JP6970708B2 - ジアミンを生産する微生物及びそれらを用いてジアミンを生産する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ジアミン生産能を有する微生物及びそれを用いてジアミンを製造する方法に関する。

バイオジェニックアミン（biogenic amines、BAs）は、アミノ酸の脱炭酸作用、アルデヒドとケトンのアミノ化とアミノ基転移反応により主に生成される窒素化合物である。このようなバイオジェニックアミンは低分子量であり、微生物、植物と動物の代謝過程で合成されるため、これらの細胞でよく発見される構成要素として知られている。特に、スペルミジン（spermidine）、スペルミン（spermine）、プトレシン（putrescineまたは1,4-butanediamine）及びカダベリン（cadaverine）などのようなポリアミン（polyamine）が代表的な物質として挙げられる。

一般に、プトレシンはアジピン酸（adipic acid）と反応してポリアミンナイロン−４
，６を合成する重要な原料物質であり、主にプロピレン（propylene）からアクリロニト
リル（acrylonitrile）及びスクシノニトリル（succinonitrile）を経る化学合成法によ
り生産される。

一方、微生物を用いてプトレシンを製造する方法としては、大腸菌とコリネバクテリウムを形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開された（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３)。 さらに、プトレシントランスポーター（transporter）に関する研究が大腸菌、酵母、植物及び動物細胞を対象に活発に行
われている（非特許文献４）。

一方、カダベリンは、動物組織の腐敗中にタンパク質の加水分解により生成される嫌な臭いを有するジアミン化合物である。カダベリンはＮＨ_２（ＣＨ_２）_５ＮＨ_２の化学式を有し、プトレシンと類似した面がある。

前記カダベリンは、ポリアミドやポリウレタンのような高分子の構成要素、キレート剤または他の添加剤として用いることができる。特に、年間３５０万トンの世界市場を有しているポリアミド−５，４は、カダベリンやコハク酸を重縮合することにより製造されることが知られており、産業の基盤となる化合物として大きな注目を集めている。

このようなカダベリンは、いくつかの微生物から発見されるジアミンであり（非特許文献５）、グラム陰性バクテリアである大腸菌においてＬ−リジンからＬ−リジンデカルボキシラーゼ（decarboxylase）を用いて直接生合成される。大腸菌内のカダベリン濃度は
カダベリンの生合成と分解、吸収と放出により調節される（非特許文献６）。

国際特許公開ＷＯ０６／００５６０３号公報 国際特許公開ＷＯ０９／１２５９２４号公報 国際特許公開ＷＯ２００９／０９６６８９公報 大韓民国登録特許第０６２００９２号公報 国際特許公開ＷＯ２００６／０６５０９５公報 大韓民国公開特許第２０１３−００８２４７８号公報 国際特許公開ＷＯ２００９／１２５９９２公報 韓国登録特許第１０−０１５９８１２号公報

Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104: 4, 651-662,2009 Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88: 4, 859-868, 2010 Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95, 169-178., 2012 K Igarashi、Plant Physiol. Biochem. 48：506-512,2010 Tabor and Tabor, MicrobiolRev., 49：81-99,1985 Soksawatmaekhin etal., MolMicrobiol., 51：1401-1412,2004 Biotechnology letters vol13, No.10,p.721-726,1991

本発明者らは、プトレシンまたはカダベリンのようなジアミンの排出能を有しているタンパク質を究明してジアミン生産能を有する微生物からジアミンの生産能を増加させるために鋭意努力した結果、コリネバクテリウム・エフィシエンス由来のタンパク質またはそれとアミノ酸配列相同性が高いタンパク質がジアミン排出能を有し、これをジアミン生産能を有する微生物に導入してその活性を強化させた結果、プトレシン及びカダベリンのようなジアミンの排出能を顕著に増加させることを確認し、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、ジアミン生産能を有する微生物を提供することにある。

本発明の他の目的は、（ｉ）前記ジアミン生産能を有する微生物を培養して培養物を得るステップ、及び（ｉｉ）前記培養された微生物または培養物からジアミンを回収するステップとを含む、ジアミンの生産方法を提供することにある。

本発明では、コリネバクテリウム・エフィシエンス由来のＣＥ２４９５タンパク質がジアミン排出能を有するタンパク質であることを究明し、プトレシン生産経路を有しているが、排出能の低いコリネバクテリウム属菌株に、前記タンパク質の活性を導入してプトレシン排出能を強化させることを確認した。また、プトレシンとカダベリン生産経路を有している大腸菌にも、前記タンパク質の活性を導入する場合、プトレシンとカダベリンが同時に増加することを確認した。従って、コリネバクテリウム・エフィシエンス由来のＣＥ２４９５タンパク質をジアミン生産能を有する微生物に適用することにより、ジアミンの効果的な生産をもたらすことができる。

前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、配列番号６で表されるアミノ酸配列またはこれと５５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が導入または強化された、ジアミン生産能を有する微生物を提供する。

本発明における用語「ジアミン」とは、アミン基を二つ有する化合物を総称し、具体的な例としてプトレシンとカダベリンが挙げられる。プトレシンはテトラメチレンジアミン（tetramethylenediamine）であり、オルニチンを前駆体として生成することができる。
カダベリンは、１，５−ペンタンジアミン（1,5-pentanediamine）またはペンタメチレンジアミン（pentamethylenediamine）と命名され、リジンを前駆体として生成することが
できる。前記のようなジアミンはポリアミンナイロン、ポリアミドやポリウレタンのよう
な高分子で合成することができる原料物質として重要な価値のある産業応用性を有する基盤化合物である。

本発明における用語「配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）に存在するタンパク
質であり、ＣＥ２４９５とも命名される。前記タンパク質は、コリネバクテリウムの膜タンパク質であるＮＣｇｌ２５２２と高い相同性を有することが見出された。本発明の一実施例では、前記ＣＥ２４９５タンパク質がジアミン生産能を有する菌株内でジアミンの排出に関与していると推定され、ジアミンの生産能を顕著に増加させることが解明された。

ここで、前記配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＣＥ２４９５タンパク質は、代表的なものとして配列番号５で表されるヌクレオチド配列によってエンコードされるタンパク質が挙げられる。ただし、前記ＣＥ２４９５タンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドンの縮退性（degeneracy）により、または前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に様々な改変がなされることが可能であり、ＣＥ２４９５タンパク質は、前記配列番号５で表されるヌクレオチド配列以外にも、様々なヌクレオチド配列によってコードされ得る。

また、本発明において、前記ＣＥ２４９５タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列だけでなく、前記配列と５５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であって、実質的にジアミン排出能を有するタンパク質であれば制限なく含まれ、このような相同性を有する配列であり、実質的に配列番号６のタンパク質と同一またはそれに相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれることは自明である。

本発明における用語「配列番号６で表されるアミノ酸配列と５５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号６で表されるアミノ酸配列と５５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むとともに、実質的にジアミン排出能を有するタンパク質である場合、制限なく含まれることを意味する。一例として、配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられるが、それに限定されるものではない。

例えば、前記配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）に存在するタンパク質であり、ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６とも命名される。前記タンパク質は、コリネバクテリウムの膜タンパク質であるＮＣｇｌ２５２２とは５９％の相同性を有し、コリネバクテリウム・エフィシエンスのＣＥ２４９５とは６１％の相同性を有することが見出された。本発明の一実施例では、前記ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６タンパク質がジアミン生産能を有する菌株内にジアミンの排出能を有し、ジアミンの生産能を顕著に増加させることが明らかになった。

配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６タンパク質としては、代表的なものとして配列番号２１で表されるヌクレオチド配列でエンコードされるタンパク質が挙げられる。ただし、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドンの縮退性により、または前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に様々な改変がなされることが可能であり、前記配列番号２１で
表されるヌクレオチド配列以外にも、様々なヌクレオチド配列によってコードされ得る。

また、前記配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質は、コリネバクテリウム・リポフィロフラバム（Corynebacterium lipophiloflavum）に存在するタンパク質であり、
ＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２とも命名される。前記タンパク質は、コリネバクテリウムの膜タンパク質であるＮＣｇｌ２５２２とは５２％の相同性を有し、コリネバクテリウム・エフィシエンスのＣＥ２４９５とは５６％の相同性を有することが見出された。本発明の一実施例では、前記ＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２タンパク質がジアミン生産能を有する菌株でジアミンの排出能を有し、ジアミンの生産能を顕著に増加させることが解明された。

配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２タンパク質としては、代表的なものとして配列番号２３で表されるヌクレオチド配列でエンコードされるタンパク質が挙げられる。ただし、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドンの縮退性により、または前記タンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、コード領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に様々な改変がなされることが可能であり、前記配列番号２３で表されるヌクレオチド配列以外にも、様々なヌクレオチド配列によってコードされ得る。

本明細書において、配列に関連する用語「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで表わすことができる。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％の相同性」で示される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）
及び類似度（similarity）などの媒介変数（parameter）を計算するための標準ソフトウ
ェア、具体的には、ＢＬＡＳＴ２．０を利用したり、定義された厳格な条件の下でサザンハイブリタイゼーション実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切なハイブリタイゼーション条件は、該当技術の範囲内であり（例えば、Sambrook et al., 1989, infraを参照）、当業者に公知の方法により決定できる。

本発明における用語「ジアミン生産能を有する微生物」とは、ジアミンの生産能を有さない親菌株にジアミンの生産能が付与された微生物、または内在的にジアミン生産能を有する微生物を意味する。具体的にはジアミンの生産能を有する微生物は、プトレシンまたはカダベリンの生産能を有する微生物であってもよい。

前記「プトレシン生産能を有する微生物」は、特にそれに限定されないが、グルタメートからオルニチンまでの生合成経路を強化するためにグルタメートをアセチルグルタメート（N-acetylglutamate）に変換するアセチルグルタメートシンターゼ、またはアセチル
オルニチンをオルニチンに変換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタメートをアセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に変換するアセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタメートセミアルデヒド（N -acetylglutamate semialdehyde）に
変換するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）、またはアセチルグルタメートセミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換す
るアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性を、内在的活性に比べて増加させるように改変することができ、プトレシンの生合成前駆体として用いられるオルニチンの生産性を向上させるように改変されたものであってもよいが、それに限定されるものではない。

また、前記プトレシン生産能を有する微生物は、オルニチンにおいてアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyl transfrase
、ArgF）、グルタメートの排出に関与するタンパク質（ＮＣｇｌ１２２１）、及び／またはプトレシンをアセチル化させるタンパク質（ＮＣｇｌ４６９）の活性を内在的活性に比べて弱化させるように変異され／変異されたり、オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性を導入するように改変されたものであってもよい。

ここで、非限定的な一例として、前記アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ＡｒｇＣ）は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。アセチルグルタメートシンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）は、配列番号１５で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。アセチルグルタメートキナーゼ（ＡｒｇＢ）は、配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）は、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。しかし、各酵素タンパク質のアミノ酸配列は、特にこれに限定されるものではなく、各酵素の活性を有するものであれば、これと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

また、非限定的な一例として、前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）は、配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記グルタメート排出に関与するタンパク質は、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。しかし、各酵素タンパク質のアミノ酸配列は、これに限定されるものではなく、各酵素の活性を有するものであれば、これと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

一方、前記「カダベリン生産能を有する微生物」とは、特にそれに限定されないが、リジン生産能を有する微生物において、さらにリジンデカルボキシラーゼ（lysine decarboxylase、LDC）の活性を導入または強化させた微生物を意味する。一例としてカダベリン
の生産を高めるためにリジンの生産能を向上させた微生物であってもよい。リジンの生産能を向上させるための方法は、従来公知の方法を活用して当業者が十分に予想可能であり、活用することができる。

前記リジンデカルボキシラーゼは、リジンをカダベリンに変換させる活性を有する酵素であり、その活性を導入または強化することにより、効果的にカダベリンを生成することができる。

前記リジンデカルボキシラーゼは、配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、特にこれに限定されるものではなく、前記活性を有するものであれば、これと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくには９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

本発明における用語「生産」とは、ジアミンを菌株内で作り出すことだけでなく、ジアミンを細胞外、例えば培養液として排出することをも含む概念である。

一方、本発明における用語「タンパク質の活性の導入」とは、内在的タンパク質を有さない微生物に、そのタンパク質が有する活性を外部から付与することを意味し、例えば、外部から遺伝子を導入することによって行われる。また、「タンパク質活性の強化」とは、微生物が保有しているか、または導入されたタンパク質の活性状態を内在的活性状態に比べて向上させることを意味する。

前記タンパク質の活性の導入または強化の非限定的な例として、突然変異等により菌株内に存在するタンパク質自体の活性を増大させ、本来の機能以上の効果を導出し／誘導したり、菌株内に存在するタンパク質の内在的遺伝子活性の増加、内部または外部の要因による内在的遺伝子の増幅、遺伝子コピー数の増加、外部からの遺伝子をさらに導入し、プロモーターの交換または改変などにより、その活性が増加することを含むが、それらに限定されるものではない。

前記遺伝子コピー数の増加は、特にそれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形で行われるか、または宿主細胞内の染色体に挿入されることによって行うことができる。具体的には、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製されて機能することのできるベクターを宿主細胞内に導入することによって行われるか、または前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することによって、前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法により行うことができる。

本発明において、ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を改変する方法は、特にこれらに限定されないが、前記発現調節配列の活性を強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換もしくはこれらの組み合わせによって配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに強い活性を有する核酸配列に交換することによって行うことができる。前記発現調節配列は、特にそれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などを含むことができる。

本発明において、プロモーターの交換または改変は、特にこれらに限定されないが、本来のプロモーターよりも強力なプロモーターに交換または改変することによって行うことができる。前記ポリヌクレオチドの発現単位の上流には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結され得るが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがあり、具体的にはコリネバクテリウム由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーターあるいはＣＪ７プロモーターと作動可能に連結され、前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができる。ここで、ｌｙｓＣＰ１プロモーターは、アスパルテートキナーゼ及びアスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドのプロモーター部位塩基配列を置換することにより改良したプロモーターである（特許文献３）。また、ＣＪ７プロモーターは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに由来した強力なプロモーターである（特許文献４及び特許文献５）。

併せて、染色体上のポリヌクレオチド配列の改変は、特にそれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導したり、またはさらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交換することによって行うことができる。

本発明における用語「ベクター」とは、好適な宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように、好適な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することのできるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは好適な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲ
ノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに組み込むことができる。

本発明において用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に公知の任意のベクターを用いることができる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。本発明で使用可能なベクターは、特に限定されるものではなく、公知となった発現ベクターを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

また、細菌内染色体挿入用ベクターを介して、染色体に内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、変異されたポリヌクレオチドに交換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に公知の任意の方法、例えば、相同組換えによって行うことができる。本発明のベクターは、相同組換えを起こして染色体内に挿入されるため、前記染色体に挿入するか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含むことができる。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的のポリヌクレオチドを挿入するか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現などのような選択可能な表現型を付与するマーカーを用いることができる。選択剤（selective agent
）が処理された環境では、選択マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または異なる表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。

本明細書における用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現することができるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内に発現することができるものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべてを含むことができる。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、どのような形で導入されるものであってもかまわない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形で宿主細胞に導入することができる。
前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。

また、前記用語「作動可能に連結された」とは、本発明の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。

また、前記ジアミン生産能を有する微生物は、ジアミンの生産量を増加させるために、ジアミンアセチルトランスフェラーゼ（diamine acetyltransferase）活性が内在的活性
に比べて弱化したものであってもよい。

本発明における用語「ジアミンアセチルトランスフェラーゼ」とは、アセチル−ＣｏＡからアセチル基をジアミンに伝達する反応を媒介する酵素であり、その例としてコリネバクテリウム・グルタミクムＮＣｇｌ１４６９または大腸菌ＳｐｅＧであってもよいが、ジアミン生産能を有する微生物の種類に応じて、その名称は変わり得る。前記ＮＣｇｌ１４６９は、配列番号１１または１２で表されるアミノ酸配列を含むものであり、ＳｐｅＧは配列番号１３で表されるアミノ酸配列が含まれるが、これらの配列は、微生物の種類に応じて異なってもよく、前記ジアミンアセチルトランスフェラーゼの活性を有するものであれば、前記配列番号のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。

前記ジアミンアセチルトランスフェラーゼは、ジアミンをアセチル−ジアミン（例えば、Ｎ−Ａｃ−プトレシンまたはＮ−Ａｃ−カダベリン）に変換させるため、その活性を内在的活性よりも弱化させると、ジアミンの生産能を増加させることができる。

本発明における用語「内在的活性」とは、本来微生物が天然の状態または非改変状態で有しているタンパク質の活性状態を意味し、「内在的活性よりも弱化するように改変される」という意味は、本来、微生物の天然状態または非改変状態で示すタンパク質活性と比較した時、活性がさらに弱化したことを意味する。

このようなタンパク質活性の弱化は、改変されていない菌株に比べてタンパク質の活性が弱化したことを意味し、活性が除去された場合も含まれる。前記タンパク質の活性を弱化させる方法は、当該分野において公知の様々な方法を用いることができる。

前記方法の例として、前記タンパク質の活性が除去された場合を含めて、前記酵素の活性が弱化するように突然変異した遺伝子であって、染色体上の前記タンパク質をコードする遺伝子を代替する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子の発現調節配列を活性の低い配列と交換する方法、前記タンパク質をコードする染色体上の遺伝子の一部または全体を欠損させる方法及び前記染色体上の遺伝子のトランスクリプトームに相補的に結合して前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入する方法、前記タンパク質をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造を形成させ、リボソームの付着を不可能にする方法及び該当配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合
わせによっても達成することができるが、前記例により特に限定されるものではない。

具体的には、タンパク質をコードする遺伝子の一部または全体を欠失させる方法は、細菌内染色体挿入用ベクターを介して、染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失したポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交換することによって行うことができる。前記「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類に応じて異なるが、具体的には、１〜３００個、好ましくは１〜１００個、さらに好ましくは１〜５０個である。

一方、本発明の微生物は、ジアミン生産能を有する微生物であって、前記配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質が発現される原核微生物を含んでおり、その例としては、エシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバク
ター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（E
nterobacter sp.）エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）
、エルウイニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）
、セレノモナス属（Selenomanas sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、シュードモナス属
（Pseudomonas sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、アルカノバクテリ
ウム属（Arcanobacterium sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp．）などに属する
微生物であってもよいが、それらに限定されない。具体的には、本発明の微生物は、コリネバクテリウム属に属する微生物またはエシェリキア属微生物であり、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムまたは大腸菌（Escherichia coli）であるが、それらに限定されない。

具体的な例として、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献６）菌株を用いて、前記菌株からプトレシン排出能を有するタンパク質であるＮＣｇｌ２５２２を欠失させた後、ＣＥ２４９５をトランスポゾン遺伝子内に導入する微生物が挙げられる。これにより、前記微生物は、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５を、ＣＣ０１−０７５７と命名し、ブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに２０１３年１１月１５日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１４７５Ｐが付与された。

もう一つの態様として、本発明は、（ｉ）前記配列番号６で表されるアミノ酸配列またはこれと５５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が導入または強化された、ジアミンの生産能を有する微生物を培養して培養物を得るステップ、及び（ｉｉ）前記培養された微生物または培養物からジアミンを回収するステップとを含む、ジアミンの生産方法を提供する。

前記配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質、これと５５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、タンパク質の活性の導入、タンパク質の活性の強化、ジアミン、及びジアミン生産能を有する微生物については、前述した通りである。

前記方法において、前記微生物を培養するステップは、特にそれに限定されないが、公知の回分式培養法、連続式培養法、流加式培養法などにより行われることが望ましい。この時、培養条件は、特にそれに限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性の化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ ５〜９、好ましくはｐＨ６〜８、最も好ましくはｐＨ ６．８）に調節し、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができ、培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃に維持することができ、約１０〜１６０時間培養することが好ましい。

また、前記培養のために用いられる培地は、炭素源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ひまわり油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを含むが、これらに限定されず、個別にまたは混合して用いることができる。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを含むが、これらに限定されず、個別に用いたり、または混合して用いることができる。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを含むが、これらに限定されず、個別にまたは混合して用いることができる。
その他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。本明細書における前記培地は、培養液と同じ意味で用いられる。

本発明における用語「培養物」とは、微生物の培養の結果として得られる物質であって、前記培地、培養された微生物、及び培養された微生物から分泌される物質を全て含むものであってもよい。例えば、菌体を培養するために必要な栄養供給源、例えば、炭素源、窒素源などの外に、無機塩成分、アミノ酸、ビタミン、核酸、及び／またはその他の一般的に培養培地（または培養液）に含有される成分が含まれてもよい。また、例えば、菌体が生産・分泌された目的物質または酵素などが含まれてもよい。

培養によって生産されたジアミンは、培地中に分泌されたり、細胞内に残留することがあるので、前記培養物は微生物の培養によって生産されたジアミンを含んでもよい。

本発明の前記培養ステップで生産されたプトレシンまたはカダベリンなどのジアミンを回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養法などにより、当該分野で公知の好適な方法を用いて、培養液から目的とするアミノ酸を収集することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

参照例１．プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物の製作
プトレシン生成能を有するコリネバクテリウム属微生物であって、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献６）、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株ＤＡＢ１２−ａ△ＮＣｇｌ１４６９（ａｒｇＦ欠損、ＮＣｇｌ１２２１欠損、大腸菌ｓｐｅＣ導入、ａｒｇオペロンプロモーター置換、ＮＣｇｌ１４６９欠損：ＤＡＢ１２−ｂと命名、特許文献６）からＭＦＳ（major facilitator superfamily）に属するパ
ーミアーゼ（ｐｅｒｍｅａｓｅ）であるＮＣｇｌ２５２２を欠失させたとき、プトレシン生産量が減少したことを確認した。

また、同様にＫＣＣＭ１１２４０ＰまたはＤＡＢ１２−ｂにＮＣｇｌ２５２２遺伝子をトランスポゾン内にさらに導入、または染色体上のＮＣｇｌ２５２２のプロモーターをｃｊ７プロモーターに置換してＮＣｇｌ２５２２活性を強化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株が、高収率でプトレシンを生産した。また、ＮＣｇｌ２５２２発現を強化させた菌株内プトレシン含量を測定した結果、対照群に比べてプトレシン量が少ないことを確認することにより、ＮＣｇｌ２５２２がプトレシンを細胞外に排出する機能があることを確認した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子の塩基配列に基づいてＮＣｇｌ２５２２のＮ末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号１及び２のプライマー対と、ＮＣｇｌ２５２２のＣ末端部位の相同組換え断片を得るための、配列番号３及び４のプライマー対を下記表１の通り用いた。

前記コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、２双のプライマーをそれぞれ用いてＰＣＲを行い、Ｎ末端部位とＣ末端部位のＰＣＲ断片をそれぞれ取得した後、これを電気泳動して目的とする断片を得た。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長過程を３０回繰り返した。これから得られたＮ末端部位の断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで、Ｃ末端部位の断片を制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理し、処理された断片を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理されたｐＤＺベクターにクローニングしてプラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を作製した。

前記プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２４０Ｐに導入して形質転換体を得て、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ−ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolin-β-D-galactoside）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（ブレインハートインフュージョン３７g/l、ソルビトール９１ｇ／ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。これから形成されたコロニーのうち、青色のコロニーを選択することにより、前記プラスミドｐＤＺ−１’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選抜した。

前記選抜された菌株をＣＭ培地（グルコース１０ｇ/ｌ、ポリペプトン１０ ｇ/ｌ、酵
母エキス５g/ｌ、牛肉エキス５g/ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ/ｌ、ウレア２ｇ/ｌ、ｐＨ６．
８）に接種し、３０℃で８時間振とう培養し、それぞれ１０^−４から１０^−１０まで順次希釈した後、Ｘ−ｇａｌ含有固体培地に塗抹し、培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニーのうち、相対的に低い割合で現われる白色のコロニーを選択し、ＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子が欠失してプトレシンの生産性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株を作製した。このように製作されたプトレシン排出能が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２と命名した。

同様に、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記表１表される２双のプライマーそれぞれを用いてＰＣＲを行い、前記記載の方法によりプラスミドｐＤＺ−２’ＮＣｇｌ２５２２（Ｋ／Ｏ）を作製した。前記ベクターを用いて、前記に明記された方法によりＤＡＢ１２−ｂ菌株のＮＣｇｌ２５２２をコードする遺伝子が欠失してプトレシンの生産性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株を作製した。このように製作されたプトレシン排出能が弱化したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株をＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２と命名した。

実施例１．コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）にお
けるＣＥ２４９５の選別
参照例１で確認したところによると、ＮＣｇｌ２５２２がコードする膜タンパク質がプトレシンを細胞外に排出する機能があることを示した。そこで、本発明者は、ＮＣｇｌ２５２２のアミノ酸配列に基づいて、米国国立生物情報センター（NCBI、www.ncbi.nlm.nih.gov）のＢｌａｓｔＰプログラムを通じて、相同性がある遺伝子を確保した。

そのうち、コリネバクテリウム・グルタミクム以外に、コリネバクテリウム属のうち、ＮＣｇｌ２５２２アミノ酸配列と７１％の相同性を有するコリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ−３１４のＣＥ２４９５の塩基配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）を確保した。

また、前記と同様の方法でＮＣｇｌ２５２２アミノ酸配列と５９％の相同性を示すコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）ＤＳＭ２０３０６由来のＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６塩基配列（配列番号２１）及びアミノ酸配列（配列番号２２）、及びＮＣｇｌ２５２２アミノ酸配列と５２％の相同性を示すコリネバクテリウム・リポフィロフラバム（Corynebacterium lipophiloflavum）ＤＳＭ４４２９１
由来のＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２の塩基配列（配列番号２３）及びアミノ酸配列（配列番号２４）を確保した。ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６のアミノ酸配列とＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２のアミノ酸配列は、下記表２に示すようにコリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ−３１４のＣＥ２４９５アミノ酸配列とそれぞれ６１％、５６％の相同性を示した。

一方、ＮＣｇｌ２５２２と相同性を示す遺伝子を有するコリネバクテリウム属微生物及びその相同性を下記表３に示した。

実施例２．コリネバクテリウム属由来プトレシン生産菌株へのＣＥ２４９５導入によるプトレシン発酵
＜２−１＞ ＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株における染色体内トランスポゾン遺伝子内へのＣＥ２４９５導入
参照例１で作製したプトレシン排出能が減少したＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２において、ＣＥ２４９５遺伝子を染色体内に挿入することによるプトレシン排出効果を確認するために、ＣＥ２４９５を下記のような過程でトランスポゾン遺伝子内に導入した。

コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて染色体内遺伝子導入を可能にする形質転換用ベクターとしてｐＤＺＴｎ（特許文献７）を用い、プロモーターはｃｊ７（特許文献５）を用いた。

ＣＥ２４９５遺伝子は、コリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ−３１４菌株の染色
体を鋳型として、配列番号９及び１０のプライマー対（表４を参照）を用いて約１．４４ｋｂの遺伝子断片を増幅した。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒間の伸長過程を３０回繰り返した。その後、このＰＣＲ結果を０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して精製した。

また、ｃｊ７プロモーター部位は、ｐ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐを鋳型として、配列番号７及び８のプライマー対（表４参照）を用いて９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の過程を３０回繰り返して得た。ｃｊ７プロモーター遺伝子断片は、０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して精製した。

ｐＤＺＴｎベクターは、ＸｈｏＩを処理し、前記で得られた各ＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ◎ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５と命名した。

その後、前記プラスミドｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５を参照例１に記載のコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２に電気穿孔法（electroporation）を用いて導入することによって形質転換体を取得し、該形質転換
体をＣＭ培地（グルコース１０ｇ／ｌ、ポリペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、牛肉エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ、ウレア２ｇ／ｌ、ｐＨ６．８）で振とう
培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０^−４から１０^−１０まで順次希釈した後、Ｘ−ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養し、コロニーを形成させた。

形成されたコロニーのうち、相対的に低い割合で現われる白色のコロニーを選択することにより２次交差（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）を行い、ＣＥ２４９５をコードする遺伝子が導入された菌株を最終選抜した。最終選抜された菌株を対象に配列番号７及び１０のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＣＥ２４９５をコードする遺伝子が導入されたことを確認し、前記コリネバクテリウム・グルタミクム変異株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７ ）−ＣＥ２４９５と命名した。

＜２−２＞ ＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株における染色体内トランスポゾン遺伝子内へのＣＥ２４９５導入
参照例１で作製したプトレシン排出能が弱化したＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２において、ＣＥ２４９５遺伝子を染色体内に挿入することによるプトレシン排出効果を確認するために、先に製作したｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５を実施例＜２−１＞と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミクムＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２に形質転換してトランスポゾン内にＣＥ２４９５が導入されたことを確認した。

これより選抜されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株をＤＡＢ１２−ｂ△ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５と命名した。

＜２−３＞ ＣＥ２４９５が導入されたコリネバクテリウム属由来のプトレシン生産菌株におけるプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株において、ＣＥ２４９５導入時にプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例＜２−１＞及び＜２−２＞で製作されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株を対象に、プトレシン生産能を比較した。

具体的には、６種のコリネバクテリウム・グルタミクム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ；ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ △ＮＣｇｌ２５２２；ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ △ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５；ＤＡＢ１２−ｂ；ＤＡＢ１２−ｂ △ＮＣｇｌ２５２２；ＤＡＢ１２−ｂ △ＮＣｇｌ２５２２Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５）をそ
れぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、牛肉エキス０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ウレア０．２％、５０％Ｎ
ａＯＨ １００μｌ、寒天２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培
養した。これより培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース８％、大豆タンパク質０．２５％、トウモロコシ固形０．５０％、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ４％、ＫＨ_２ＰＯ
_４ ０．１％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０５％、ウレア０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、カルシウム−パントテン酸３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ_３ ５％、ｐＨ７．０、１Ｌ基準）に一白金耳程度接種した後、これを３０℃にて２００ｒｐｍで９８時間振とう培養した。すべての菌株の培養時培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表５に示した。

前記表５に示すように、ＣＥ２４９５が導入された２種のコリネバクテリウム・グルタミクム変異株の両方でプトレシンの生産量が増加したことを確認した。

実施例３．コリネバクテリウム属由来のリジン生産菌株ベースにおけるＣＥ２４９５導入、及びリジンデカルボキシラーゼ発現によるカダベリンの発酵
＜３−１＞ Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐにおける染色体内トランスポゾン遺伝子内へのＣＥ２４９５導入

ＣＥ２４９５遺伝子の挿入によるカダベリン排出能を確認するために、リジン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物は、韓国微生物保存センターに１９９５年１２月１８日付で受託番号ＫＦＣＣ１０８８１として寄託された後、ブダペスト条約上の国際寄託機関に再寄託され、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとして寄託番号が付与された。特許文献８）をベースとしてＣＥ２４９５遺伝子を染色体内に挿入した。先に製作したｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５を実施例＜２−１＞と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換してトランスポゾン内ＣＥ２４９５が導入されたことを確認した。

これより選抜されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ
Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５と命名した。

＜３−２＞ ＣＥ２４９５が導入されたＬ−リジン生産菌株への大腸菌由来リジンデカルボキシラーゼ遺伝子導入
実施例＜３−１＞で製作されたＣＥ２４９５が導入されたＬ−リジン生産菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５にカダベリンを生成するための大腸菌
由来のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子をプラスミドの形で導入した。リジンデカルボキシラーゼｌｄｃＣの塩基配列（配列番号２５）及びアミノ酸配列（配列番号２６）をＮＣＢＩのデータベースから確保した。

ｌｄｃＣ遺伝子は、大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型としてＰＣＲ法により配列番号２９と配列番号３０のプライマー対（表６を参照）を用いて、９５℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で２分間の伸長過程を３０回繰り返し、それぞれ２．１ｋｂの遺伝子断片を得た。その後、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩを処理した後、０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して精製した。

また、ｃｊ７プロモーター部位は、ｐ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐを鋳型として、配列番号２７及び２８のプライマー対（表６参照）を用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長過程を３０回繰り返して得た。ｃｊ７プロモーター遺伝子断片は、ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩを処理した後、０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して精製した。

ＫｐｎＩとＸｂａＩを処理したｐＥＣＣＧ１１７(非特許文献７) のベクターを０．８
％のアガロースゲルで電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶出して精製した遺伝子断片、 ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩを処理したｃｊ７プロモーター遺伝子断片、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ処理したリジンデカルボキシラーゼｌｄｃＣ遺伝子断片をＴ４ ＤＮ
Ａ ｌｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いてクローニングした。前記実験で得られた大腸菌ｌ
ｄｃＣをコードしているプラスミドをｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｌｄｃＣと命名した。

前記作製したｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｌｄｃＣベクターまたはｐＥＣＣＧ１１７ベクターをＫＣＣＭ１１０１６Ｐ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５に電気穿孔法を用いて導入した。導入された菌株を２５μｇ／ｍｌのカナマイシンが含まれたＢＨＩＳ平板培地に塗抹して形質転換体を選別した。選別された菌株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ ｐＥＣＣＧ１１７、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｌｄｃＣ、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５ ｐＥＣＣＧ１１７、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５ ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｌｄｃＣと命名した。

＜３−３＞ ＣＥ２４９５が染色体に導入されてリジンデカルボキシラーゼがプラスミドに導入されたコリネバクテリウム属由来リジン生産菌株におけるカダベリン生産能の評価
カダベリン生産菌株において、ＣＥ２４９５導入時にカダベリン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例＜３−２＞で製作されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株を対象に、カダベリン生産能を比較した。

具体的には、４種のコリネバクテリウム・グルタミクム変異株（ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ
ｐＥＣＣＧ１１７； ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｌｄｃＣ； ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５ ｐＥＣＣＧ１１７； ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５ ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｌｄｃＣ ）を下記の方法で培養してカダベリン生産能を比較した。

それぞれのＣＭ平板培地（グルコース１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、牛肉エキス０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、ウレア０．２％、５０％ＮａＯＨ １００μｌ、寒天２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹して３０℃で２４時間培養した。これより培養された各菌株を種培地（グルコース ２％、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ウレア０．１５％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．４％、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．８％、ＭｇＳＯ_４・７
Ｈ_２Ｏ ０．０５％、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム
−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、ｐＨ７．０、１Ｌ基準）２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナー−バプルフラスコに接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。

その後、生産培地（グルコース４％、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ２％、大豆タンパク質２．５％、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５％、ウレア０．３％、ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、カルシウム−パントテン酸２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ロイシン０．２ｇ、トレオニン０．１ｇ、メチオニン０．１ｇ、ＣａＣＯ_３ ５％、ｐＨ７．０、１Ｌ基準）２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナー−バプルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。

培養が終了した後、ＨＰＬＣでＬ−リジンとカダベリンの生産能を測定した。実験した各菌株に対する培養液中のＬ−リジンとカダベリン濃度は下記表７の通りである。

前記表７に示すように、ＣＥ２４９５が導入されたコリネバクテリウム・グルタミクム変異株においてカダベリン生産量が増加したことを確認した。

実施例４．ジアミン排出能を有するタンパク質の導入によるジアミン発酵
＜４−１＞ Ｗ３１１０にＣＥ２４９５、ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６、またはＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２導入した菌株の製作
ＣＥ２４９５と併せて、ＮＣｇｌ２５２２と５９％の相同性を示すコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＤＳＭ２０３０６由来のＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６タンパク質と、ＮＣｇｌ２５２２と５２％の相同性を示すコリネバクテリウム・リポフィロフラバムＤＳＭ４４２９１由来のＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２タンパク質が大腸菌内でジアミン排出活性を有するか否かを確認した。

実施例２−１のｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５製作と同様の方法でＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６とＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６を導入するためのベクターを作製した。

ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６遺伝子は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＤＳＭ２０３０６菌株の染色体を鋳型として、配列番号３１及び３２のプライマー対（表８参照）を用いて約１．４ ｋｂの遺伝子断片を増幅した。

同様にＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２遺伝子は、コリネバクテリウム・リポフィロフラバムＤＳＭ４４２９１菌株の染色体を鋳型として、配列番号３３及び３４のプライマー対（表８参照）を用いて約１．３６ｋｂの遺伝子断片を増幅した。

この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒間の伸長過程を３０回繰り返した。その後、前記ＰＣＲ結果物を０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して精製した。

また、ｃｊ７プロモーター部位は、ｐ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐを鋳型として、配列番号７及び８のプライマー対を用いて、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の過程を３０回繰り返して得た。ｃｊ７プロモーター遺伝子断片は、０．８％のアガロースゲルで電気泳動した後、所望のサイズのバンドを溶離して精製した。

ｐＤＺＴｎベクターは、ＸｈｏＩを処理し、前記で得られた各ＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングは、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ◎ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。その結果として得られたプラスミドをそれぞれｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６、ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２と命名した。

その後、プトレシン生成能とカダベリン生合成経路を有する大腸菌野生型菌株Ｗ３１１０におけるコリネバクテリウム・エフィシエンスＹＳ−３１４のＣＥ２４９５、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス由来のＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６、またはコリネバクテリウム・リポフィロフラバム由来のＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２タンパク質発現時にプトレシンとカダベリンの生産増加効果を確認するために、Ｗ３１１０のコリネバクテリウムと大腸菌シャトルベクターベースのｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５、ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６、またはｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２をそれぞれ導入した。

大腸菌内形質転換は、２Ｘ ＴＳＳ溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用し、これをカナ
マイシン（５０μｇ／ｍｌ）が含有されたＬＢ平板培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａｃｌ １０ｇ、寒天２％、１Ｌ基準）に塗抹して培養することにより、コロニ
ーを形成させた。これから形成されたコロニーをＷ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）
−ＣＥ２４９５、Ｗ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６、Ｗ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２と命名した。

＜４−２＞ ＣＥ２４９５、ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６、ＨＭＰＲＥＦ０２９
８＿０２６２が導入された大腸菌におけるジアミン生産能の比較
前記で得られた菌株を対象に、プトレシンとカダベリン生産能を確認した。
具体的には、大腸菌Ｗ３１１０とＷ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５
、Ｗ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６、Ｗ３１
１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２をＬＢ固体培地にお
いて３７℃で２４時間培養した。

その後、これをそれぞれ２５ｍＬ力価培地（（ＮＨ_４）_２ＰＯ_４ ２ｇ、ＫＨ２ＰＯ_４ ６．７５ｇ、クエン酸０．８５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．７ｇ、微量元素０．５％
（ｖ／ｖ）、グルコース１０ｇ、ＡＭＳ ３ｇ、ＣａＣＯ_３ ３０ｇ、１Ｌ当り）において３７℃で２４時間培養した。微量金属溶液（Trace metal solution）は、１リットル当たり５Ｍ ＨＣｌ：ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ １０ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ２．２５ｇ、
ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ １ｇ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ、Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ ０．２３ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ２ｇ、（ＮＨ_４）_６Ｍｏ_７Ｏ_２・４Ｈ_２Ｏ ０
．１ｇを含む。

各培養物から生産されたプトレシンとカダベリン濃度を測定し、その結果を下記表９に示した。

前記表９に示すように、親菌株Ｗ３１１０に比べて、ＣＥ２４９５が導入されたＷ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＣＥ２４９５菌株において培養物内のプトレシン及びカダベリンの量が多く示された。また、ＨＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６とＨＭＰＲＥＦ０２９８＿０２６２がそれぞれ導入されたＷ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−Ｈ
ＭＰＲＥＦ０２８１＿０１４４６とＷ３１１０ ｐＤＺＴｎ−Ｐ（ｃｊ７）−ＨＭＰＲＥ
Ｆ０２９８＿０２６２菌株の両方でプトレシンとカダベリン生産量が顕著に増加した。

即ち、ＣＥ２４９５アミノ酸配列、またはその配列相同性が５５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性強化により培養液にジアミンの生産量が顕著に増加したことが確認された。このような結果は、ＣＥ２４９５アミノ酸配列、またはこれと配列相同性が５５％以上であるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性強化により、プトレシン及びカダベリンのようなジアミン排出能向上を示唆するものである。

このように、本発明者は、プトレシン生成経路はあるものの、排出機能が弱化したコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２にトランスポゾン内ＣＥ２４９５を導入してＣＥ２４９５活性を強化させたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株が、プトレシン排出能増加し、高収率でプトレシンを生成することができることを確認した。

これにより、前記菌株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ△ＮＣｇｌ２５２２ Ｔｎ：Ｐ（ｃｊ７
）−ＣＥ２４９５をＣＣ０１−０７５７と命名した後、これを２０１３年１１月１５日付でブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１４７５Ｐが与えられた。

寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４７５Ｐ
受託日：２０１３年１１月１５日

本発明では、コリネバクテリウム・エフィシエンス由来のＣＥ２４９５タンパク質がジアミン排出能を有するタンパク質であることを解明し、プトレシン生産経路を有しているが、排出能の低いコリネバクテリウム属菌株に、前記タンパク質の活性を導入してプトレシン排出能を強化させることを確認した。また、プトレシンとカダベリン生産経路を有している大腸菌にも、前記タンパク質の活性を導入すると、プトレシンとカダベリンが同時に増加することを確認した。従って、コリネバクテリウム・エフィシエンス由来のＣＥ２４９５タンパク質をジアミン生産能を有する微生物に適用することにより、ジアミンの効果的な生産をもたらすことができる。

Claims (5)

1. （ｉ）配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が導入または強化された、カダベリン生産能を有する微生物を培養して培養物を得るステップ、及び
   （ｉｉ）前記培養された微生物または培養物からカダベリンを回収するステップ
   とを含む、カダベリンの生産方法。
2. （ｉ）配列番号６と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質の活性が導入または強化された、カダベリン生産能を有する微生物であって、前記配列番号６と５５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２２または２４である、微生物を培養して培養物を得るステップ、及び
   （ｉｉ）前記培養された微生物または培養物からカダベリンを回収するステップ
   とを含む、カダベリンの生産方法。
3. 前記微生物中のジアミンアセチルトランスフェラーゼ活性が内在的活性に比べてさらに弱化したものである、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記ジアミンアセチルトランスフェラーゼは、配列番号１１、１２、及び１３からなるグループから選択されたアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。
5. 前記微生物は、コリネバクテリウム（Corynebacteirum）属微生物またはエシェリキア（Escherichia）属微生物である、請求項１または２に記載の方法。