CN1417586A - 一种免疫检测信号放大***和它的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白的制备，尤其是应用偶合剂制作的免疫检测放大***和它的制备方法及其应用。本发明是一种免疫信号放大***，它包括葡萄球素蛋白A(SPA)与链霉素抗生物素(SP)的复合物，本***的检测灵敏度更高，可以代替二抗，操作时间缩短，可与许多种属来源的一抗配用。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白的制备，尤其是应用偶合剂制作的免疫检测放大***和它的制备方法及其应用。
背景技术
免疫检测技术是目前医学、生物学等领域最基本也是最常用的检测技术之一，它不仅广泛应用于医学生物学基础研究，也广泛应用于医学临床，甚至环境监测，在疾病诊断、疾病发展的预测、疾病治疗的反应性、病人预后的预测，甚至食品和环境微生物污染的监测中都具有十分重要的应用价值。免疫检测技术包括免疫组织化学技术、酶联免疫吸附技术(ELISA等)、免疫层析技术、免疫沉淀技术及免疫芯片技术等。不论是通过抗原检测抗体还是通过抗体检测抗原，所有这些技术是建立在抗原抗体反应基础之上的。免疫检测方法不仅特异性高，而且几十年来人们通过不断的探索，发明了一些免疫检测信号放大***，如除使用能与目的抗原特异结合的第一抗体外，再加上信号放大***，如加能与第一抗体结合的第二抗体，甚至在加生物素标记第二抗体后再加卵白素或链霉菌素抗生物素(strepavidin，在下文中称为SP)，或在加第二抗体后加过氧化物酶标记的葡萄球菌素蛋白A(staphylococal protein A，在下文中称为SPA)，使其免疫反应特异信号多次放大，从而大大提高了检测的灵敏度。目前最常用的免疫信号放大***是SP放大***(也有人称之为SLAB***)，该信号放大***在免疫组织化学检测中比传统的ABC法或PAP法等要敏感数倍至十几倍。即使如此，SP免疫信号放大***对于非常微量的抗原如病原微生物的检测仍然无能为力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能用于多种免疫检测如免疫组织化学检测、酶联免疫吸附检测、免疫层析检测及免疫芯片等在内的免疫检测信号放大***和它的制备方法及其应用。
本发明所述的一种免疫信号放大***，它包括葡萄球素蛋白A(SPA)与链霉菌素抗生物素(SP)的复合物。
它的制备方法为：
1、活化生物素的制备：
●1.5-2.5mg生物素加入30ml-50ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，再依次加入0.5--2.5g琥珀酰亚胺脂和1-3.0g双乙基碳化二亚胺，室温下密闭磁力搅拌20-24小时，使其析出沉淀物。
●减压过滤除去沉淀物，并滴加DMF洗涤数次，滤液置4℃过夜。
●减压过滤除去沉淀物，滤液加热至100℃左右，减压抽去DMF后得到固体物质。
●用少量乙醛洗涤数次，进一步除去双环乙基碳化二亚胺和减压除去溶剂DMF，得到活化生物素纯品。此纯品置4℃干燥保存。
2、葡萄球菌素蛋白A(SPA)的生物素化
1ml的SPA(0.01-0.03mg/ml)，用0.1mol/LNaHCO3调到PH8.5，加入2-3mg的活化生物素，室温搅拌60分钟，4℃过夜，然后用PBS缓冲液透析，0.2μm滤孔膜除菌。
3、制备链霉菌素抗生物素(SP)
按常规方法制备。简介如下：Savidinil ATCC27419菌株培养液100ml，纱布过滤并离心，上清用6mol/LNaOH调到PH11，将10ml亚胺生物素-CL-Sepharose 4B加入1000ml上清中，25℃搅拌1小时，用砂芯漏斗抽滤，直到OD280nm＝0，将洗后的4B珠装柱，用PH4.0的PBS缓冲液洗下，再于4℃下用PH7.0的PBS透析。
4、对SP进行标记，如用过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、同位素、荧光素等标记。HRP标记SP方法如下：
2-4mgHRP和4-8mgSP溶于1ml的0.1mol/L PH6.8的PBS中，与30--60μl的0.1％戊二醛水溶液混合，室温搅拌3小时后用PBS在4℃下透析48分钟，4℃下离心(300-4000r/分钟)30分钟，最后分装保存于-20℃之下。
5、将生物素化的葡萄球菌素蛋白A与已标记的链霉菌素偶联成葡萄球菌素蛋白A与链菌素合物。
5.1SPA-SP偶联的方法为：
(1)将SPA溶解于双蒸水或1.5％醋酸溶液中，SPA与液体的比例为1g∶1-1.8L，
(2)SP溶解于0.1％PBS(PH7.5)或蒸馏水中，SP与液体的比例为10-15g∶1L；
(3)将上述6LSPA溶液与1L的SP溶液振荡混匀，在搅拌中逐滴加入0.2％戊二醛1L，搅拌5-10分钟于室温下继续反应1-2小时。
5.2SPA-SP偶联的方法为MBS法：
(1)将1-3mgSPA溶于0.5mlPBS中，透析，透析液加入MBS/DMF(每ml DMF中含15mg MBS)50-58ml，用PD-10层析柱层析；
(2)将2-3mg SP溶于PBS中。然后与SPA溶液混合，再同蒸馏水透析过液。SPA-SP连接物置4℃保存供二次试验用。
5.3SPA-SP偶联的方法为EDCI法：
将7-8mgSPA溶于1ml双蒸水中，加入EDCI40mg，用0.1mol/L Hcl调至PH4.5，加入双蒸水溶解的SP3-5mg/0.5ml，4℃透析过夜，冰箱保存。
5.4SPA-SP偶联的方法为BDB法：
将SPA3-4mg溶于8-10ml PH9.0硼酸缓冲液中，加入SP1.5-1.8mg，缓慢加入0.1mlBDB，置4℃振荡2小时，用0.1mol/L NaoH调至PH9.0，倒转试管数次，低温冰箱中保存。
本发明的原理为：
SPA蛋白能与人及许多动物的免疫球蛋白(Ig)结合，结合的部位是Ig的FC段。每个SPA分子可结合2个Ig分子，还可同时结合标记物如HRP、AP、荧光素、胶体金等。正因为如此，检测抗原时，如在加一抗后加SPA，可代替二抗并使检测的敏感性放大数倍(与二抗相比，SPA结合一抗的数量加一倍)。SP蛋白分子，其上有四个生物素结合位点，可结合四个生物素分子，所以采用SP可使原有的免疫检测敏感性提高几十倍。SPA与SP联结成SPA-SP复合后，使其将SPA和SP的优点集于一身；使其免疫信号的放大倍数大大提高。
本发明的优点在于：
①与SP免疫信号放大***和SPA免疫信号放大***相比，其检测的灵敏度更高；②由于SPA-SP信号放大***可以代替二抗，节省了二抗的费用；③由于SPA-SP信号放大***可以代替二抗，所以与现有通用的免疫检测方法相比，操作时间缩短；④由于SPA不仅能与一抗(属Ig)结合，而且无种属特异性，所以可与许多种属来源的一抗(不论是单克隆抗体还是抗血清)配用，而现有的免疫检测***中的二抗却不能。
具体实施
免疫信号放大***，包括葡萄球素蛋白A(SPA)与链霉菌素抗生物素(SP)的复合物。
制备方法：
1、制备活化生物素
2、制备葡萄球菌素蛋白A-SPA的生物素化
3、制备链霉菌素抗生物素SP
4、对链霉菌素抗生物素进行标记
5、将生物素化的葡萄球菌素蛋白A与已标记过的链霉菌素偶联成葡萄球菌素蛋白A与链霉菌素复合物。
实施例1：1、活化生物素的制备：
●2.5mg生物素加入30ml二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，再依次加入1.5g琥珀酰亚胺脂和2.0g双乙基碳化二亚胺，室温下密闭磁力搅拌20-24小时，使其析出沉淀物。
●减压过滤除去沉淀物，并滴加DMF洗涤数次，滤液置4℃过夜。
●减压过滤除去沉淀物，滤液加热至100℃左右，减压抽去DMF后得到固体物质。
●用少量乙醛洗涤数次，进一步除去双环乙基碳化二亚胺和减压除去溶剂DMF，得到活化生物素纯品。此纯品置4℃干燥保存。
2、葡萄球菌素蛋白A(SPA)的生物素化
1ml的SPA(0.02mg/ml)，用0.1mol/LNaHCO3调到PH8.5，加入2.5mg的活化生物素，室温搅拌60分钟，4℃过夜，然后用PBS缓冲液透析，0.2μm滤孔膜除菌。
3、制备链霉菌素抗生物素(SP)
按常规方法制备。简介如下：Savidinil ATCC27419菌株培养液100ml，纱布过滤并离心，上清用6mol/LNaOH调到PH11，将10ml亚胺生物素-CL-Sepharose 4B加入1000ml上清中，25℃搅拌1小时，用砂芯漏斗抽滤，直到OD280nm＝0，将洗后的4B珠装柱，用PH4.0的PBS缓冲液洗下，再于4℃下用PH7.0的PBS透析。
4、对SP进行标记，如用过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、同位素、荧光素等标记。HRP标记SP方法如下：
4mgHRP和8mg SP溶于1ml的0.1mol/L PH6.8的PBS中，与50μl的0.1％戊二醛水溶液混合，室温搅拌3小时后用PBS在4℃下透析48分钟，4℃下离心(300-4000r/分钟)30分钟，最后分装保存于-20℃之下。
5、SPA与SP偶联成SPA-SP复合物，即SPA-SP免疫信号放大***。
4mg葡萄球菌素A溶解于6ml双蒸水或1.5％醋酸溶液中，12mg的链霉菌素抗生物素溶解于1ml 0.1％PBS(PH7.5)或蒸馏水中。
将上述SPA溶液和SP溶液振荡混匀。在搅拌中逐滴加入0.2％戊二醛1ml。再搅拌5～10分钟，于室温下继续反应1～2小时。
原理：
戊二醛在这里起偶合作用，它的两个醛基分别与SPA和SP这两种蛋白质的-NH2结合，起到了一种“桥梁”作用，从而把SPA和SP联接在一起。
在上述实施例中第5点SPA与SP偶联的方法也可为：
5.1MBS法；
●将1-3mgSPA溶于0.5mlPBS中透析，透析液加入MBS/DMF(每ml DMF中含15mg MBS)50-58ml，用PD-10层析柱层析；
●将2-3mg SP溶于PBS中。然后与SPA溶液混合，再同蒸馏水透析过液。
SPA-SP连接物置4℃保存供二次试验用。
5.2 SPA-SP偶联成SPA-SP复合物的方法也可用EDCI法，
将7-8mgSPA溶于1ml双蒸水中，加入EDCI40mg，用0.1mol/L Hcl调至PH4.5，加入双蒸水溶解的SP3-5mg/0.5ml，4℃透析过夜，冰箱保存。
5.3 SPA-SP偶联成SPA-SP复合物的方法还可用BDB法，
将SPA3-4mg溶于8-10ml PH9.0硼酸缓冲液中，加入SP1.5-1.8mg，缓慢加入0.1mlBDB，置4℃振荡2小时，用0.1mol/L NaoH调至PH9.0，倒转度管数次，低温冰箱中保存。
SPA-SP免疫信号放大***应用广泛，主要有：
SPA-SP免疫信号放大***与第一抗体和显色***组成SPA-SP免疫检测***
SPA-SP免疫信号放大***与不同的第一抗体(能与靶抗原特异性结合的抗体)和不同的显色***可组成不同的免疫检测***，如组成免疫组织化学SPA-SP检测***、酶联吸附SPA-SP检测***、免疫层析SPA-SP金标检测***和蛋白印迹(western blot)SPA-SP检测***的制备及检测等。
(1)、免疫组织化学SPA-SP检测***制备方法：
●常规制备针对靶抗原的第一抗体(单克隆抗体或抗血清)；
●制备SPA-SP免疫信号放大***，见上述；
●常规制备非免疫动物血清；
●DAB染色剂(为HRP的底物)。
一抗和SPA-SP通过对靶组织和非靶组织(对照组织)进行棋盘式测定，找出最大的信号/噪音比的显色效果后，组成免疫组织化学SPA-SP检测试剂盒。免疫组织化学SPA-SP检测的使用方法(以免疫组织化学SPA-SP检测***检测石蜡切片抑癌基因蛋白P53表达为例)：
●石蜡切片脱蜡至水，用PBS洗3次，每次5分钟；
●每张切片加50的过氧化物酶阻断剂，室温(15-28)孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟；
●每张切片加50的非免疫动物血清，室温(15-28)孵育10分钟；
●每张切片加50抗P53的单克隆抗体(P1801)，室温(15-28)孵育30-60分钟，PBS洗3次，每次5分钟；
●每张切片加50SPA-SP复合物，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟；
●每张切片加100新配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟；
●自来水洗，苏木素复染，中性树胶封片。
(2)、酶联免疫吸附SPA-SP检测***的制备方法：
●按常规用抗靶抗原的抗体包被96孔反应板
●制备SPA-SP免疫信号放大***
●制备SPA-SP复合物稀释液(先经系列浓度的SPA-SP复合物测定相应抗原，找出最佳稀释度)
●制备显色液
●购买所测抗原标准品并配成倍比稀释浓度共5管
●将上述各组分组装成一检测试剂盒。
检测操作步骤(以检测CA72-4)为例：待检标本(如血清、血浆和胸水)以生理盐水作5倍稀释备用。根据需要将酶结合物和缓冲液按1∶10的比例混合，此为应用液。向反应孔中加入25标准或标本；向反应孔中加入100应用液，轻轻混匀。室温反应150分钟。用生理盐水洗涤5次，每次3分钟，拍干。加入100显色液，室温避光反应60分钟。轻轻混匀，酶标仪690nmim测量吸光度，绘制标准曲线；查标本测定值。
(3)、免疫层析金标SPA-SP检测***的制备及检测：
本***由包被有胶体金标一抗的玻璃纤维、包被有SPA-SP-一抗(与胶体金标的一抗都针对同一抗原，但针对的抗原决定簇不同)，和阳性对照的二抗、吸水滤纸以及硬质塑料片底板组成，这几种物质按金标试纸常规装配方法装配，胶体金一抗复合物按常规方法制备，其颗粒大小为20nm，SPA-SP与一抗偶联：按SPA-SP∶一抗为1∶3的比例混合，4℃孵育过夜，用PBS透析，最后将此膜置于0.02mol/L Tris HCL(PH7.4，含1％BSA的缓冲液)中浸泡30分钟，轩室温下密封，干燥处保存，检测方法如下：
将试纸条的玻璃纤维端***待测液体样本中20秒钟，取入平放在桌上5-10后即可观察到结果。如样本溶液中存在靶抗原，则在包被SPA-SP-一抗的NC膜处即可见到红色线。
(4)、蛋白印迹(western blot)SPA-SP检测***的制备及检测：
本***由第一抗体、SPA-SP复合物和氯萘酚显色***组成。
按常规蛋白由聚丙烯凝胶转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上；取下NC膜取下，放入含8ml 3％牛血清白蛋白(BSA)/TBS溶液，如此封闭后在含1mmol/L NaN3的BSA/TBS中保存过夜。用TBS溶液洗膜。倒掉TBS，加入8ml与靶抗原特异性结合的一抗摇动1个小时以上，孵育过夜。加8ml SPA-SP复合物(按1∶600-1∶5000稀释)摇动1小时以上。用TBS洗膜30分钟，共同3次。用氯萘酚溶液显色(30mg/ml氯萘酚溶液1ml+10ml甲醇+50mlTBS+30μl双蒸水)5-30分钟，双蒸水洗膜，吸干膜上水分，摄片。
Claims (7)
1、一种免疫信号放大***，其特征在于它包括葡萄球素蛋白A与链霉菌素抗生物素的复合物。
2、根据权利要求1所述的免疫信号放大***的制备方法，其特征在于：
2.1制备活化生物素
2.2制备葡萄球菌素蛋白A的生物素化
2.3制备链霉菌素抗生物素
2.4对链霉菌素抗生物素进行标记
2.5将生物素化的葡萄球菌素蛋白A与已标记的链霉菌素抗生物偶联成葡萄球菌素蛋白A与链菌素复合物。
3、根据权利要求2所述的一种免疫信号放大***的制备方法，其特征在于生物素化的葡萄球素蛋白A与已标记过的链霉素抗生物素偶联的方法为：
3.1将生物素化的葡萄球素蛋白A溶解于双蒸水或1.5％醋酸溶液中，生物素化的葡萄球素蛋白A与液体的比例为1g∶1-1.8L，
3.2将标记过的链霉素抗生物素溶解于0.1％PBS(PH7.5)或蒸馏水中，它与液体的比例为10-15g∶1L；
3.3将上述6L经3.1制成溶液和1L经3.2制成溶液振荡混匀，在搅拌中逐滴加入0.2％戊二醛1L，搅拌5-10分钟，于室温下继续反应1-2小时。
4、根据权利要求2所述的的免疫信号放大***的制备方法，其特征在于：葡萄球素蛋白A与链霉素抗生物素偶联的方法为MBS法；
4.1将1-3mg生物素化葡萄球素蛋白A溶于0.5mlPBS中透析，透析液加入MBS/DMF，每ml DMF中含15mg MBS50-58ml，用PD-10层析柱层析；
4.2将2-3mg标记过的链霉素抗生物素溶于PBS中，然后与上述4.1的葡萄球素蛋白A溶液混合，再用蒸馏水透析过夜，葡萄球素蛋白A-链霉素抗生物素复合物置4℃保存。
5、根据权利要求2所述的的免疫信号放大***的制备方法，其特征在于：葡萄球素蛋白A与链霉素抗生物素偶联的方法为EDCI法，将7-8mg生物素化的葡萄球素蛋白A溶于1ml双蒸水中，加入EDCI40mg，用0.1mol/L Hcl调至PH4.5，加入双蒸水溶解的SP3-5mg/0.5ml，4℃透析过夜，冰箱保存。
6、根据权利要求2所述的免疫信号放大***的制备方法，其特征在于：
葡萄球素蛋白A与链霉素抗生物素偶联的方法为BDB法，将生物素化的葡萄球素蛋白A3-4mg溶于g-10ml PH9.0硼酸缓冲液中，加入已标记的链霉素抗生物素1.5-1.8mg，缓慢加入0.1mlBDB，置4℃振荡2小时，用0.1mol/L NaoH调至PH9.0，倒转试管数次，低温冰箱中保存。
7、根据权利要求1所述的免疫放大***在检测***中的应用，其特征在于，
7.1常规制备针对靶抗原的第一抗体(单克隆抗体或抗血清)；
7.2制备葡萄球素蛋白A-链霉素抗生物素免疫信号放大***，
7.3常规制备非免疫动物血清；
7.4DAB染色剂(为HRP的底物)；
7.5将一抗和葡萄球素蛋白A-链霉素抗生物素免疫信号放大***通过对靶组织和非靶组织(对照组织)进行棋盘式测定，找出最大的信号/噪音比的显色效果后，组成免疫组织化学葡萄球素蛋白A-链霉素抗生物素检测试剂盒。
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