JP7226449B2 - 発酵によるグリシンの製造方法 - Google Patents
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Description
作用下での加水分解反応によりグリシノニトリルからグリシンを製造する方法が知られている(EP1243657 B1)。
ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変された場合に、同細菌を培地で培養した際にグリシンが同細菌により生産され培地から回収できるように培地中にグリシンを生産できるようになり得る。例えば、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌は、同細菌がtdh遺伝子およびkbl遺伝子を過剰発現するように改変された場合に、同細菌を培地で培養した際にグリシンが同細菌により生産され培地から回収できるように培地中にグリシンを生産できるようになり得る。すなわち、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように細菌を改変することにより、細菌を培地で培養した際にグリシンが同細菌により生産され培地から回収できるようにグリシンを生産する能力を細菌に付与することができる。
(i)グリシン生産細菌を培地で培養して培地もしくは菌体、またはその両者中にグリシンまたはその塩を生産および蓄積すること、
(ii)培地もしくは菌体、またはその両者からグリシンまたはその塩を回収すること
を含み、
前記細菌が、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、方法を提供することである。
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記(A)、(B)、および(C)からなる群より選択され:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~50個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記(D)、(E)、および(F)からなる群より選択される、方法を提供することである:
(D)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1~50個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質;
(F)配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記(a)、(b)、および(c)からなる群より選択されるDNAにコードされ:
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA;
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~50個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質がL-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するものであるDNA;
(c)遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記(d)、(e)、および(f)からなる群より選択されるDNAにコードされる、方法を提供することである:
(d)配列番号3に示す塩基配列を含むDNA;
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1~50個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、該タンパク質が2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するものであるDNA;
(f)遺伝子コードの縮重による配列番号3の変異体塩基配列であるDNA。
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されている、細菌を提供することである。
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記(A)、(B)、および(C)からなる群より選択され:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~50個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記(D)、(E)、および(F)からなる群より選択される、細菌を提供することである:
(D)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1~50個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質;
(F)配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して60%以上のアミノ酸残基の同一性を有し、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。
れている、前記細菌を提供することである。
本明細書に記載の方法においては、改変された細菌が同細菌の発酵により培地中にグリシンを生産できるようになり得る限り、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変できるいずれの細菌でも使用できる。あるいは、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように細菌が改変された場合に発酵によりグリシンを生産できるようになる限り、いずれの細菌でも使用できる。本明細書に記載の細菌は、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されたグリシン生産菌であり得る。細菌の例は、後述する。
リシンを生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積できる細菌を意味し得る。「細菌を培地で培養(cultivate)する」とは、「細菌を培地で培養(culture)する」ことと同等であり得、これらの表現は当業者には公知である。また、「グリシン生産菌」とは、非改変株、例えば、Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum) ATCC13032またはEscherichia coli (E. coli) K-12等の野生株または親株、と比較して、より多い量でグリシンを培地中に生成し、排出もしくは分泌し、且つ/又は蓄積できる細菌も意味し得る。細菌は、0.01 g/L以上のグリシン、例えば、0.1 g/L以上、0.5 g/L以上、あるいは1.0 g/L以上のグリシンを培地中に蓄積し得る。
に統合された細菌も包含する(Liebl W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, “Brevibacterium flavum” DSM 20411, “Brevibacterium lactofermentum” DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns, Int. J. Syst. Bacteriol., 1991, 41:255-260)。コリネ型細菌は、かつてはCorynebacterium ammoniagenesに分類されていたが16S rRNA塩基配列解析等により現在はCorynebacterium stationisに再分類されている細菌も包含する(Bernard K.A. et al., Assignment of Brevibacterium stationis (ZoBell and Upham 1944) Breed 1953 to the genus Corynebacterium, as Corynebacterium stationis comb. nov., and emended description of the genus Corynebacterium to include isolates that can alkalinize citrate, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60:874-879)。コリネ型細菌を使用する利点は、コリネ型細菌は細菌細胞壁に熱いペプチドグリカン層を有するグラム陽性細菌であり、それにより、例えば、温度や化学的活性剤(例えば、酸化的および毒性化学物質)等の種々の環境条件に耐性となることである。コリネ型細菌を使用する他の利点は、糖、アンモニア、およびミネラル塩等を含有する単純な培地でよく生育でき、よって、培地コスト、培養法、および培養生産性等の観点で優れていることである。
Corynebacterium acetoacidophilum,
Corynebacterium acetoglutamicum,
Corynebacterium alkanolyticum,
Corynebacterium callunae,
Corynebacterium glutamicum,
Corynebacterium lilium,
Corynebacterium melassecola,
Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens),
Corynebacterium herculis,
Brevibacterium divaricatum,
Brevibacterium flavum,
Brevibacterium immariophilum,
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum),
Brevibacterium roseum,
Brevibacterium saccharolyticum,
Brevibacterium thiogenitalis,
Corynebacterium ammonia genes (Corynebacterium stationis),
Brevibacterium album,
Brevibacterium cerinum,
Microbacterium ammoniaphilum.
Specific examples of coryneform bacteria include the following strains:
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511,
Corynebacterium callunae ATCC 15991,
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734,
Corynebacterium lilium ATCC 15990,
Corynebacterium melassecola ATCC 17965,
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539),
Corynebacterium herculis ATCC 13868,
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020,
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205),
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068,
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869,
Brevibacterium roseum ATCC 13825,
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066,
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240,
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872,
Brevibacterium album ATCC 15111,
Brevibacterium cerinum ATCC 15112,
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354。
1996)に挙げられるものが使用できる。特にエシェリヒア・コリ(Escherichia coli;E. coli)が挙げられる。エシェリヒア・コリの具体例としては、プロトタイプ野生株であるエシェリヒア・コリK-12株由来のエシェリヒア・コリW3110(ATCC 27325)やエシェリヒア・コリMG1655(ATCC 47076)等が挙げられる。これらの株は、上述した通り、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手することができる。
agglomerans)やエンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等が挙げられ、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)等が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスのいくつかの株は、近年、16S rRNAの塩基配列解析などによりパントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)、パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)、またはパントエア・スチューアルティ(Pantoea stewartii)に再分類されている。腸内細菌科に分類される細菌であれば、エンテロバクター属またはパントエア属のいずれに属するものであっても使用することができる。パントエア・アナナティス株を遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスAJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、及びそれらの派生株を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり最近16S rRNAの塩基配列解析等によりパントエア・アナ
ナティスに再分類されている。
from E. coli K-12, J. Biol. Chem., 1981, 256(4):1809-1815)。例えば、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそのホモログであってNAD+依存的にL-スレオニン(L-threonine)をL-2-アミノ-3-オキソブタン酸(L-2-amino-3-oxobutanoate)に還元する反応を触媒するものを意味してよい。L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質の活性は、L-スレオニン(L-threonine)からのアミノアセトン(aminoacetone)の生成を比色分析で評価することにより、またはNADHの生成を分光光度計で観測することにより、決定できる(Boylan S.A. and Dekker E.E., 1981およびその参考文献を参照のこと)。
acid sequence of homogeneous E. coli 2-amino-3-ketobutyrate CoA ligase, a pyridoxal phosphate-dependent enzyme, J. Biol. Chem., 1987, 262:14441-14447)。例えば、2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質は、配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそのホモログであって2-アミノ-3-オキソブタン酸(2-amino-3-oxobutanoate)をグリシン(glycine)とアセチルコエンザイムA(acetyl-coenzyme A)に開裂する反応を触媒するものを意味してよい。2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質の活性は、グリシン(glycine)とアセチルCoA(Ac-CoA)からのアミノアセトン(aminoacetone)の生成を比色分析で評価することにより、またはコエンザイムA(coenzyme A;CoAともいう)と5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid))間の縮合反応を412 nmで測定することにより、決定できる(例えば、Mukherjee J.J. and Dekker E.E., 1987およびその参考文献を参照のこと)。
。また、他の細菌種のTDHのアミノ酸ホモログ、例えば、配列番号2のTDHを有するE. coli
(同一性: 100%), Shigella flexneri (同一性: 99%), Salmonella enteric (同一性: 98%), Klebsiella pneumonia (同一性: 97%), Enterobacter cloacae (同一性: 96%), P. ananatis (同一性: 86%)種等の腸内細菌科の細菌; Burkholderia mallei (同一性: 77%), Paraburkholderia xenovorans (同一性: 76%)種等のBurkholderiaceae科の細菌; Rhizobium etli (同一性: 71%)種等のRhizobiaceae科の細菌; Xanthomonas axonopodis (同一性:
64%)種等のXanthomonadaceae科の細菌等に由来するホモログも公知である(例えば、the
NCBI database, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/を参照のこと)。よって、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質としては、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のホモログであるタンパク質も挙げられる。
剰発現するように改変され得る。また、細菌は、改変された細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質の活性および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A
ligase活性を有するタンパク質の活性が検出されるように改変され得る。すなわち、改変された細菌においてL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質の活性および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質の活性を検出でき、且つ改変された細菌が本明細書に記載するようにグリシンを生産できるように、L-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変され得る限り、本来的または天然にはL-threonine 3-dehydrogenase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-amino-3-oxobutanoate coenzyme A ligase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有しないいずれの細菌でも使用され得る。
平均コドン頻度として定義され得る(Zhang S.P. et al., Gene, 1991, 105(1):61-72))。生物のコドン使用度は、CUTG(Codon Usage Tabulated from GenBank) (http://www.kazusa.or.jp/codon/; Nakamura Y. et al., Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000, Nucleic Acids Res., 2000, 28(1):292)の拡張web版であるCodon Usage Databaseで見られる。使用度が低いコドンを使用度が高い同義コドンに置換するのが好ましい場合がある。レアコドンまたは使用度が低いコドンの使用度が中程度または高い同義コドンへの置換は、レアコドンを認識するtRNAをコードする遺伝子の共発現と組み合わせてもよい。
は、染色体DNA中に複数のコピーを有する配列を標的として実施することができる。染色体DNA中に複数のコピーを有する配列としては、限定するものではないが、レペティティブDNAや転移因子の末端に存在するインバーテッドリピートが挙げられる。さらに、遺伝子をトランスポゾンに組み込んで転移させることにより、染色体DNAに多コピーの遺伝子を導入することができる。Muドリブンインテグレーションを使用することにより、一回の操作により3を超えるコピー数の遺伝子を染色体DNAに導入することができる(Akhverdyan
V.Z. et al., Biotechnol. (Russian), 2007, 3:3-20)。
後、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッテイング、または蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)等を行うことにより、測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティングや定量的RT-PCR等の様々な周知の方法を使用して遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することにより決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEと、その後の免疫ブロッティング(ウェスタンブロッティング)やタンパク質試料の質量分析等の公知の方法により測定することができる。
Cheryl L. Patten, “Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA”, 4th ed., Washington, DC, ASM Press (2009)に記載されている。
N.Y.: Cold Spring Harbor La. Press, 1972)。宿主微生物へのランダムおよび/またはターゲットしたDNAの組み込みのための他の方法、例えば、「Mu-driven組み込み/増幅」(Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871)や、「Red/ET-driven組み込み」または「λRed/ETを介した組み込み」(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(12):6640-45; Zhang Y., et al., Nature Genet., 1998, 20:123-128)、を適用できる。また、所望の遺伝子の多数の挿入のためには、Mu-driven replicative transposition(Akhverdyan et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871)および所望の遺伝子の増幅をもたらす化学的に誘導されるrecA依存的相同組み換えに基づく染色体の進化(Tyo K.E.J. et al., Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765)に加えて、トランスポゾン、Red/ETを介した部位特異的および/または相同組み換え、および/またはP1を介した一般化形質導入の種々の組み合わせを含む他の方法を利用できる(例えば、Minaeva N. et al., BMC Biotechnology, 2008, 8:63; Koma D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, 93(2):815-829を参照のこと)。
る。また、コリネ型細菌における遺伝子の過剰発現に適した方法は、適宜改変して腸内細菌科に属する細菌における遺伝子の過剰発現に利用でき、また、逆もそうである。よって、本明細書に記載の遺伝子を過剰発現する方法は、事実上、本明細書に記載のいずれの細菌にも適用してよい。
Ile、Met、ValまたはPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、HisまたはArgへの置換、MetからIle、Leu、ValまたはPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、IleまたはLeuへの置換、SerからThrまたはAlaへの置換、ThrからSerまたはAlaへの置換、TrpからPheまたはTyrへの置換、TyrからHis、PheまたはTrpへの置換、及びValからMet、IleまたはLeuへの置換が挙げられる。
Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)検索は、プログラムblastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、及びtblastxにより使用される発見的探索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin S.及びAltschul S.F.の統計学的方法 (“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features
by using general scoring schemes” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; “Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877)を使用して、有意性を発見物に帰着させるものである。コンピュータプログラムBLASTは3つのパラメーター、すなわち、スコア、同一性、及び類似性、を計算する。FASTA検索法は、Pearson W.R.により記載されている(“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98)。ClustalW法は、Thompson J.D. et al.によって記載されている(“CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680)。
正荷電ナイロンメンブレン(GE Healthcare)のストリンジェントな条件下での推奨洗浄時間は15分である。洗浄工程は2または3回行うことができる。プローブとしては、配列番号1に示す配列に相補的な配列の一部を使用してもよい。そのようなプローブは、配列番号1に示す配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、該塩基配列を含むDNA断片を鋳型として使用するPCR(polymerase chain reaction; White
T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189を参照のこと)によって調製することができる。プローブの長さは、50 bpを超えることが推奨されるが、ハイブリゼーション条件により適切に選択することができ、通常100 bp ~1
kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、例えば、50℃、60℃、あるいは65℃における2×SSC、0.1%SDSであり得る。
配列には限定されない。種由来のアミノ酸配列および塩基配列ならびにそれらのホモログの具体例は本明細書に記載されており、配列番号1および3に示す塩基配列を有する対応する遺伝子にコードされる、配列番号2および4に示すアミノ酸配列をそれぞれ有するE. coli種の細菌由来のTDHおよびKBLが挙げられる。
本明細書に記載の細菌を使用するグリシンまたはその塩を製造する方法は、細菌を培地で培養(cultivating; culturingともいう)してグリシンまたはその塩を培地もしくは菌体、またはその両者中に生成させ、排出もしくは分泌させ、且つ/又は蓄積させる工程と、培地及び/又は菌体からグリシンまたはその塩を回収する工程を含む。この方法は、任意で、培地及び/又は菌体からグリシンまたはその塩を精製する工程を含んでいてよい。グリシンは、遊離の形態もしくはその塩、またはそれらの混合物として生産されてよい。例えば、グリシンのナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩、または両性イオン等の内部塩を、前記方法により製造することができる。これは、アミノ酸が発酵条件下で、互いに、あるいは無機または有機の酸またはアルカリ性物質等の中和剤と、典型的な酸塩基中和反応により反応して塩を生成することができることから可能であり、これは当業者に明らかなアミノ酸の化学的特徴である。
カリ性物質により調節することができる。
1.1 DNA断片<KBL>および<TDH>のデザインと合成
C. glutamicum株の構築に用いたDNA断片<KBL>および<TDH>の構造を図1に示す。DNA断片は、kblおよびtdh遺伝子の制御部位としてのプロモーターと、それらの遺伝子の構造部位を含む。DNA断片は、化学合成した(ATG Service Gene; Russian Federation, St. Petersburg, www.service-gene.spb.ru)。
i) rplK遺伝子のプロモーター(図1A中、PrplKと示す)。プロモーターPrplKの塩基配列は、C. glutamicum R株の完全ゲノム配列(GenBank, accession No. AP009044.1)の638849~639029の塩基に相当する;
ii) 配列番号3に示す塩基配列を有する、E. coli K-12株substr. MG1655由来のkbl遺伝子の構造部位。
i) gapA遺伝子のプロモーター(図1B中、PgapAと示す)。プロモーターPgapAの塩基配列は、C. glutamicum R株の完全ゲノム配列(上記参照)の1822219~1821813の塩基に相当する;
ii) 配列番号1に示す塩基配列を有する、E. coli K-12株substr. MG1655由来のtdh遺伝子の構造部位。
pPK4-kbl-tdhプラスミドの構築手順を図2に示す。全ての酵素と手順はFermentas(Thermo Fisher Scientific)から取得した。pPK4-kbl-tdhプラスミドの構築のため、DNA断片<KBL>および<TDH>をそれぞれ制限酵素NheIとXbaIまたはSalIで消化し、制限酵素XbaIとNheIで消化したC. glutamicum/E. coliシャトルベクターpPK4(US6,090,597 A)にT4 DNA ligaseを用いてライゲーションした。E. coli JM109株(Promega, cat. No. P9751)をライゲーション後の混合物で形質転換した。取得したpPK4-kbl-tdhプラスミド(図3)は5~20個のランダムに選択したカナマイシン耐性(KnR)コロニーから単離したプラスミドから選抜した。プラスミドの構造は、制限解析と配列解析により確認した。その結果、C. glutamicum ATCC13032/pPK4-kbl-tdh株が構築された。対照株として、ベクターpPK4を保持するC. glutamicum ATCC13032/pPK4株を同一の手順で構築した。
1.3.1 MM*培地
以下のストック溶液を用いた:
A - Thiamine hydrochloride, 水溶液, 1.6 g/L;
B - Biotin, 水溶液, 1 g/L;
C - D,L-Methionine, 水溶液, 15 g/L;
D - Glucose, 1 N HCl溶液, 40% (w/v), 滅菌;
E - MgSO4, 水溶液, 1 M;
F - Kanamycin, 水溶液 (100 g/L)。
(NH4)2SO4 - 3 g;
KH2PO4 - 0.3 g;
Yeast extract - 0.2 g;
FeSO4x7H2O - 30 mg;
MnSO4x7H2O - 30 mg;
L-Threonine - 27.8 g。
2YT寒天プレート(2YT-broth with bacteriological agar-agar (American type, 1.6%
(w/w), Dia-m, Russian Federation, cat. No. 212303.0500f), kanamycin (50 mg/L))で生育させたC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の菌体を、グルコース(1 g/L)とカナマイシン(50 mg/L)を添加した4 mLの2YT-broth(Thermo Fisher Scientific, cat. No. 22712020)にそれぞれ植菌し、30℃で約6時間培養した。細胞培養物500 μLを4 mLのMM*培地にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪(250 rpm)しながら30℃で96時間培養した。
実施例1.3.2で得られた培養液を入れた試験管に水40 mLを添加し、試験管を激しく振盪して懸濁液を得た。培養液中に蓄積したグリシンをTLC解析で決定した。懸濁液100
μLを水900 μLと混合して激しく振盪し、非溶解物を沈殿により除去した。得られた各溶液1 μLをシリカゲルプレートにアプライし、プレートをacetone : isopropanol : ammonia (25%) : H2O = 50 : 50 : 24 : 16 (v/v)の混合物で展開した。
L-threonineを添加した培地におけるC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の試験管発酵の結果を表1に示す。表1から分かるように、1.2 mM L-threonineを添加した培地で培養した改変株C. glutamicum ATCC13032/pPK4-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを0.74 mM (収率62%)の量で蓄積した。親株C. glutamicum ATCC13032/pPK4は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
2.1 MM1培地
以下のストック溶液を用いた:
NH4Cl (40 g/L), KH2PO4(10 g/L), およびK2HPO4 (30 g/L)を含有する10 x SS (salts solution);
FeSO4x7H2O (1 g), MnSO4x7H2O (1 g), ZnSO4x7H2O (0.1 g), CoCl2x6H2O (0.02 g), CuSO4 (0.02 g), およびNiSO4x6H2O (0.002 g) (100 mL中)を含有するTES (trace elements solution);
a) - FeSO4x7H2O, 0.1 N HCl溶液, 1% (w/v);
b) - MnSO4x7H2O, 水溶液, 1% (w/v);
c) - MgSO4, 水溶液, 1 M;
d) - CaCl2, 水溶液, 1 M;
e) - Urea (Sigma), 水溶液, 400 g/L;
f) - Glucose, 1 N HCl溶液, 40% (w/v), sterile;
g) - Vitamin B1, 水溶液, 1.6 g/L;
h) - Vitamin B3, 水溶液, 1.6 g/L;
i) - Biotin, 70% (v/v) EtOH溶液, 1 g/L;
j) - Kanamycin, 水溶液, 100 g/L。
50 μL; h), 50 μL; i), 5 μL; j), 100 μL; 水を最終容量50 mLまで。
2YT寒天プレートで生育させたC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株(実施例1.2)の菌体を、グルコース(1 g/L)とカナマイシン(50 mg/L)を添加した4 mLの2YT-brothにそれぞれ植菌し、30℃で約6時間培養した。細胞培養物500 μLを4 mLのMM1培地にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪(250 rpm)しながら30℃で24時間培養した。培養液中に蓄積したグリシンを決められたHPLC分析で決定した。
L-threonineを添加しない培地におけるC. glutamicum ATCC13032/pPK4株およびATCC13032/pPK4-kbl-tdh株の試験管発酵の結果を表2に示す。表2から分かるように、L-threonineを添加しない培地で培養した改変株C. glutamicum ATCC13032/pPK4-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを蓄積した。親株C. glutamicum ATCC13032/pPK4は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
3.1 E. coli MG1655/pET15(b+)株およびMG1655/pEL-kbl-tdh株の構築
E. coli MG1655の染色体を鋳型として、プライマーP1(配列番号7)とP2(配列番号8)を用いてE. coli MG1655株(ATCC 47076)の染色体のDNA断片を増幅した。得られたDNA断片(2277 bp)を制限酵素BamHIおよびNotIで消化し、pEL-IDO(Lys, 23)プラスミド(WO2009082029 A1)を同制限酵素で消化して得たベクターにクローニングした。その結果、E. coli MG1655由来の<kbl-tdh>オペロンが、多コピーベクター上のPlacUV5プロモーターの制御下に配置された(図4)。よって、E. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株が構築された。対照株として、pET-15(b+)ベクター(Novagen, Germany)を導入してE. coli MG1655株を構築した。
Luria-Bertani(LB)寒天プレート(LB-broth Powder (Thermo Fisher Scientific, cat. No. 12780029), bacteriological agar-agar (American type, 1.6% (w/w)), kanamycin (50 mg/L))で生育させたE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株(実施例3.1)の菌体を、グルコース(1 g/L)とカナマイシン(100 mg/L)を添加した4
mLの2YT-brothにそれぞれ植菌し、37℃で約6時間培養した。細胞培養物40 μLをグルコース(4 g/L)とL-threonine(100 mM)を添加した4 mLのM9-salts培地(Sigma, M6030)にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪(250 rpm)しながら37℃で48時間培養した。培養液中に蓄積したグリシンを決められたHPLC分析で決定した。
L-threonineを添加した培地におけるE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株の試験管発酵の結果を表3に示す。表3から分かるように、100 mM L-threonineを添加した培地で培養した改変株E. coli MG1655/pEL-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを26 mM (収率26%)の量で蓄積した。非改変株E. coli MG1655/pET15(b+)は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
4.1 MM2培地
以下のストック溶液を用いた:
NH4Cl (40 g/L), KH2PO4 (10 g/L), およびK2HPO4 (30 g/L)を含有する10 x SS (salts solution);
A’ - FeSO4x7H2O, 0.1 N HCl溶液, 1% (w/v);
B’ - MnSO4x7H2O, 水溶液, 1% (w/v);
C’ - MgSO4, 水溶液, 1 M;
D’ - CaCl2, 水溶液, 1 M;
E‘ - Glucose, 1 N HCl溶液, 40% (w/v), sterile;
F’ - Vitamin B1, 水溶液, 1.6 g/L;
G’ - Biotin, 70% (v/v) EtOH溶液, 1 g/L;
H’ - Kanamycin, 水溶液, 50 g/L;
I’ - 2-YT培養溶液;
J’ - L-Threonine, 水溶液, 1 M。
H’, 100 μL; I’, 2.5 mL; J’, 5 mL; 水を最終容量50 mLまで。
2YT寒天プレートで生育させたE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株(実施例3.1)の菌体を、グルコース(1 g/L)とカナマイシン(50 mg/L)を添加した4 mLの2YT-brothにそれぞれ植菌し、37℃で約6時間培養した。細胞培養物40 μLをMM2培地にそれぞれ植菌し、50 mL試験管内で激しく振盪(250 rpm)しながら37℃で48時間培養した。培養液中に蓄積したグリシンを決められたHPLC分析で決定した。
L-threonineを添加しない培地におけるE. coli MG1655/pEL-kbl-tdh株およびMG1655/pET15(b+)株の試験管発酵の結果を表4に示す。表4から分かるように、L-threonineを添加
しない培地で培養した改変株E. coli MG1655/pEL-kbl-tdhは、培養液中にグリシンを蓄積した。非改変株E. coli MG1655/pET15(b+)は、培養液中にグリシンを蓄積できなかった。
Claims (9)
- グリシンまたはその塩を製造する方法であって、
(i)グリシン生産細菌を培地で培養して培地もしくは菌体、またはその両者中にグリシ
ンまたはその塩を生産および蓄積すること、
(ii)培地もしくは菌体、またはその両者からグリシンまたはその塩を回収すること
を含み、
前記細菌が、コリネ型細菌であり、
前記細菌が、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されており、
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を導入することにより、該遺伝子のコピー数を増加させることにより、もしくは該遺伝子のプロモ-ターをより強いプロモ-ターに改変することにより、またはそれらの組み合わせにより過剰発現し、該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されており、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記(A)、(B)、および(C)からなる群より選択され:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上のアミノ酸残基の同一性を有し
、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記(D)、(E)、および(F)からなる群より選択される、方法:
(D)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1~30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザ
イムAリガーゼ活性を有するタンパク質;
(F)配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上のアミノ酸残基の同一性を有し
、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質がtdh遺伝子にコードさ
れ、前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質がkbl遺伝子にコードされる、請求項1に記載の方法。 - 請求項1または2に記載の方法であって、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記(a)、(b)、および(c)からなる群より選択されるDNAにコードされ:
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA;
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、
該タンパク質がL-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するものであるDNA;
(c)遺伝子コードの縮重による配列番号1の変異体塩基配列であるDNA、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下記(d)、(e)、および(f)からなる群より選択されるDNAにコードされる、方法:
(d)配列番号3に示す塩基配列を含むDNA;
(e)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1~30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするDNAであって、
該タンパク質が2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するものであるDNA;
(f)遺伝子コードの縮重による配列番号3の変異体塩基配列であるDNA。 - 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属またはブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属に属するものである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- グリシン生産細菌であって、
前記細菌が、コリネ型細菌であり、
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように改変されており、
L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子および2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、該遺伝子を導入することにより、該遺伝子のコピー数を増加させることにより、もしくは該遺伝子のプロモ-ターをより強いプロモ-ターに改変することにより、またはそれらの組み合わせにより過剰発現し、該遺伝子の発現が非改変細菌と比較して増強されており、
前記L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質が、下記(A)、(B)、および(C)からなる群より選択され:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1~30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質;
(C)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上のアミノ酸残基の同一性を有し
、L-スレオニン3-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、
前記2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質が、下
記(D)、(E)、および(F)からなる群より選択される、細菌:
(D)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(E)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1~30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び/又は付加を含むアミノ酸配列を含み、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザ
イムAリガーゼ活性を有するタンパク質;
(F)配列番号4に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上のアミノ酸残基の同一性を有し
、2-アミノ-3-オキソブタン酸コエンザイムAリガーゼ活性を有するタンパク質。 - tdh遺伝子およびkbl遺伝子を過剰発現するように改変されている、請求項6に記載の細菌。
- 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属またはブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属に属するものである、請求項6または7に記載の細菌。 - 前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項6~8のいずれか1項に記載の細菌。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001340097A (ja) | 2000-06-01 | 2001-12-11 | Asahi Kasei Corp | グリシンを微生物学的に製造する方法 |
JP2002191357A (ja) | 2000-12-28 | 2002-07-09 | Asahi Kasei Corp | 新奇グリシンデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物菌体およびそれを用いたグリシンの製造方法 |
US20150111261A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-04-23 | Mitsui Chemicals, Inc. | L-threonine-producing escherichia coli and method for producing l-threonine using the same |
JP2015525561A (ja) | 2012-07-11 | 2015-09-07 | 味の素株式会社 | ジペプチド合成酵素(バリアント)をコードするdna、エシェリヒア属に属する細菌、およびそれらを用いるジペププドの生産方法 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU875663A1 (ru) | 1978-06-30 | 1982-09-15 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени |
JPS5618596A (en) | 1979-07-23 | 1981-02-21 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-lysine through fermentation process |
JPS57134500A (en) | 1981-02-12 | 1982-08-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Plasmid pcg1 |
JPS57183799A (en) | 1981-04-17 | 1982-11-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Novel plasmid |
JPS5835197A (ja) | 1981-08-26 | 1983-03-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | プラスミドpcg2 |
JPS5867679A (ja) | 1981-09-30 | 1983-04-22 | アメリカン・サイアナミド・カンパニ− | イソシアン酸を三量化してシアヌル酸をつくる方法 |
JPS5877895A (ja) | 1981-11-02 | 1983-05-11 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドphm1519 |
JPS58192900A (ja) | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Ajinomoto Co Inc | 複合プラスミド |
JPH01191686A (ja) | 1988-01-26 | 1989-08-01 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 複合プラスミド |
US5185262A (en) | 1988-07-27 | 1993-02-09 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | DNA fragment containing gene which encodes the function of stabilizing plasmid in host microorganism |
JP2678995B2 (ja) | 1988-09-08 | 1997-11-19 | 三菱化学株式会社 | トリプトフアンシンターゼの製造法 |
JPH02207791A (ja) | 1989-02-07 | 1990-08-17 | Ajinomoto Co Inc | 微生物の形質転換法 |
JP2973446B2 (ja) | 1990-01-11 | 1999-11-08 | 三菱化学株式会社 | 新規プラスミドベクター |
WO1994011517A1 (en) | 1992-11-10 | 1994-05-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-threonine by fermentation |
JPH07155184A (ja) | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−リジンの製造法 |
US5998178A (en) | 1994-05-30 | 1999-12-07 | Ajinomoto Co., Ltd. | L-isoleucine-producing bacterium and method for preparing L-isoleucine through fermentation |
DE4440118C1 (de) | 1994-11-11 | 1995-11-09 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA |
JPH0970291A (ja) | 1995-06-30 | 1997-03-18 | Ajinomoto Co Inc | 人工トランスポゾンを用いた遺伝子増幅方法 |
JP4035855B2 (ja) | 1996-06-05 | 2008-01-23 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
JP4168463B2 (ja) | 1996-12-05 | 2008-10-22 | 味の素株式会社 | L−リジンの製造法 |
CN1170938C (zh) | 1998-09-25 | 2004-10-13 | 味之素株式会社 | 构建产生氨基酸的细菌的方法及通过发酵该经构建的产生氨基酸的细菌以制备氨基酸的方法 |
CN1296345C (zh) | 1999-12-27 | 2007-01-24 | 旭化成株式会社 | 生产甘氨酸的方法 |
US7314974B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-01-01 | Monsanto Technology, Llc | Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties |
JP4380305B2 (ja) | 2003-11-21 | 2009-12-09 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−アミノ酸の製造法 |
RU2007147436A (ru) | 2007-12-21 | 2009-06-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Бактерия-продуцент (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина и способ продукции (2s,3r,4s)-4-гидрокси-l-изолейцина |
-
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-
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001340097A (ja) | 2000-06-01 | 2001-12-11 | Asahi Kasei Corp | グリシンを微生物学的に製造する方法 |
JP2002191357A (ja) | 2000-12-28 | 2002-07-09 | Asahi Kasei Corp | 新奇グリシンデヒドロゲナーゼ活性を有する微生物菌体およびそれを用いたグリシンの製造方法 |
JP2015525561A (ja) | 2012-07-11 | 2015-09-07 | 味の素株式会社 | ジペプチド合成酵素(バリアント)をコードするdna、エシェリヒア属に属する細菌、およびそれらを用いるジペププドの生産方法 |
US20150111261A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-04-23 | Mitsui Chemicals, Inc. | L-threonine-producing escherichia coli and method for producing l-threonine using the same |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Bowyer A. et al.,Structure and function of the l-threonine dehydrogenase (TkTDH) from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis,J Struct Biol,2009年,Vol. 168(2),pp. 294-304 |
Lin Z. et al.,Metabolic engineering of Escherichia coli for poly(3-hydroxybutyrate) production via threonine bypass,Microb Cell Fact,2015年,Vol. 14:185,pp. 1-12 |
Marcus JP. et al.,Threonine formation via the coupled activity of 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A lyase and threonine dehydrogenase,J Bacteriol,1993年,Vol. 175(20),pp. 6505-6511 |
Zou Y. et al.,Enhancement of 5-aminolevulinic acid production by metabolic engineering of the glycine biosynthesis pathway in Corynebacterium glutamicum,Biotechnol Lett,2017年05月23日,Vol. 39(9),pp. 1369-1374 |
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