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
- 前記標的分析物が、イヌ糸状虫の寄生虫抗原、ネコ白血病ウイルスのウイルス抗原、イヌパルボウイルスのウイルス抗原、C反応性タンパク質、ジアルジア・ランブリア(Giardia lamblia)の寄生虫抗原、エールリヒア属(Ehrlichia)抗原もしくは抗体、ボレリア属(Borrelia)抗原もしくは抗体、アナプラズマ属(Anaplasma)抗原もしくは抗体、がん抗原、心臓マーカー抗原、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン、トロポニン、または脳性ナトリウム利尿ペプチドである、請求項19に記載のLSPRアッセイ複合体。
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