JP7192314B2 - Adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms, and uses thereof - Google Patents
Adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms, and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- JP7192314B2 JP7192314B2 JP2018163701A JP2018163701A JP7192314B2 JP 7192314 B2 JP7192314 B2 JP 7192314B2 JP 2018163701 A JP2018163701 A JP 2018163701A JP 2018163701 A JP2018163701 A JP 2018163701A JP 7192314 B2 JP7192314 B2 JP 7192314B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- meth
- acrylate
- group
- vinyl
- monomer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Description
本発明は、蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤、並びに、該接着抑制剤を含む生化学分析用ブロッキング剤、バイオフィルム形成抑制コート剤、細胞培養器材処理剤、タンパク質安定化剤及び細胞培養培地添加剤に関する。 The present invention provides an adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms, and a blocking agent for biochemical analysis containing the adhesion inhibitor, a coating agent for inhibiting biofilm formation, a treatment agent for cell culture equipment, a protein stabilizer, and a cell culture medium. Regarding additives.
生化学分析の分野では、抗原抗体反応による特異吸着を利用し、ＤＮＡやタンパク質を検出し可視化する方法が、サザンブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等として広く知られている。抗体は、標的タンパク質以外とも非特異的な吸着反応を起こす。このような非特異的吸着を防ぐために、検出・測定対象表面を、非特異的な吸着は防ぐけれど特異的吸着は妨げないようなブロッキング剤を覆うような前処理が行われる。
ブロッキング剤としては、正常血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルクのような生体由来のタンパク質が知られている（特許文献１、非特許文献１）。また、ブロッキング剤としては、ＴＷＥＥＮ２０と称される界面活性剤、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、（メタ）アクリロイルモルホリンとその他のモノマーとの共重合体なども知られている（特許文献２、３、４）。また、ホスホリルコリン基を側鎖に有する共重合体を用いたブロッキング剤も検討されている（特許文献５、非特許文献２）。
しかし、特許文献１や非特許文献１に開示されるような生体由来のタンパク質は、性能にばらつきが生じやすいという潜在的な課題を有している。ところで、ブロッキング剤には、染色の標的であるタンパク質に染色剤が特異吸着し、発色する際、その発色を妨げないと共に、標的以外のタンパク質を覆い、標的以外のタンパク質には染色剤が吸着せずに発色しないことが求められる。しかし、特許文献２～４に開示される界面活性剤等は、標的のタンパク質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げたり、標的以外のタンパク質を十分には覆えず、標的以外のタンパク質にも染色剤が吸着し、発色してしまったりするなどの課題を有している。さらに、特許文献５に開示される共重合体は、原料のモノマー合成時に複数の反応やそれに伴う精製が必要であるなど生産性に問題を有していた。
In the field of biochemical analysis, Southern blotting, Western blotting, ELISA, immunostaining, and the like are widely known methods for detecting and visualizing DNA and proteins using specific adsorption due to antigen-antibody reaction. Antibodies also cause non-specific adsorption reactions other than target proteins. In order to prevent such non-specific adsorption, the surface of the detection/measurement target is pretreated by covering it with a blocking agent that prevents non-specific adsorption but does not hinder specific adsorption.
As blocking agents, living body-derived proteins such as normal serum, bovine serum albumin, gelatin, and skim milk are known (Patent Document 1, Non-Patent Document 1). Also known as blocking agents are a surfactant called TWEEN 20, hydroxyalkyl cellulose, polyvinyl alcohol, and copolymers of (meth)acryloylmorpholine with other monomers (Patent Documents 2, 3, 4). A blocking agent using a copolymer having a phosphorylcholine group in its side chain has also been investigated (Patent Document 5, Non-Patent Document 2).
However, bio-derived proteins such as those disclosed in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 have a potential problem that performance tends to vary. By the way, the blocking agent specifically adsorbs the staining agent to the protein, which is the target of staining, and when it develops color, it does not interfere with the color development, covers proteins other than the target, and does not adsorb the staining agent to proteins other than the target. It is required that it does not develop color. However, the surfactants and the like disclosed in Patent Documents 2 to 4 cannot prevent color development due to specific adsorption of the staining agent to the target protein, or cannot sufficiently cover proteins other than the target, and stains proteins other than the target. There is a problem that the agent is adsorbed and color develops. Furthermore, the copolymer disclosed in Patent Document 5 has problems in productivity, such as the need for multiple reactions and accompanying purification when synthesizing the raw material monomers.
また、バイオフィルムは生物膜やスライムとも言われ、一般に水系で細菌やカビ等の微生物が物質の表面に付着・増殖することによって微生物細胞内から多糖やタンパク質などの高分子物質を産生して構造体を形成したものを指す。バイオフィルムが形成される前後で比較すると、バイオフィルムが一度形成された場合、洗浄・除去、抗生物質、薬剤、熱、乾燥等に対して著しく高い抵抗性を示す。その結果、付着・増殖した微生物を原因とする危害が発生して様々な産業分野で問題を引き起こす。
例えば、カテーテル等の医療機器の管内に細菌が付着しバイオフィルムを形成することで詰まりの原因となり、処すべき治療を施すことが不可能となる。また、バイオフィルムが剥がれ落ち、細菌の凝集体が体内に侵入し、深刻な疾病となる恐れがある。食品プラントの配管内にバイオフィルムが形成されると、バイオフィルムが剥がれ落ち、製品内への異物混入につながるだけでなく、微生物由来の毒素で食中毒の原因となる。更に、金属表面へのバイオフィルム形成は金属腐食の原因となり、設備の老朽化を促進する。また、水槽の内面にバイオフィルムが形成されると、水槽内の生物に悪影響を及ぼす。
このように、バイオフィルムの形成抑制が求められており、バイオフィルム形成抑制について種々検討されている。
特許文献６では、アルカリ無機塩を主成分とするバイオフィルム崩壊剤に、低分子量のアミンオキシド界面活性剤を含むバイオフィルム用処理剤が開示され、一度形成されたバイオフィルムを、低分子量の界面活性剤によって洗浄する手法が開示されている。しかし、一度形成されたバイオフィルムをはがすことは困難であり、洗浄作業による労働的負担が大きい。また洗浄作業の際、多量の水を使用するため処理問題や環境汚染問題を伴う。特許文献７では、アミノ基及び４級アンモニウム基から選ばれる基を１種類以上有し、かつ、アニオン性基を有するビニル系モノマーに由来する高分子化合物を特徴とする、バイオフィルムの形成を抑制する方法が開示され、該高分子化合物が、微生物の付着防止、殺菌、抗菌作用を発揮し、バイオフィルムの形成を抑制する手法が開示されている。しかし、該高分子化合物は耐水性が劣り、バイオフィルム形成抑制性が不十分である。
Biofilms are also called biofilms or slimes. Generally, microbes such as bacteria and fungi adhere to and proliferate on the surface of a substance in a water system. Refers to the thing that formed the body. Comparing before and after biofilm formation, once a biofilm is formed, it exhibits significantly higher resistance to cleaning/removal, antibiotics, drugs, heat, drying, and the like. As a result, hazards caused by attached and proliferated microorganisms occur, causing problems in various industrial fields.
For example, when bacteria adhere to the inside of a tube of a medical device such as a catheter and form a biofilm, it causes clogging, making it impossible to administer treatment. Biofilms can also slough off and bacterial aggregates can enter the body and cause serious illness. When a biofilm is formed in the pipes of a food plant, the biofilm peels off, which not only leads to contamination of products, but also causes food poisoning due to toxins derived from microorganisms. Furthermore, biofilm formation on metal surfaces causes metal corrosion and accelerates aging of facilities. In addition, the formation of a biofilm on the inner surface of an aquarium adversely affects organisms in the aquarium.
Thus, suppression of biofilm formation is required, and various studies have been made on biofilm formation suppression.
Patent Document 6 discloses a biofilm treatment agent containing a low-molecular-weight amine oxide surfactant in a biofilm-disintegrating agent containing an alkali inorganic salt as a main component. Techniques for cleaning with active agents are disclosed. However, it is difficult to peel off the biofilm once formed, and the labor burden due to cleaning work is large. In addition, since a large amount of water is used during the cleaning work, there are problems of disposal and environmental pollution. In Patent Document 7, a polymer compound derived from a vinyl-based monomer having one or more groups selected from an amino group and a quaternary ammonium group and having an anionic group is used to suppress biofilm formation. A method for preventing the adhesion of microorganisms, a sterilizing effect, and an antibacterial effect are exhibited by the polymer compound, and a method for suppressing biofilm formation is disclosed. However, the polymer compound has poor water resistance and insufficient biofilm formation inhibitory properties.
また、医薬品、農薬などの創薬や食品検査、診断、遺伝子工学等の分野において、細胞を用いた評価が幅広く行われている。従来、細胞の機能や応答を評価する場合には、細胞はシャーレなどに入れられた培地等により培養され、様々な実験に用いられている。しかし、数多くの薬品や導入物質による反応を調べる場合には、細胞の特定の反応を効率よく、短時間で多種類の分析を行い、しかもより少ない試料で結果が得られる評価方法が望まれていた。このような状況において、マイクロチップと呼ばれる細胞培養器材がガラス等の基板上で保持した細胞の化学反応を観察あるいは測定する試みは、操作の簡便化・自動化による分析時間の短縮などのメリットをもたらすと期待され、近年盛んに行われてきている。マイクロチップを利用したシステムの利点としては、サンプルや試薬の使用量あるいは廃液の排出量が軽減され、省スペースで持ち運び可能な安価なシステムの実現が考えられている。例えば非特許文献３には、上記利点を活かし、流路壁面に細胞を付着させたマイクロチップを用いて細胞の機能や応答を評価する研究もなされている。
しかしながら、細胞を用いるマイクロチップでは、デバイスの表面に生物試料由来の細胞や蛋白質による接着が生じ、目詰まりや分析の精度や感度の低下を招くという問題があった。その問題を解消するために、例えば特許文献８には、スルフィニル基を側鎖に有する繰り返し単位を有する重合体を有効成分とする細胞接着防止剤でコーティングされたマイクロ流路デバイスが報告されている。
In addition, evaluation using cells is widely performed in the fields of drug discovery such as pharmaceuticals and agricultural chemicals, food inspection, diagnosis, and genetic engineering. Conventionally, when evaluating cell functions and responses, cells are cultured in a medium or the like placed in a petri dish or the like and used in various experiments. However, when examining the reactions of many chemicals and introduced substances, there is a need for an evaluation method that can efficiently perform a wide variety of analyzes of specific cell reactions in a short time and obtain results with a smaller number of samples. rice field. Under these circumstances, an attempt to observe or measure the chemical reaction of cells held on a substrate such as glass by a cell culture device called a microchip brings advantages such as simplified operation and shortened analysis time through automation. In recent years, it has become popular. As an advantage of a system using a microchip, the amount of samples and reagents used and the amount of waste liquid discharged are reduced, and it is considered that a space-saving, portable and inexpensive system can be realized. For example, Non-Patent Document 3 utilizes the above advantages to conduct research on evaluating the function and response of cells using a microchip in which cells are adhered to the wall surface of a channel.
However, in the microchip using cells, there is a problem that the surface of the device is adhered by cells or proteins derived from a biological sample, which causes clogging and deterioration of accuracy and sensitivity of analysis. In order to solve this problem, Patent Document 8, for example, reports a microfluidic device coated with a cell adhesion inhibitor containing, as an active ingredient, a polymer having a repeating unit having a sulfinyl group in its side chain. .
また、タンパク質はポリペプチド鎖内のファンデルワールス相互作用、水素結合、静電的相互作用などの非共有結合性の弱い極性相互作用によって高次構造が維持されており、このような高次構造により様々な機能が発現されている。これらの結合は外的なさまざまな要因（温度、ｐＨ、塩濃度、タンパク質自身の濃度、界面活性剤、変性剤、二価金属、プロテアーゼの共存）によって変化し、場合によってはタンパク質の構造が壊れて本来の機能が失われた状態となる。そのためタンパク質の安定性は機能的な高次構造を維持する能力と言い換えることができる。
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる必要があり、緩衝溶液中で常に所定の温度にして保存するなど保管条件の最適化や、安定化剤（アルブミンなど他のタンパク質、グリセロース・ポリエチレングリコール・スクロースなどの多価アルコール、グルタミン酸・リジンなどのアミノ酸、グルタチオン・ジチオトレイトールなどの還元剤、ＥＤＴＡなどの金属キレート剤、クエン酸などの有機酸塩、重金属塩、基質、補酵素）を単独又は併用しての使用が検討されている（非特許文献４）。特に合成化合物の安定化剤としては、例えば、特許文献９にはホスホリルコリン基を有する重合体、特許文献１０にはポリエチレングリコール部位を有する高分子化合物、特許文献１１には低分子アミンオキシド化合物、を使用する方法が開示されている。
しかし、これらの方法はタンパク質の種類によっては、保持率や安定期間が満足できるものではない場合があり、更なる改良が求められている。
In addition, the higher-order structure of proteins is maintained by non-covalent weak polar interactions such as van der Waals interactions, hydrogen bonds, and electrostatic interactions within the polypeptide chain. Various functions are expressed by These bonds are changed by various external factors (temperature, pH, salt concentration, concentration of the protein itself, surfactants, denaturants, divalent metals, coexistence of proteases), and in some cases the protein structure is destroyed. It loses its original function. Protein stability can therefore be translated into the ability to maintain a functional conformation.
For this reason, it is necessary to stabilize the protein in an aqueous solution, and optimization of storage conditions such as constant storage at a predetermined temperature in a buffer solution and use of stabilizers (other proteins such as albumin, glycerose, polyethylene, etc.) Polyhydric alcohols such as glycol and sucrose, amino acids such as glutamic acid and lysine, reducing agents such as glutathione and dithiothreitol, metal chelating agents such as EDTA, organic acid salts such as citric acid, heavy metal salts, substrates, coenzymes) The use of them alone or in combination is being studied (Non-Patent Document 4). In particular, as stabilizers for synthetic compounds, for example, a polymer having a phosphorylcholine group in Patent Document 9, a polymer compound having a polyethylene glycol moiety in Patent Document 10, and a low-molecular-weight amine oxide compound in Patent Document 11 are used. A method of using is disclosed.
However, depending on the type of protein, these methods are sometimes unsatisfactory in terms of retention rate and stability period, and further improvement is required.
また、化学物質や医薬品等の薬効及び毒性評価、抗体などの有用物質の大量生産、再生医療等の分野で利用される動物細胞は、シャーレやマルチウェルプレート、袋状容器などの培養容器内で培養されることが多い。培養容器内の細胞は、例えば、培養容器の表面に接着し、培養容器の培養面上で伸展することにより２次元的に増殖する。しかし、２次元的に増殖した細胞は生体内と環境が大きく異なるため、生体内における形態や機能を発現しない場合があり、３次元的な細胞凝集塊を形成させる方が、その機能維持に有利であると言われている。そこで、細胞が接着しにくい培養容器による細胞凝集塊を形成する技術が開示されている。例えば、非特許文献５には、親水性のポリヒドロキシエチルメタクリレートを塗布した培養器具で、肝細胞がスフェロイドを形成することが報告されている。また、特許文献１２には、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体がコーティングされた培養容器が開示されている。
しかし、非特許文献５や特許文献１２に開示されるような技術では、培養容器の表面をコーティング剤で処理するためのコストや時間がかかってしまう。また、ポリスチレン表面に減圧した空気、アルゴンガス等の雰囲気下で高電圧をかけ、プラズマを発生させて表面にラジカルを生成させ、このラジカルに水蒸気や酸素を接触反応させ、水酸基やカルボキシル器などの親水性の官能基を生成させる方法も利用されているが、このような方法では、プラズマ処理後、ポリスチレン表面が徐々に疎水性に変化していき、親水性な表面状態を保持できず、３次元的な細胞凝集塊を形成することができないという問題があった。
In addition, animal cells used in fields such as efficacy and toxicity evaluation of chemical substances and pharmaceuticals, mass production of useful substances such as antibodies, regenerative medicine, etc. often cultivated. Cells in a culture vessel grow two-dimensionally, for example, by adhering to the surface of the culture vessel and spreading on the culture surface of the culture vessel. However, since the environment of two-dimensionally proliferated cells is very different from that in vivo, they may not express their morphology and functions in vivo. It is said that Therefore, techniques for forming cell aggregates using culture vessels to which cells are difficult to adhere have been disclosed. For example, Non-Patent Document 5 reports that hepatocytes form spheroids in a culture device coated with hydrophilic polyhydroxyethyl methacrylate. Further, Patent Document 12 discloses a culture vessel coated with a copolymer of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine and butyl methacrylate.
However, the techniques disclosed in Non-Patent Document 5 and Patent Document 12 require cost and time to treat the surface of the culture vessel with the coating agent. In addition, high voltage is applied to the surface of polystyrene in an atmosphere of decompressed air, argon gas, etc., plasma is generated to generate radicals on the surface, and these radicals are contacted with water vapor or oxygen to form hydroxyl groups, carboxyl groups, etc. A method of generating hydrophilic functional groups is also used, but in such a method, the polystyrene surface gradually changes to hydrophobic after plasma treatment, and the hydrophilic surface state cannot be maintained. A problem was the inability to form dimensional cell aggregates.
また、動物細胞を大量に効率よく培養する技術は、モノクローナル抗体をはじめ有用な生理活性物質の生産に応用されているが、例えばＲＰＭ１１６４０、イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ‘ｓ Ｆ１２などの合成基礎培地に１０～２０％程度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清を添加した培養液が一般に用いられる。しかしながら、培地に血清を加えることは培地コストの上昇を招き、また、血清由来のタンパク質を含む培養液から目的とする生理活性物質を単離することが困難になるなどの欠点がある。また、多くの場合、血清にはロット間に品質のばらつきがみられる。そこで血清の使用に先立ってロットチェックを十分に行い、使用可能な血清を選択する必要があるが、この血清の選択には多くの労力を要する。
上記課題を解決すべく、血清を用いない培地（無血清培地）の検討が行われてきた。
例えば、特許文献１３には、グリシルグリシンを培地に添加することで、動物細胞に高濃度に有用物質を生産させることができることが開示されている。また、特許文献１４には、リン脂質類似構造を有するポリマーを含有する培地で細胞培養した場合に、生理活性物質を効率的に生産できることが開示されている。また、特許文献１５には、疎水性Ｄ－アミノ酸を含有する培地が、細胞増殖を促進させ、有用物質の生産量を増大させることが開示されている。
しかし、従来の無血清培地の多くは、抗体産生細胞の増殖性、生存性及び抗体生産性の面で血清含有培地に比べて十分なものとは言えない。また、抗体産生細胞培養において、培地成分にアミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマーを培地添加剤として用いた効果に関する知見は無い。
Techniques for efficiently culturing animal cells in large quantities have been applied to the production of useful physiologically active substances such as monoclonal antibodies. A culture medium supplemented with animal serum such as fetal bovine serum (FBS) at about 20% is generally used. However, the addition of serum to the medium causes an increase in the cost of the medium, and has the drawback of making it difficult to isolate the target physiologically active substance from the culture medium containing serum-derived proteins. Also, sera often exhibit lot-to-lot quality variability. Therefore, it is necessary to perform a lot check before using the serum to select a usable serum, but the selection of the serum requires a lot of labor.
In order to solve the above problems, studies have been conducted on media that do not use serum (serum-free media).
For example, Patent Document 13 discloses that addition of glycylglycine to a medium enables animal cells to produce useful substances at high concentrations. Further, Patent Document 14 discloses that bioactive substances can be efficiently produced when cells are cultured in a medium containing a polymer having a phospholipid-like structure. In addition, Patent Document 15 discloses that a medium containing a hydrophobic D-amino acid promotes cell growth and increases production of useful substances.
However, many of the conventional serum-free media are not sufficient compared to serum-containing media in terms of growth, viability, and antibody productivity of antibody-producing cells. In addition, there is no knowledge about the effect of using a vinyl polymer having an amine oxide group as a medium component and a mass average molecular weight of 2,000 or more as a medium additive in antibody-producing cell culture.
上記事情に鑑み、本発明の課題は、優れた蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制力を発現する、蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤、並びに、該接着抑制剤を含む各種用途を提供することにある。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide an adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms that exhibits excellent ability to inhibit adhesion of proteins, cells or microorganisms, and various uses including the adhesion inhibitor. It is in.
また、本発明は、標的のタンパク質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げない性能や、標的以外のタンパク質を十分に覆い、標的以外のタンパク質に対する染色剤の非特異吸着を防止し、発色を防止する性能を安定して発現できる、生化学分析用ブロッキング剤を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、標的のタンパク質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げることなく、標的以外のタンパク質を十分に覆い、標的以外のタンパク質に対する染色剤の非特異吸着を防止して発色させない効果を安定して発揮する生化学分析用ブロッキング剤を提供することを目的とする。 In addition, the present invention has the ability to prevent color development due to the specific adsorption of the staining agent to the target protein, and the ability to sufficiently cover proteins other than the target to prevent non-specific adsorption of the staining agent to proteins other than the target and prevent color development. It is an object of the present invention to provide a blocking agent for biochemical analysis that can stably exhibit the ability to That is, the present invention has the effect of sufficiently covering proteins other than the target without hindering the color development due to the specific adsorption of the staining agent to the target protein, and preventing the non-specific adsorption of the staining agent to the protein other than the target to prevent color development. An object of the present invention is to provide a blocking agent for biochemical analysis that exhibits stability.
また、本発明の課題は、安全性、塗工性及び耐水性に優れ、かつ、長期間のバイオフィルム形成抑制を可能とする、バイオフィルム形成抑制コート剤及び該コート剤からなる塗膜を有する、バイオフィルム形成抑制積層体を提供することである。 Further, an object of the present invention is to provide a biofilm formation-inhibiting coating agent that is excellent in safety, coatability and water resistance, and enables long-term biofilm formation suppression, and a coating film comprising the coating agent. , to provide a biofilm formation inhibiting laminate.
また、本発明は、蛋白質吸着性が抑えられ、且つ優れた細胞接着防止効果を発揮する細胞培養器材処理剤、該細胞培養器材処理剤からなる細胞接着防止膜を有する、細胞塊製造に適した細胞培養器材、該器材を具備するメディカルデバイス、及び該細胞培養器材の製造方法を提供することを目的とする。 In addition, the present invention provides a cell cultureware treatment agent that suppresses protein adsorption and exerts an excellent cell adhesion prevention effect, and a cell adhesion prevention film comprising the cell cultureware treatment agent, which is suitable for cell mass production. An object of the present invention is to provide a cell culture device, a medical device equipped with the device, and a method for manufacturing the cell culture device.
また、本発明の課題は、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を用いることで、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質安定化剤を提供することにある。また、該タンパク質安定化剤とタンパク質とを共存させることで、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質の安定化方法を提供することにある。 Another object of the present invention is to use a vinyl-based polymer (A) having an amine oxide group and a mass average molecular weight of 2,000 or more, which enables stable storage without impairing protein functions. , to provide protein stabilizers. Another object of the present invention is to provide a method for stabilizing a protein, which enables stable storage without impairing the function of the protein by coexisting the protein stabilizer and the protein.
また、本発明の目的は、コストや手間の増加を伴わずに３次元的かつ生細胞数の割合が良好な細胞凝集塊を作製するための、細胞培養培地添加剤、該添加剤を含む細胞培養培地、該添加剤を用いた細胞凝集塊の製造方法を提供することにある。 In addition, the object of the present invention is to provide a cell culture medium additive, a cell containing the additive, for producing a three-dimensional cell aggregate with a good ratio of viable cells without increasing costs and labor An object of the present invention is to provide a culture medium and a method for producing cell aggregates using the additive.
また、本発明の目的は、コストや手間の増加を伴わずに、抗体の生産性を高めるための、抗体産生細胞培養培地添加剤、該添加剤を用いた抗体産生細胞の培養方法、細胞培養培地及び抗体の製造方法を提供することにある。 In addition, the object of the present invention is to provide an antibody-producing cell culture medium additive, a method for culturing antibody-producing cells using the additive, and a cell culture method for increasing the productivity of antibodies without increasing costs and labor. An object of the present invention is to provide a medium and a method for producing an antibody.
すなわち、本発明は以下の〔１〕～〔２６〕に関する。 That is, the present invention relates to the following [1] to [26].
〔１〕 アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を含む、蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤。 [1] An adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms, comprising a vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more.
〔２〕 ビニル系ポリマー（Ａ）が、下記一般式１～３で示される少なくともいずれかの構造を有する、〔１〕に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤。 [2] The adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms according to [1], wherein the vinyl polymer (A) has at least one structure represented by the following general formulas 1 to 3.
［一般式１～３中、
Ｘは２価の結合基、
ｙは０又は１、
Ｒ1は炭素数１～６のアルキレン基、
Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ4は水素原子又は炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ5～Ｒ9のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ5～Ｒ9のうちの１つはビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表し、
＊はビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表す。］
[In general formulas 1 to 3,
X is a divalent linking group;
y is 0 or 1;
R 1 is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms;
R 2 and R 3 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
Four of R 5 to R 9 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and one of R 5 to R 9 is compatible with the main chain of the vinyl polymer (A). represents the binding position,
* represents the bonding position with the main chain of the vinyl polymer (A). ]
〔３〕 前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、エチレン性不飽和基を有するモノマーを重合してなるポリマーと酸化剤との反応生成物であり、
前記エチレン性不飽和基を有するモノマーが、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と３級アミノ基とを有するモノマー（ａ）を必須成分として含む、〔１〕又は〔２〕に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤。
[3] the vinyl polymer (A) is a reaction product of a polymer obtained by polymerizing a monomer having an ethylenically unsaturated group and an oxidizing agent;
[1] or [2], wherein the monomer having an ethylenically unsaturated group contains a monomer (a) having one ethylenically unsaturated group and a tertiary amino group in one molecule as an essential component. Adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms.
〔４〕 前記エチレン性不飽和基を有するモノマーが、少なくとも、３級アミノ基を有するモノマー（ａ）と、炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）とを含む、〔３〕に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤。 [4] to [3], wherein the monomer having an ethylenically unsaturated group comprises at least a monomer (a) having a tertiary amino group and a monomer (c) having an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms; Adhesion inhibitor for the described proteins, cells or microorganisms.
〔５〕 〔１〕～〔４〕いずれか１項に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤を含み、前記接着抑制剤中のビニル系ポリマー（Ａ）が、アミンオキシド基を１～１０ｍｍｏｌ／ｇ有するビニル系ポリマー（Ａ）である、生化学分析用ブロッキング剤。 [5] The adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms according to any one of [1] to [4] is included, and the vinyl polymer (A) in the adhesion inhibitor contains 1 to 10 mmol of amine oxide groups. /g of the vinyl-based polymer (A), a blocking agent for biochemical analysis.
〔６〕 前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体である、〔５〕に記載の生化学分析用ブロッキング剤。 [6] The blocking agent for biochemical analysis according to [5], wherein the vinyl polymer (A) is a copolymer comprising a thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer.
〔７〕 基材表面に固定した病理組織に、〔５〕又は〔６〕に記載の生化学分析用ブロッキング剤を接触させた後、前記病理組織中の抗原に、染色用抗体を吸着させ、前記抗原を検出する免疫染色方法。 [7] contacting the biochemical analysis blocking agent according to [5] or [6] with the pathological tissue fixed on the substrate surface, and then adsorbing the staining antibody to the antigen in the pathological tissue; An immunostaining method for detecting the antigen.
〔８〕 チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなるアミンオキシド基含有ビニル系ポリマー（Ａ’）であって、該アミンオキシド基含有ビニル系ポリマー（Ａ’）が、下記一般式１～３で表される少なくともいずれかのアミンオキシド構造を含む、アミンオキシド基含有ビニル系ポリマー（Ａ’）。 [8] An amine oxide group-containing vinyl polymer (A') comprising a thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, wherein the amine oxide group-containing vinyl polymer (A') is represented by the following general formula 1 An amine oxide group-containing vinyl polymer (A') containing at least one of the amine oxide structures represented by -3.
［一般式１～３中、
Ｘは２価の結合基、
ｙは０又は１、
Ｒ1は炭素数１～６のアルキレン基、
Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ4は水素原子又は炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ5～Ｒ9のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ5～Ｒ9のうちの１つはビニル系ポリマー（Ａ’）の主鎖との結合位置を表し、
＊はビニル系ポリマー（Ａ’）の主鎖との結合位置を表す。］
[In general formulas 1 to 3,
X is a divalent linking group;
y is 0 or 1;
R 1 is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms;
R 2 and R 3 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
Four of R 5 to R 9 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and one of R 5 to R 9 is the main chain of the vinyl polymer (A'). represents the bond position of
* represents the bonding position with the main chain of the vinyl-based polymer (A'). ]
〔９〕 〔１〕～〔４〕いずれか１項に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤を含み、前記接着抑制剤が、質量平均分子量が２，０００～１０，０００，０００であるビニル系ポリマー（Ａ）を含む、バイオフィルム形成抑制コート剤。 [9] Contains the protein, cell or microorganism adhesion inhibitor according to any one of [1] to [4], wherein the adhesion inhibitor has a mass average molecular weight of 2,000 to 10,000,000. A biofilm formation-inhibiting coating agent containing a vinyl-based polymer (A).
〔１０〕 前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、アミンオキシド基を０．２５～５ｍｍｏｌ／ｇ含む〔９〕に記載のバイオフィルム形成抑制コート剤。 [10] The biofilm formation-inhibiting coating agent according to [9], wherein the vinyl polymer (A) contains 0.25 to 5 mmol/g of an amine oxide group.
〔１１〕 基材上に、〔９〕又は〔１０〕に記載のバイオフィルム形成抑制コート剤からなる塗膜を有する、バイオフィルム形成抑制積層体。 [11] A biofilm formation-inhibiting laminate having a coating film made of the biofilm formation-inhibiting coating agent according to [9] or [10] on a substrate.
〔１２〕 〔１〕～〔４〕いずれか１項に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤を含む、細胞培養器材処理剤。 [12] A treatment agent for cell cultureware, comprising the protein, cell or microorganism adhesion inhibitor according to any one of [1] to [4].
〔１３〕 前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、アミンオキシド基を０．２５～５ｍｍｏｌ／ｇ含む、〔１２〕に記載の細胞培養器材処理剤。 [13] The agent for treating cell cultureware according to [12], wherein the vinyl polymer (A) contains 0.25 to 5 mmol/g of an amine oxide group.
〔１４〕 前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、カルボキシル基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋性基を有する〔１２〕又は〔１３〕に記載の細胞培養器材処理剤。 [14] The agent for treating cell cultureware according to [12] or [13], wherein the vinyl polymer (A) has at least one crosslinkable group selected from the group consisting of carboxyl groups and hydroxyl groups.
〔１５〕 さらに架橋剤を含む〔１４〕に記載の細胞培養器材処理剤。 [15] The agent for treating cell cultureware of [14], further comprising a cross-linking agent.
〔１６〕 基材上に、〔１〕～〔４〕いずれか１項に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤を含む細胞接着防止膜を有する細胞培養器材。 [16] A cell culture device having, on a substrate, a cell adhesion-preventing film containing the protein, cell or microorganism adhesion inhibitor according to any one of [1] to [4].
〔１７〕 〔１６〕に記載の細胞培養器材を具備する、メディカルデバイス。 [17] A medical device comprising the cell cultureware of [16].
〔１８〕 〔１〕～〔４〕いずれか１項に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤を含む、タンパク質安定化剤。 [18] A protein stabilizer comprising the protein, cell or microorganism adhesion inhibitor according to any one of [1] to [4].
〔１９〕 前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、アミンオキシド基を１～１０ｍｍｏｌ／ｇ含む、〔１８〕に記載のタンパク質安定化剤。 [19] The protein stabilizer of [18], wherein the vinyl polymer (A) contains 1 to 10 mmol/g of amine oxide groups.
〔２０〕 〔１８〕又は〔１９〕に記載のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させることを特徴とする、タンパク質の安定化方法。 [20] A method for stabilizing a protein, which comprises allowing the protein stabilizer of [18] or [19] to coexist with the protein.
〔２１〕 〔１〕～〔４〕いずれか１項に記載の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤を含む、細胞培養培地添加剤。 [21] A cell culture medium additive comprising the protein, cell or microorganism adhesion inhibitor according to any one of [1] to [4].
〔２２〕 前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、アミンオキシド基を１～１０ｍｍｏｌ／ｇ含む、〔２１〕に記載の細胞培養培地添加剤。 [22] The cell culture medium additive of [21], wherein the vinyl polymer (A) contains 1 to 10 mmol/g of amine oxide groups.
〔２３〕 前記細胞が抗体産生細胞である、〔２１〕又は〔２２〕に記載の細胞培養培地添加剤。 [23] the cell culture medium additive of [21] or [22], wherein the cells are antibody-producing cells;
〔２４〕 〔２１〕～〔２３〕いずれか１項に記載の細胞培養培地添加剤を含む、細胞培養培地。 [24] A cell culture medium comprising the cell culture medium additive of any one of [21] to [23].
〔２５〕 前記細胞培養培地における前記ビニル系ポリマー（Ａ）の濃度が０．０１質量％以上１質量％以下である、〔２４〕に記載の細胞培養培地。 [25] The cell culture medium of [24], wherein the concentration of the vinyl polymer (A) in the cell culture medium is 0.01% by mass or more and 1% by mass or less.
〔２６〕 〔２１〕～〔２３〕いずれか１項に記載の細胞培養培地添加剤を含む細胞培養培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成する、細胞凝集塊の製造方法。 [26] A method for producing cell aggregates, comprising culturing cells in a cell culture medium containing the cell culture medium additive according to any one of [21] to [23] to form cell aggregates.
本発明により、優れた蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制力を発現する、蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤、並びに、該接着抑制剤を含む各種用途を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide an adhesion inhibitor for proteins, cells, or microorganisms that exhibits excellent ability to inhibit adhesion of proteins, cells, or microorganisms, and various uses including the adhesion inhibitor.
また、本発明のブロッキング剤は、標的のタンパク質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げない性能や、標的以外のタンパク質を十分に覆い、標的以外のタンパク質に対する染色剤の非特異吸着を防止し、発色を防止する性能を、生体由来のブロッキング剤とは異なり、安定して発現できる。このブロッキング剤を用いることにより、感度よくウエスタンブロッティングや免疫組織染色などの抗原抗体反応を利用した生化学分析を行うことが可能になる。 In addition, the blocking agent of the present invention has a performance that does not interfere with the color development due to the specific adsorption of the staining agent to the target protein, sufficiently covers proteins other than the target, prevents non-specific adsorption of the staining agent to proteins other than the target, The ability to prevent color development can be stably exhibited, unlike biologically-derived blocking agents. By using this blocking agent, biochemical analysis using antigen-antibody reactions, such as western blotting and immunohistochemical staining, can be performed with high sensitivity.
また、本発明により、標的のたんぱく質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げることなく、標的以外のたんぱく質を十分に覆い、標的以外のたんぱく質に対する染色剤の非特異吸着を防止して発色させない効果を発揮する生化学分析用ブロッキング剤を提供することが出来る。これにより、感度よくウエスタンブロッティングや免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法などの抗原抗体反応を利用した生化学分析を行うことが可能になる。例えば、免疫組織染色では、基材表面に固定した病理組織に、本発明の生化学分析用ブロッキング剤を接触させた後、前記病理組織中の抗原に染色用抗体を吸着させて前記抗原を検出できる。 In addition, the present invention has the effect of sufficiently covering proteins other than the target without hindering the coloring due to the specific adsorption of the staining agent to the target protein, preventing the non-specific adsorption of the staining agent to the protein other than the target and preventing color development. It is possible to provide a blocking agent for biochemical analysis that exhibits This makes it possible to perform biochemical analyzes using antigen-antibody reactions such as western blotting, immunohistochemical staining, ELISA, and immunochromatography with high sensitivity. For example, in immunohistochemical staining, the blocking agent for biochemical analysis of the present invention is brought into contact with the pathological tissue fixed on the surface of the base material, and then the staining antibody is adsorbed to the antigen in the pathological tissue to detect the antigen. can.
また、本発明により、安全性、塗工性及び耐水性に優れ、かつ、長期間のバイオフィルム形成抑制を可能とする、バイオフィルム形成抑制コート剤を提供することができる。
本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤は、医療機器、製造設備又は水槽内面等、微生物が付着し、バイオフィルムが形成することが想定される物質表面に、好適に用いることができる。
Further, according to the present invention, it is possible to provide a biofilm formation-inhibiting coating agent that is excellent in safety, coatability, and water resistance, and that enables long-term biofilm formation inhibition.
The biofilm formation-inhibiting coating agent of the present invention can be suitably used on the surfaces of substances on which microorganisms are expected to adhere and form biofilms, such as medical equipment, manufacturing equipment, or the inner surface of water tanks.
また、本発明によれば、細胞毒性が低く、かつ優れた蛋白質や細胞の接着防止効果を有する細胞培養器材処理剤を提供すること、また、細胞塊を簡単に製造することができる細胞培養器材、メディカルデバイス及び細胞培養器材の製造方法を提供することができる。 Further, according to the present invention, it is possible to provide a cell culture ware treatment agent having low cytotoxicity and an excellent effect of preventing adhesion of proteins and cells, and a cell culture ware with which cell aggregates can be easily produced. , a method for manufacturing a medical device and a cell cultureware.
また、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を用いることで、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質安定化剤を提供することできる。また、該タンパク質安定化剤とタンパク質とを共存させることで、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質の安定化方法を提供することができる。 In addition, by using a vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a mass average molecular weight of 2,000 or more, a protein stabilizer that can be stably stored without impairing protein functions is provided. can provide. In addition, by coexisting the protein stabilizer and the protein, it is possible to provide a method for stabilizing the protein that enables stable storage without impairing the function of the protein.
また、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を細胞培養培地添加剤として培地に添加することで、コストや手間の増加を伴わずに簡便に細胞凝集塊の作製を行うことが可能になる。すなわち、本発明により、コストや手間の増加を伴わずに３次元的かつ生細胞数の割合が良好な細胞凝集塊を作製するための、細胞培養培地添加剤、該添加剤を含む細胞培養培地、該添加剤を用いた細胞凝集塊の製造方法を提供することができる。 In addition, by adding the vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a mass average molecular weight of 2,000 or more to the medium as a cell culture medium additive, it is possible to obtain the following results without increasing costs and labor. It becomes possible to easily prepare cell aggregates. That is, according to the present invention, a cell culture medium additive, a cell culture medium containing the additive, for producing cell aggregates that are three-dimensional and have a good ratio of viable cells without increasing costs and labor , can provide a method for producing a cell aggregate using the additive.
また、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を抗体産生細胞培養培地添加剤として培地に添加することで、コストや手間の増加を伴わずに抗体を効率的に生産することができる。また、培養中の抗体産生細胞凝集物の発生が抑制され、目的とする抗体の精製が容易となる。すなわち、本発明により、コストや手間の増加を伴わずに、抗体の生産性及び精製性を高めるための、抗体産生細胞培養培地添加剤、該添加剤を用いた抗体産生細胞の培養方法、細胞培養培地及び抗体の製造方法を提供することができる。 In addition, adding the vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a mass average molecular weight of 2,000 or more to the medium as an antibody-producing cell culture medium additive increases costs and labor. Antibodies can be efficiently produced without In addition, the generation of antibody-producing cell aggregates during culture is suppressed, facilitating the purification of the desired antibody. That is, according to the present invention, an antibody-producing cell culture medium additive, a method for culturing antibody-producing cells using the additive, and a cell Culture media and methods for producing antibodies can be provided.
本発明の蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤は、アミンオキシド基を有し、かつ質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を含むことを特徴とする。ビニル系ポリマー（Ａ）を有することで、優れた蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制性を発現する。 The adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms of the present invention is characterized by containing a vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more. By having the vinyl-based polymer (A), excellent adhesion inhibitory properties for proteins, cells, or microorganisms are exhibited.
＜ビニル系ポリマー（Ａ）＞
本発明のビニル系ポリマー（Ａ）は、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であればよく、従来公知のポリマーを用いることができ、２種以上を併用してもよい。アミンオキシド基のイメージを下記一般式４に示す。式中、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12は、それぞれ独立に有機基を表す。
<Vinyl-based polymer (A)>
The vinyl-based polymer (A) of the present invention may have an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more, and conventionally known polymers can be used. good too. An image of an amine oxide group is shown in Formula 4 below. In the formula, R 10 , R 11 and R 12 each independently represent an organic group.
アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ）は、前記Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12のうち、少なくとも１つがポリマーに連結している。 In the vinyl-based polymer (A) having an amine oxide group, at least one of R 10 , R 11 and R 12 is linked to the polymer.
ビニル系ポリマー（Ａ）へのアミンオキシド基の導入方法は特に限定はされないが、例えば、
（１）１分子中に１つのエチレン性不飽和基と３級アミノ基とを有するモノマー（ａ）を必須成分として含むエチレン性不飽和基を有するモノマーを重合し、得られた重合体を酸化剤で酸化する方法と、
（２）１分子中に１つのエチレン性不飽和基とアミンオキシド基とを有するモノマー（ｂ）を必須成分として含むエチレン性不飽和基を有するモノマーを重合する方法が挙げられる。
Although the method for introducing the amine oxide group into the vinyl polymer (A) is not particularly limited, for example,
(1) polymerizing a monomer having an ethylenically unsaturated group containing a monomer (a) having one ethylenically unsaturated group and a tertiary amino group in one molecule as an essential component, and oxidizing the resulting polymer; a method of oxidizing with an agent;
(2) A method of polymerizing a monomer having an ethylenically unsaturated group containing a monomer (b) having one ethylenically unsaturated group and an amine oxide group in one molecule as an essential component.
また、上記方法以外のものとして、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物や２－イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基含有不飽和化合物と、ヒドロキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンオキシド等のアミンオキシド基含有化合物との反応生成物を用いて共重合したものも用いることができる。 In addition to the above methods, for example, epoxy group-containing unsaturated compounds such as glycidyl (meth) acrylate and isocyanate group-containing unsaturated compounds such as 2-isocyanatoethyl (meth) acrylate, hydroxyethyl-N,N- A copolymer obtained by copolymerizing a reaction product with an amine oxide group-containing compound such as dimethylamine oxide can also be used.
アミンオキシド基の含有量は、例えば、方法（１）でアミンオキシド基を導入した場合は下記数式１によって算出できる。 The content of amine oxide groups can be calculated by the following formula 1, for example, when amine oxide groups are introduced by method (1).
アミンオキシド基の含有量は、例えば、方法（２）でアミンオキシド基を導入した場合は、重合に用いたアミンオキシド基を有するモノマーの量から求めることができる。 The content of amine oxide groups can be determined, for example, from the amount of monomers having amine oxide groups used in the polymerization when amine oxide groups are introduced by method (2).
本発明でアミンオキシド基は、下記一般式１～３のいずれかに該当するものが好ましい。 In the present invention, the amine oxide group preferably corresponds to one of the following general formulas 1 to 3.
［一般式１～３中、
Ｘは２価の結合基、
ｙは０又は１、
Ｒ1は炭素数１～６のアルキレン基、
Ｒ2及びＲ3はそれぞれ独立して炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ4は水素原子又は炭素数１～４のアルキル基、
Ｒ5～Ｒ9のうち４つはそれぞれ独立して水素原子又は炭素数１～６のアルキル基を表し、Ｒ5～Ｒ9のうちの１つはビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表し、
＊はビニル系ポリマー（Ａ）の主鎖との結合位置を表す。］
[In general formulas 1 to 3,
X is a divalent linking group;
y is 0 or 1;
R 1 is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms;
R 2 and R 3 are each independently an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms;
Four of R 5 to R 9 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and one of R 5 to R 9 is compatible with the main chain of the vinyl polymer (A). represents the binding position,
* represents the bonding position with the main chain of the vinyl polymer (A). ]
＜モノマー（ａ）＞
モノマー（ａ）は、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と、水素原子に置換されておらず、不対電子対を有する３級アミノ基とを有するモノマーを示す。３級アミノ基は各種酸化剤により酸化されることでアミンオキシド基化することができる。
<Monomer (a)>
Monomer (a) is a monomer having one ethylenically unsaturated group in one molecule and a tertiary amino group which is not substituted with a hydrogen atom and has an unpaired electron pair. A tertiary amino group can be converted into an amine oxide group by being oxidized with various oxidizing agents.
モノマー（ａ）としては、特に限定はされないが、一般式１の構造を形成するためものとしては例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、
或いは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、
グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物等が挙げられる。
なお、本発明において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」及び「メタクリル」の両者を言い表すものとする。
The monomer (a) is not particularly limited, but examples for forming the structure of general formula 1 include N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N- dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylamide, vinyl N,N-dimethylaminopropionate, vinyl N,N-diethylaminopropionate, N,N-dimethylacrylamide, N,N-dimethyl allylamine, p-dimethylaminomethylstyrene, p-dimethylaminoethylstyrene, p-diethylaminomethylstyrene, p-diethylaminoethylstyrene, N,N-dimethylvinylamine, N,N-diethylvinylamine, N,N-diphenylvinyl amine,
Alternatively, reaction products of unsaturated group-containing acid anhydrides such as maleic anhydride, itaconic anhydride and citraconic anhydride with N,N-dimethyl-1,3-propanediamine and the like,
Examples include reaction products of epoxy group-containing unsaturated compounds such as glycidyl (meth)acrylate and N,N-dimethyl-1,3-propanediamine.
In the present invention, "(meth)acryl" refers to both "acryl" and "methacryl".
一般式３の構造を形成するためのものとしては、例えば、２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジン等が挙げられる。 For forming the structure of general formula 3, for example, 2-vinylpyridine, 3-vinylpyridine, 4-vinylpyridine, 2-methyl-3-vinylpyridine, 2-methyl-4-vinylpyridine, 3 -methyl-4-vinylpyridine, 2-methyl-5-vinylpyridine, 3-methyl-5-vinylpyridine, 4-methyl-5-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-4-vinylpyridine, 2- (t-butyl)-5-vinylpyridine and the like.
一般式２の構造を形成するためのものとしては、例えば、１－ビニルイミダゾール、
２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾール等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 2, for example, 1-vinylimidazole,
2-methyl-1-vinylimidazole, 4-methyl-1-vinylimidazole, 5-methyl-1-vinylimidazole, 4-(t-butyl)-1-vinylimidazole and the like.
モノマー（ａ）に由来する三級アミン基は、各種酸化剤を使用することでアミンオキシド基化することができる。これによりビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を導入することができる。 A tertiary amine group derived from the monomer (a) can be converted into an amine oxide group by using various oxidizing agents. Thereby, an amine oxide group can be introduced into the vinyl-based polymer (A).
酸化剤としては、特に限定はされないが、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等の過酸化物やオゾンが挙げられる。 The oxidizing agent is not particularly limited, but includes peroxides such as hydrogen peroxide, ammonium persulfate, sodium persulfate, peracetic acid, metachloroperbenzoic acid, benzoyl peroxide, and t-butyl hydroperoxide, and ozone. .
＜モノマー（ｂ）＞
モノマー（ｂ）とは、１分子中に１つのエチレン性不飽和基とアミンオキシド基とを有するモノマーを示す。アミンオキシド基を有するモノマー（ｂ）を重合することで、ビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を組み込むことができる。モノマー（ｂ）としては、特に限定はされないが、上記モノマー（ａ）の有する３級アミン基をアミンオキシド基に置換したものが挙げられる。
<Monomer (b)>
Monomer (b) refers to a monomer having one ethylenically unsaturated group and one amine oxide group in one molecule. An amine oxide group can be incorporated into the vinyl-based polymer (A) by polymerizing the monomer (b) having an amine oxide group. The monomer (b) is not particularly limited, but includes those obtained by substituting an amine oxide group for the tertiary amine group of the above monomer (a).
＜モノマー（ｃ）＞
モノマー（ｃ）は、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と炭素数４～１８のアルキル基とを有するモノマーを示す。ビニル系ポリマー（Ａ）は炭素数４～１８のアルキル基を有することで、極性が制御され、標的以外のタンパク質への吸着性能が向上させることができる。
<Monomer (c)>
Monomer (c) is a monomer having one ethylenically unsaturated group and an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms in one molecule. Since the vinyl polymer (A) has an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms, the polarity can be controlled and the adsorption performance to proteins other than the target can be improved.
モノマー（ｃ）としては、特に限定はされないが、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；
１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和モノマーなどが挙げられる。
Monomer (c) is not particularly limited, but butyl (meth)acrylate, pentyl (meth)acrylate, heptyl (meth)acrylate, 2-ethylhexyl (meth)acrylate, octyl (meth)acrylate, nonyl (meth)acrylate. Alkyl (meth)acrylates such as , decyl (meth)acrylate, dodecyl (meth)acrylate, cyclohexyl (meth)acrylate;
Examples include α-olefinic ethylenically unsaturated monomers such as 1-butene, 1-pentene, 1-hexene, 1-octene, 1-nonene and 1-decene.
＜モノマー（ｄ）＞
本発明においてモノマー（ｄ）は、モノマー（ａ）（ｂ）（ｃ）と共重合可能な、モノマー（ａ）（ｂ）（ｃ）以外の、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有するモノマーを示す。
<Monomer (d)>
In the present invention, the monomer (d) has one ethylenically unsaturated group in one molecule other than the monomers (a), (b), and (c), which are copolymerizable with the monomers (a), (b), and (c). shows the monomers that have
モノマー（ｄ）としては、特に限定はされないが、
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレートなどアルキル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、プロポキシエチル（メタ）アクリレート、ブトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシプロピル（メタ）アクリレート等のアクリルエステル（メタ）アクリレート；
フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族エステル（メタ）アクリレート；
（メタ）アクリル酸アリル、（メタ）アクリル酸１－メチルアリル、（メタ）アクリル酸２－メチルアリル、（メタ）アクリル酸１－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－ブテニル、（メタ）アクリル酸３－ブテニル、（メタ）アクリル酸１，３－メチル－３－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－クロルアリル、（メタ）アクリル酸３－クロルアリル、（メタ）アクリル酸ｏ－アリルフェニル、（メタ）アクリル酸２－（アリルオキシ）エチル、（メタ）アクリル酸アリルラクチル、（メタ）アクリル酸シトロネリル、（メタ）アクリル酸ゲラニル、（メタ）アクリル酸ロジニル、（メタ）アクリル酸シンナミル、ジアリルマレエート、ジアリルイタコン酸、（メタ）アクリル酸ビニル、クロトン酸ビニル、オレイン酸ビニル，リノレン酸ビニル、（メタ）アクリル酸２－（２’－ビニロキシエトキシ）エチルなどのエチレン性不飽和基含有（メタ）アクリル酸エステル類；
パーフルオロメチルメチル（メタ）アクリレート、パーフルオロエチルメチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロブチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロイソノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロデシルエチル（メタ）アクリレート、パーフルオロプロピルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルアミル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルウンデシル（メタ）アクリレートなどの炭素数１～２０のパーフルオロアルキル基を有するパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和モノマーなどの（メタ）アクリレート系モノマー；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリロイロキシエチル－２－ヒドロキシエチルフタル酸、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシビニルベンゼン、１－エチニル－１－シクロヘキサノール、アリルアルコールなどの水酸基を有するモノマー；
マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、シトラコン酸、又は、これらのアルキル若しくはアルケニルモノエステル、フタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、イソフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、テレフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、コハク酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、けい皮酸などのカルボン酸基、若しくはその無水物を有するモノマー；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有するモノマー；
（２－ヒドロキシエチル）メタクリレートアシッドホスフェートなどのリン酸基を有するモノマー；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１～３級アミド基を有するモノマー；
（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマー；
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系モノマー；スチレン、α－メチルスチレン、２－メチルスチレン、クロロスチレン、アリルベンゼン、エチニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー；（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和モノマー；酢酸ビニル、酪酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ヘキサン酸ビニル、カプリル酸ビニル、ラウリル酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；ブチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのビニルエーテル系エチレン性不飽和モノマー； 酢酸アリル、シアン化アリルなどのアリルモノマー；シアン化ビニル、ビニルシクロヘキサン、ビニルメチルケトンなどのビニルモノマー；アセチレン、エチニルトルエンなどのエチニルモノマーパーフルオロブチルエチレン、パーフルオロヘキシルエチレン、パーフルオロオクチルエチレン、パーフルオロデシルエチレンなどのパーフルオロアルキル、アルキレン類などのパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和化合物等の、（メタ）アクリレートではないエチレン性不飽和結合を有するモノマーなどが挙げられる。
Although the monomer (d) is not particularly limited,
Alkyl (meth)acrylate, stearyl (meth)acrylate, cetyl (meth)acrylate, isobornyl (meth)acrylate, methoxyethyl (meth)acrylate, ethoxy Acrylic ester (meth)acrylates such as ethyl (meth)acrylate, propoxyethyl (meth)acrylate, butoxyethyl (meth)acrylate, ethoxypropyl (meth)acrylate;
aromatic ester (meth)acrylates such as phenyl (meth)acrylate, benzyl (meth)acrylate, phenoxyethyl (meth)acrylate;
Allyl (meth)acrylate, 1-methylallyl (meth)acrylate, 2-methylallyl (meth)acrylate, 1-butenyl (meth)acrylate, 2-butenyl (meth)acrylate, 3-(meth)acrylate butenyl, 1,3-methyl-3-butenyl (meth)acrylate, 2-chloroallyl (meth)acrylate, 3-chloroallyl (meth)acrylate, o-allylphenyl (meth)acrylate, (meth)acrylic acid 2-(allyloxy)ethyl, allyllactyl (meth)acrylate, citronellyl (meth)acrylate, geranyl (meth)acrylate, rhodinyl (meth)acrylate, cinnamyl (meth)acrylate, diallyl maleate, diallyl itaconic acid, Ethylenically unsaturated group-containing (meth)acrylates such as vinyl (meth)acrylate, vinyl crotonate, vinyl oleate, vinyl linolenate, and 2-(2'-vinyloxyethoxy)ethyl (meth)acrylate ;
Perfluoromethylmethyl (meth)acrylate, perfluoroethylmethyl (meth)acrylate, 2-perfluorobutylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorohexylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorooctylethyl (meth)acrylate , 2-perfluoroisononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorodecylethyl (meth)acrylate, perfluoropropylpropyl (meth)acrylate, perfluorooctylpropyl (meth)acrylate ) acrylate, perfluorooctyl amyl (meth) acrylate, perfluorooctyl undecyl (meth) acrylate, perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated monomers having a perfluoroalkyl group having 1 to 20 carbon atoms (meth) an acrylate-based monomer;
2-hydroxyethyl (meth)acrylate, 2-hydroxypropyl (meth)acrylate, 4-hydroxybutyl (meth)acrylate, 2-(meth)acryloyloxyethyl-2-hydroxyethyl phthalate, glycerol mono(meth)acrylate , 4-hydroxyvinylbenzene, 1-ethynyl-1-cyclohexanol, monomers having a hydroxyl group such as allyl alcohol;
Maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citraconic acid, or their alkyl or alkenyl monoesters, β-(meth)acryloxyethyl phthalate monoester, β-(meth)acryloxyethyl isophthalic acid, terephthalic acid monomers having a carboxylic acid group such as β-(meth)acryloxyethyl monoester, β-(meth)acryloxyethyl succinate, acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, cinnamic acid, or an anhydride thereof;
monomers having a sulfonic acid group such as vinylsulfonic acid and styrenesulfonic acid;
Monomers with a phosphate group such as (2-hydroxyethyl) methacrylate acid phosphate;
(Meth)acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidone, N-methoxymethyl-(meth)acrylamide, N-ethoxymethyl-(meth)acrylamide, N-propoxymethyl-(meth)acrylamide, N-butoxymethyl-(meth) ) acrylamide, N-pentoxymethyl-(meth)acrylamide, N,N-di(methoxymethyl)acrylamide, N-ethoxymethyl-N-methoxymethylmethacrylamide, N,N-di(ethoxymethyl)acrylamide, N- Ethoxymethyl-N-propoxymethylmethacrylamide, N,N-di(propoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl-N-(propoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(butoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl -N-(methoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(pentoxymethyl)acrylamide, N-methoxymethyl-N-(pentoxymethyl)methacrylamide, N,N-dimethylacrylamide, N,N-diethylacrylamide , a monomer having a primary to tertiary amide group such as diacetone (meth)acrylamide;
(Meth)acrylic acid dimethylaminoethylmethyl chloride salt, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylpropyl)ammonium chloride, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamidopropyl)ammonium chloride, and monomers having a quaternary amino group such as trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylethyl)ammonium chloride;
Polyethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, ethoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, propoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-butoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-pentoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate Acrylate, phenoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, polypropylene glycol (meth) acrylate, methoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, propoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, n-butoxy polypropylene glycol (meth) acrylate , n-pentoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, phenoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, polytetramethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolytetramethylene glycol (meth)acrylate, phenoxytetraethylene glycol (meth)acrylate, hexaethylene Monomers having polyether chains such as glycol (meth)acrylate and methoxyhexaethylene glycol (meth)acrylate;
(Meth)acrylate monomers having a polymer structure in side chains such as ethylenically unsaturated compounds having a polyester chain such as lactone-modified (meth)acrylate; styrene, α-methylstyrene, 2-methylstyrene, chlorostyrene, allyl Aromatic vinyl monomers such as benzene and ethynylbenzene; Nitrile group-containing ethylenically unsaturated monomers such as (meth)acrylonitrile; Vinyl acetate, vinyl butyrate, vinyl propionate, vinyl hexanoate, vinyl caprylate, vinyl laurate, palmitic acid fatty acid vinyl compounds such as vinyl and vinyl stearate; vinyl ether ethylenically unsaturated monomers such as butyl vinyl ether and ethyl vinyl ether; allyl monomers such as allyl acetate and allyl cyanide; Vinyl monomers; Ethynyl monomers such as acetylene and ethynyltoluene Perfluoroalkyl groups such as perfluorobutylethylene, perfluorohexylethylene, perfluorooctylethylene, perfluorodecylethylene, and perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated compounds such as alkylenes Examples include monomers having ethylenically unsaturated bonds that are not (meth)acrylates, such as
以下に、蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤を含む各種用途について詳細を述べる。 Various uses, including protein, cell or microbial adhesion inhibitors, are detailed below.
＜生化学分析用ブロッキング剤＞
本発明のブロッキング剤は、前述のビニル系ポリマー（Ａ）を含む。
本発明でアミンオキシド基の含有量は、１～１０ｍｍｏｌ／ｇであることが好ましく、２～８ｍｍｏｌ／ｇであることが更に好ましい。アミンオキシド基の含有量が上記範囲にあることによって、好適な水溶性を発現すると共に、染色の標的であるタンパク質に対する吸着を抑制しつつ、標的以外のタンパク質への吸着性能を向上できる。
<Blocking agent for biochemical analysis>
The blocking agent of the present invention contains the aforementioned vinyl polymer (A).
In the present invention, the content of amine oxide groups is preferably 1 to 10 mmol/g, more preferably 2 to 8 mmol/g. When the content of the amine oxide group is within the above range, it is possible to exhibit suitable water solubility, suppress adsorption to the protein that is the target of staining, and improve the adsorption performance to proteins other than the target.
本発明でアミンオキシド基は、前述の一般式１～３のいずれかに該当するものが好ましく、上記構造であることによって、好適な水溶性を発現すると共に、染色の標的であるタンパク質に対する吸着を抑制しつつ、標的以外のタンパク質への吸着性能を向上できる。 In the present invention, the amine oxide group preferably corresponds to one of the general formulas 1 to 3 described above, and by having the above structure, it exhibits suitable water solubility and adsorbs to the protein that is the target of staining. It is possible to improve the adsorption performance to proteins other than the target while suppressing it.
本発明では、ビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を方法（１）で導入する場合、モノマー（ａ）を全モノマー中２０～９９．９重量％含むモノマーを重合して得ることが望ましい。 In the present invention, when an amine oxide group is introduced into the vinyl-based polymer (A) by the method (1), it is desirable to polymerize a monomer containing 20 to 99.9% by weight of the monomer (a) in all the monomers.
本発明では、ビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を方法（２）で導入する場合、モノマー（ｂ）を全モノマー中２０～９９．９重量％含むモノマーを重合して得ることが望ましい。 In the present invention, when the amine oxide group is introduced into the vinyl-based polymer (A) by the method (2), it is desirable to polymerize a monomer containing 20 to 99.9% by weight of the monomer (b) in all the monomers.
本発明では、ビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を方法（１）で導入する場合、モノマー（ｃ）を全モノマー中０．１～８０重量％含むモノマーを重合して得ることが望ましい。本発明では、ビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を方法（２）で導入する場合、モノマー（ｃ）を全モノマー中０．１～８０重量％含むモノマーを重合して得ることが望ましい。 In the present invention, when an amine oxide group is introduced into the vinyl-based polymer (A) by the method (1), it is desirable to polymerize a monomer containing 0.1 to 80% by weight of the monomer (c) based on all the monomers. In the present invention, when the amine oxide group is introduced into the vinyl-based polymer (A) by the method (2), it is desirable to polymerize a monomer containing 0.1 to 80% by weight of the monomer (c) based on all the monomers.
＜チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体＞
また、本発明の生化学分析用ブロッキング剤は、チオール基含有化合物（ｘ）とビニ ル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系ポリマー（Ａ） （以下、ビニル系重合体ともいう）を含有してもよい。
アミンオキシド基を有することにより、好適な水溶性を発現すると共に、染色の標的であるタンパク質に対する吸着を抑制しつつ、標的以外のタンパク質への吸着性能を向上できる。またチオール基含有化合物（ｘ）を用いることにより、共重合体にチオール基由来の硫黄原子が導入され、さらに後述の３官能以上のチオール基含有化合物を用いることにより分岐構造が導入される。この硫黄原子や分岐構造の導入は、牛血清アルブミン等生体由来のたんぱく質の構造や、あるいは水溶液中での溶解状態に近づけることができる。
上記により、チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ）を含む本発明の生化学分析用ブロッキング剤は、タンパク質への吸着性が制御され、優れたブロッキング性能を発揮する。
<Copolymer composed of thiol group-containing compound (x) and vinyl-based monomer>
Further, the blocking agent for biochemical analysis of the present invention is an amine oxide group-containing vinyl polymer (A) (hereinafter referred to as vinyl polymer Also called) may be contained.
By having an amine oxide group, it is possible to exhibit suitable water solubility and improve the adsorption performance to proteins other than the target while suppressing adsorption to the protein that is the target of staining. Further, by using the thiol group-containing compound (x), a sulfur atom derived from a thiol group is introduced into the copolymer, and a branched structure is introduced by using a trifunctional or higher thiol group-containing compound described later. The introduction of this sulfur atom or branched structure can approximate the structure of a protein derived from a living body such as bovine serum albumin, or the dissolved state in an aqueous solution.
As described above, the blocking agent for biochemical analysis of the present invention containing the amine oxide group-containing vinyl polymer (A), which is a copolymer composed of the thiol group-containing compound (x) and the vinyl monomer, is capable of adsorbing to proteins. Controlled properties and excellent blocking performance.
これらの中で、チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体は、ポリマーの製造及び精製の観点から、好ましくは下記（ｉ）又は（ｉ）のいずれかである。
（ｉ）アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）を含むビニル系モノマーと、チオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体。
（ｉｉ）３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）を含むビニル系モノマーと、チオール基含有化合物（ｘ）と、からなる共重合体の３級アミノ基に、オキシド化剤を反応させてなる共重合体。
すなわち、アミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ）の製造方法は特に限定はされないが、ポリマーの製造及び精製の観点から、好ましくは下記（１）又は（２）のいずれかである。
（１）アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）を含むビニル系モノマーと、チオール基含有化合物（ｘ）とを共重合する方法。
（２）３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）を含むビニル系モノマーと、チオール基含有化合物（ｘ）とを共重合してなる共重合体の３級アミノ基に、オキシド化剤を反応させる方法。
さらに、より簡便にポリマーを製造及び精製するという点で（ｉｉ）の共重合体であることが好ましく、製造方法としては（２）が好ましい。
Among these, an amine oxide group-containing vinyl polymer, which is a copolymer composed of a thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, is preferably the following (i) or (i).
(i) A copolymer comprising a vinyl monomer containing an amine oxide group-containing vinyl monomer (a1) and a thiol group-containing compound (x).
(ii) reacting a tertiary amino group of a copolymer comprising a vinyl monomer containing a vinyl monomer (a2) having a tertiary amino group and a thiol group-containing compound (x) with an oxidizing agent; copolymer.
That is, the method for producing the amine oxide group-containing vinyl polymer (A) is not particularly limited, but from the viewpoint of polymer production and purification, the following (1) or (2) is preferable.
(1) A method of copolymerizing a vinyl monomer containing an amine oxide group-containing vinyl monomer (a1) and a thiol group-containing compound (x).
(2) an oxidizing agent is added to the tertiary amino group of a copolymer obtained by copolymerizing a vinyl monomer containing a vinyl monomer (a2) having a tertiary amino group and a thiol group-containing compound (x); How to react.
Furthermore, the copolymer of (ii) is preferred in that the polymer can be produced and purified more easily, and the production method of (2) is preferred.
＜ビニル系モノマー＞
チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体は、後述のチオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であり、ビニル系モノマーにより、アミンオキシド基を導入することができる。具体的には、アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）によりアミンオキシド基を導入してもよいし、３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）を用いて共重合体を得た後に、３級アミノ基にオキシド化剤を反応させてアミンオキシド基に変性してもよい。
ビニル系モノマーとしては、重合性の観点から（メタ）アクリレート基若しくは芳香族ビニル基であることが好ましい。
以下に、各ビニル系モノマーについて説明する。
<Vinyl monomer>
The amine oxide group-containing vinyl polymer, which is a copolymer of a thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, is a copolymer of a thiol group-containing compound (x) described below and a vinyl monomer. , a vinyl-based monomer can introduce an amine oxide group. Specifically, an amine oxide group may be introduced by the amine oxide group-containing vinyl-based monomer (a1), or after obtaining a copolymer using a vinyl-based monomer (a2) having a tertiary amino group, A tertiary amino group may be reacted with an oxidizing agent to modify it into an amine oxide group.
From the viewpoint of polymerizability, the vinyl-based monomer is preferably a (meth)acrylate group or an aromatic vinyl group.
Each vinyl monomer is described below.
［アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）］
アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）は、特に限定はされず、市販品を用いてもよいし、合成品を用いてもよく、例えば、後述の３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）の３級アミノ基に、後述のオキシド化剤を反応させてアミンオキシド基としたものを用いてもよい。
[Amine oxide group-containing vinyl monomer (a1)]
The amine oxide group-containing vinyl monomer (a1) is not particularly limited, and a commercially available product or a synthetic product may be used. For example, a vinyl monomer having a tertiary amino group (a2 ) may be reacted with an oxidizing agent to be described later to form an amine oxide group.
本発明では、チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体にアミンオキシド基を方法（１）で導入する場合、アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）は、全ビニル系モノマー中２０～９９．９重量％含むことが望ましい。 In the present invention, when an amine oxide group is introduced by method (1) into an amine oxide group-containing vinyl polymer, which is a copolymer comprising a thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, the amine oxide group-containing vinyl The monomer (a1) is desirably contained in an amount of 20 to 99.9% by weight in all vinyl monomers.
［３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）］
３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）は、３級アミノ基に後述のオキシド化剤を反応させることにより、アミンオキシド構造とすることができる。
[Vinyl monomer having a tertiary amino group (a2)]
The vinyl-based monomer (a2) having a tertiary amino group can be converted to an amine oxide structure by reacting the tertiary amino group with an oxidizing agent described below.
本発明では、チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体にアミンオキシド基を方法（２）で導入する場合、３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）は、全ビニル系モノマー中、２０～９９．９重量％含むことが望ましい。 In the present invention, when an amine oxide group is introduced by the method (2) into an amine oxide group-containing vinyl polymer, which is a copolymer comprising a thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, a tertiary amino group is introduced. It is preferable that the vinyl monomer (a2) contained in the total vinyl monomer is 20 to 99.9% by weight.
３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）は、特に限定はされないが、一般式１の構造を形成するためのものとしては例えば、
Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、
或いは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、
グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物等が挙げられる。
The vinyl-based monomer (a2) having a tertiary amino group is not particularly limited, but examples for forming the structure of general formula 1 include:
N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N- Dimethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylaminopropionic acid vinyl, vinyl N,N-diethylaminopropionate, N,N-dimethylallylamine, p-dimethylaminomethylstyrene, p-dimethylaminoethylstyrene, p-diethylaminomethylstyrene, p-diethylaminoethylstyrene, N,N-dimethylvinyl amines, N,N-diethylvinylamine, N,N-diphenylvinylamine,
Alternatively, reaction products of unsaturated group-containing acid anhydrides such as maleic anhydride, itaconic anhydride and citraconic anhydride with N,N-dimethyl-1,3-propanediamine and the like,
Examples include reaction products of epoxy group-containing unsaturated compounds such as glycidyl (meth)acrylate and N,N-dimethyl-1,3-propanediamine.
一般式３の構造を形成するためものとしては例えば、
２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジン等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 3, for example,
2-vinylpyridine, 3-vinylpyridine, 4-vinylpyridine, 2-methyl-3-vinylpyridine, 2-methyl-4-vinylpyridine, 3-methyl-4-vinylpyridine, 2-methyl-5-vinylpyridine , 3-methyl-5-vinylpyridine, 4-methyl-5-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-4-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-5-vinylpyridine and the like.
一般式２の構造を形成するためものとしては例えば、
１－ビニルイミダゾール、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾール等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 2, for example,
1-vinylimidazole, 2-methyl-1-vinylimidazole, 4-methyl-1-vinylimidazole, 5-methyl-1-vinylimidazole, 4-(t-butyl)-1-vinylimidazole and the like.
［その他ビニル系ノマー］
ビニル系モノマー（ａ）は、アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）、３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）以外の、その他ビニル系モノマーを含んでもよい。
[Other vinyl type Nomer]
The vinyl-based monomer (a) may contain vinyl-based monomers other than the amine oxide group-containing vinyl-based monomer (a1) and the vinyl-based monomer (a2) having a tertiary amino group.
（炭素数１～１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ３））
その他ビニル系モノマーとしては、炭素数１～１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ３）を用いることが好ましい。炭素数１～１８のアルキル基をビニル系重合体（Ａ）に導入することにより、極性が制御され、標的以外のタンパク質への吸着性能を向上させることができる。
(Vinyl-based monomer (a3) having an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms)
As another vinyl-based monomer, it is preferable to use a vinyl-based monomer (a3) having an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms. By introducing an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms into the vinyl polymer (A), the polarity can be controlled and the adsorption performance to proteins other than the target can be improved.
炭素数１～１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ３）としては、特に限定はされないが、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；
１－プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和単量体などが挙げられる。
The vinyl monomer (a3) having an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms is not particularly limited, but examples include methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, n-butyl (meth) ) acrylate, pentyl (meth) acrylate, heptyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, octyl (meth) acrylate, nonyl (meth) acrylate, decyl (meth) acrylate, dodecyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate ) alkyl (meth)acrylates such as acrylates, isobornyl (meth)acrylates, stearyl (meth)acrylates, cetyl (meth)acrylates;
Examples include α-olefinic ethylenically unsaturated monomers such as 1-propylene, 1-butene, 1-pentene, 1-hexene, 1-octene, 1-nonene and 1-decene.
本発明では、炭素数１～１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ３）は、全ビニル系モノマー中０．１～８０重量％含むことが望ましい。 In the present invention, the vinyl monomer (a3) having an alkyl group of 1 to 18 carbon atoms is desirably contained in an amount of 0.1 to 80% by weight based on all vinyl monomers.
上述のビニル系モノマー（ａ１）～（ａ３）以外に用いてもよいビニル系モノマーとしては、特に限定はされないが、例えば、
メトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、プロポキシエチル（メタ）アクリレート、ブトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシプロピル（メタ）アクリレート等のアルコキシアルキル（メタ）アクリレート；
フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族含有（メタ）アクリレート；
（メタ）アクリル酸アリル、（メタ）アクリル酸１－メチルアリル、（メタ）アクリル酸２－メチルアリル、（メタ）アクリル酸１－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－ブテニル、（メタ）アクリル酸３－ブテニル、（メタ）アクリル酸１，３－メチル－３－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－クロルアリル、（メタ）アクリル酸３－クロルアリル、（メタ）アクリル酸ｏ－アリルフェニル、（メタ）アクリル酸２－（アリルオキシ）エチル、（メタ）アクリル酸アリルラクチル、（メタ）アクリル酸シトロネリル、（メタ）アクリル酸ゲラニル、（メタ）アクリル酸ロジニル、（メタ）アクリル酸シンナミル、ジアリルマレエート、ジアリルイタコン酸、（メタ）アクリル酸ビニル、クロトン酸ビニル、オレイン酸ビニル，リノレン酸ビニル、（メタ）アクリル酸２－（２’－ビニロキシエトキシ）エチルなどのエチレン性不飽和基含有（メタ）アクリル酸エステル類；
パーフルオロメチルメチル（メタ）アクリレート、パーフルオロエチルメチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロブチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロイソノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロデシルエチル（メタ）アクリレート、パーフルオロプロピルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルアミル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルウンデシル（メタ）アクリレートなどの炭素数１～２０のパーフルオロアルキル基を有するパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和モノマーなどの（メタ）アクリレート系モノマー；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリロイロキシエチル－２－ヒドロキシエチルフタル酸、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシビニルベンゼン、１－エチニル－１－シクロヘキサノール、アリルアルコールなどの水酸基を有するモノマー；
マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、シトラコン酸、又は、これらのアルキル若しくはアルケニルモノエステル、フタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、イソフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、テレフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、コハク酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、けい皮酸などのカルボン酸基、若しくはその無水物を有するモノマー；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有するモノマー；
（２－ヒドロキシエチル）メタクリレートアシッドホスフェートなどのリン酸基を有するモノマー；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１～３級アミド基を有するモノマー；
（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマー；
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系モノマー；
スチレン、α－メチルスチレン、２－メチルスチレン、クロロスチレン、アリルベンゼン、エチニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー；
（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和モノマー；
酢酸ビニル、酪酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ヘキサン酸ビニル、カプリル酸ビニル、ラウリル酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；ブチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのビニルエーテル系エチレン性不飽和モノマー；
酢酸アリル、シアン化アリルなどのアリルモノマー；
シアン化ビニル、ビニルシクロヘキサン、ビニルメチルケトンなどのビニルモノマー；アセチレン、エチニルトルエンなどのエチニルモノマーパーフルオロブチルエチレン、パーフルオロヘキシルエチレン、パーフルオロオクチルエチレン、パーフルオロデシルエチレンなどのパーフルオロアルキル、アルキレン類などのパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和化合物等の、（メタ）アクリレートではないエチレン性不飽和結合を有するモノマーなどが挙げられる。
Vinyl-based monomers that may be used other than the vinyl-based monomers (a1) to (a3) described above are not particularly limited, but include, for example:
Alkoxyalkyl (meth)acrylates such as methoxyethyl (meth)acrylate, ethoxyethyl (meth)acrylate, propoxyethyl (meth)acrylate, butoxyethyl (meth)acrylate, ethoxypropyl (meth)acrylate;
aromatic-containing (meth)acrylates such as phenyl (meth)acrylate, benzyl (meth)acrylate, phenoxyethyl (meth)acrylate;
Allyl (meth)acrylate, 1-methylallyl (meth)acrylate, 2-methylallyl (meth)acrylate, 1-butenyl (meth)acrylate, 2-butenyl (meth)acrylate, 3-(meth)acrylate butenyl, 1,3-methyl-3-butenyl (meth)acrylate, 2-chloroallyl (meth)acrylate, 3-chloroallyl (meth)acrylate, o-allylphenyl (meth)acrylate, (meth)acrylic acid 2-(allyloxy)ethyl, allyllactyl (meth)acrylate, citronellyl (meth)acrylate, geranyl (meth)acrylate, rhodinyl (meth)acrylate, cinnamyl (meth)acrylate, diallyl maleate, diallyl itaconic acid, Ethylenically unsaturated group-containing (meth)acrylates such as vinyl (meth)acrylate, vinyl crotonate, vinyl oleate, vinyl linolenate, and 2-(2'-vinyloxyethoxy)ethyl (meth)acrylate ;
Perfluoromethylmethyl (meth)acrylate, perfluoroethylmethyl (meth)acrylate, 2-perfluorobutylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorohexylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorooctylethyl (meth)acrylate , 2-perfluoroisononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorodecylethyl (meth)acrylate, perfluoropropylpropyl (meth)acrylate, perfluorooctylpropyl (meth)acrylate ) acrylate, perfluorooctyl amyl (meth) acrylate, perfluorooctyl undecyl (meth) acrylate, perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated monomers having a perfluoroalkyl group having 1 to 20 carbon atoms (meth) an acrylate-based monomer;
2-hydroxyethyl (meth)acrylate, 2-hydroxypropyl (meth)acrylate, 4-hydroxybutyl (meth)acrylate, 2-(meth)acryloyloxyethyl-2-hydroxyethyl phthalate, glycerol mono(meth)acrylate , 4-hydroxyvinylbenzene, 1-ethynyl-1-cyclohexanol, monomers having a hydroxyl group such as allyl alcohol;
Maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citraconic acid, or their alkyl or alkenyl monoesters, β-(meth)acryloxyethyl phthalate monoester, β-(meth)acryloxyethyl isophthalic acid, terephthalic acid monomers having a carboxylic acid group such as β-(meth)acryloxyethyl monoester, β-(meth)acryloxyethyl succinate, acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, cinnamic acid, or an anhydride thereof;
monomers having a sulfonic acid group such as vinylsulfonic acid and styrenesulfonic acid;
Monomers with a phosphate group such as (2-hydroxyethyl) methacrylate acid phosphate;
(Meth)acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidone, N-methoxymethyl-(meth)acrylamide, N-ethoxymethyl-(meth)acrylamide, N-propoxymethyl-(meth)acrylamide, N-butoxymethyl-(meth) ) acrylamide, N-pentoxymethyl-(meth)acrylamide, N,N-di(methoxymethyl)acrylamide, N-ethoxymethyl-N-methoxymethylmethacrylamide, N,N-di(ethoxymethyl)acrylamide, N- Ethoxymethyl-N-propoxymethylmethacrylamide, N,N-di(propoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl-N-(propoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(butoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl -N-(methoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(pentoxymethyl)acrylamide, N-methoxymethyl-N-(pentoxymethyl)methacrylamide, N,N-dimethylacrylamide, N,N-diethylacrylamide , a monomer having a primary to tertiary amide group such as diacetone (meth)acrylamide;
(Meth)acrylic acid dimethylaminoethylmethyl chloride salt, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylpropyl)ammonium chloride, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamidopropyl)ammonium chloride, and monomers having a quaternary amino group such as trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylethyl)ammonium chloride;
Polyethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, ethoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, propoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-butoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-pentoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate Acrylate, phenoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, polypropylene glycol (meth) acrylate, methoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, propoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, n-butoxy polypropylene glycol (meth) acrylate , n-pentoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, phenoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, polytetramethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolytetramethylene glycol (meth)acrylate, phenoxytetraethylene glycol (meth)acrylate, hexaethylene Monomers having polyether chains such as glycol (meth)acrylate and methoxyhexaethylene glycol (meth)acrylate;
A (meth)acrylate monomer having a polymer structure in a side chain such as an ethylenically unsaturated compound having a polyester chain such as a lactone-modified (meth)acrylate;
aromatic vinyl monomers such as styrene, α-methylstyrene, 2-methylstyrene, chlorostyrene, allylbenzene, ethynylbenzene;
nitrile group-containing ethylenically unsaturated monomers such as (meth)acrylonitrile;
Fatty acid vinyl compounds such as vinyl acetate, vinyl butyrate, vinyl propionate, vinyl hexanoate, vinyl caprylate, vinyl laurate, vinyl palmitate and vinyl stearate; vinyl ether ethylenically unsaturated monomers such as butyl vinyl ether and ethyl vinyl ether ;
allyl monomers such as allyl acetate and allyl cyanide;
Vinyl monomers such as vinyl cyanide, vinylcyclohexane and vinyl methyl ketone; Ethynyl monomers such as acetylene and ethynyltoluene Perfluoroalkyl and alkylenes such as perfluorobutylethylene, perfluorohexylethylene, perfluorooctylethylene and perfluorodecylethylene monomers having ethylenically unsaturated bonds other than (meth)acrylates, such as perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated compounds such as
チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体は、アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）若しくは３級アミノ基を有するビニル系モノマー（ａ２）を２０～９９．９重量％、炭素数１～１８のアルキル基を有するビニル系モノマー（ａ３）を０．１～８０重量％、その他のエチレン性不飽和基単量体（ｃ）を０～７９．９重量％の範囲で含むことが好ましい。 The amine oxide group-containing vinyl polymer, which is a copolymer composed of the thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, is an amine oxide group-containing vinyl monomer (a1) or a vinyl monomer having a tertiary amino group ( 20 to 99.9% by weight of a2), 0.1 to 80% by weight of vinyl monomer (a3) having an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, and other ethylenically unsaturated group monomer (c) It is preferably contained in the range of 0 to 79.9% by weight.
＜オキシド化剤＞
オキシド化剤としては、特に限定されないが、過酸化物又はオゾン等の酸化剤が好適に用いられる。過酸化物としては、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等が挙げられ、過酸化水素が好ましく、通常は水溶液の形で用いられる。過酸化物にはラジカル発生剤としての機能もあるので、３級アミノ基含有ビニル系モノマーを共重合してなるビニル系共重合体の場合には、重合後にオキシド化することが好ましい。
<Oxidizing agent>
The oxidizing agent is not particularly limited, but oxidizing agents such as peroxides and ozone are preferably used. Examples of peroxides include hydrogen peroxide, ammonium persulfate, sodium persulfate, peracetic acid, metachloroperbenzoic acid, benzoyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, etc. Hydrogen peroxide is preferred, and is usually an aqueous solution. used in the form Since the peroxide also functions as a radical generator, in the case of a vinyl-based copolymer obtained by copolymerizing a tertiary amino group-containing vinyl-based monomer, it is preferable to oxidize after polymerization.
＜アミンオキシド基含有量＞
アミンオキシド基は、水溶性とタンパク質非吸着性とを共重合体に付与する。チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体中のアミンオキシド基含有量は、好ましくは１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは２～８ｍｍｏｌ／ｇである。上記範囲にあることによって、好適な水溶性を発現すると共に、染色の標的であるタンパク質に対する吸着を抑制しつつ、標的以外のタンパク質への吸着性能を向上できる。
アミンオキシド基の含有量は、前記一般式１～３で示される少なくともいずれかのアミンオキシド構造の含有量であり、アミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）を重合して共重合体を得る場合には、重合に用いたアミンオキシド基含有ビニル系モノマー（ａ１）の量から求めることができる。一方、３級アミノ基含有ビニル系モノマー（ａ２）を重合した後に得られたポリマーをオキシド化する場合には、前述の数式１によって算出できる。
<Amine oxide group content>
The amine oxide group imparts water solubility and non-adsorbing properties to the copolymer. The amine oxide group content in the amine oxide group-containing vinyl polymer, which is a copolymer of the thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, is preferably 1 to 10 mmol/g, more preferably 2. ~8 mmol/g. By being in the above range, it is possible to exhibit suitable water solubility, suppress adsorption to the protein that is the target of staining, and improve the adsorption performance to proteins other than the target.
The content of the amine oxide group is the content of at least one of the amine oxide structures represented by the above general formulas 1 to 3, and when the copolymer is obtained by polymerizing the amine oxide group-containing vinyl monomer (a1). can be determined from the amount of the amine oxide group-containing vinyl monomer (a1) used in the polymerization. On the other hand, when the polymer obtained after polymerizing the tertiary amino group-containing vinyl-based monomer (a2) is oxidized, it can be calculated by Equation 1 above.
＜チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系重合体の製造＞
チオール基含有化合物（ｘ）とビニル系モノマーとからなる共重合体であるアミンオキシド基含有ビニル系共重合体は、連鎖移動剤としてチオール基含有化合物（ｘ）を用いてビニル系モノマーを共重合することで製造することができる。チオール基含有化合物（ｘ）を用いることで、アミンオキシド基含有ビニル系重合体中に硫黄原子を組み込むことができ、かつ３官能以上のチオール基含有化合物を用いることで、重合体の構造に分岐構造を導入することができる。このような構造にすることで、生体由来のたんぱく質の水溶液中での溶解状態に近づけることができるため、優れたブロッキング性能が得られると推察される。
<Production of amine oxide group-containing vinyl polymer, which is a copolymer of thiol group-containing compound (x) and vinyl monomer>
An amine oxide group-containing vinyl copolymer, which is a copolymer composed of a thiol group-containing compound (x) and a vinyl monomer, is obtained by copolymerizing a vinyl monomer using the thiol group-containing compound (x) as a chain transfer agent. It can be manufactured by By using the thiol group-containing compound (x), a sulfur atom can be incorporated into the amine oxide group-containing vinyl polymer, and by using a trifunctional or higher thiol group-containing compound, the structure of the polymer can be branched. Structure can be introduced. It is presumed that such a structure makes it possible to approximate the dissolved state of the protein derived from the living body in an aqueous solution, thereby obtaining excellent blocking performance.
＜チオール基含有化合物（ｘ）＞
チオール基含有化合物（ｘ）は、重合反応において連鎖移動剤として働くチオールを含む化合物であればよい。その中でも特に複数のチオール基を持つものが好ましい。複数のチオール基を持つチオール基含有化合物として、例えば、
２－メルカプトエタノール、β－メルカプトプロピオン酸、２－エチルヘキシル－３－メルカプトプロピオネート、n－オクチル－３－メルカプトプロピオネート、メトキシブ
チル－３－メルカプトプロピオネート、ステアリル－３－メルカプトプロピオネート、チオグリセロール、トリメチロールプロパントリス（３－メルカプトプロピオネート）、トリス－[(３－メルカプトプロピオニルオキシ)－エチル]－イソシアヌレート、ペンタエリスリトールテトラキス（３－メルカプトプロピオネート）、テトラエチレングリコールビス（３－メルカプトプロピオネート）、ジペンタエリスリトールヘキサキス（３－メルカプトプロピオネート）等が挙げられる。中でも、上述の理由から、３官能以上のチオール基含有化合物が好ましい。
<Thiol group-containing compound (x)>
The thiol group-containing compound (x) may be any compound containing a thiol that acts as a chain transfer agent in the polymerization reaction. Among them, those having a plurality of thiol groups are particularly preferable. As a thiol group-containing compound having multiple thiol groups, for example,
2-mercaptoethanol, β-mercaptopropionic acid, 2-ethylhexyl-3-mercaptopropionate, n-octyl-3-mercaptopropionate, methoxybutyl-3-mercaptopropionate, stearyl-3-mercaptopropionate thioglycerol, trimethylolpropane tris(3-mercaptopropionate), tris-[(3-mercaptopropionyloxy)-ethyl]-isocyanurate, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate), tetraethylene glycol bis(3-mercaptopropionate), dipentaerythritol hexakis(3-mercaptopropionate) and the like. Among them, trifunctional or higher thiol group-containing compounds are preferable for the reasons described above.
［３官能以上のチオール基含有連鎖移動剤（ｘ）］
３官能以上のチオール基含有化合物は、分子内に連鎖移動剤として作用する３官能以上のチオール基（‐ＳＨ基）があればよく、そのような化合物として、例えば下記一般式５で表す化合物が挙げられる。
[Trifunctional or higher thiol group-containing chain transfer agent (x)]
The tri- or more functional thiol group-containing compound may have a tri- or more functional thiol group (—SH group) acting as a chain transfer agent in the molecule. mentioned.
一般式５
［一般式５中、Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール基又はイソシアヌレート基を表す。ｎはそれぞれ独立に０～１０の整数を表し、ｋ1は０～３の整数を表し、ｌ1は０～４の整数を表し、ｍ1は０～３の整数を表し、ｋ2は０～３の整数を表し、ｌ2は０～３の整数を表し、ｍ2は０～３の整数を表す。ただし、ｋ1とｌ1とｍ1との総和は４以下であり、ｋ2とｌ2とｍ2との総和は４以下であり、ｌ1とｌ2の総和は３以上である。］ [In general formula 5, R 5 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an alkoxy group, an aryl group, or an isocyanurate group. n independently represents an integer of 0 to 10, k 1 represents an integer of 0 to 3, l 1 represents an integer of 0 to 4, m 1 represents an integer of 0 to 3, k 2 represents 0 represents an integer of ˜3, l 2 represents an integer of 0-3, and m 2 represents an integer of 0-3. However, the sum of k 1 , l 1 and m 1 is 4 or less, the sum of k 2 , l 2 and m 2 is 4 or less, and the sum of l 1 and l 2 is 3 or more. ]
一般式５におけるＲ5が表すアルキル基としては、炭素数１～１０のアルキル基を挙げることができ、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｉ－プロピル基、ｔ－ブチル基等を挙げることができる。一般式５におけるＲ5が表すアルコキシ基としては、炭素数１～１０のアルコキシ基を挙げることができ、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｉ－プロポキシ基、ｔ－ブトキシ基、ｎ－オクチルオキシ基、２－メトキシエトキシ基等が挙げられる。一般式５におけるＲ5が表すアリール基としては、炭素数６から３０のアリール基、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。 Examples of the alkyl group represented by R 5 in general formula 5 include alkyl groups having 1 to 10 carbon atoms, such as methyl group, ethyl group, n-propyl group, i-propyl group and t-butyl group. can be mentioned. Examples of the alkoxy group represented by R 5 in general formula 5 include alkoxy groups having 1 to 10 carbon atoms, such as methoxy, ethoxy, i-propoxy, t-butoxy and n-octyloxy groups. , 2-methoxyethoxy group and the like. The aryl group represented by R 5 in Formula 5 includes aryl groups having 6 to 30 carbon atoms, such as phenyl group and naphthyl group.
３官能以上のチオール基含有化合物の具体例を以下に挙げるが、本発明で採用することができるチオール含有化合物はこれらの具体例に限定されるものではない。 Specific examples of tri- or more functional thiol group-containing compounds are listed below, but the thiol-containing compounds that can be employed in the present invention are not limited to these specific examples.
チオール基含有化合物（ｘ）は、重合反応時の添加量でアミンオキシド基含有ビニル系重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）が決まる。そのためチオール基含有化合物（ｘ）の添加量は、アミンオキシド基含有ビニル系重合体を構成する全ビニル系モノマーに対して、好ましくは０．１重量％～１５重量％であり、より好ましくは０．１重量％～１０重量％である。０．１％重量％以上とすることで重合反応時の熱制御や分子量制御がしやすく、１５重量％以下とすることでより優れたブロッキング性能を発揮する。 The amount of the thiol group-containing compound (x) added during the polymerization reaction determines the weight average molecular weight (Mw) of the amine oxide group-containing vinyl polymer. Therefore, the amount of the thiol group-containing compound (x) added is preferably 0.1% by weight to 15% by weight, more preferably 0%, based on the total vinyl monomers constituting the amine oxide group-containing vinyl polymer. .1% to 10% by weight. When the amount is 0.1% by weight or more, heat control and molecular weight control during the polymerization reaction are facilitated, and when the amount is 15% by weight or less, more excellent blocking performance is exhibited.
＜アミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ）の重量平均分子量（Ｍｗ）＞
アミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ）の質量平均分子量（Ｍｗ）は、１，０００～１０，０００，０００であることが好ましい。重量平均分子量（Ｍｗ）が１，０００以上であることで、標的以外の非特異的吸着を抑制でき、１０，０００，０００以下であることで、水溶性とすることができる。
<Weight Average Molecular Weight (Mw) of Amine Oxide Group-Containing Vinyl Polymer (A)>
The weight average molecular weight (Mw) of the amine oxide group-containing vinyl polymer (A) is preferably from 1,000 to 10,000,000. When the weight-average molecular weight (Mw) is 1,000 or more, non-specific adsorption of substances other than the target can be suppressed, and when it is 10,000,000 or less, water solubility can be achieved.
アミンオキシド基含有ビニル系重合体の重量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用する。測定装置及び測定条件としては、下記条件１によることを基本とした。ただし、重合体種によっては、さらに適宜適切なキャリア（溶離液）及びそれに適合したカラムを選定して用いてもよい。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照することとする。またアミンオキシド基含有ビニル系重合体の分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド基含有ビニル系重合体アミンオキシド化剤反応前の前駆体である３級アミノ基を有するビニル系重合体の重量平均分子量をアミンオキシド基含有ビニル系重合体の重量平均分子量とすることが出来る。アミンオキシド基含有ビニル系重合体のアミンオキシド化剤反応前の前駆体である３級アミノ基を有するビニル系重合体の重量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件２によることを基本とした。
（条件１）
カラム：ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｒｋ ＳＢ－８００ＲＬ
ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｒｋ ＳＢ－８００ＲＨ
Ｓｈｏｄｅｘ０Ｈｐａｒｋ ＳＢ－８０２．５ ＨＱ
Ｓｈｏｄｅｘ０Ｈｐａｒｋ ＳＢ－８０６Ｍ ＨＱ
をつないだカラムを用いる
キャリア：リン酸緩衝水溶液
測定温度：４０℃
試料濃度：０．２質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００
をつないだカラムを用いる
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
試料濃度：０．２質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
The weight-average molecular weight of the amine oxide group-containing vinyl-based polymer employs a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene. The measurement apparatus and measurement conditions were based on condition 1 below. However, depending on the type of polymer, an appropriate carrier (eluent) and a column suitable for it may be selected and used. For other matters, refer to JISK7252-1 to 4:2008. If it is difficult to measure the molecular weight of the amine oxide group-containing vinyl polymer, the weight average of the vinyl polymer having a tertiary amino group, which is the precursor before the reaction of the amine oxide group-containing vinyl polymer with the amine oxidizing agent, is The molecular weight can be the weight average molecular weight of the amine oxide group-containing vinyl polymer. The weight-average molecular weight of the vinyl polymer having a tertiary amino group, which is the precursor of the amine oxide group-containing vinyl polymer before reaction with the amine oxidizing agent, was measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene. The following condition 2 was used as a basis for the measurement apparatus and measurement conditions.
(Condition 1)
Column: Shodex OHpark SB-800RL
Shodex OHpark SB-800RH
Shodex0Hpark SB-802.5 HQ
Shodex0Hpark SB-806M HQ
Carrier using a column connected with: Phosphate buffer aqueous solution Measurement temperature: 40 ° C.
Sample concentration: 0.2% by mass
Detector: RI (refractive index) detector (Condition 2)
Column: TOSOH TSKgel Super AW4000,
TOSOH TSKgel Super AW3000,
TOSOH TSKgel Super AW2500
use a column that connects
Carrier: N,N-dimethylformamide (1 L), triethylamine (3.04 g), LiBr (0.87 g) mixed liquid Measurement temperature: 40 ° C.
Sample concentration: 0.2% by mass
Detector: RI (refractive index) detector
＜バイオフィルム形成抑制コート剤＞
バイオフィルム形成抑制コート剤に含まれるビニル系ポリマーは、アミンオキシド基を含み、かつ、質量平均分子量が２，０００～１０，０００，０００であることが好ましい。アミンオキシド基を有することで、優れたバイオフィルム形成抑制の効果を発揮する。
<Biofilm formation suppression coating agent>
The vinyl-based polymer contained in the biofilm formation-inhibiting coating agent preferably contains an amine oxide group and has a weight average molecular weight of 2,000 to 10,000,000. By having an amine oxide group, an excellent effect of suppressing biofilm formation is exhibited.
本発明において、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマーは、以下のような２つの方法で得ることができる。即ち、アミンオキシド基を有するモノマーと他のモノマーとを重合して、アミンオキシド基を有するポリマーを得ることができる。あるいは、アミンオキシド基の前駆官能基とでもいうべき３級アミノ基を有するポリマーを得た後、前記３級アミノ基に酸化剤を反応させ、ポリマーにアミンオキシド基を導入することができ、副反応を生じ難いという点で後者の方法が好ましい。なお、３級アミノ基に酸化剤を反応させることを、以下「オキシド化」ともいう。 In the present invention, a vinyl polymer having amine oxide groups can be obtained by the following two methods. That is, a polymer having an amine oxide group can be obtained by polymerizing a monomer having an amine oxide group and another monomer. Alternatively, after obtaining a polymer having a tertiary amino group, which can be said to be a precursor functional group for an amine oxide group, the tertiary amino group is reacted with an oxidizing agent to introduce an amine oxide group into the polymer. The latter method is preferred because it is less likely to cause a reaction. The reaction of the tertiary amino group with an oxidizing agent is hereinafter also referred to as "oxidation".
ビニル系ポリマーとしては、具体的には、前述の一般式１～３で表される少なくともいずれかの構造を含むものであることが好ましく、中でも一般式１で表される構造を含むものが特に好ましい。 Specifically, the vinyl-based polymer preferably contains at least one of the structures represented by the general formulas 1 to 3 described above, and among them, those containing the structure represented by the general formula 1 are particularly preferable.
このような構造を有するビニルポリマーは、前述の通り、２つの方法で得ることができる。より好ましくは、３級アミノ基含有モノマー（Ａ）をオキシド化した後に、他のモノマーと重合するか、あるいは３級アミノ基含有モノマー（Ａ）と他のモノマーとを重合した後にオキシド化する方法である。 A vinyl polymer having such a structure can be obtained in two ways, as described above. More preferably, the tertiary amino group-containing monomer (A) is oxidized and then polymerized with another monomer, or the tertiary amino group-containing monomer (A) and another monomer are polymerized and then oxidized. is.
＜３級アミノ基含有モノマー（Ａ）＞
オキシド化前の前駆体としての３級アミノ基含有モノマー（Ａ）のうち、一般式１の構造を形成するためものとしては、
例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、
あるいは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、
グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物等が挙げられる。
好ましくは、（メタ）アクリレートモノマーであり、より好ましくはＮ，Ｎ－ジアルキルアミノエチル（メタ）アクリレート又はＮ，Ｎ－ジアルキルアミノプロピル（メタ）アクリレートである。
なお、本発明において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」及び「メタクリル」の両者を言い表すものとする。
<Tertiary amino group-containing monomer (A)>
Among the tertiary amino group-containing monomers (A) as precursors before oxidation, for forming the structure of general formula 1,
For example, N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylamino vinyl propionate, vinyl N,N-diethylaminopropionate, N,N-dimethylacrylamide, N,N-dimethylallylamine, p-dimethylaminomethylstyrene, p-dimethylaminoethylstyrene, p-diethylaminomethylstyrene, p-diethylamino ethylstyrene, N,N-dimethylvinylamine, N,N-diethylvinylamine, N,N-diphenylvinylamine,
Alternatively, reaction products of unsaturated group-containing acid anhydrides such as maleic anhydride, itaconic anhydride and citraconic anhydride with N,N-dimethyl-1,3-propanediamine and the like,
Examples include reaction products of epoxy group-containing unsaturated compounds such as glycidyl (meth)acrylate and N,N-dimethyl-1,3-propanediamine.
Preferred are (meth)acrylate monomers, more preferred are N,N-dialkylaminoethyl (meth)acrylates or N,N-dialkylaminopropyl (meth)acrylates.
In the present invention, "(meth)acryl" refers to both "acryl" and "methacryl".
一般式３の構造を形成するためのものとしては、例えば、２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジン等が挙げられる。 For forming the structure of general formula 3, for example, 2-vinylpyridine, 3-vinylpyridine, 4-vinylpyridine, 2-methyl-3-vinylpyridine, 2-methyl-4-vinylpyridine, 3 -methyl-4-vinylpyridine, 2-methyl-5-vinylpyridine, 3-methyl-5-vinylpyridine, 4-methyl-5-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-4-vinylpyridine, 2- (t-butyl)-5-vinylpyridine and the like.
一般式２の構造を形成するためのものとしては、例えば、１－ビニルイミダゾー
ル、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾール等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 2, for example, 1-vinylimidazole, 2-methyl-1-vinylimidazole, 4-methyl-1-vinylimidazole, 5-methyl-1-vinylimidazole, 4- and (t-butyl)-1-vinylimidazole.
＜架橋性基を有するモノマー（Ｂ）＞
ビニル系ポリマーの耐水性向上という観点から、ビニル系ポリマーを得る際に、前記モノマー（Ａ）以外に、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、１級若しくは２級アミノ基及びイソシアネート基からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋性基を有するモノマー（Ｂ）を使用することが好ましい。モノマー（Ｂ）に由来する架橋性基は、後述する架橋剤と反応することでポリマー塗膜に架橋構造を導入し、優れた耐水性を発揮する。
<Monomer (B) having a crosslinkable group>
From the viewpoint of improving the water resistance of the vinyl-based polymer, when obtaining the vinyl-based polymer, in addition to the monomer (A), a group consisting of a carboxyl group, a hydroxyl group, an epoxy group, a primary or secondary amino group, and an isocyanate group is selected. It is preferred to use a monomer (B) having at least one crosslinkable group. The crosslinkable group derived from the monomer (B) introduces a crosslinked structure into the polymer coating film by reacting with a crosslinking agent described later, thereby exhibiting excellent water resistance.
例えば、カルボキシル基が導入された共重合体は、エポキシ化合物やアジリジン化合物、カルボジイミド化合物、Ｎ－ヒドロキシエチルアクリルアミド化合物により架橋することができる。水酸基が導入された共重合体は、イソシアネート化合物等により架橋することができる。アミノ基が導入された共重合体は、エポキシ化合物により架橋することができる。イソシアネート基が導入された共重合体は、水酸基含有化合物により架橋することができる。 For example, a copolymer into which a carboxyl group has been introduced can be crosslinked with an epoxy compound, an aziridine compound, a carbodiimide compound, or an N-hydroxyethylacrylamide compound. A copolymer into which a hydroxyl group has been introduced can be crosslinked with an isocyanate compound or the like. A copolymer into which an amino group has been introduced can be crosslinked with an epoxy compound. A copolymer into which an isocyanate group has been introduced can be crosslinked with a hydroxyl group-containing compound.
カルボキシル基含有モノマーとしては、その構造中にカルボキシル基有するものであれば特に制限はなく、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸２－カルボキシエチル、あるいはエチレンオキサイドやプロピレンオキサイド等のアルキレンオキサイドの繰り返し付加した末端にカルボキシル基を有するアルキレンオキサイド付加系コハク酸（メタ）アクリレート等が挙げられる。 The carboxyl group-containing monomer is not particularly limited as long as it has a carboxyl group in its structure. Alkylene oxide addition type succinic acid (meth)acrylate having a carboxyl group at the terminal to which an oxide is repeatedly added, and the like.
水酸基含有モノマーとしては、その構造中に水酸基を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、（メタ）アクリル酸２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸１－ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２－ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸３－ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸１－ヒドロキシブチル、単官能（メタ）アクリル酸グリセロール、ラクトン環の開環付加により末端に水酸基を有するポリラクトン系（メタ）アクリル酸エステル、エチレンオキサイドやプロピレンオキサイド等のアルキレンオキサイドの繰り返し付加した末端に水酸基を有するアルキレンオキサイド付加系（メタ）アクリル酸エステル、グルコース環系（メタ）アクリル酸エステル類が挙げられる。 The hydroxyl group-containing monomer is not particularly limited as long as it has a hydroxyl group in its structure. Examples include 2-hydroxyethyl (meth)acrylate, 1-hydroxypropyl (meth)acrylate, and (meth)acrylic acid. 2-Hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl (meth)acrylate, 1-hydroxybutyl (meth)acrylate, monofunctional glycerol (meth)acrylate, polylactones with terminal hydroxyl groups by ring-opening addition of lactone rings (meth) ) acrylic acid esters, alkylene oxide-added (meth)acrylic acid esters having hydroxyl groups at the terminals to which alkylene oxides such as ethylene oxide and propylene oxide are repeatedly added, and glucose ring-based (meth)acrylic acid esters.
エポキシ基含有モノマーとしては、その構造中にエポキシ基を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、（メタ）アクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸３，４－エポキシシクロヘキシルメチル等が挙げられる。 The epoxy group-containing monomer is not particularly limited as long as it has an epoxy group in its structure, and examples thereof include glycidyl (meth)acrylate and 3,4-epoxycyclohexylmethyl (meth)acrylate. .
１級若しくは２級アミノ基含有モノマーとしては、その構造中にアミノ基を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、（メタ）アクリル酸モノメチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸モノエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸モノメチルアミノプロピル、（メタ）アクリル酸モノエチルアミノプロピル等が挙げられる。 The primary or secondary amino group-containing monomer is not particularly limited as long as it has an amino group in its structure, and examples thereof include monomethylaminoethyl (meth)acrylate and monoethylaminoethyl (meth)acrylate. , monomethylaminopropyl (meth)acrylate, and monoethylaminopropyl (meth)acrylate.
架橋性基を有するモノマー（Ｂ）としては、耐水性及び長期バイオフィルム形成抑制能の観点から、好ましくはカルボキシル基含有モノマーである。 The monomer (B) having a crosslinkable group is preferably a carboxyl group-containing monomer from the viewpoint of water resistance and ability to suppress long-term biofilm formation.
＜その他のモノマー（Ｃ）＞
ビニル系ポリマーを得る際に、前記モノマー（Ａ）、モノマー（Ｂ）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他のモノマー（Ｃ）を用いることができる。モノマー（Ｃ）に基づく構造の導入により、極性やＴｇが適切に制御され、優れた塗工性、耐水性、及び耐候性を有することができる。
<Other Monomers (C)>
When obtaining a vinyl-based polymer, other monomers (C) having one ethylenically unsaturated group in one molecule can be used in addition to the monomers (A) and (B). By introducing a structure based on the monomer (C), the polarity and Tg can be appropriately controlled, and excellent coatability, water resistance, and weather resistance can be obtained.
１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他のモノマー（Ｃ）としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；
１－プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和モノマー。
Other monomers (C) having one ethylenically unsaturated group in one molecule include, for example, methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, propyl (meth)acrylate, butyl (meth)acrylate, pentyl Alkyl (meth)acrylates such as (meth)acrylate, heptyl (meth)acrylate, 2-ethylhexyl (meth)acrylate, octyl (meth)acrylate, nonyl (meth)acrylate, decyl (meth)acrylate, dodecyl (meth)acrylate;
α-olefinic ethylenically unsaturated monomers such as 1-propylene, 1-butene, 1-pentene, 1-hexene, 1-octene, 1-nonene and 1-decene;
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有するモノマー；
（２－ヒドロキシエチル）メタクリレートアシッドホスフェートなどのリン酸基を有するモノマー；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１～３級アミド基を有するモノマー；
（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマーが挙げられる。
monomers having a sulfonic acid group such as vinylsulfonic acid and styrenesulfonic acid;
Monomers with a phosphate group such as (2-hydroxyethyl) methacrylate acid phosphate;
(Meth)acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidone, N-methoxymethyl-(meth)acrylamide, N-ethoxymethyl-(meth)acrylamide, N-propoxymethyl-(meth)acrylamide, N-butoxymethyl-(meth) ) acrylamide, N-pentoxymethyl-(meth)acrylamide, N,N-di(methoxymethyl)acrylamide, N-ethoxymethyl-N-methoxymethylmethacrylamide, N,N-di(ethoxymethyl)acrylamide, N- Ethoxymethyl-N-propoxymethylmethacrylamide, N,N-di(propoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl-N-(propoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(butoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl -N-(methoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(pentoxymethyl)acrylamide, N-methoxymethyl-N-(pentoxymethyl)methacrylamide, N,N-dimethylacrylamide, N,N-diethylacrylamide , a monomer having a primary to tertiary amide group such as diacetone (meth)acrylamide;
(Meth)acrylic acid dimethylaminoethylmethyl chloride salt, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylpropyl)ammonium chloride, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamidopropyl)ammonium chloride, and monomers having a quaternary amino group such as trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylethyl)ammonium chloride;
Polyethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, ethoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, propoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-butoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-pentoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate Acrylate, phenoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, polypropylene glycol (meth) acrylate, methoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, propoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, n-butoxy polypropylene glycol (meth) acrylate , n-pentoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, phenoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, polytetramethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolytetramethylene glycol (meth)acrylate, phenoxytetraethylene glycol (meth)acrylate, hexaethylene Monomers having a polyether chain such as glycol (meth)acrylate and methoxyhexaethylene glycol (meth)acrylate can be mentioned.
＜ビニル系ポリマーの共重合組成＞
ビニル系ポリマーの共重合組成について説明する。
３級アミノ基含有モノマー（Ａ）は、全モノマーの合計量に対して、１質量％以上で使用することが好ましい。好ましくは４質量％以上であり、より好ましくは１０質量％以上である。また、９５質量％以下で使用することが好ましい。好ましくは９０質量％以下であり、より好ましくは５０質量％以下であり、特に好ましくは３０質量％以下である。上記範囲とすることで、長期的なバイオフィルム形成抑制能の効果を発揮する。
架橋性基を有するモノマー（Ｂ）は、全モノマーの合計量に対して、２０質量％以下で使用することが好ましい。好ましくは１５質量％以下であり、より好ましくは１０質量％以下である。上記範囲とすることで、架橋剤を併用した場合に適度な架橋密度を有する塗膜を得ることができる。
<Copolymer composition of vinyl polymer>
The copolymer composition of the vinyl polymer will be described.
The tertiary amino group-containing monomer (A) is preferably used in an amount of 1% by mass or more based on the total amount of all monomers. It is preferably 4% by mass or more, more preferably 10% by mass or more. Moreover, it is preferable to use it in 95 mass % or less. It is preferably 90% by mass or less, more preferably 50% by mass or less, and particularly preferably 30% by mass or less. By setting it as the said range, the effect of long-term biofilm formation inhibitory ability is exhibited.
The monomer (B) having a crosslinkable group is preferably used in an amount of 20% by mass or less based on the total amount of all monomers. It is preferably 15% by mass or less, more preferably 10% by mass or less. By setting it as the said range, when a crosslinking agent is used together, the coating film which has a moderate crosslink density can be obtained.
＜オキシド化＞
重合前のオキシド化、重合後のオキシド化について説明する。重合前のオキシド化は、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を含む溶液に、重合後のオキシド化は、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須とするモノマーを重合したポリマーを含む溶液に、オキシド化剤を加えて２０℃～１００℃の範囲で０．１～１００時間、好ましくは１～５０時間反応させることによって、３級アミノ基をオキシド化することができる。
<Oxidation>
Oxidation before polymerization and oxidation after polymerization will be described. Oxidation before polymerization is a solution containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A), and oxidation after polymerization is a polymer obtained by polymerizing a monomer essentially containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A). The tertiary amino group can be oxidized by adding an oxidizing agent to the solution containing and reacting at 20° C. to 100° C. for 0.1 to 100 hours, preferably 1 to 50 hours.
オキシド化剤としては、過酸化物又はオゾン等の酸化剤が用いられる。過酸化物としては、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等が挙げられ、過酸化水素が好ましく、通常は水溶液の形で用いられる。程度の違いはあるとはいうものの、過酸化物にはラジカル発生剤としての機能もあるので、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須の原料とするビニル系ポリマーの場合には、重合後にオキシド化することが好ましい。また、後述するウレタン系ポリマーの場合にも副反応が生じないように、重合後にオキシド化することが好ましい。 As the oxidizing agent, an oxidizing agent such as peroxide or ozone is used. Examples of peroxides include hydrogen peroxide, ammonium persulfate, sodium persulfate, peracetic acid, metachloroperbenzoic acid, benzoyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, etc. Hydrogen peroxide is preferred, and is usually an aqueous solution. used in the form Although there is a difference in degree, peroxides also function as radical generators. Therefore, in the case of a vinyl polymer containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A) as an essential raw material, Oxidation after polymerization is preferred. Also, in the case of a urethane-based polymer, which will be described later, it is preferable to oxidize after polymerization so as not to cause a side reaction.
一般的にはオキシド化剤の使用量は、オキシド化可能な官能基、即ち、３級アミノ基に対して、０．２～３倍モル当量の割合で使用し、更に０．５～２倍モル当量使用するのがより好ましい。得られたポリマー溶液は、残存した過酸化物を公知の方法で処理した後、使用することもできる。具体的には還元剤添加処理、イオン交換処理、活性炭処理、金属触媒による処理等があげられる。 Generally, the amount of the oxidizing agent used is 0.2 to 3 times the molar equivalent of the oxidizable functional group, that is, the tertiary amino group, and further 0.5 to 2 times the molar equivalent. It is more preferred to use molar equivalents. The obtained polymer solution can also be used after treating the residual peroxide by a known method. Specific examples include reducing agent addition treatment, ion exchange treatment, activated carbon treatment, treatment with a metal catalyst, and the like.
得られたポリマー溶液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて再沈殿、溶媒留去等の公知の方法でアミンオキシド基含有ポリマーを単離して使用することも出来る。また、単離したアミンオキシド基含有ポリマーは、必要ならば再沈殿や、溶剤洗浄、膜分離、吸着処理等によってさらに精製できる。 The obtained polymer solution can be used as it is, but if necessary, the amine oxide group-containing polymer can be isolated and used by known methods such as reprecipitation and solvent distillation. In addition, the isolated amine oxide group-containing polymer can be further purified by reprecipitation, solvent washing, membrane separation, adsorption treatment, or the like, if necessary.
本発明におけるビニル系ポリマーとしては、前述の如く、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）をオキシド化した後に他のモノマーと重合したもの、及び、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須とするモノマーを重合し、ポリマーを得た後にオキシド化したものの他、モノマーとして、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物や２－イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基含有不飽和化合物と、ヒドロキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンオキシド等のアミンオキシド基含有化合物との反応生成物を用いて共重合したものも用いることができる。 As the vinyl-based polymer in the present invention, as described above, the tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A) is oxidized and then polymerized with another monomer, and the tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A). In addition to those obtained by polymerizing a monomer essential and oxidizing after obtaining a polymer, as a monomer, for example, an epoxy group-containing unsaturated compound such as glycidyl (meth) acrylate or isocyanate such as 2-isocyanatoethyl (meth) acrylate Copolymerization using a reaction product of a group-containing unsaturated compound and an amine oxide group-containing compound such as hydroxyethyl-N,N-dimethylamine oxide can also be used.
＜アミンオキシド基含有量＞
アミンオキシド基は、バイオフィルム形成抑制性をポリマーに付与する。ビニル系ポリマー中のアミンオキシド基含有量は、好ましくは０．２５～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．５～２ｍｍｏｌ／ｇである。０．２５～５ｍｍｏｌ／ｇであることにより、長時間水中に浸漬しても最適なバイオフィルム形成抑制能を維持することができる。
ビニル系ポリマー中のアミンオキシド基含有量は、アミンオキシド基を有するモノマーを重合してビニル系ポリマーを得る場合には、重合に用いたアミンオキシド基を有するモノマーの量から求めることができる。一方、３級アミノ基含有モノマーを必須とするモノマーを重合した後に得られたポリマーをオキシド化する場合には、前述の数式１によって算出できる。
<Amine oxide group content>
The amine oxide groups impart biofilm formation inhibitory properties to the polymer. The amine oxide group content in the vinyl polymer is preferably 0.25-5 mmol/g, more preferably 0.5-2 mmol/g. By setting it to 0.25 to 5 mmol/g, it is possible to maintain the optimum biofilm formation suppressing ability even when immersed in water for a long time.
The amine oxide group content in the vinyl-based polymer can be obtained from the amount of the monomer having the amine oxide group used for the polymerization when the vinyl-based polymer is obtained by polymerizing the monomer having the amine oxide group. On the other hand, in the case of oxidizing a polymer obtained after polymerizing a monomer essentially containing a tertiary amino group-containing monomer, it can be calculated by Equation 1 above.
＜質量平均分子量（Ｍｗ）＞
ビニル系ポリマーの質量平均分子量は、２，０００～１０，０００，０００であり、好ましくは５，０００～６，０００，０００であり、より好ましくは１０，０００～６００，０００であり、特に好ましくは１０，０００～１００，０００である。分子量が２，０００以上であることにより、凝集力を付与でき、塗工基材からの剥離を抑制でき、長期間のバイオフィルム形成抑制効果を発揮する。また、１０，０００，０００以下であることにより、適正な粘度になることから、塗工適性が向上する。そのため、ビニル系ポリマーの質量平均分子量を、上記特定範囲内に限定する。
<Mass average molecular weight (Mw)>
The weight average molecular weight of the vinyl polymer is 2,000 to 10,000,000, preferably 5,000 to 6,000,000, more preferably 10,000 to 600,000, and particularly preferably is between 10,000 and 100,000. When the molecular weight is 2,000 or more, cohesive force can be imparted, peeling from the coating substrate can be suppressed, and a long-term biofilm formation suppressing effect can be exhibited. In addition, when it is 10,000,000 or less, the viscosity is appropriate, and thus the coatability is improved. Therefore, the weight-average molecular weight of the vinyl polymer is limited within the above specific range.
ビニル系ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用する。測定装置及び測定条件としては、下記条件１によることを基本とし、試料の溶解性等により条件２とすることを許容する。ただし、重合体種によっては、さらに適宜適切なキャリア（溶離液）及びそれに適合したカラムを選定して用いてもよい。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照することとする。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定することとする。
また、ビニル系ポリマーの分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をポリマー（ａ）の質量平均分子量とすることが出来る。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件３によることを基本とする。
（条件１）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺＭ－Ｈ、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ４０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ２０００を連結したもの。
キャリア：テトラヒドロフラン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷＭ－Ｈを２本連結したもの。
キャリア：１０ｍＭＬｉＢｒ／Ｎ－メチルピロリドン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件３）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
The mass-average molecular weight of the vinyl-based polymer employs a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene. The measurement apparatus and measurement conditions are based on condition 1 below, and condition 2 is allowed depending on the solubility of the sample. However, depending on the type of polymer, an appropriate carrier (eluent) and a column suitable for it may be selected and used. For other matters, refer to JISK7252-1 to 4:2008. For poorly soluble polymer compounds, measurements are made at a soluble concentration under the following conditions.
Moreover, when it is difficult to measure the molecular weight of the vinyl polymer, the weight average molecular weight of the amine oxide precursor polymer can be used as the weight average molecular weight of the polymer (a). The mass-average molecular weight of the amine oxide precursor polymer employs a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene, and the measurement apparatus and measurement conditions are based on Condition 3 below.
(Condition 1)
Column: TOSOHTSKgelSuperHZM-H,
A combination of TOSOHTSKgelSuperHZ4000 and TOSOHTSKgelSuperHZ2000.
Carrier: Tetrahydrofuran Measuring temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
(Condition 2)
Column: Two columns of TOSOHTSKgelSuperAWM-H are connected.
Carrier: 10 mM LiBr/N-methylpyrrolidone Measurement temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
(Condition 3)
Column: TOSOH TSKgel Super AW4000,
A concatenation of TOSOHTSKgelSuperAW3000 and TOSOHTSKgelSuperAW2500.
Carrier: N,N-dimethylformamide (1 L), triethylamine (3.04 g), LiBr (0.87 g) mixed liquid Measurement temperature: 40 ° C.
Carrier flow rate: 0.6 mL/min
＜架橋剤＞
本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤は、架橋剤を含むことができる。架橋剤を含むことにより、前述のビニル系ポリマーが架橋性基を有する場合、塗膜に架橋を形成して耐水性を向上させることができる。本発明で用いることのできる架橋剤としては、前述のビニル系ポリマーを形成するためのモノマー（Ｂ）におけるカルボキシル基、水酸基、エポキシ基、１級若しくは２級アミノ基及びイソシアネート基からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋性基と反応するものが好ましく、例えば、エポキシ基、イソシアネート基、及びアジリジニル基から選ばれる少なくとも一種の官能基を有するものの他、金属キレート化合物、カルボジイミド基含有化合物等が挙げられる。これらの架橋剤は、塗膜の弾性率や耐性を上げる目的で使用したり、接着力を調製したりするために用いることができる。
<Crosslinking agent>
The biofilm formation suppression coating agent of the present invention can contain a cross-linking agent. By including a cross-linking agent, when the above-mentioned vinyl-based polymer has a cross-linkable group, cross-linking can be formed in the coating film to improve water resistance. The cross-linking agent that can be used in the present invention is selected from the group consisting of carboxyl groups, hydroxyl groups, epoxy groups, primary or secondary amino groups and isocyanate groups in the monomer (B) for forming the vinyl polymer. Those that react with at least one crosslinkable group are preferable, for example, those having at least one functional group selected from epoxy groups, isocyanate groups, and aziridinyl groups, metal chelate compounds, carbodiimide group-containing compounds, and the like. be done. These cross-linking agents can be used for the purpose of increasing the elastic modulus and resistance of the coating film, and can be used for adjusting the adhesive force.
［エポキシ基を有する架橋剤］
本発明で用いられるエポキシ基を有する架橋剤としては、１分子中に２個以上のエポキシ基を有するものであればよく、特に限定されるものではない。２官能エポキシ基を有する架橋剤としては、例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレンオキサイドジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、１，６-ヘキサンジオールジ
グリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリブタジエンジグリシジルエーテル等の脂肪族エポキシ化合物、ビスフェノールＡ型エポキシ樹脂、ビスフェノールＦ型エポキシ樹脂、ビスフェノールＳ型エポキシ樹脂、ビフェノール型エポキシ樹脂、ジヒドロキシベンゾフェノンジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ヒドロキノンジグリシジルエーテル、ジヒドロキシアントラセン型エポキシ樹脂、ビスフェノールフルオレンジグリシジルエーテル、Ｎ，Ｎ－ジグリシジルアニリン等の芳香族エポキシ化合物、上記記載の芳香族エポキシ化合物の水素添加物、ヘキサヒドロフタル酸ジグリシジルエステル等の脂環式エポキシ化合物などが挙げられる。エポキシ基を３つ以上有する架橋剤としては、例えば、トリグリシジルイソシアヌレート、トリスフェノール型エポキシ化合物、テトラキスフェノール型エポキシ化合物、フェノールノボラック型エポキシ化合物等が挙げられる。
[Crosslinking Agent Having Epoxy Group]
The epoxy group-containing cross-linking agent used in the present invention is not particularly limited as long as it has two or more epoxy groups in one molecule. Examples of cross-linking agents having a bifunctional epoxy group include ethylene glycol diglycidyl ether, polyethylene oxide diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, tetramethylene glycol diglycidyl ether, and polytetramethylene glycol diglycidyl. Aliphatic epoxy compounds such as ether, 1,6-hexanediol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polybutadiene diglycidyl ether, bisphenol A type epoxy resin, bisphenol F type epoxy resin, bisphenol S type epoxy resin, biphenol type Aromatic epoxy compounds such as epoxy resins, dihydroxybenzophenone diglycidyl ether, resorcinol diglycidyl ether, hydroquinone diglycidyl ether, dihydroxyanthracene type epoxy resins, bisphenol fluorenediglycidyl ether, N,N-diglycidylaniline, etc. Hydrogenated products of epoxy compounds, alicyclic epoxy compounds such as diglycidyl hexahydrophthalate, and the like are included. Examples of cross-linking agents having three or more epoxy groups include triglycidyl isocyanurate, trisphenol-type epoxy compounds, tetrakisphenol-type epoxy compounds, phenol novolac-type epoxy compounds, and the like.
［イソシアネート基を有する架橋剤］
本発明で用いられるイソシアネート基を有する架橋剤としては、１分子中に２個以上のイソシアネート基を有した化合物であればよく、特に限定されるものではない。２官能イソシアネート化合物としては、例えば、２，２’－ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４’－ジフェニルメタンジイソシアネート、４，４’－ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４－トリレンジイソシアネート、２，６－トリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート等を挙げることができる。
３官能イソシアネート化合物としては、上記で説明したジイソシアネートのトリメチロールプロパンアダクト体、水と反応したビュウレット体、イソシアヌレート環を有する３量体が挙げられる。
また、イソシアネート基を有する架橋剤中のイソシアネート基は、ブロック化されていても良いし、ブロック化されていなくても良い。本発明で用いられるブロック化イソシアネート架橋剤としては、前記イソシアネート化合物中のイソシアネート基がε－カプロラクタム、ＭＥＫオキシム、シクロヘキサノンオキシム、ピラゾール、フェノール等でブロックされたブロック化イソシアネート化合物であればよく、特に限定されるものではない。
[Crosslinking agent having isocyanate group]
The isocyanate group-containing cross-linking agent used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having two or more isocyanate groups in one molecule. Examples of bifunctional isocyanate compounds include 2,2′-diphenylmethane diisocyanate, 2,4′-diphenylmethane diisocyanate, 4,4′-diphenylmethane diisocyanate, 2,4-tolylene diisocyanate, 2,6-tolylene diisocyanate, hexa Examples include methylene diisocyanate and isophorone diisocyanate.
Examples of the trifunctional isocyanate compound include the trimethylolpropane adduct of the diisocyanate described above, the water-reacted biuret form, and the trimer having an isocyanurate ring.
Moreover, the isocyanate group in the cross-linking agent having an isocyanate group may be blocked or may not be blocked. The blocked isocyanate crosslinking agent used in the present invention may be a blocked isocyanate compound in which the isocyanate group in the isocyanate compound is blocked with ε-caprolactam, MEK oxime, cyclohexanone oxime, pyrazole, phenol, or the like, and is particularly limited. not to be
［アジリジニル基を有する架橋剤］
本発明で用いられるアジリジン化合物としては、１分子中に２個以上のアジリジン基を有した化合物であればよく、特に限定されるものではない。アジリジン化合物としては、例えば、２，２’－ビスヒドロキシメチルブタノールトリス［３－（１－アジリジニル）プロピオネート］、４，４－ビス（エチレンイミノカルボニルアミノ）ジフェニルメタン等が挙げられる。
[Crosslinking Agent Having Aziridinyl Group]
The aziridine compound used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having two or more aziridine groups in one molecule. Examples of aziridine compounds include 2,2′-bishydroxymethylbutanol tris[3-(1-aziridinyl)propionate], 4,4-bis(ethyleneiminocarbonylamino)diphenylmethane, and the like.
［カルボジイミド基含有化合物］
本発明で用いられるカルボジイミド基含有化合物としては、日清紡績株式会社のカルボジライトシリーズを用いることができ、Ｖ－０２、Ｖ－０４、Ｖ－０６、Ｖ－１０などの水性タイプ、Ｖ－０１、Ｖ－０３、Ｖ－０５、Ｖ―０７、Ｖ―０９などの油性タイプ等が挙げられる。
[Carbodiimide group-containing compound]
As the carbodiimide group-containing compound used in the present invention, the Carbodilite series of Nisshinbo Co., Ltd. can be used, and aqueous types such as V-02, V-04, V-06, V-10, V-01 , V-03, V-05, V-07 and V-09.
［β－ヒドロキシアルキルアミド基含有化合物］
本発明では、β－ヒドロキシアルキルアミド基含有化合物も架橋剤として用いることができる。β－ヒドロキシアルキルアミド基含有化合物としては、分子内にβ－ヒドロキシアルキルアミド基を含有する化合物であればよく、特に限定されるものではない。β－ヒドロキシアルキルアミド基含有化合物としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラキス（ヒドロキシエチル）アジパミド（エムスケミー社製ＰｒｉｍｉｄＸＬ－５５２）をはじめとする種々の化合物を挙げることができる。
[β-hydroxyalkylamide group-containing compound]
In the present invention, a compound containing a β-hydroxyalkylamide group can also be used as a cross-linking agent. The β-hydroxyalkylamide group-containing compound is not particularly limited as long as it contains a β-hydroxyalkylamide group in the molecule. Examples of the β-hydroxyalkylamide group-containing compound include various compounds such as N,N,N',N'-tetrakis(hydroxyethyl)adipamide (PrimidXL-552 manufactured by Em Chemie).
本発明において、架橋剤は、一種のみを単独で用いてもよいし、複数を併用しても良い。架橋剤の使用量は、ビニル系ポリマー中に含まれる官能基の種類やモル数を考慮して決定すればよく、特に限定されるものではないが、通常はビニル系ポリマー１００質量部に対して０．１質量部～１００質量部の範囲で用いられる。ビニル系ポリマー中に含まれる官能基のモル数よりも少ない範囲で配合することで、未反応の架橋剤が遊離する懸念をなくすことができる。この範囲であれば、目的とするバイオフィルム形成抑制の各効果に、特に優れた性能が発現される。 In the present invention, the cross-linking agent may be used singly or in combination of two or more. The amount of the cross-linking agent used may be determined in consideration of the type and number of moles of functional groups contained in the vinyl-based polymer, and is not particularly limited, but is usually based on 100 parts by mass of the vinyl-based polymer. It is used in the range of 0.1 parts by mass to 100 parts by mass. By blending in a range smaller than the number of moles of the functional groups contained in the vinyl polymer, it is possible to eliminate the concern that unreacted cross-linking agents will be liberated. Within this range, particularly excellent performance is exhibited in each of the intended effects of suppressing biofilm formation.
＜バイオフィルム形成抑制コート剤の調整＞
本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤は、コート剤１００質量％中、前記ビニル系ポリマーを１～５０質量％含むことが好ましく、５～３０質量％含むことがより好ましい。ビニル系ポリマー含有量を１質量％以上とすることで、アミンオキシド基によるバイオフィルム形成抑制の効果を発揮することができる。また、本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤は、ビニル系ポリマー以外の成分を含んでも良い。
<Adjustment of biofilm formation suppression coating agent>
The biofilm formation-inhibiting coating agent of the present invention preferably contains 1 to 50% by mass, more preferably 5 to 30% by mass, of the vinyl polymer based on 100% by mass of the coating agent. By setting the vinyl-based polymer content to 1% by mass or more, the effect of suppressing biofilm formation by the amine oxide group can be exhibited. In addition, the biofilm formation-suppressing coating agent of the present invention may contain components other than the vinyl-based polymer.
＜溶媒＞
本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤は、ビニル系ポリマー以外の成分として溶媒を含有してもよく、２種以上を併用して含んでもよい。溶媒は、アミンオキシド量に依存するビニル系ポリマーの溶解性や印刷条件等を考慮し、従来公知の溶媒から適宜選択することができる。例えば、ビニル系ポリマー中のアミンオキシド量が多い場合、水、メタノールやエタノール等のアルコール類、アセトンやエチルメチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフランやジエチルエーテル等のエーテル類、酢酸メチルや酢酸エチル等のエステル類、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ギ酸や酢酸等の有機酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の有機塩基を選択することができる。一方、ビニル系ポリマー中のアミンオキシド量がの少ない場合、アセトンやエチルメチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフランやジエチルエーテル等のエーテル類、酢酸メチルや酢酸エチル等のエステル類、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルに加え、ジクロロメタンやトリクロロメタン等のハロゲン溶媒を選択することができる。
<Solvent>
The biofilm formation-inhibiting coating agent of the present invention may contain a solvent as a component other than the vinyl polymer, or may contain two or more kinds in combination. The solvent can be appropriately selected from conventionally known solvents in consideration of the solubility of the vinyl polymer, which depends on the amount of amine oxide, printing conditions, and the like. For example, when the amount of amine oxide in the vinyl polymer is large, water, alcohols such as methanol and ethanol, ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether, methyl acetate and ethyl acetate, etc. Esters, dimethylsulfoxide, acetonitrile, organic acids such as formic acid and acetic acid, and organic bases such as N,N-dimethylformamide can be selected. On the other hand, when the amount of amine oxide in the vinyl polymer is small, in addition to ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and acetonitrile, , a halogen solvent such as dichloromethane or trichloromethane can be selected.
さらに、本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、各種の添加剤を含有してもよい。 Furthermore, the biofilm formation suppression coating agent of the present invention may contain various additives within a range that does not impair the effects of the present invention.
＜バイオフィルム形成抑制積層体＞
本発明のバイオフィルム形成抑制積層体は、基材上に、本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤からなる塗膜を有するものである。塗膜を形成する方法としては、基材に応じて、様々な塗膜形成方法（塗工・印刷・乾燥方法）を選択することができる。一例として、グラビア・オフセット等の各種印刷方式のほか、インクジェット方式、スプレー方式、浸漬方式等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。塗工後の乾燥は、溶媒を除去できればよく、バイオフィルム形成抑制コート剤に含まれる溶媒等から適宜乾燥温度を選択することができる。工業的には、４０～１８０℃で２分間程度であるのが望ましい。さらに、本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤が架橋剤を含む場合、架橋反応を促進させるための工程を設けることが好ましい。架橋条件は、一般的に４０～１５０℃で６～２４時間であるが、これらに限定されない。バイオフィルム形成抑制コート剤からなる塗膜の厚みは、本発明の効果を損なわない範囲で適宜選択でき、０．５～２μｍでも十分効果を発揮する。
<Biofilm formation suppression laminate>
The biofilm formation-inhibiting laminate of the present invention has a coating film formed of the biofilm formation-inhibiting coating agent of the present invention on a substrate. As a method for forming a coating film, various coating film forming methods (coating/printing/drying method) can be selected according to the substrate. Examples thereof include various printing methods such as gravure and offset, as well as an inkjet method, a spray method, and an immersion method, but are not limited to these. Drying after coating is sufficient as long as the solvent can be removed, and the drying temperature can be appropriately selected from the solvent and the like contained in the biofilm formation-inhibiting coating agent. Industrially, it is desirable that the temperature is 40 to 180° C. for about 2 minutes. Furthermore, when the biofilm formation suppressing coating agent of the present invention contains a cross-linking agent, it is preferable to provide a step for promoting the cross-linking reaction. Cross-linking conditions are generally 40-150° C. for 6-24 hours, but are not limited thereto. The thickness of the coating film made of the biofilm formation-inhibiting coating agent can be appropriately selected within a range that does not impair the effects of the present invention.
＜基材＞
本発明のバイオフィルム形成抑制コート剤は、バイオフィルムの危害が懸念される広い分野に適用することが可能であるため、医療機器、製造設備又は水槽内面等、微生物が付着し、バイオフィルムが形成することが想定される物質表面に、好適に用いることができる。そのため、基材としては、上記用途で従来公知に用いられる基材であれば制限無く使用することができ、例えば、プラスチック、ガラス、セラミックス、金属等の材質からなる基材が挙げられる。
<Base material>
Since the biofilm formation suppression coating agent of the present invention can be applied to a wide range of fields where biofilm hazards are a concern, microorganisms adhere to medical equipment, manufacturing equipment, or the inner surface of water tanks, etc., and biofilms are formed. It can be suitably used on the surface of a substance that is assumed to be used. Therefore, as the substrate, any substrate that has been conventionally used for the above applications can be used without limitation, and examples thereof include substrates made of materials such as plastics, glass, ceramics, and metals.
＜細胞培養器材処理剤＞
細胞培養器材処理剤は、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を含む。
本発明において、アミンオキシド基を有するポリマーは、以下のような２つの方法で得ることができる。即ち、アミンオキシド基を有するモノマーと他のモノマーとを重合して、アミンオキシド基を有するポリマーを得ることができる。あるいは、アミンオキシド基の前駆官能基とでもいうべき３級アミノ基を有するポリマーを得た後、前記３級アミノ基に酸化剤を反応させ、ポリマーにアミンオキシド基を導入することができ、副反応を生じ難いという点で後者の方法が好ましい。なお、３級アミノ基に酸化剤を反応させることを、以下「オキシド化」ともいう。
<Cell cultureware treatment agent>
The cell cultureware treatment agent contains a vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more.
In the present invention, polymers having amine oxide groups can be obtained by the following two methods. That is, a polymer having an amine oxide group can be obtained by polymerizing a monomer having an amine oxide group and another monomer. Alternatively, after obtaining a polymer having a tertiary amino group, which can be said to be a precursor functional group for an amine oxide group, the tertiary amino group is reacted with an oxidizing agent to introduce an amine oxide group into the polymer. The latter method is preferred because it is less likely to cause a reaction. The reaction of the tertiary amino group with an oxidizing agent is hereinafter also referred to as "oxidation".
ビニル系ポリマーとしては、具体的には、前述の一般式１～３で表される少なくともいずれかの構造を含むものであることが好ましく、中でも一般式１で表される構造を含むものが特に好ましい。ビニル系ポリマーは、共重合体であることが好ましく、ブロック共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよい。 Specifically, the vinyl-based polymer preferably contains at least one of the structures represented by the general formulas 1 to 3 described above, and among them, those containing the structure represented by the general formula 1 are particularly preferable. The vinyl-based polymer is preferably a copolymer, and may be a block copolymer, a random copolymer, or an alternating copolymer.
このような構造を有するビニルポリマーは、前述の通り、２つの方法で得ることができる。より好ましくは、３級アミノ基含有モノマー（Ａ）をオキシド化した後に、他のモノマーと重合するか、あるいは３級アミノ基含有モノマー（Ａ）とその他モノマーとを重合した後にオキシド化する方法である。 A vinyl polymer having such a structure can be obtained in two ways, as described above. More preferably, the tertiary amino group-containing monomer (A) is oxidized and then polymerized with other monomers, or the tertiary amino group-containing monomer (A) and other monomers are polymerized and then oxidized. be.
＜３級アミノ基含有モノマー（Ａ）＞
オキシド化前の前駆体としての３級アミノ基含有モノマー（Ａ）のうち、一般式１の構造を形成するためものとしては、
例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、あるいは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物等が挙げられる。
好ましくは、（メタ）アクリレートモノマーであり、より好ましくはＮ，Ｎ－ジアルキルアミノエチル（メタ）アクリレート又はＮ，Ｎ－ジアルキルアミノプロピル（メタ）アクリレートである。
なお、本発明において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」及び「メタクリル」の両者を言い表すものとする。
<Tertiary amino group-containing monomer (A)>
Among the tertiary amino group-containing monomers (A) as precursors before oxidation, for forming the structure of general formula 1,
For example, N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylamino vinyl propionate, vinyl N,N-diethylaminopropionate, N,N-dimethylacrylamide, N,N-dimethylallylamine, p-dimethylaminomethylstyrene, p-dimethylaminoethylstyrene, p-diethylaminomethylstyrene, p-diethylamino Ethylstyrene, N,N-dimethylvinylamine, N,N-diethylvinylamine, N,N-diphenylvinylamine, or unsaturated group-containing acid anhydrides such as maleic anhydride, itaconic anhydride, and citraconic anhydride , reaction products with N,N-dimethyl-1,3-propanediamine and the like, reactions of epoxy group-containing unsaturated compounds such as glycidyl (meth)acrylate with N,N-dimethyl-1,3-propanediamine and the like products and the like.
Preferred are (meth)acrylate monomers, more preferred are N,N-dialkylaminoethyl (meth)acrylates or N,N-dialkylaminopropyl (meth)acrylates.
In the present invention, "(meth)acryl" refers to both "acryl" and "methacryl".
一般式３の構造を形成するためのものとしては、例えば、２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジン等が挙げられる。 For forming the structure of general formula 3, for example, 2-vinylpyridine, 3-vinylpyridine, 4-vinylpyridine, 2-methyl-3-vinylpyridine, 2-methyl-4-vinylpyridine, 3 -methyl-4-vinylpyridine, 2-methyl-5-vinylpyridine, 3-methyl-5-vinylpyridine, 4-methyl-5-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-4-vinylpyridine, 2- (t-butyl)-5-vinylpyridine and the like.
一般式２の構造を形成するためのものとしては、例えば、１－ビニルイミダゾール、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾール等が挙げられる。 For forming the structure of general formula 2, for example, 1-vinylimidazole, 2-methyl-1-vinylimidazole, 4-methyl-1-vinylimidazole, 5-methyl-1-vinylimidazole, 4- and (t-butyl)-1-vinylimidazole.
＜架橋性基を有するモノマー（Ｂ）＞
ビニル系ポリマーの耐久性の向上という観点から、ビニル系ポリマーは、カルボキシル基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋性基を有することが好ましい。具体的には、ビニル系ポリマーを得る際に、前記モノマー（Ａ）以外に、カルボキシル基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋性基を有するモノマー（Ｂ）を使用することが好ましい。モノマー（Ｂ）に由来する架橋性基は、後述する架橋剤と反応することでポリマー塗膜に架橋構造を導入し、優れた耐久性を発揮する。
<Monomer (B) having a crosslinkable group>
From the viewpoint of improving the durability of the vinyl polymer, the vinyl polymer preferably has at least one crosslinkable group selected from the group consisting of carboxyl groups and hydroxyl groups. Specifically, when obtaining a vinyl-based polymer, in addition to the monomer (A), it is preferable to use a monomer (B) having at least one crosslinkable group selected from the group consisting of a carboxyl group and a hydroxyl group. . The crosslinkable group derived from the monomer (B) introduces a crosslinked structure into the polymer coating film by reacting with a crosslinking agent described later, thereby exhibiting excellent durability.
例えば、カルボキシル基が導入された共重合体は、エポキシ化合物、アジリジン化合物、オキセタン、カルボジイミド化合物、アミノ化合物又はイソシアネート化合物等により架橋することができる。水酸基が導入された共重合体は、カルボジイミド化合物、イソシアネート化合物、アミノ化合物又はアルコキシラン化合物等により架橋することができる。 For example, a copolymer into which a carboxyl group has been introduced can be crosslinked with an epoxy compound, an aziridine compound, an oxetane, a carbodiimide compound, an amino compound, an isocyanate compound, or the like. A copolymer into which a hydroxyl group has been introduced can be crosslinked with a carbodiimide compound, an isocyanate compound, an amino compound, an alkoxysilane compound, or the like.
カルボキシル基含有モノマーとしては、その構造中にカルボキシル基有するものであれば特に制限はなく、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸２－カルボキシエチル、あるいはエチレンオキサイドやプロピレンオキサイド等のアルキレンオキサイドの繰り返し付加した末端にカルボキシル基を有するアルキレンオキサイド付加系コハク酸（メタ）アクリレート等が挙げられる。 The carboxyl group-containing monomer is not particularly limited as long as it has a carboxyl group in its structure. Alkylene oxide addition type succinic acid (meth)acrylate having a carboxyl group at the terminal to which an oxide is repeatedly added, and the like.
水酸基含有モノマーとしては、その構造中に水酸基を有するものであれば、特に制限はなく、例えば、（メタ）アクリル酸２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸１－ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸２－ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸３－ヒドロキシプロピル、（メタ）アクリル酸１－ヒドロキシブチル、単官能（メタ）アクリル酸グリセロール、ラクトン環の開環付加により末端に水酸基を有するポリラクトン系（メタ）アクリル酸エステル、エチレンオキサイドやプロピレンオキサイド等のアルキレンオキサイドの繰り返し付加した末端に水酸基を有するアルキレンオキサイド付加系（メタ）アクリル酸エステル、グルコース環系（メタ）アクリル酸エステル類が挙げられる。 The hydroxyl group-containing monomer is not particularly limited as long as it has a hydroxyl group in its structure. Examples include 2-hydroxyethyl (meth)acrylate, 1-hydroxypropyl (meth)acrylate, and (meth)acrylic acid. 2-Hydroxypropyl, 3-hydroxypropyl (meth)acrylate, 1-hydroxybutyl (meth)acrylate, monofunctional glycerol (meth)acrylate, polylactones with terminal hydroxyl groups by ring-opening addition of lactone rings (meth) ) acrylic acid esters, alkylene oxide-added (meth)acrylic acid esters having hydroxyl groups at the terminals to which alkylene oxides such as ethylene oxide and propylene oxide are repeatedly added, and glucose ring-based (meth)acrylic acid esters.
耐久性の観点から、ビニル系ポリマーは、架橋性基としてカルボキシル基を有することが好ましく、ポリマーを構成する架橋性基を有するモノマー（Ｂ）としてカルボキシル基含有モノマーを用いることが好ましい。 From the viewpoint of durability, the vinyl polymer preferably has a carboxyl group as a crosslinkable group, and a carboxyl group-containing monomer is preferably used as the monomer (B) having a crosslinkable group that constitutes the polymer.
＜その他のモノマー（Ｃ）＞
ビニル系ポリマーを得る際に、前記モノマー（Ａ）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他のモノマー（Ｃ）を用いることができる。モノマー（Ｃ）に基づく構造の導入により、極性やＴｇが適切に制御され、優れた塗工性、塗工膜の耐久性を有することができるほか、溶媒溶解性等を制御することができる。
<Other Monomers (C)>
When obtaining a vinyl-based polymer, other monomers (C) having one ethylenically unsaturated group in one molecule can be used in addition to the monomers (A). By introducing a structure based on the monomer (C), the polarity and Tg can be appropriately controlled, excellent coatability and durability of the coating film can be obtained, and solvent solubility and the like can be controlled.
１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他のモノマー（Ｃ）としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；１－プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和モノマー。
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有するモノマー；（２－ヒドロキシエチル）メタクリレートアシッドホスフェートなどのリン酸基を有するモノマー；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１～３級アミド基を有するモノマー；（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマーが挙げられる。
Other monomers (C) having one ethylenically unsaturated group in one molecule include, for example, methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, propyl (meth)acrylate, butyl (meth)acrylate, pentyl Alkyl (meth)acrylates such as (meth)acrylate, heptyl (meth)acrylate, 2-ethylhexyl (meth)acrylate, octyl (meth)acrylate, nonyl (meth)acrylate, decyl (meth)acrylate, dodecyl (meth)acrylate; α-olefinic ethylenically unsaturated monomers such as 1-propylene, 1-butene, 1-pentene, 1-hexene, 1-octene, 1-nonene and 1-decene;
monomers having a sulfonic acid group such as vinylsulfonic acid and styrenesulfonic acid; monomers having a phosphoric acid group such as (2-hydroxyethyl)methacrylate acid phosphate;
(Meth)acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidone, N-methoxymethyl-(meth)acrylamide, N-ethoxymethyl-(meth)acrylamide, N-propoxymethyl-(meth)acrylamide, N-butoxymethyl-(meth) ) acrylamide, N-pentoxymethyl-(meth)acrylamide, N,N-di(methoxymethyl)acrylamide, N-ethoxymethyl-N-methoxymethylmethacrylamide, N,N-di(ethoxymethyl)acrylamide, N- Ethoxymethyl-N-propoxymethylmethacrylamide, N,N-di(propoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl-N-(propoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(butoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl -N-(methoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(pentoxymethyl)acrylamide, N-methoxymethyl-N-(pentoxymethyl)methacrylamide, N,N-dimethylacrylamide, N,N-diethylacrylamide , Monomers having primary to tertiary amide groups such as diacetone (meth)acrylamide; (meth)acrylic acid dimethylaminoethylmethyl chloride salt, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamide-1,1-dimethylpropyl) Monomers having a quaternary amino group such as ammonium chloride, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamidopropyl)ammonium chloride, and trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylethyl)ammonium chloride ; polyethylene glycol (meth) acrylate, methoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, propoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, n-butoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, n-pentoxy polyethylene glycol (meth) ) acrylate, phenoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, polypropylene glycol (meth) acrylate, methoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, propoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, n-butoxy polypropylene glycol (meth) Acrylate, n-pentoxypolypropylene glycol (meth)acrylate rate, phenoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, polytetramethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolytetramethylene glycol (meth)acrylate, phenoxytetraethyleneglycol (meth)acrylate, hexaethyleneglycol (meth)acrylate, methoxyhexaethyleneglycol Examples include monomers having polyether chains such as (meth)acrylates.
＜ビニル系ポリマーの共重合組成＞
ビニル系ポリマーの共重合組成について説明する。
３級アミノ基含有モノマー（Ａ）は、全モノマーの合計量に対して、１質量％以上で使用することが好ましい。好ましくは４質量％以上であり、より好ましくは１０質量％以上である。また、９５質量％以下で使用することが好ましい。好ましくは９０質量％以下であり、より好ましくは５０質量％以下であり、特に好ましくは３０質量％以下である。上記範囲とすることで、長期的な、細胞毒性が低く、かつ優れた蛋白質や細胞の接着防止効果を発揮する。架橋性基を有するモノマー（Ｂ）は、全モノマーの合計量に対して、２０質量％以下で使用することが好ましい。好ましくは１５質量％以下であり、より好ましくは１０質量％以下である。上記範囲とすることで、架橋剤を併用した場合に適度な架橋密度を有する塗膜を得ることができる。
<Copolymer composition of vinyl polymer>
The copolymer composition of the vinyl polymer will be described.
The tertiary amino group-containing monomer (A) is preferably used in an amount of 1% by mass or more based on the total amount of all monomers. It is preferably 4% by mass or more, more preferably 10% by mass or more. Moreover, it is preferable to use it in 95 mass % or less. It is preferably 90% by mass or less, more preferably 50% by mass or less, and particularly preferably 30% by mass or less. Within the above range, long-term, low cytotoxicity and excellent anti-adhesion effects for proteins and cells can be exhibited. The monomer (B) having a crosslinkable group is preferably used in an amount of 20% by mass or less based on the total amount of all monomers. It is preferably 15% by mass or less, more preferably 10% by mass or less. By setting it as the said range, when a crosslinking agent is used together, the coating film which has a moderate crosslink density can be obtained.
＜オキシド化＞
重合前のオキシド化、重合後のオキシド化について説明する。重合前のオキシド化は、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を含む溶液に、重合後のオキシド化は、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須とするモノマーを重合したポリマーを含む溶液に、オキシド化剤を加えて２０℃～１００℃の範囲で０．１～１００時間、好ましくは１～５０時間反応させることによって、３級アミノ基をオキシド化することができる。
<Oxidation>
Oxidation before polymerization and oxidation after polymerization will be described. Oxidation before polymerization is a solution containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A), and oxidation after polymerization is a polymer obtained by polymerizing a monomer essentially containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A). The tertiary amino group can be oxidized by adding an oxidizing agent to the solution containing and reacting at 20° C. to 100° C. for 0.1 to 100 hours, preferably 1 to 50 hours.
オキシド化剤としては、過酸化物又はオゾン等の酸化剤が用いられる。過酸化物としては、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等が挙げられ、過酸化水素が好ましく、通常は水溶液の形で用いられる。程度の違いはあるとはいうものの、過酸化物にはラジカル発生剤としての機能もあるので、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須の原料とするビニル系ポリマーの場合には、重合後にオキシド化することが好ましい。また、後述するウレタン系ポリマーの場合にも副反応が生じないように、重合後にオキシド化することが好ましい。 As the oxidizing agent, an oxidizing agent such as peroxide or ozone is used. Examples of peroxides include hydrogen peroxide, ammonium persulfate, sodium persulfate, peracetic acid, metachloroperbenzoic acid, benzoyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, etc. Hydrogen peroxide is preferred, and is usually an aqueous solution. used in the form Although there is a difference in degree, peroxides also function as radical generators. Therefore, in the case of a vinyl polymer containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A) as an essential raw material, Oxidation after polymerization is preferred. Also, in the case of a urethane-based polymer, which will be described later, it is preferable to oxidize after polymerization so as not to cause a side reaction.
一般的にはオキシド化剤の使用量は、オキシド化可能な官能基、即ち、３級アミノ基に対して、０．２～３倍モル当量の割合で使用し、更に０．５～２倍モル当量使用するのがより好ましい。得られたポリマー溶液は、残存した過酸化物を公知の方法で処理した後、使用することもできる。具体的には還元剤添加処理、イオン交換処理、活性炭処理、金属触媒による処理等があげられる。得られたポリマー溶液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて再沈殿、溶媒留去等の公知の方法でアミンオキシド基含有ポリマーを単離して使用することも出来る。また、単離したアミンオキシド基含有ポリマーは、必要ならば再沈殿や、溶剤洗浄、膜分離、吸着処理等によってさらに精製できる。 Generally, the amount of the oxidizing agent used is 0.2 to 3 times the molar equivalent of the oxidizable functional group, that is, the tertiary amino group, and further 0.5 to 2 times the molar equivalent. It is more preferred to use molar equivalents. The obtained polymer solution can also be used after treating the residual peroxide by a known method. Specific examples include reducing agent addition treatment, ion exchange treatment, activated carbon treatment, treatment with a metal catalyst, and the like. The obtained polymer solution can be used as it is, but if necessary, the amine oxide group-containing polymer can be isolated and used by known methods such as reprecipitation and solvent distillation. In addition, the isolated amine oxide group-containing polymer can be further purified by reprecipitation, solvent washing, membrane separation, adsorption treatment, or the like, if necessary.
本発明におけるビニル系ポリマーとしては、前述の如く、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）をオキシド化した後に他のモノマーと重合したもの、及び、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須とするモノマーを重合し、ポリマーを得た後にオキシド化したものの他、モノマーとして、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物や２－イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基含有不飽和化合物と、ヒドロキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンオキシド等のアミンオキシド基含有化合物との反応生成物を用いて共重合したものも用いることができる。 As the vinyl-based polymer in the present invention, as described above, the tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A) is oxidized and then polymerized with another monomer, and the tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A). In addition to those obtained by polymerizing a monomer essential and oxidizing after obtaining a polymer, as a monomer, for example, an epoxy group-containing unsaturated compound such as glycidyl (meth) acrylate or isocyanate such as 2-isocyanatoethyl (meth) acrylate Copolymerization using a reaction product of a group-containing unsaturated compound and an amine oxide group-containing compound such as hydroxyethyl-N,N-dimethylamine oxide can also be used.
＜アミンオキシド基含有量＞
アミンオキシド基は、細胞接着防止効果をポリマーに付与する。ビニル系ポリマー中のアミンオキシド基含有量は、好ましくは０．２５～５ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは０．５～５ｍｍｏｌ／ｇである。０．２５～５ｍｍｏｌ／ｇであることにより、長時間水中に浸漬しても細胞接着防止効果を維持することができる。
ビニル系ポリマー中のアミンオキシド基含有量は、アミンオキシド基を有するモノマーを重合してビニル系ポリマーを得る場合には、重合に用いたアミンオキシド基を有するモノマーの量から求めることができる。一方、３級アミノ基含有モノマーを必須とするモノマーを重合した後に得られたポリマーをオキシド化する場合には、前述の数式１によって算出できる。
<Amine oxide group content>
The amine oxide group imparts cell adhesion prevention effect to the polymer. The amine oxide group content in the vinyl polymer is preferably 0.25 to 5 mmol/g, more preferably 0.5 to 5 mmol/g. When it is 0.25 to 5 mmol/g, the anti-cell adhesion effect can be maintained even after being immersed in water for a long time.
The amine oxide group content in the vinyl-based polymer can be obtained from the amount of the monomer having the amine oxide group used for the polymerization when the vinyl-based polymer is obtained by polymerizing the monomer having the amine oxide group. On the other hand, in the case of oxidizing a polymer obtained after polymerizing a monomer essentially containing a tertiary amino group-containing monomer, it can be calculated by Equation 1 above.
＜質量平均分子量（Ｍｗ）＞
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、２，０００以上であり、好ましくは２，０００～１０，０００，０００であり、より好ましくは５，０００以上であり、さらに好ましくは１０，０００以上であり、特に好ましくは１００，０００以上である。分子量が２，０００以上であることにより、塗膜の凝集力を付与でき、塗工基材からの剥離を抑制でき、長期間の細胞接着防止効果を発揮する。また、１０，０００，０００以下であると、適正な粘度になることから、塗工適性が向上するため好ましい。より好ましくは、５００，０００以下である。
<Mass average molecular weight (Mw)>
The weight average molecular weight of the vinyl polymer (A) is 2,000 or more, preferably 2,000 to 10,000,000, more preferably 5,000 or more, and still more preferably 10,000 or more. and particularly preferably 100,000 or more. When the molecular weight is 2,000 or more, cohesive force of the coating film can be imparted, peeling from the coating substrate can be suppressed, and cell adhesion prevention effect can be exhibited for a long period of time. Further, when it is 10,000,000 or less, the appropriate viscosity is obtained, and thus the coatability is improved, which is preferable. More preferably, it is 500,000 or less.
ビニル系ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用する。測定装置及び測定条件としては、下記条件１によることを基本とし、試料の溶解性等により条件２とすることを許容する。ただし、重合体種によっては、さらに適宜適切なキャリア（溶離液）及びそれに適合したカラムを選定して用いてもよい。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照することとする。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定することとする。また、ビニル系ポリマーの分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をビニル系ポリマーの質量平均分子量とすることが出来る。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件３によることを基本とする。 The mass-average molecular weight of the vinyl-based polymer employs a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene. The measurement apparatus and measurement conditions are based on condition 1 below, and condition 2 is allowed depending on the solubility of the sample. However, depending on the type of polymer, an appropriate carrier (eluent) and a column suitable for it may be selected and used. For other matters, refer to JISK7252-1 to 4:2008. For poorly soluble polymer compounds, measurements are made at a soluble concentration under the following conditions. Moreover, when it is difficult to measure the molecular weight of the vinyl polymer, the weight average molecular weight of the amine oxide precursor polymer can be used as the weight average molecular weight of the vinyl polymer. The mass-average molecular weight of the amine oxide precursor polymer employs a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene, and the measurement apparatus and measurement conditions are based on Condition 3 below.
（条件１）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺＭ－Ｈ、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ４０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ２０００を連結したもの。
キャリア：テトラヒドロフラン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
(Condition 1)
Column: TOSOHTSKgelSuperHZM-H,
A combination of TOSOHTSKgelSuperHZ4000 and TOSOHTSKgelSuperHZ2000.
Carrier: Tetrahydrofuran Measuring temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷＭ－Ｈを２本連結したもの。
キャリア：１０ｍＭＬｉＢｒ／Ｎ－メチルピロリドン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
(Condition 2)
Column: Two columns of TOSOHTSKgelSuperAWM-H are connected.
Carrier: 10 mM LiBr/N-methylpyrrolidone Measurement temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
（条件３）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
(Condition 3)
Column: TOSOH TSKgel Super AW4000,
A concatenation of TOSOHTSKgelSuperAW3000 and TOSOHTSKgelSuperAW2500.
Carrier: N,N-dimethylformamide (1 L), triethylamine (3.04 g), LiBr (0.87 g) mixed liquid Measurement temperature: 40 ° C.
Carrier flow rate: 0.6 mL/min
＜架橋剤＞
本発明の細胞培養器材処理剤は、さらに架橋剤を含むことができる。架橋剤を含むことにより、前述のビニル系ポリマーが架橋性基を有する場合、塗膜に架橋を形成して耐久性（耐水性）を向上させることができる。
本発明で用いることのできる架橋剤としては、前述のビニル系ポリマーを形成するためのモノマー（Ｂ）におけるカルボキシル基及び水酸基からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋性基と反応するものが好ましく、例えば、カルボキシル基が導入されたビニル系ポリマー（Ａ）の架橋剤としては、イソシアネート化合物、アジリジン化合物、カルボジイミド化合物、アミノ化合物等が挙げられる。また、水酸基が導入されたビニル系ポリマー（Ａ）の架橋剤としては、カルボジイミド化合物、イソシアネート化合物、アミノ化合物、アルコキシラン化合物等が挙げられる。これらの架橋剤は、塗膜の弾性率や耐性を上げる目的で使用したり、基材への接着力を調製したりするために用いることができる。
以下に、好ましい架橋剤の例として、カルボジイミド化合物及びイソシアネート化合物について説明する。
<Crosslinking agent>
The agent for treating cell cultureware of the present invention can further contain a cross-linking agent. By containing a cross-linking agent, when the vinyl-based polymer has a cross-linkable group, cross-linking can be formed in the coating film to improve durability (water resistance).
The cross-linking agent that can be used in the present invention preferably reacts with at least one cross-linkable group selected from the group consisting of carboxyl groups and hydroxyl groups in the monomer (B) for forming the vinyl polymer. Examples of cross-linking agents for the vinyl-based polymer (A) into which carboxyl groups have been introduced include isocyanate compounds, aziridine compounds, carbodiimide compounds, amino compounds and the like. Examples of the crosslinking agent for vinyl-based polymer (A) into which hydroxyl groups have been introduced include carbodiimide compounds, isocyanate compounds, amino compounds, alkoxylan compounds, and the like. These cross-linking agents can be used for the purpose of increasing the elastic modulus and resistance of the coating film, and can be used for adjusting the adhesive force to the substrate.
Carbodiimide compounds and isocyanate compounds are described below as examples of preferred cross-linking agents.
［カルボジイミド基含有化合物（カルボジイミド化合物）］
カルボジイミド基含有化合物としては、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’－ジ－２，６－ジイソプロピルフェニルカルボジイミドなどのジカルボジイミドや、ポリ（１，６－ヘキサメチレンカルボジイミド）、ポリ（４，４’－メチレンビスシクロヘキシルカルボジイミド）、ポリ（１，３－シクロヘキシレンカルボジイミド）、ポリ（１，４－シクロヘキシレンカルボジイミド）、ポリ（４，４’－ジシクロヘキシルメタンカルボジイミド）、ポリ（４，４’－ジフェニルメタンカルボジイミド）、ポリ（３，３’－ジメチル－４，４’－ジフェニルメタンカルボジイミド）、ポリ（ナフタレンカルボジイミド）、ポリ（ｐ－フェニレンカルボジイミド）、ポリ（ｍ－フェニレンカルボジイミド）、ポリ（トリルカルボジイミド）、ポリ（ジイソプロピルカルボジイミド）、ポリ（メチル－ジイソプロピルフェニレンカルボジイミド）、ポリ（１，３，５－トリイソプロピルベンゼン）ポリカルボジイミド、ポリ（１，３，５－トリイソプロピルベンゼン）ポリカルボジイミド、ポリ（１，５－ジイソプロピルベンゼン）ポリカルボジイミド、ポリ（トリエチルフェニレンカルボジイミド）、ポリ（トリイソプロピルフェニレンカルボジイミド）などのポリカルボジイミドなどを挙げることができる。
[Carbodiimide group-containing compound (carbodiimide compound)]
Examples of carbodiimide group-containing compounds include dicarbodiimides such as N,N'-diisopropylcarbodiimide, N,N'-dicyclohexylcarbodiimide, N,N'-di-2,6-diisopropylphenylcarbodiimide, poly(1,6-hexa methylenecarbodiimide), poly(4,4'-methylenebiscyclohexylcarbodiimide), poly(1,3-cyclohexylenecarbodiimide), poly(1,4-cyclohexylenecarbodiimide), poly(4,4'-dicyclohexylmethanecarbodiimide) , poly(4,4′-diphenylmethanecarbodiimide), poly(3,3′-dimethyl-4,4′-diphenylmethanecarbodiimide), poly(naphthalenecarbodiimide), poly(p-phenylenecarbodiimide), poly(m-phenylenecarbodiimide) ), poly(tolylcarbodiimide), poly(diisopropylcarbodiimide), poly(methyl-diisopropylphenylenecarbodiimide), poly(1,3,5-triisopropylbenzene) polycarbodiimide, poly(1,3,5-triisopropylbenzene) Polycarbodiimides such as polycarbodiimide, poly(1,5-diisopropylbenzene)polycarbodiimide, poly(triethylphenylenecarbodiimide), poly(triisopropylphenylenecarbodiimide) and the like can be mentioned.
カルボジイミド基含有化合物の市販品として、日清紡ホールディングス（株）製“カルボジライト”（登録商標）、ラインケミー製“スタバクゾール（登録商標）”などを挙げることができる。 Examples of commercially available carbodiimide group-containing compounds include "Carbodilite" (registered trademark) manufactured by Nisshinbo Holdings Inc. and "Stabaxol (registered trademark)" manufactured by Rhein Chemie.
［イソシアネート基を有する架橋剤（イソシアネート化合物）］
本発明で用いられるイソシアネート基を有する架橋剤としては、１分子中に２個以上のイソシアネート基を有した化合物であればよく、特に限定されるものではない。
２官能イソシアネート化合物としては、例えば、２，２’－ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４’－ジフェニルメタンジイソシアネート、４，４’－ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４－トリレンジイソシアネート、２，６－トリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート等を挙げることができる。
３官能イソシアネート化合物としては、上記で説明したジイソシアネートのトリメチロールプロパンアダクト体、水と反応したビュウレット体、イソシアヌレート環を有する３量体が挙げられる。
また、イソシアネート基を有する架橋剤中のイソシアネート基は、ブロック化されていても良いし、ブロック化されていなくても良い。本発明で用いられるブロック化イソシアネート架橋剤としては、前記イソシアネート化合物中のイソシアネート基がε－カプロラクタム、ＭＥＫオキシム、シクロヘキサノンオキシム、ピラゾール、フェノール等でブロックされたブロック化イソシアネート化合物であればよく、特に限定されるものではない。
[Crosslinking agent having isocyanate group (isocyanate compound)]
The isocyanate group-containing cross-linking agent used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having two or more isocyanate groups in one molecule.
Examples of bifunctional isocyanate compounds include 2,2′-diphenylmethane diisocyanate, 2,4′-diphenylmethane diisocyanate, 4,4′-diphenylmethane diisocyanate, 2,4-tolylene diisocyanate, 2,6-tolylene diisocyanate, hexa Examples include methylene diisocyanate and isophorone diisocyanate.
Examples of the trifunctional isocyanate compound include the trimethylolpropane adduct of the diisocyanate described above, the water-reacted biuret form, and the trimer having an isocyanurate ring.
Moreover, the isocyanate group in the cross-linking agent having an isocyanate group may be blocked or may not be blocked. The blocked isocyanate crosslinking agent used in the present invention may be a blocked isocyanate compound in which the isocyanate group in the isocyanate compound is blocked with ε-caprolactam, MEK oxime, cyclohexanone oxime, pyrazole, phenol, or the like, and is particularly limited. not to be
本発明において、架橋剤は、一種のみを単独で用いてもよいし、複数を併用しても良い。架橋剤の使用量は、ビニル系ポリマー中に含まれる官能基の種類やモル数を考慮して決定すればよく、特に限定されるものではないが、通常はビニル系ポリマー１００質量部に対して０．１質量部～１００質量部の範囲で用いられる。ビニル系ポリマー中に含まれる官能基のモル数よりも少ない範囲で配合することで、未反応の架橋剤が遊離する懸念をなくすことができる。この範囲であれば、目的とする細胞培養器材処理剤の各効果に、特に優れた性能が発現される。 In the present invention, the cross-linking agent may be used singly or in combination of two or more. The amount of the cross-linking agent used may be determined in consideration of the type and number of moles of functional groups contained in the vinyl-based polymer, and is not particularly limited, but is usually based on 100 parts by mass of the vinyl-based polymer. It is used in the range of 0.1 parts by mass to 100 parts by mass. By blending in a range smaller than the number of moles of the functional groups contained in the vinyl polymer, it is possible to eliminate the concern that unreacted cross-linking agents will be liberated. Within this range, particularly excellent performance is exhibited in each effect of the intended cell cultureware treatment agent.
＜細胞培養器材処理剤の調製＞
本発明の細胞培養器材処理剤は、細胞培養器材処理剤１００質量％中、前記ビニル系ポリマーを５０質量以下％含むことが好ましく、０．５～１０質量％含むことがより好ましい。ビニル系ポリマー含有量を０．５質量％以上とすることで、アミンオキシド基による細胞接着抑制の効果を発揮することができる。また、本発明の細胞培養器材処理剤は、ビニル系ポリマー以外の成分を含んでも良い。
<Preparation of cell cultureware treatment agent>
The cell cultureware treatment agent of the present invention preferably contains the vinyl polymer in an amount of 50% by mass or less, more preferably 0.5 to 10% by mass, based on 100% by mass of the cell cultureware treatment agent. By setting the vinyl-based polymer content to 0.5% by mass or more, the effect of inhibiting cell adhesion by the amine oxide groups can be exhibited. In addition, the agent for treating cell cultureware of the present invention may contain components other than the vinyl-based polymer.
＜溶媒＞
本発明の細胞培養器材処理剤は、ビニル系ポリマー以外の成分として溶媒を含有してもよく、２種以上を併用して含んでもよい。溶媒は、アミンオキシド量に依存するビニル系ポリマーの溶解性や製膜条件等を考慮し、従来公知の溶媒から適宜選択することができる。
例えば、ビニル系ポリマー中のアミンオキシド量が多い場合、水、メタノールやエタノール等のアルコール類、アセトンやエチルメチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフランやジエチルエーテル等のエーテル類、酢酸メチルや酢酸エチル等のエステル類、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、ギ酸や酢酸等の有機酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド等の有機塩基を選択することができる。一方、ビニル系ポリマー中のアミンオキシド量がの少ない場合、アセトンやエチルメチルケトン等のケトン類、テトラヒドロフランやジエチルエーテル等のエーテル類、酢酸メチルや酢酸エチル等のエステル類、ジメチルスルホキシド、アセトニトリルに加え、ジクロロメタンやトリクロロメタン等のハロゲン溶媒を選択することができる。
<Solvent>
The agent for treating cell cultureware of the present invention may contain a solvent as a component other than the vinyl polymer, or may contain two or more of them in combination. The solvent can be appropriately selected from conventionally known solvents in consideration of the solubility of the vinyl-based polymer, which depends on the amount of amine oxide, the film-forming conditions, and the like.
For example, when the amount of amine oxide in the vinyl polymer is large, water, alcohols such as methanol and ethanol, ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether, methyl acetate and ethyl acetate, etc. Esters, dimethylsulfoxide, acetonitrile, organic acids such as formic acid and acetic acid, and organic bases such as N,N-dimethylformamide can be selected. On the other hand, when the amount of amine oxide in the vinyl polymer is small, in addition to ketones such as acetone and ethyl methyl ketone, ethers such as tetrahydrofuran and diethyl ether, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, dimethyl sulfoxide, and acetonitrile, , a halogen solvent such as dichloromethane or trichloromethane can be selected.
＜その他添加剤等＞
本発明の細胞培養器材処理剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、各種の添加剤を含有してもよく、界面活性剤、等張化剤、キレート化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、増粘剤、安定化剤、タンパク質分解酵素、薬理活性成分、生理活性成分や、医薬品添加物辞典に記載された各種添加剤等を、本発明の効果を損なわない範囲で含んでいてもよい。これらは１種を単独で含んでいてもよく、２種以上を含んでいてもよい。
<Other additives, etc.>
The agent for treating cell cultureware of the present invention may contain various additives, such as surfactants, tonicity agents, chelating agents, pH adjusters, buffers, as long as the effects of the present invention are not impaired. , thickeners, stabilizers, proteolytic enzymes, pharmacologically active ingredients, bioactive ingredients, and various additives described in the Dictionary of Pharmaceutical Additives, etc., as long as the effects of the present invention are not impaired. . These may contain 1 type independently and may contain 2 or more types.
例えば、イオンバランスを調製するために、ｐＨ調整剤を含有してもよい。ｐＨ調整剤としては、酸性又は塩基性の化合物が挙げられる。酸性ｐＨ調整剤の例としては、カルボン酸、無機酸及びスルホン酸が挙げられ、塩基性ｐＨ調整剤の例としては、水酸化物、アルコキシド、第一級及び第二級アミン以外の窒素含有化合物、塩基性炭酸塩、並びに塩基性リン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養器材処理剤のｐＨ値は、４．０～９．０程度、好ましくは６．０～８．０程度、であり、７．０付近になるように調整して用いることが好ましい。 For example, it may contain a pH adjuster to adjust the ion balance. pH adjusters include acidic or basic compounds. Examples of acidic pH modifiers include carboxylic acids, inorganic acids and sulfonic acids, and examples of basic pH modifiers include nitrogen-containing compounds other than hydroxides, alkoxides, primary and secondary amines. , basic carbonates, and basic phosphates. The pH value of the cell cultureware treatment agent is about 4.0 to 9.0, preferably about 6.0 to 8.0, and is preferably adjusted to about 7.0 before use.
また、等張化剤としては、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）又は塩化ナトリウム等が挙げられる。増粘剤、安定化剤としては、ポリビニルアルコール、ポリ－Ｎ－ビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアクリルアミド等の合成有機高分子化合物、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体、カルボキシメチルスターチナトリウム、ヒドロキシエチルスターチ等のスターチ誘導体、コンドロイチン硫酸塩、ヒアルロン酸塩等が挙げられる。 In addition, isotonizing agents include sugars, polyalcohols (mannitol, sorbitol, etc.), sodium chloride, and the like. Examples of thickeners and stabilizers include synthetic organic polymer compounds such as polyvinyl alcohol, poly-N-vinylpyrrolidone, polyethylene glycol, polypropylene glycol, and polyacrylamide, and cellulose derivatives such as hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, and hydroxypropylmethyl cellulose. , carboxymethyl starch sodium, starch derivatives such as hydroxyethyl starch, chondroitin sulfate, hyaluronate and the like.
＜細胞培養器材＞
本発明の細胞培養器材は、基材上に、アミンオキシド基を含み、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマーを含む細胞接着防止膜（塗膜とも言う場合もある）を有し、基材上に、アミンオキシド基を含み、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマーを含む細胞接着防止膜を形成する工程を含むこと、具体的には、アミンオキシド基を含み、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマーを含む細胞培養器材処理剤をコーティングする工程を含むことにより製造することができる。
<Cell cultureware>
The cell cultureware of the present invention comprises a cell adhesion-preventing film (also referred to as a coating film) containing an amine oxide group and a vinyl polymer having a mass average molecular weight of 2,000 or more on a substrate. and forming, on a substrate, a cell adhesion-preventing film containing a vinyl polymer having an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more, specifically, an amine oxide It can be produced by including a step of coating a cell cultureware treatment agent containing a vinyl polymer having a group and a mass average molecular weight of 2,000 or more.
細胞接着防止膜を形成する方法、即ちアミンオキシド基を含み、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマーを含む細胞培養器材処理剤をコーティングする工程としては、公知の方法で行うことができる。例えば、前記細胞培養器材処理剤を公知の方法でコーティングした後に、熱処理等をすることで、塗膜を形成することができる。なお、架橋剤を使用して硬化することもできる。 The method of forming a cell adhesion-preventing film, that is, the step of coating a cell cultureware treatment agent containing a vinyl polymer having an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more, is carried out by a known method. be able to. For example, a coating film can be formed by performing heat treatment or the like after coating the cell cultureware treatment agent by a known method. In addition, it can also be cured using a cross-linking agent.
前記コーティング方法は、基材に応じて適宜選択でき、具体的には、スプレーコーティング法、ディップコーティング法、フローコーティング法、インクジェット方式、刷毛塗り、スポンジ塗り等が挙げられる。また、グラビア印刷、オフセット印刷、シルクスクリーン印刷等の各種印刷方式を用いてもよい。コーティング後の熱処理温度は、含有する溶媒の沸点や、架橋剤の架橋温度に応じて適宜選択できるが、工業的には、４０～１８０℃であるのが望ましい。さらに、本組成物が架橋剤を含む場合、架橋反応を促進させるための工程を設けることが好ましい。架橋条件は、一般的に４０～１５０℃で６～２４時間であるが、これらに限定されない。 The coating method can be appropriately selected according to the base material, and specific examples thereof include spray coating, dip coating, flow coating, ink jet method, brush coating, and sponge coating. Various printing methods such as gravure printing, offset printing, and silk screen printing may also be used. The heat treatment temperature after coating can be appropriately selected according to the boiling point of the contained solvent and the cross-linking temperature of the cross-linking agent. Furthermore, when the present composition contains a cross-linking agent, it is preferable to provide a step for promoting the cross-linking reaction. Cross-linking conditions are generally 40-150° C. for 6-24 hours, but are not limited thereto.
＜基材＞
本発明の基材は、細胞培養器材用に使用可能であれば特に制限されない。具体的には、（メタ）アクリル系樹脂、スチレン系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリビニルアセテート、ビニル－アセテート共重合体、スチレン－メチルメタアクリレート共重合体、アクリルニトリル－スチレン共重合体、アクリルニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、ナイロン、ポリメチルペンテン、シリコーン樹脂、アミノ樹脂、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリエーテルイミド、フッ素樹脂、及びポリイミドの樹脂材料からなる群から選択された１種以上の樹脂のほか、ガラス基材等が挙げられる。
<Base material>
The substrate of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for cell cultureware. Specifically, (meth)acrylic resin, styrene resin, polycarbonate resin, polyolefin resin, polystyrene, polyethylene, polyvinyl chloride, polypropylene, polyester, polyvinyl acetate, vinyl-acetate copolymer, styrene-methyl meta Acrylate copolymer, acrylonitrile-styrene copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, nylon, polymethylpentene, silicone resin, amino resin, polysulfone, polyethersulfone, polyetherimide, fluororesin, and In addition to one or more resins selected from the group consisting of polyimide resin materials, glass substrates and the like can be used.
＜シリコーン基材＞
前記シリコーン基材は、シリコーン系樹脂を含む基材であれば特に制限されない。
シリコーン系樹脂としては、ポリジメチルシロキサン、ポリフェニルメチルシロキサン、ポリジフェニルシロキサンのようなポリオルガノシロキサンを主鎖とするものが挙げられ、好ましくは、ポリジメチルシロキサンである。また、このようなシリコーン基材としては、具体的には、例えば、シリコーン含有医療用デバイス、マイクロ流路を有するシリコーン基材、好ましくはシリコーン含有マイクロ流路デバイスが挙げられる。
<Silicone base material>
The silicone base material is not particularly limited as long as it contains a silicone resin.
Examples of silicone-based resins include those having polyorganosiloxane as a main chain, such as polydimethylsiloxane, polyphenylmethylsiloxane, and polydiphenylsiloxane, with polydimethylsiloxane being preferred. Specific examples of such silicone substrates include silicone-containing medical devices and silicone substrates having microchannels, preferably silicone-containing microchannel devices.
前記医療用デバイスとは、生体内で使用される医療用の構造体のことをいい、斯様な構造体は、体内へ埋め込んで使用するものと、体内で（埋め込まずに）使用するものとに大別される。なお、医療用デバイスの大きさや長さは特に限定されるものではなく、微細な回路を有するものや、微量の試料を検出するものも包含される。
体内へ埋め込んで使用する構造体としては、例えば、心臓ペースメーカー等の疾患が生じている生体の機能を補うための機能補助装置；埋入型バイオチップ等の生体の異常を検出するための装置；インプラント、骨固定材、縫合糸、人工血管等の医療用器具が挙げられる。また、体内で（埋め込まずに）使用する構造体としては、カテーテル、胃カメラ等が挙げられる。
The medical device refers to a medical structure used in vivo, and such a structure may be used by being implanted in the body or used in the body (without being implanted). It is divided into Note that the size and length of the medical device are not particularly limited, and devices with minute circuits and devices that detect minute amounts of samples are also included.
Structures to be implanted in the body include, for example, functional assisting devices such as cardiac pacemakers for supplementing the functions of diseased living bodies; devices for detecting abnormalities in living bodies such as implantable biochips; Examples include medical instruments such as implants, bone fixation materials, sutures, and artificial blood vessels. Structures used inside the body (without being implanted) include catheters, gastroscopes, and the like.
前記マイクロ流路デバイスとしては、例えば、微小反応デバイス（具体的にはマイクロリアクターやマイクロプラント等）、集積型核酸分析デバイス、微小電気泳動デバイス、微小クロマトグラフィーデバイス等の微小分析デバイス；質量スペクトルや液体クロマトグラフィー等の分析試料調製用微小デバイス；抽出、膜分離、透析などに用いる物理化学的処理デバイス；環境分析チップ、臨床分析チップ、遺伝子分析チップ（ＤＮＡチップ）、タンパク質分析チップ（プロテオームチップ）、糖鎖チップ、クロマトグラフチップ、細胞解析チップ、製薬スクリーニングチップ等のマイクロ流路チップが挙げられる。これらの中でも、マイクロ流路チップが好ましい。 Examples of the microfluidic device include microanalysis devices such as microreaction devices (specifically, microreactors, microplants, etc.), integrated nucleic acid analysis devices, microelectrophoresis devices, and microchromatography devices; Microdevices for analysis sample preparation such as liquid chromatography; physicochemical processing devices used for extraction, membrane separation, dialysis, etc.; environmental analysis chip, clinical analysis chip, gene analysis chip (DNA chip), protein analysis chip (proteome chip) , sugar chain chips, chromatography chips, cell analysis chips, and pharmaceutical screening chips. Among these, a microchannel chip is preferable.
なお、前記マイクロ流路は、微量の試料（好ましくは液体試料）が流れる部位であり、その流路幅及び深さは特に限定されないが、いずれも、通常、０．１μｍ～１ｍｍ程度であり、好ましくは１０μｍ～８００μｍである。なお、マイクロ流路の流路幅や深さは、流路全長にわたって同じであってもよく、部分的に異なる大きさや形状であってもよい。 The microchannel is a portion through which a small amount of sample (preferably liquid sample) flows, and the channel width and depth are not particularly limited, but both are usually about 0.1 μm to 1 mm, It is preferably 10 μm to 800 μm. The channel width and depth of the microchannel may be the same over the entire length of the channel, or may be partially different in size and shape.
前記シリコーン基材は、プラズマ処理、ＵＶオゾン処理、内部浸潤剤処理等がされていてもよい。これらの処理がなされたシリコーン基材は表面が親水化されているため、重合体が吸着しにくくなる場合があるが、本発明で用いる、アミンオキシド基を含み、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマーはこのようなプラズマ処理等がされたシリコーン基材にも吸着し、優れた親水性及び生体試料吸着抑制効果が付与される。 The silicone base material may be subjected to plasma treatment, UV ozone treatment, internal infiltration agent treatment, or the like. Since the surface of the silicone base material subjected to these treatments is hydrophilized, it may be difficult for the polymer to adsorb thereon. A vinyl polymer having a molecular weight of 000 or more is adsorbed even to such a plasma-treated silicone substrate, and is imparted with excellent hydrophilicity and an effect of suppressing adsorption of biological samples.
＜メディカルデバイス＞
前記メディカルデバイスは、医療用器材であれば特に制限されず、具体例としては、例えば、血液バッグ、採尿バッグ、輸血セット、縫合糸、ドレーンチューブ、各種カテーテル、ブラッドアクセス、血液回路、人工血管、人工腎臓、人工心肺、人工弁、血漿交換膜、各種吸着体、ＣＡＰＤ、ＩＡＢＰ、ペースメーカー、人工関節、人工骨頭、歯科材料、各種シャント、が挙げられる。
メディカルデバイスの材質や形状は特に限定されず、材質としては、ポリオレフィン、変性ポリオレフィン、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニルやそれらの共重合体などの各種高分子材料、金属、セラミック、カーボン、及びこれらの複合材料等が挙げられる。また、形状は特に限定されず、平滑、多孔質などいずれであってもよい。
<Medical devices>
The medical device is not particularly limited as long as it is a medical device, and specific examples include blood bags, urine collection bags, blood transfusion sets, sutures, drain tubes, various catheters, blood accesses, blood circuits, artificial blood vessels, Artificial kidneys, artificial heart lungs, artificial valves, plasma exchange membranes, various adsorbents, CAPD, IABP, pacemakers, artificial joints, artificial femoral heads, dental materials, and various shunts.
The material and shape of the medical device are not particularly limited, and materials include polyolefin, modified polyolefin, polyether, polyurethane, polyamide, polyimide, polyester such as polyethylene terephthalate, polytetrafluoroethylene, polyvinyl chloride, and their copolymers. and various polymer materials such as metals, ceramics, carbon, and composite materials thereof. Moreover, the shape is not particularly limited, and may be smooth, porous, or the like.
＜細胞培養培地添加剤＞
本発明の細胞培養培地添加剤は、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を含む。上記ビニル系ポリマー（Ａ）を含むことで、細胞が基材に接着することなく、細胞同士が集まった３次元的かつ生細胞数の割合が良好な細胞凝集塊を形成する効果を発揮する。
また、本発明の細胞培養培地添加剤は、ビニル系ポリマー（Ａ）を含むことで、抗体を効率的に生産することができる。また、抗体産生細胞凝集物の発生が抑制され、目的とする抗体の精製が容易となる。
<Cell culture medium additive>
The cell culture medium additive of the present invention contains a vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more. By including the vinyl-based polymer (A), cells do not adhere to the substrate, and an effect of forming a three-dimensional cell aggregate in which the cells are gathered together and having a good ratio of the number of viable cells is exhibited.
In addition, the cell culture medium additive of the present invention can efficiently produce antibodies by containing the vinyl polymer (A). In addition, the generation of antibody-producing cell aggregates is suppressed, facilitating the purification of the desired antibody.
＜ビニル系ポリマー（Ａ）＞
本発明のビニル系ポリマー（Ａ）は、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であればよく、従来公知のポリマーを用いることができ、２種以上を併用してもよい。アミンオキシド基を有することで、優れた細胞凝集塊形成性を発揮する。
<Vinyl-based polymer (A)>
The vinyl-based polymer (A) of the present invention may have an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more, and conventionally known polymers can be used. good too. Having an amine oxide group exhibits excellent cell aggregate formation properties.
本発明において、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマーは、以下のような２つの方法で得ることができる。
（１）アミンオキシド基を有するモノマーとその他モノマーとの共重合体として得る方法。
（２）アミンオキシド基の前駆官能基とでもいうべき３級アミノ基を有するビニル系ポリマーを得た後、前記３級アミノ基と酸化剤との反応生成物として得る方法。
（３）３級アミノ基を有するモノマーと酸化剤との反応生成物モノマー（アミンオキシド基含有モノマー）と、その他モノマーとの共重合体として得る方法。
３級アミノ基に酸化剤（以下、オキシド化剤ともいう）を反応させることで、アミンオキシド基を導入することができる。この反応を以下「オキシド化」ともいう。副反応を生じ難いという点で（２）の方法が好ましい。
In the present invention, a vinyl polymer having amine oxide groups can be obtained by the following two methods.
(1) A method of obtaining a copolymer of a monomer having an amine oxide group and other monomers.
(2) A method of obtaining a vinyl-based polymer having a tertiary amino group, which can be called a precursor functional group of an amine oxide group, and then obtaining a reaction product of the tertiary amino group and an oxidizing agent.
(3) A method of obtaining a copolymer of a monomer (amine oxide group-containing monomer) which is a reaction product of a monomer having a tertiary amino group and an oxidizing agent, and other monomers.
An amine oxide group can be introduced by reacting a tertiary amino group with an oxidizing agent (hereinafter also referred to as an oxidizing agent). This reaction is hereinafter also referred to as "oxidation". The method (2) is preferable in that side reactions are less likely to occur.
ビニル系ポリマーとしては、具体的には、前述の一般式１～３で表される少なくともいずれかの構造を含むものであることが好ましく、中でも一般式１で表される構造を含むものが特に好ましい。アミンオキシド基が下記式であらわされるものであることによって、好適な水溶性を発現することができる。
ビニル系ポリマーは、共重合体であることが好ましく、ブロック共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよい。
Specifically, the vinyl-based polymer preferably contains at least one of the structures represented by the general formulas 1 to 3 described above, and among them, those containing the structure represented by the general formula 1 are particularly preferable. Suitable water-solubility can be exhibited when the amine oxide group is represented by the following formula.
The vinyl-based polymer is preferably a copolymer, and may be a block copolymer, a random copolymer, or an alternating copolymer.
このような構造を有するビニルポリマーは、前述の通り、３つの方法で得ることができる。より好ましくは前述の（２）である、３級アミノ基含有モノマー（ａ）と、その他モノマーとを重合した後にオキシド化する方法である。その他モノマーは、炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）を含むことが好ましい。 A vinyl polymer having such a structure can be obtained by three methods, as described above. More preferably, the above-described method (2), in which the tertiary amino group-containing monomer (a) and other monomers are polymerized and then oxidized. Other monomers preferably include a monomer (c) having an alkyl group of 4 to 18 carbon atoms.
＜３級アミノ基含有モノマー（ａ）＞
オキシド化前の前駆体としての３級アミノ基含有モノマー（ａ）のうち、
一般式１の構造を形成するためものとしては、例えば、
Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、あるいは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物等が挙げられる。
好ましくは、（メタ）アクリレートモノマーであり、より好ましくはＮ，Ｎ－ジアルキルアミノエチル（メタ）アクリレート又はＮ，Ｎ－ジアルキルアミノプロピル（メタ）アクリレートである。
なお、本発明において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」及び「メタクリル」の両者を言い表すものとする。
<Tertiary amino group-containing monomer (a)>
Of the tertiary amino group-containing monomer (a) as a precursor before oxidation,
For forming the structure of general formula 1, for example,
N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N- Dimethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylaminopropionic acid vinyl, vinyl N,N-diethylaminopropionate, N,N-dimethylacrylamide, N,N-dimethylallylamine, p-dimethylaminomethylstyrene, p-dimethylaminoethylstyrene, p-diethylaminomethylstyrene, p-diethylaminoethylstyrene , N,N-dimethylvinylamine, N,N-diethylvinylamine, N,N-diphenylvinylamine, or unsaturated group-containing acid anhydrides such as maleic anhydride, itaconic anhydride, and citraconic anhydride, and N , N-dimethyl-1,3-propanediamine, etc., reaction products of epoxy group-containing unsaturated compounds such as glycidyl (meth)acrylate and N,N-dimethyl-1,3-propanediamine, etc. etc.
Preferred are (meth)acrylate monomers, more preferred are N,N-dialkylaminoethyl (meth)acrylates or N,N-dialkylaminopropyl (meth)acrylates.
In the present invention, "(meth)acryl" refers to both "acryl" and "methacryl".
一般式３の構造を形成するためのものとしては、例えば、
２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジン等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 3, for example,
2-vinylpyridine, 3-vinylpyridine, 4-vinylpyridine, 2-methyl-3-vinylpyridine, 2-methyl-4-vinylpyridine, 3-methyl-4-vinylpyridine, 2-methyl-5-vinylpyridine , 3-methyl-5-vinylpyridine, 4-methyl-5-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-4-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-5-vinylpyridine and the like.
一般式２の構造を形成するためのものとしては、例えば、
１－ビニルイミダゾール、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾール等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 2, for example,
1-vinylimidazole, 2-methyl-1-vinylimidazole, 4-methyl-1-vinylimidazole, 5-methyl-1-vinylimidazole, 4-(t-butyl)-1-vinylimidazole and the like.
＜その他モノマー＞
ビニル系ポリマー（Ａ）を得る際に、前記３級アミノ基含有モノマー（ａ）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他モノマーを用いることができる。その他モノマーに基づく構造の導入により、極性やＴｇが適切に制御され、溶媒溶解性等を制御することができる。
その他モノマーとしては、炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）を用いることが、細胞凝集塊形成性の観点及び細胞凝集物の吸着抑制性の観点から好ましい。
<Other monomers>
When obtaining the vinyl-based polymer (A), other monomers having one ethylenically unsaturated group in one molecule can be used in addition to the tertiary amino group-containing monomer (a). By introducing a structure based on other monomers, polarity and Tg can be appropriately controlled, and solvent solubility and the like can be controlled.
As other monomers, it is preferable to use a monomer (c) having an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms from the viewpoint of cell aggregate formation and adsorption inhibition of cell aggregates.
［炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）］
炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）は、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と炭素数４～１８のアルキル基とを有するモノマーが好ましい。ビニル系ポリマー（Ａ）は、炭素数４～１８のアルキル基を有することで、極性が制御され、周囲の環境を適切に制御することができる。
[Monomer (c) having an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms]
The monomer (c) having an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms is preferably a monomer having one ethylenically unsaturated group and an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms in one molecule. Since the vinyl-based polymer (A) has an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms, the polarity is controlled and the surrounding environment can be appropriately controlled.
モノマー（ｃ）としては、特に限定はされないが、例えば、
ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；
１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和モノマーなどが挙げられる。
Although the monomer (c) is not particularly limited, for example,
Butyl (meth)acrylate, pentyl (meth)acrylate, heptyl (meth)acrylate, 2-ethylhexyl (meth)acrylate, octyl (meth)acrylate, nonyl (meth)acrylate, decyl (meth)acrylate, dodecyl (meth)acrylate, Alkyl (meth)acrylates such as stearyl (meth)acrylate, cetyl (meth)acrylate, cyclohexyl (meth)acrylate;
Examples include α-olefinic ethylenically unsaturated monomers such as 1-butene, 1-pentene, 1-hexene, 1-octene, 1-nonene and 1-decene.
［（ａ）、（ｃ）以外のモノマー（ｄ）］
さらに、ビニル系ポリマーを得る際に、前記モノマー（ａ）、（ｃ）以外のモノマー（ｃ）を用いてもよい。（ａ）（ｃ）以外のモノマー（ｄ）は、モノマー（ａ）や（ｃ）と共重合可能であり、モノマー（ａ）（ｃ）以外の、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有するモノマーであることが好ましい。
[monomer (d) other than (a) and (c)]
Furthermore, a monomer (c) other than the monomers (a) and (c) may be used when obtaining the vinyl-based polymer. The monomer (d) other than (a) and (c) is copolymerizable with the monomers (a) and (c), and has one ethylenically unsaturated group in one molecule other than the monomers (a) and (c). is preferably a monomer having
モノマー（ｄ）としては、特に限定はされないが、
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレートなどアルキル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、プロポキシエチル（メタ）アクリレート、ブトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシプロピル（メタ）アクリレート等のアクリルエステル（メタ）アクリレート；
フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族エステル（メタ）アクリレート；
（メタ）アクリル酸アリル、（メタ）アクリル酸１－メチルアリル、（メタ）アクリル酸２－メチルアリル、（メタ）アクリル酸１－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－ブテニル、（メタ）アクリル酸３－ブテニル、（メタ）アクリル酸１，３－メチル－３－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－クロルアリル、（メタ）アクリル酸３－クロルアリル、（メタ）アクリル酸ｏ－アリルフェニル、（メタ）アクリル酸２－（アリルオキシ）エチル、（メタ）アクリル酸アリルラクチル、（メタ）アクリル酸シトロネリル、（メタ）アクリル酸ゲラニル、（メタ）アクリル酸ロジニル、（メタ）アクリル酸シンナミル、ジアリルマレエート、ジアリルイタコン酸、（メタ）アクリル酸ビニル、クロトン酸ビニル、オレイン酸ビニル，リノレン酸ビニル、（メタ）アクリル酸２－（２’－ビニロキシエトキシ）エチルなどのエチレン性不飽和基含有（メタ）アクリル酸エステル類；
パーフルオロメチルメチル（メタ）アクリレート、パーフルオロエチルメチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロブチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロイソノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロデシルエチル（メタ）アクリレート、パーフルオロプロピルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルアミル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルウンデシル（メタ）アクリレートなどの炭素数１～２０のパーフルオロアルキル基を有するパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和モノマーなどの（メタ）アクリレート系モノマー；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリロイロキシエチル－２－ヒドロキシエチルフタル酸、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシビニルベンゼン、１－エチニル－１－シクロヘキサノール、アリルアルコールなどの水酸基を有するモノマー；
マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、シトラコン酸、又は、これらのアルキル若しくはアルケニルモノエステル、フタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、イソフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、テレフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、コハク酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、けい皮酸などのカルボン酸基、若しくはその無水物を有するモノマー；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有するモノマー；
（２－ヒドロキシエチル）メタクリレートアシッドホスフェートなどのリン酸基を有するモノマー；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１～３級アミド基を有するモノマー；
（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマー；
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系モノマー；スチレン、α－メチルスチレン、２－メチルスチレン、クロロスチレン、アリルベンゼン、エチニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー；（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和モノマー；酢酸ビニル、酪酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ヘキサン酸ビニル、カプリル酸ビニル、ラウリル酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；ブチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのビニルエーテル系エチレン性不飽和モノマー；
酢酸アリル、シアン化アリルなどのアリルモノマー；シアン化ビニル、ビニルシクロヘキサン、ビニルメチルケトンなどのビニルモノマー；アセチレン、エチニルトルエンなどのエチニルモノマーパーフルオロブチルエチレン、パーフルオロヘキシルエチレン、パーフルオロオクチルエチレン、パーフルオロデシルエチレンなどのパーフルオロアルキル、アルキレン類などのパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和化合物等の、（メタ）アクリレートではないエチレン性不飽和結合を有するモノマーなどが挙げられる。
Although the monomer (d) is not particularly limited,
Methyl (meth)acrylate, Ethyl (meth)acrylate, Propyl (meth)acrylate, Alkyl (meth)acrylate, Isobornyl (meth)acrylate, Methoxyethyl (meth)acrylate, Ethoxyethyl (meth)acrylate, Propoxyethyl (meth)acrylate , butoxyethyl (meth)acrylate, acrylic ester (meth)acrylate such as ethoxypropyl (meth)acrylate;
aromatic ester (meth)acrylates such as phenyl (meth)acrylate, benzyl (meth)acrylate, phenoxyethyl (meth)acrylate;
Allyl (meth)acrylate, 1-methylallyl (meth)acrylate, 2-methylallyl (meth)acrylate, 1-butenyl (meth)acrylate, 2-butenyl (meth)acrylate, 3-(meth)acrylate butenyl, 1,3-methyl-3-butenyl (meth)acrylate, 2-chloroallyl (meth)acrylate, 3-chloroallyl (meth)acrylate, o-allylphenyl (meth)acrylate, (meth)acrylic acid 2-(allyloxy)ethyl, allyllactyl (meth)acrylate, citronellyl (meth)acrylate, geranyl (meth)acrylate, rhodinyl (meth)acrylate, cinnamyl (meth)acrylate, diallyl maleate, diallyl itaconic acid, Ethylenically unsaturated group-containing (meth)acrylates such as vinyl (meth)acrylate, vinyl crotonate, vinyl oleate, vinyl linolenate, and 2-(2'-vinyloxyethoxy)ethyl (meth)acrylate ;
Perfluoromethylmethyl (meth)acrylate, perfluoroethylmethyl (meth)acrylate, 2-perfluorobutylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorohexylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorooctylethyl (meth)acrylate , 2-perfluoroisononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorodecylethyl (meth)acrylate, perfluoropropylpropyl (meth)acrylate, perfluorooctylpropyl (meth)acrylate ) acrylate, perfluorooctyl amyl (meth) acrylate, perfluorooctyl undecyl (meth) acrylate, perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated monomers having a perfluoroalkyl group having 1 to 20 carbon atoms (meth) an acrylate-based monomer;
2-hydroxyethyl (meth)acrylate, 2-hydroxypropyl (meth)acrylate, 4-hydroxybutyl (meth)acrylate, 2-(meth)acryloyloxyethyl-2-hydroxyethyl phthalate, glycerol mono(meth)acrylate , 4-hydroxyvinylbenzene, 1-ethynyl-1-cyclohexanol, monomers having a hydroxyl group such as allyl alcohol;
Maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citraconic acid, or their alkyl or alkenyl monoesters, β-(meth)acryloxyethyl phthalate monoester, β-(meth)acryloxyethyl isophthalic acid, terephthalic acid monomers having a carboxylic acid group such as β-(meth)acryloxyethyl monoester, β-(meth)acryloxyethyl succinate, acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, cinnamic acid, or an anhydride thereof;
monomers having a sulfonic acid group such as vinylsulfonic acid and styrenesulfonic acid;
Monomers with a phosphate group such as (2-hydroxyethyl) methacrylate acid phosphate;
(Meth)acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidone, N-methoxymethyl-(meth)acrylamide, N-ethoxymethyl-(meth)acrylamide, N-propoxymethyl-(meth)acrylamide, N-butoxymethyl-(meth) ) acrylamide, N-pentoxymethyl-(meth)acrylamide, N,N-di(methoxymethyl)acrylamide, N-ethoxymethyl-N-methoxymethylmethacrylamide, N,N-di(ethoxymethyl)acrylamide, N- Ethoxymethyl-N-propoxymethylmethacrylamide, N,N-di(propoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl-N-(propoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(butoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl -N-(methoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(pentoxymethyl)acrylamide, N-methoxymethyl-N-(pentoxymethyl)methacrylamide, N,N-dimethylacrylamide, N,N-diethylacrylamide , a monomer having a primary to tertiary amide group such as diacetone (meth)acrylamide;
(Meth)acrylic acid dimethylaminoethylmethyl chloride salt, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylpropyl)ammonium chloride, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamidopropyl)ammonium chloride, and monomers having a quaternary amino group such as trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylethyl)ammonium chloride;
Polyethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, ethoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, propoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-butoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-pentoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate Acrylate, phenoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, polypropylene glycol (meth) acrylate, methoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, propoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, n-butoxy polypropylene glycol (meth) acrylate , n-pentoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, phenoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, polytetramethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolytetramethylene glycol (meth)acrylate, phenoxytetraethylene glycol (meth)acrylate, hexaethylene Monomers having polyether chains such as glycol (meth)acrylate and methoxyhexaethylene glycol (meth)acrylate;
(Meth)acrylate monomers having a polymer structure in side chains such as ethylenically unsaturated compounds having a polyester chain such as lactone-modified (meth)acrylate; styrene, α-methylstyrene, 2-methylstyrene, chlorostyrene, allyl Aromatic vinyl monomers such as benzene and ethynylbenzene; Nitrile group-containing ethylenically unsaturated monomers such as (meth)acrylonitrile; Vinyl acetate, vinyl butyrate, vinyl propionate, vinyl hexanoate, vinyl caprylate, vinyl laurate, palmitic acid fatty acid vinyl-based compounds such as vinyl and vinyl stearate; vinyl ether-based ethylenically unsaturated monomers such as butyl vinyl ether and ethyl vinyl ether;
Allyl monomers such as allyl acetate and allyl cyanide; Vinyl monomers such as vinyl cyanide, vinylcyclohexane and vinyl methyl ketone; Ethynyl monomers such as acetylene and ethynyltoluene; Monomers having an ethylenically unsaturated bond other than (meth)acrylates, such as perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated compounds such as perfluoroalkyl groups such as fluorodecylethylene and alkylenes, and the like can be mentioned.
＜ビニル系ポリマー（Ａ）の共重合組成＞
ポリマー（ａ）の共重合組成について説明する。
３級アミノ基含有モノマー（ａ）は、全モノマーの合計量中、２０～９９．９質量％含むことが好ましく、より好ましくは６５～８５質量％である。上記範囲とすることで、特に優れた細胞凝集塊形成性を発揮する。
炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）は、全モノマーの合計量中、０．１～８０質量％含むことが好ましく、より好ましくは１２～４０質量％である。
その他モノマー（ｄ）は、全モノマーの合計量中、０～７９．９質量％含むことが好ましく、より好ましくは０～５０質量％であり、特に好ましくは０～２５質量％である。
<Copolymer composition of vinyl polymer (A)>
The copolymer composition of the polymer (a) will be explained.
The tertiary amino group-containing monomer (a) is preferably contained in an amount of 20 to 99.9% by mass, more preferably 65 to 85% by mass, based on the total amount of all monomers. By setting it as the said range, the cell aggregate formability which was especially excellent is exhibited.
Monomer (c) having an alkyl group of 4 to 18 carbon atoms is preferably contained in an amount of 0.1 to 80% by mass, more preferably 12 to 40% by mass, based on the total amount of all monomers.
Other monomer (d) is preferably contained in an amount of 0 to 79.9% by mass, more preferably 0 to 50% by mass, particularly preferably 0 to 25% by mass, based on the total amount of all monomers.
＜オキシド化＞
モノマー（ａ）に由来する３級アミン基は、各種酸化剤を使用することでアミンオキシド基化することができる。これによりビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を導入することができる。オキシド化は、ビニル系ポリマー（Ａ）の重合前、重合後のいずれであってもよく、重合前のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を含む溶液に、重合後のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合したビニル系ポリマーを含む溶液に、オキシド化剤を加えて２０℃～１００℃の範囲で０．１～１００時間、好ましくは１～５０時間反応させることによって、３級アミノ基をオキシド化することができる。
<Oxidation>
A tertiary amine group derived from the monomer (a) can be converted into an amine oxide group by using various oxidizing agents. Thereby, an amine oxide group can be introduced into the vinyl-based polymer (A). Oxidation may be performed before or after polymerization of the vinyl polymer (A). is an oxidizing agent added to a solution containing a vinyl polymer obtained by polymerizing a monomer essentially containing a tertiary amino group-containing monomer (a), and the mixture is heated at 20°C to 100°C for 0.1 to 100 hours, preferably Tertiary amino groups can be oxidized by reacting for 1 to 50 hours.
オキシド化剤としては、過酸化物又はオゾン等の酸化剤が用いられる。過酸化物としては、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等が挙げられ、過酸化水素が好ましく、通常は水溶液の形で用いられる。程度の違いはあるとはいうものの、過酸化物にはラジカル発生剤としての機能もあるので、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須の原料とするビニル系ポリマーの場合には、重合後にオキシド化することが好ましい。 As the oxidizing agent, an oxidizing agent such as peroxide or ozone is used. Examples of peroxides include hydrogen peroxide, ammonium persulfate, sodium persulfate, peracetic acid, metachloroperbenzoic acid, benzoyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, etc. Hydrogen peroxide is preferred, and is usually an aqueous solution. used in the form Although there is a difference in degree, peroxides also function as radical generators. Therefore, in the case of a vinyl polymer containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A) as an essential raw material, Oxidation after polymerization is preferred.
一般的にはオキシド化剤の使用量は、オキシド化可能な官能基、即ち、３級アミノ基に対して、０．２～３倍モル当量の割合で使用し、更に０．５～２倍モル当量使用するのがより好ましい。得られたポリマー溶液は、残存した過酸化物を公知の方法で処理した後、使用することもできる。具体的には還元剤添加処理、イオン交換処理、活性炭処理、金属触媒による処理等があげられる。得られたポリマー溶液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて再沈殿、溶媒留去等の公知の方法でアミンオキシド基含有ポリマーを単離して使用することも出来る。また、単離したアミンオキシド基含有ポリマーは、必要ならば再沈殿や、溶剤洗浄、膜分離、吸着処理等によってさらに精製できる。 Generally, the amount of the oxidizing agent used is 0.2 to 3 times the molar equivalent of the oxidizable functional group, that is, the tertiary amino group, and further 0.5 to 2 times the molar equivalent. It is more preferred to use molar equivalents. The obtained polymer solution can also be used after treating the residual peroxide by a known method. Specific examples include reducing agent addition treatment, ion exchange treatment, activated carbon treatment, treatment with a metal catalyst, and the like. The obtained polymer solution can be used as it is, but if necessary, the amine oxide group-containing polymer can be isolated and used by known methods such as reprecipitation and solvent distillation. In addition, the isolated amine oxide group-containing polymer can be further purified by reprecipitation, solvent washing, membrane separation, adsorption treatment, or the like, if necessary.
本発明におけるビニル系ポリマーとしては、前述の如く、３級アミノ基含有モノマー（ａ）をオキシド化した後に他のモノマーと重合したもの、及び、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合し、ポリマーを得た後にオキシド化したものの他、モノマーとして、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物や２－イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基含有不飽和化合物と、ヒドロキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンオキシド等のアミンオキシド基含有化合物との反応生成物を用いて共重合したものも用いることができる。 As the vinyl-based polymer in the present invention, as described above, the one obtained by oxidizing the tertiary amino group-containing monomer (a) and then polymerizing it with another monomer, and the tertiary amino group-containing monomer (a) are essential. In addition to those obtained by polymerizing a monomer and oxidizing it after obtaining a polymer, as a monomer, for example, an epoxy group-containing unsaturated compound such as glycidyl (meth) acrylate or an isocyanate group-containing unsaturated compound such as 2-isocyanatoethyl (meth) acrylate A copolymer obtained by using a reaction product of a compound and an amine oxide group-containing compound such as hydroxyethyl-N,N-dimethylamine oxide can also be used.
＜アミンオキシド基含有量＞
アミンオキシド基は、タンパク質の周辺環境を適切に制御し、機能の失活を抑える効果を発揮する。ポリマー（Ａ）中のアミンオキシド基含有量は、好ましくは１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは２～８ｍｍｏｌ／ｇである。アミンオキシド基の含有量が上記範囲にあることによって、好適な水溶性を発現すると共に、極性が制御され、周囲の環境を適切に制御することができる。
<Amine oxide group content>
An amine oxide group exerts the effect of appropriately controlling the surrounding environment of proteins and suppressing the deactivation of their functions. The amine oxide group content in the polymer (A) is preferably 1-10 mmol/g, more preferably 2-8 mmol/g. When the content of the amine oxide group is within the above range, suitable water-solubility is exhibited, the polarity is controlled, and the surrounding environment can be appropriately controlled.
ビニル系ポリマー（Ａ）中のアミンオキシド基含有量は、アミンオキシド基を有するモノマーを重合してポリマー（Ａ）を得る場合には、重合に用いたアミンオキシド基を有するモノマーの量から求めることができる。一方、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合した後に得られたポリマーをオキシド化する場合には、前述の数式１によって算出できる。 The amine oxide group content in the vinyl polymer (A) can be obtained from the amount of the monomer having an amine oxide group used in the polymerization when the polymer (A) is obtained by polymerizing a monomer having an amine oxide group. can be done. On the other hand, in the case of oxidizing the polymer obtained after polymerizing the monomer essentially containing the tertiary amino group-containing monomer (a), it can be calculated by Equation 1 above.
＜質量平均分子量（Ｍｗ）＞
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、好ましくは２，０００～１０，０００，０００であり、より好ましくは５，０００以上であり、さらに好ましくは１０，０００以上であり、特に好ましくは２０，０００以上である。より好ましくは、５００，０００以下であり、特に好ましくは、２００，０００以下である。分子量が上記範囲であることにより、増粘作用を低下させゲル化等の不具合を防ぐことができる。またピペット操作などの取り扱いが容易になる。
<Mass average molecular weight (Mw)>
The weight average molecular weight of the vinyl polymer (A) is preferably 2,000 to 10,000,000, more preferably 5,000 or more, still more preferably 10,000 or more, particularly preferably 20 , 000 or more. It is more preferably 500,000 or less, and particularly preferably 200,000 or less. When the molecular weight is within the above range, it is possible to reduce the thickening action and prevent problems such as gelation. In addition, handling such as pipetting is facilitated.
（質量平均分子量（Ｍｗ）の測定方法）
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準プルラン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては下記条件１を用いた。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照した。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定した。また、ビニル系ポリマー（Ａ）の分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量とすることが出来る。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件２によることを基本とした。
(Method for measuring mass average molecular weight (Mw))
As the mass average molecular weight of the vinyl polymer (A), a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard pullulan was adopted. The following condition 1 was used as a measuring device and measuring conditions. For other matters, JISK7252-1 to 4:2008 were referred to. For poorly soluble polymer compounds, measurements were made at a soluble concentration under the following conditions. Moreover, when it is difficult to measure the molecular weight of the vinyl-based polymer (A), the weight-average molecular weight of the amine oxide precursor polymer can be used as the weight-average molecular weight of the vinyl-based polymer (A). The mass-average molecular weight of the amine oxide precursor polymer was measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene, and the measurement apparatus and measurement conditions were based on Condition 2 below.
（条件１）
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ－Ｇ、
ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０６Ｍ ＨＱを３本及び、
ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０２．５ ＨＱを連結したもの。
キャリア：１／１５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０ リン酸緩衝液
（りん酸緩衝剤粉末１／１５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０（富士フイルム和光純薬(株)製）をイオン交換水１Ｌに溶解させたもの）
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．５質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
(Condition 1)
Column: OHpak SB-G,
Three OHpak SB-806M HQ and,
Concatenated with OHpak SB-802.5 HQ.
Carrier: 1/15 mol/L pH 7.0 phosphate buffer (Phosphate buffer powder 1/15 mol/L pH 7.0 (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 1 L of ion-exchanged water. thing)
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.5% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
(Condition 2)
Column: TOSOH TSKgel Super AW4000,
A concatenation of TOSOHTSKgelSuperAW3000 and TOSOHTSKgelSuperAW2500.
Carrier: N,N-dimethylformamide (1 L), triethylamine (3.04 g), LiBr (0.87 g) mixed liquid Measurement temperature: 40 ° C.
Carrier flow rate: 0.6 mL/min
＜細胞凝集塊の製造方法＞
本実施形態に係る細胞凝集塊の製造方法では、前述のビニル系ポリマー（Ａ）を含む細胞培養培地添加剤を細胞培養培地に添加する。ビニル系ポリマー（Ａ）を培地に添加することにより、細胞が培養容器に接着しなくなる。そのため、本実施形態に係る製造方法では、静置培養にて細胞凝集塊を容易に形成することができる。
<Method for producing cell aggregates>
In the method for producing a cell aggregate according to this embodiment, the cell culture medium additive containing the vinyl polymer (A) is added to the cell culture medium. Addition of the vinyl polymer (A) to the medium prevents cells from adhering to the culture vessel. Therefore, in the production method according to the present embodiment, cell aggregates can be easily formed by stationary culture.
本発明においてビニル系ポリマー（Ａ）の添加量は、細胞培養培地に対して０．０１質量％以上５質量％以下の範囲で使用することが好ましく、ビニル系ポリマー（Ａ）の添加量が培地に対して０．０５質量％より多い場合に細胞凝集塊を特に良好に形成することができる。また、培地への溶解性の観点から、ビニル系ポリマー（Ａ）の添加量は培地に対して１質量％以下であることが好ましい。 In the present invention, the amount of the vinyl polymer (A) added is preferably in the range of 0.01% by mass or more and 5% by mass or less with respect to the cell culture medium. Cell aggregates can be formed particularly well when the amount is more than 0.05% by weight. From the viewpoint of solubility in the medium, the amount of the vinyl polymer (A) added is preferably 1% by mass or less relative to the medium.
本実施形態に係る細胞凝集塊の製造方法を適用可能な動物細胞は特に限定されない。このような動物細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来細胞が挙げられる。 Animal cells to which the method for producing a cell aggregate according to this embodiment can be applied are not particularly limited. Such animal cells include, for example, cells derived from mammals such as humans, mice, and rats.
本実施形態に利用可能な細胞培養培地は特に限定されない。このような培地としては、例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等）や、これらの組み合わせが挙げられる。 A cell culture medium that can be used in this embodiment is not particularly limited. Such media include, for example, various commercially available media (αMEM, MEM, DMEM, IMDEM, RPMI1640, DMEM/F12, etc.) and combinations thereof.
細胞培養培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２－メルカプトエタノール等）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清等）、血清代替物などが添加される。 If necessary, the cell culture medium may contain various growth factors (epidermal growth factor, insulin-like growth factor, nerve growth factor, hepatocyte growth factor, vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, transferrin, steroid hormone , 2-mercaptoethanol, etc.), various animal sera (fetal bovine serum (FBS), bovine serum, etc.), serum substitutes, and the like are added.
本実施形態に適用可能な培養容器としては、一般的な培養容器を採用することができる。このような培養容器としては、例えば、マルチウェルプレート、シャーレ、袋状容器や培養フラスコが挙げられる。これらの培養容器の材質としては、例えば、ポリスチレンが挙げられる。 As a culture vessel applicable to this embodiment, a general culture vessel can be adopted. Such culture vessels include, for example, multiwell plates, petri dishes, bag-like vessels, and culture flasks. Materials for these culture vessels include, for example, polystyrene.
本実施形態における培養条件は、通常の動物細胞の培養条件でよく、例えば、５％ＣＯ2雰囲気で、温度が３７℃である条件とすることができる。 The culture conditions in this embodiment may be normal animal cell culture conditions, for example, a 5% CO 2 atmosphere at a temperature of 37°C.
＜抗体の製造方法＞
本実施形態に係る抗体の製造方法では、前述のビニル系ポリマー（Ａ）を含む抗体産生細胞培養培地添加剤を含む細胞培養培地を用いて抗体産生細胞を培養することを含む。
ビニル系ポリマー（Ａ）の添加量は、細胞培養培地に対して０．０１質量％以上５質量％以下の範囲で使用することが好ましく、ビニル系ポリマー（Ａ）の添加量が培地に対して０．０５質量％より多い場合に、抗体産生細胞凝集物の発生を特に抑制することができる。また、培地への溶解性の観点から、ビニル系ポリマー（Ａ）の添加量は培地に対して１質量％以下であることが好ましい。
<Method for producing antibody>
The method for producing an antibody according to this embodiment includes culturing antibody-producing cells using a cell culture medium containing an antibody-producing cell culture medium additive containing the vinyl polymer (A) described above.
The amount of the vinyl polymer (A) added is preferably in the range of 0.01% by mass or more and 5% by mass or less with respect to the cell culture medium. When it is more than 0.05% by mass, the generation of antibody-producing cell aggregates can be particularly suppressed. From the viewpoint of solubility in the medium, the amount of the vinyl polymer (A) added is preferably 1% by mass or less relative to the medium.
本発明の培養方法で培養される動物細胞は特に限定されず、細胞については抗体生産に使用可能な細胞であれば特に限定されず、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、rodent myeloma細胞（例えば、ＳＰ２/Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞等のマウス骨髄腫細胞等）、ハイブリドーマ、昆虫細胞及びそれらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が例として挙げられるが、例えばＣＨＯ細胞、ＳＰ２/Ｏ細胞又はＮＳＯ細胞等を細胞融合することによって得られるハイブリドーマ等を抗体産生細胞として採用することができる。 The animal cells cultured by the culture method of the present invention are not particularly limited, and the cells are not particularly limited as long as they can be used for antibody production. CHO cells, BHK cells, HepG2 cells, rodent myeloma cells (e.g., SP2/O cells, mouse myeloma cells such as NSO cells, etc.), hybridomas, insect cells, and transformed cells obtained by introducing a foreign gene into these cells, such as CHO cells, SP2/O cells or NSO cells. Hybridomas and the like obtained by cell fusion can be employed as antibody-producing cells.
本発明の培養方法で産生される抗体は特に限定されず、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体又はヒトモノクローナル抗体である。また、免疫グロブリンのクラスは特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１ 、ＩｇＧ２等） である。 Antibodies produced by the culture method of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include mouse monoclonal antibodies, humanized monoclonal antibodies, and human monoclonal antibodies. The class of immunoglobulin is not particularly limited, but is, for example, IgG (eg, IgG1, IgG2, etc.).
本発明の培養方法又は製造方法において、培養を行う際、通常培養に用いられる容器又は装置を用いることができる。例えば、マルチウェルプレート、シャーレ、培養フラスコ、スピナーフラスコ、ジャーファーメンター、ファーメンター、ローラーボトル、ホローファイバー、マイクロキャリアー等が挙げられる。 In the culturing method or production method of the present invention, a container or apparatus that is commonly used for culturing can be used for culturing. Examples include multiwell plates, petri dishes, culture flasks, spinner flasks, jar fermenters, fermenters, roller bottles, hollow fibers, microcarriers and the like.
本実施形態における培養条件は、通常の動物細胞の培養条件でよく、例えば、５％ＣＯ2雰囲気で、温度が３７℃である条件とすることができる。 The culture conditions in this embodiment may be normal animal cell culture conditions, for example, a 5% CO 2 atmosphere at a temperature of 37°C.
培養液から細胞を採取するには、浮遊細胞の場合は、例えば培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集める。接着細胞の場合は、例えば０．２５％トリプシン－０．０２％EDTA液を添加して細胞を浮遊させた後遠心分離やろ過により集める。 To collect cells from the culture medium, in the case of floating cells, for example, the culture medium is directly subjected to a centrifugal separator or a filter and collected. In the case of adherent cells, for example, a 0.25% trypsin-0.02% EDTA solution is added to suspend the cells, and then collected by centrifugation or filtration.
細胞培養によって生産される抗体は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過又は遠心分離により上澄み液を得、これから採取される。また、細胞内に蓄積される物質の場合には、ろ過又は遠心分離により得た細胞をホモジナイズ、超音波処理、化学薬品処理等を施し、生産物を抽出した上澄み液を得る。 Antibodies produced by cell culture are harvested from the supernatant obtained by filtration or centrifugation when the material accumulates in the culture medium. In the case of a substance that accumulates intracellularly, the cells obtained by filtration or centrifugation are homogenized, sonicated, treated with chemicals, or the like, and the product is extracted to obtain a supernatant.
上記上澄み液から抗体を分離、精製するには、公知の方法を適宜組み合わせて行う。例えば、硫安沈殿、透析、限外ろ過、電気泳動、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等が適用される。 To separate and purify the antibody from the above supernatant, known methods are appropriately combined. For example, ammonium sulfate precipitation, dialysis, ultrafiltration, electrophoresis, gel filtration, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography and the like are applied.
＜タンパク質安定化剤＞
本発明のタンパク質安定化剤は、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるポリマー（Ａ）を含むことを特徴とする。
本発明のビニル系ポリマー（Ａ）は、アミンオキシド基を有していれば、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であればよく、従来公知のポリマーを用いることができ、２種以上を併用してもよく、アミンオキシド基を有することで、優れたタンパク質安定化効果を発揮する。
<Protein stabilizer>
The protein stabilizer of the present invention is characterized by containing a polymer (A) having an amine oxide group and a weight average molecular weight of 2,000 or more.
The vinyl-based polymer (A) of the present invention only needs to have an amine oxide group and have a weight average molecular weight of 2,000 or more, and conventionally known polymers can be used. It may be used in combination, and having an amine oxide group exhibits an excellent protein stabilizing effect.
本発明において、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマーは、以下のような２つの方法で得ることができる。
即ち、アミンオキシド基を有するモノマーと他のモノマーとを重合して、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマーを得ることができる。
あるいは、アミンオキシド基の前駆官能基とでもいうべき３級アミノ基を有するビニル系ポリマーを得た後、前記３級アミノ基に酸化剤を反応させ、ビニル系ポリマーにアミンオキシド基を導入することができ、副反応を生じ難いという点で後者の方法が好ましい。なお、３級アミノ基に酸化剤を反応させることを、以下「オキシド化」ともいう。
In the present invention, a vinyl polymer having amine oxide groups can be obtained by the following two methods.
That is, a vinyl polymer having an amine oxide group can be obtained by polymerizing a monomer having an amine oxide group and another monomer.
Alternatively, after obtaining a vinyl-based polymer having a tertiary amino group, which can be called a precursor functional group for an amine oxide group, the tertiary amino group is reacted with an oxidizing agent to introduce an amine oxide group into the vinyl-based polymer. The latter method is preferred in that it is possible to obtain a reaction and side reactions are less likely to occur. The reaction of the tertiary amino group with an oxidizing agent is hereinafter also referred to as "oxidation".
ビニル系ポリマーとしては、具体的には、前述の一般式１～３で表される少なくともいずれかの構造を含むものであることが好ましく、中でも一般式１で表される構造を含むものが特に好ましい。アミンオキシド基が下記式であらわされるものであることによって、好適な水溶性を発現すると共に、タンパク質との過度な相互作用を抑え、周囲の環境を適切に制御することができる。
ビニル系ポリマーは、共重合体であることが好ましく、ブロック共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよい。
Specifically, the vinyl-based polymer preferably contains at least one of the structures represented by the general formulas 1 to 3 described above, and among them, those containing the structure represented by the general formula 1 are particularly preferable. When the amine oxide group is represented by the following formula, suitable water solubility can be exhibited, excessive interaction with proteins can be suppressed, and the surrounding environment can be appropriately controlled.
The vinyl-based polymer is preferably a copolymer, and may be a block copolymer, a random copolymer, or an alternating copolymer.
このような構造を有するビニルポリマーは、前述の通り、２つの方法で得ることができる。より好ましくは、３級アミノ基含有モノマー（ａ）と、その他のモノマーとを重合した後にオキシド化する方法である。その他モノマーは、炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）を含むことが好ましい。 A vinyl polymer having such a structure can be obtained in two ways, as described above. More preferably, the tertiary amino group-containing monomer (a) and other monomers are polymerized and then oxidized. Other monomers preferably include a monomer (c) having an alkyl group of 4 to 18 carbon atoms.
＜３級アミノ基含有モノマー（ａ）＞
オキシド化前の前駆体としての３級アミノ基含有モノマー（ａ）のうち、一般式１の構造を形成するためものとしては、
例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピオン酸ビニル、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、ｐ－ジメチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジメチルアミノエチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノメチルスチレン、ｐ－ジエチルアミノエチルスチレン、Ｎ，Ｎ－ジメチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルビニルアミン、Ｎ，Ｎ－ジフェニルビニルアミン、あるいは、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸等の不飽和基含有酸無水物と、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物とＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロパンジアミン等との反応生成物等が挙げられる。
好ましくは、（メタ）アクリレートモノマーであり、より好ましくはＮ，Ｎ－ジアルキルアミノエチル（メタ）アクリレート又はＮ，Ｎ－ジアルキルアミノプロピル（メタ）アクリレートである。
なお、本発明において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」及び「メタクリル」の両者を言い表すものとする。
<Tertiary amino group-containing monomer (a)>
Among the tertiary amino group-containing monomers (a) as precursors before oxidation, for forming the structure of general formula 1,
For example, N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylate, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylate, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminoethyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-diethylaminopropyl (meth)acrylamide, N,N-dimethylamino vinyl propionate, vinyl N,N-diethylaminopropionate, N,N-dimethylallylamine, p-dimethylaminomethylstyrene, p-dimethylaminoethylstyrene, p-diethylaminomethylstyrene, p-diethylaminoethylstyrene, N,N- Dimethylvinylamine, N,N-diethylvinylamine, N,N-diphenylvinylamine, or unsaturated group-containing acid anhydrides such as maleic anhydride, itaconic anhydride and citraconic anhydride, and N,N-dimethyl- Examples thereof include reaction products with 1,3-propanediamine and the like, reaction products of epoxy group-containing unsaturated compounds such as glycidyl (meth)acrylate and N,N-dimethyl-1,3-propanediamine and the like.
Preferred are (meth)acrylate monomers, more preferred are N,N-dialkylaminoethyl (meth)acrylates or N,N-dialkylaminopropyl (meth)acrylates.
In the present invention, "(meth)acryl" refers to both "acryl" and "methacryl".
一般式３の構造を形成するためのものとしては、例えば、
２－ビニルピリジン、３－ビニルピリジン、４－ビニルピリジン、２－メチル－３－ビニルピリジン、２－メチル－４－ビニルピリジン、３－メチル－４－ビニルピリジン、２－メチル－５－ビニルピリジン、３－メチル－５－ビニルピリジン、４－メチル－５－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－４－ビニルピリジン、２－（ｔ－ブチル）－５－ビニルピリジン等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 3, for example,
2-vinylpyridine, 3-vinylpyridine, 4-vinylpyridine, 2-methyl-3-vinylpyridine, 2-methyl-4-vinylpyridine, 3-methyl-4-vinylpyridine, 2-methyl-5-vinylpyridine , 3-methyl-5-vinylpyridine, 4-methyl-5-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-4-vinylpyridine, 2-(t-butyl)-5-vinylpyridine and the like.
一般式２の構造を形成するためのものとしては、例えば、
１－ビニルイミダゾール、２－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－メチル－１－ビニルイミダゾール、５－メチル－１－ビニルイミダゾール、４－（ｔ－ブチル）－１－ビニルイミダゾール等が挙げられる。
For forming the structure of general formula 2, for example,
1-vinylimidazole, 2-methyl-1-vinylimidazole, 4-methyl-1-vinylimidazole, 5-methyl-1-vinylimidazole, 4-(t-butyl)-1-vinylimidazole and the like.
＜その他モノマー＞
ビニル系ポリマーを得る際に、前記モノマー（ａ）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有する、その他モノマーを用いることができる。その他モノマーに基づく構造の導入により、極性やＴｇが適切に制御され、優れた塗工性、塗工膜の耐久性を有することができるほか、溶媒溶解性等を制御することができる。
その他モノマーとしては、炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）を用いることが、タンパク質安定化効果の観点から好ましい。
<Other monomers>
When obtaining a vinyl-based polymer, other monomers having one ethylenically unsaturated group in one molecule can be used in addition to the monomer (a). By introducing a structure based on other monomers, polarity and Tg can be appropriately controlled, excellent coatability and durability of the coating film can be obtained, and solvent solubility and the like can be controlled.
As other monomers, it is preferable to use a monomer (c) having an alkyl group of 4 to 18 carbon atoms from the viewpoint of protein stabilization effect.
［炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）］
炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）は、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と炭素数４～１８のアルキル基とを有するモノマーが好ましい。ビニル系ポリマー（Ａ）は、炭素数４～１８のアルキル基を有することで、極性が制御され、周囲の環境を適切に制御することができる。
[Monomer (c) having an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms]
The monomer (c) having an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms is preferably a monomer having one ethylenically unsaturated group and an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms in one molecule. Since the vinyl-based polymer (A) has an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms, the polarity is controlled and the surrounding environment can be appropriately controlled.
モノマー（ｃ）としては、特に限定はされないが、例えば、
ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；
１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和モノマーなどが挙げられる。
Although the monomer (c) is not particularly limited, for example,
Butyl (meth)acrylate, pentyl (meth)acrylate, heptyl (meth)acrylate, 2-ethylhexyl (meth)acrylate, octyl (meth)acrylate, nonyl (meth)acrylate, decyl (meth)acrylate, dodecyl (meth)acrylate, Alkyl (meth)acrylates such as stearyl (meth)acrylate, cetyl (meth)acrylate, cyclohexyl (meth)acrylate;
Examples include α-olefinic ethylenically unsaturated monomers such as 1-butene, 1-pentene, 1-hexene, 1-octene, 1-nonene and 1-decene.
［（ａ）（ｃ）以外のモノマー（ｄ）］
（ａ）（ｃ）以外のモノマー（ｄ）は、モノマー（ａ）や（ｃ）と共重合可能であり、モノマー（ａ）（ｃ）以外の、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有するモノマーであることが好ましい。
[Monomer (d) other than (a) and (c)]
The monomer (d) other than (a) and (c) is copolymerizable with the monomers (a) and (c), and has one ethylenically unsaturated group in one molecule other than the monomers (a) and (c). is preferably a monomer having
モノマー（ｄ）としては、特に限定はされないが、
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレートなどアルキル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、プロポキシエチル（メタ）アクリレート、ブトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシプロピル（メタ）アクリレート等のアクリルエステル（メタ）アクリレート；
フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族エステル（メタ）アクリレート；
（メタ）アクリル酸アリル、（メタ）アクリル酸１－メチルアリル、（メタ）アクリル酸２－メチルアリル、（メタ）アクリル酸１－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－ブテニル、（メタ）アクリル酸３－ブテニル、（メタ）アクリル酸１，３－メチル－３－ブテニル、（メタ）アクリル酸２－クロルアリル、（メタ）アクリル酸３－クロルアリル、（メタ）アクリル酸ｏ－アリルフェニル、（メタ）アクリル酸２－（アリルオキシ）エチル、（メタ）アクリル酸アリルラクチル、（メタ）アクリル酸シトロネリル、（メタ）アクリル酸ゲラニル、（メタ）アクリル酸ロジニル、（メタ）アクリル酸シンナミル、ジアリルマレエート、ジアリルイタコン酸、（メタ）アクリル酸ビニル、クロトン酸ビニル、オレイン酸ビニル，リノレン酸ビニル、（メタ）アクリル酸２－（２’－ビニロキシエトキシ）エチルなどのエチレン性不飽和基含有（メタ）アクリル酸エステル類；
パーフルオロメチルメチル（メタ）アクリレート、パーフルオロエチルメチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロブチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロイソノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロノニルエチル（メタ）アクリレート、２－パーフルオロデシルエチル（メタ）アクリレート、パーフルオロプロピルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルアミル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルウンデシル（メタ）アクリレートなどの炭素数１～２０のパーフルオロアルキル基を有するパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和モノマーなどの（メタ）アクリレート系モノマー；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリロイロキシエチル－２－ヒドロキシエチルフタル酸、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシビニルベンゼン、１－エチニル－１－シクロヘキサノール、アリルアルコールなどの水酸基を有するモノマー；
マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、シトラコン酸、又は、これらのアルキル若しくはアルケニルモノエステル、フタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、イソフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、テレフタル酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、コハク酸β－（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、けい皮酸などのカルボン酸基、若しくはその無水物を有するモノマー；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有するモノマー；
（２－ヒドロキシエチル）メタクリレートアシッドホスフェートなどのリン酸基を有するモノマー；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１～３級アミド基を有するモノマー；
（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル－３－（１－（メタ）アクリルアミド－１，１－ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ－ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマー；
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系モノマー；スチレン、α－メチルスチレン、２－メチルスチレン、クロロスチレン、アリルベンゼン、エチニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー；（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和モノマー；酢酸ビニル、酪酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ヘキサン酸ビニル、カプリル酸ビニル、ラウリル酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；ブチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのビニルエーテル系エチレン性不飽和モノマー； 酢酸アリル、シアン化アリルなどのアリルモノマー；シアン化ビニル、ビニルシクロヘキサン、ビニルメチルケトンなどのビニルモノマー；アセチレン、エチニルトルエンなどのエチニルモノマーパーフルオロブチルエチレン、パーフルオロヘキシルエチレン、パーフルオロオクチルエチレン、パーフルオロデシルエチレンなどのパーフルオロアルキル、アルキレン類などのパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和化合物等の、（メタ）アクリレートではないエチレン性不飽和結合を有するモノマーなどが挙げられる。
Although the monomer (d) is not particularly limited,
Methyl (meth)acrylate, Ethyl (meth)acrylate, Propyl (meth)acrylate, Alkyl (meth)acrylate, Isobornyl (meth)acrylate, Methoxyethyl (meth)acrylate, Ethoxyethyl (meth)acrylate, Propoxyethyl (meth)acrylate , butoxyethyl (meth)acrylate, acrylic ester (meth)acrylate such as ethoxypropyl (meth)acrylate;
aromatic ester (meth)acrylates such as phenyl (meth)acrylate, benzyl (meth)acrylate, phenoxyethyl (meth)acrylate;
Allyl (meth)acrylate, 1-methylallyl (meth)acrylate, 2-methylallyl (meth)acrylate, 1-butenyl (meth)acrylate, 2-butenyl (meth)acrylate, 3-(meth)acrylate butenyl, 1,3-methyl-3-butenyl (meth)acrylate, 2-chloroallyl (meth)acrylate, 3-chloroallyl (meth)acrylate, o-allylphenyl (meth)acrylate, (meth)acrylic acid 2-(allyloxy)ethyl, allyllactyl (meth)acrylate, citronellyl (meth)acrylate, geranyl (meth)acrylate, rhodinyl (meth)acrylate, cinnamyl (meth)acrylate, diallyl maleate, diallyl itaconic acid, Ethylenically unsaturated group-containing (meth)acrylates such as vinyl (meth)acrylate, vinyl crotonate, vinyl oleate, vinyl linolenate, and 2-(2'-vinyloxyethoxy)ethyl (meth)acrylate ;
Perfluoromethylmethyl (meth)acrylate, perfluoroethylmethyl (meth)acrylate, 2-perfluorobutylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorohexylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorooctylethyl (meth)acrylate , 2-perfluoroisononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorononylethyl (meth)acrylate, 2-perfluorodecylethyl (meth)acrylate, perfluoropropylpropyl (meth)acrylate, perfluorooctylpropyl (meth)acrylate ) acrylate, perfluorooctyl amyl (meth) acrylate, perfluorooctyl undecyl (meth) acrylate, perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated monomers having a perfluoroalkyl group having 1 to 20 carbon atoms (meth) an acrylate-based monomer;
2-hydroxyethyl (meth)acrylate, 2-hydroxypropyl (meth)acrylate, 4-hydroxybutyl (meth)acrylate, 2-(meth)acryloyloxyethyl-2-hydroxyethyl phthalate, glycerol mono(meth)acrylate , 4-hydroxyvinylbenzene, 1-ethynyl-1-cyclohexanol, monomers having a hydroxyl group such as allyl alcohol;
Maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citraconic acid, or their alkyl or alkenyl monoesters, β-(meth)acryloxyethyl phthalate monoester, β-(meth)acryloxyethyl isophthalic acid, terephthalic acid monomers having a carboxylic acid group such as β-(meth)acryloxyethyl monoester, β-(meth)acryloxyethyl succinate, acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, cinnamic acid, or an anhydride thereof;
monomers having a sulfonic acid group such as vinylsulfonic acid and styrenesulfonic acid;
Monomers with a phosphate group such as (2-hydroxyethyl) methacrylate acid phosphate;
(Meth)acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidone, N-methoxymethyl-(meth)acrylamide, N-ethoxymethyl-(meth)acrylamide, N-propoxymethyl-(meth)acrylamide, N-butoxymethyl-(meth) ) acrylamide, N-pentoxymethyl-(meth)acrylamide, N,N-di(methoxymethyl)acrylamide, N-ethoxymethyl-N-methoxymethylmethacrylamide, N,N-di(ethoxymethyl)acrylamide, N- Ethoxymethyl-N-propoxymethylmethacrylamide, N,N-di(propoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl-N-(propoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(butoxymethyl)acrylamide, N-butoxymethyl -N-(methoxymethyl)methacrylamide, N,N-di(pentoxymethyl)acrylamide, N-methoxymethyl-N-(pentoxymethyl)methacrylamide, N,N-dimethylacrylamide, N,N-diethylacrylamide , a monomer having a primary to tertiary amide group such as diacetone (meth)acrylamide;
(Meth)acrylic acid dimethylaminoethylmethyl chloride salt, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylpropyl)ammonium chloride, trimethyl-3-(1-(meth)acrylamidopropyl)ammonium chloride, and monomers having a quaternary amino group such as trimethyl-3-(1-(meth)acrylamido-1,1-dimethylethyl)ammonium chloride;
Polyethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, ethoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, propoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-butoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate, n-pentoxypolyethyleneglycol (meth)acrylate Acrylate, phenoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, polypropylene glycol (meth) acrylate, methoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, propoxy polypropylene glycol (meth) acrylate, n-butoxy polypropylene glycol (meth) acrylate , n-pentoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, phenoxypolypropylene glycol (meth)acrylate, polytetramethylene glycol (meth)acrylate, methoxypolytetramethylene glycol (meth)acrylate, phenoxytetraethylene glycol (meth)acrylate, hexaethylene Monomers having polyether chains such as glycol (meth)acrylate and methoxyhexaethylene glycol (meth)acrylate;
(Meth)acrylate monomers having a polymer structure in side chains such as ethylenically unsaturated compounds having a polyester chain such as lactone-modified (meth)acrylate; styrene, α-methylstyrene, 2-methylstyrene, chlorostyrene, allyl Aromatic vinyl monomers such as benzene and ethynylbenzene; Nitrile group-containing ethylenically unsaturated monomers such as (meth)acrylonitrile; Vinyl acetate, vinyl butyrate, vinyl propionate, vinyl hexanoate, vinyl caprylate, vinyl laurate, palmitic acid fatty acid vinyl compounds such as vinyl and vinyl stearate; vinyl ether ethylenically unsaturated monomers such as butyl vinyl ether and ethyl vinyl ether; allyl monomers such as allyl acetate and allyl cyanide; Vinyl monomers; Ethynyl monomers such as acetylene and ethynyltoluene Perfluoroalkyl groups such as perfluorobutylethylene, perfluorohexylethylene, perfluorooctylethylene, perfluorodecylethylene, and perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated compounds such as alkylenes Examples include monomers having ethylenically unsaturated bonds that are not (meth)acrylates, such as
＜ビニル系ポリマー（Ａ）の共重合組成＞
ポリマー（ａ）の共重合組成について説明する。
３級アミノ基含有モノマー（ａ）は、全モノマーの合計量中、２０～９９．９質量％含むことが好ましく、より好ましくは６５～８５質量％である。上記範囲とすることで、特に優れたタンパク質安定化効果を発揮する。 炭素数４～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）は、全モノマーの合計量中、０．１～８０質量％含むことが好ましく、より好ましくは１２～４０質量％である。
その他モノマー（ｄ）は、全モノマーの合計量中、０～７９．９質量％含むことが好ましく、より好ましくは０～５０質量％であり、特に好ましくは０～２５質量％である。
<Copolymer composition of vinyl polymer (A)>
The copolymer composition of the polymer (a) will be explained.
The tertiary amino group-containing monomer (a) is preferably contained in an amount of 20 to 99.9% by mass, more preferably 65 to 85% by mass, based on the total amount of all monomers. By setting it as the said range, the protein stabilization effect which was especially outstanding is exhibited. Monomer (c) having an alkyl group of 4 to 18 carbon atoms is preferably contained in an amount of 0.1 to 80% by mass, more preferably 12 to 40% by mass, based on the total amount of all monomers.
Other monomer (d) is preferably contained in an amount of 0 to 79.9% by mass, more preferably 0 to 50% by mass, particularly preferably 0 to 25% by mass, based on the total amount of all monomers.
＜オキシド化＞
モノマー（ａ）に由来する三級アミン基は、各種酸化剤を使用することでアミンオキシド基化することができる。これによりビニル系ポリマー（Ａ）にアミンオキシド基を導入することができる。オキシド化は、ビニル系ポリマー（Ａ）の重合前、重合後のいずれであってもよく、重合前のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を含む溶液に、重合後のオキシド化は、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合したビニル系ポリマーを含む溶液に、オキシド化剤を加えて２０℃～１００℃の範囲で０．１～１００時間、好ましくは１～５０時間反応させることによって、３級アミノ基をオキシド化することができる。
<Oxidation>
A tertiary amine group derived from the monomer (a) can be converted into an amine oxide group by using various oxidizing agents. Thereby, an amine oxide group can be introduced into the vinyl-based polymer (A). Oxidation may be performed before or after polymerization of the vinyl polymer (A). is an oxidizing agent added to a solution containing a vinyl polymer obtained by polymerizing a monomer essentially containing a tertiary amino group-containing monomer (a), and the mixture is heated at 20°C to 100°C for 0.1 to 100 hours, preferably Tertiary amino groups can be oxidized by reacting for 1 to 50 hours.
オキシド化剤としては、過酸化物又はオゾン等の酸化剤が用いられる。過酸化物としては、過酸化水素、過硫酸アンモニウム、過硫酸ソーダ、過酢酸、メタクロロ過安息香酸、ベンゾイルパーオキシド、ｔ－ブチルハイドロパーオキシド等が挙げられ、過酸化水素が好ましく、通常は水溶液の形で用いられる。程度の違いはあるとはいうものの、過酸化物にはラジカル発生剤としての機能もあるので、３級アミノ基含有不飽和モノマー（Ａ）を必須の原料とするビニル系ポリマーの場合には、重合後にオキシド化することが好ましい。 As the oxidizing agent, an oxidizing agent such as peroxide or ozone is used. Examples of peroxides include hydrogen peroxide, ammonium persulfate, sodium persulfate, peracetic acid, metachloroperbenzoic acid, benzoyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, etc. Hydrogen peroxide is preferred, and is usually an aqueous solution. used in the form Although there is a difference in degree, peroxides also function as radical generators. Therefore, in the case of a vinyl polymer containing a tertiary amino group-containing unsaturated monomer (A) as an essential raw material, Oxidation after polymerization is preferred.
一般的にはオキシド化剤の使用量は、オキシド化可能な官能基、即ち、３級アミノ基に対して、０．２～３倍モル当量の割合で使用し、更に０．５～２倍モル当量使用するのがより好ましい。得られたポリマー溶液は、残存した過酸化物を公知の方法で処理した後、使用することもできる。具体的には還元剤添加処理、イオン交換処理、活性炭処理、金属触媒による処理等があげられる。得られたポリマー溶液はそのまま使用することもできるが、必要に応じて再沈殿、溶媒留去等の公知の方法でアミンオキシド基含有ポリマーを単離して使用することも出来る。また、単離したアミンオキシド基含有ポリマーは、必要ならば再沈殿や、溶剤洗浄、膜分離、吸着処理等によってさらに精製できる。 Generally, the amount of the oxidizing agent used is 0.2 to 3 times the molar equivalent of the oxidizable functional group, that is, the tertiary amino group, and further 0.5 to 2 times the molar equivalent. It is more preferred to use molar equivalents. The obtained polymer solution can also be used after treating the residual peroxide by a known method. Specific examples include reducing agent addition treatment, ion exchange treatment, activated carbon treatment, treatment with a metal catalyst, and the like. The obtained polymer solution can be used as it is, but if necessary, the amine oxide group-containing polymer can be isolated and used by known methods such as reprecipitation and solvent distillation. In addition, the isolated amine oxide group-containing polymer can be further purified by reprecipitation, solvent washing, membrane separation, adsorption treatment, or the like, if necessary.
本発明におけるビニル系ポリマーとしては、前述の如く、３級アミノ基含有不飽和モノマー（ａ）をオキシド化した後に他のモノマーと重合したもの、及び、３級アミノ基含有不飽和モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合し、ポリマーを得た後にオキシド化したものの他、モノマーとして、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート等のエポキシ基含有不飽和化合物や２－イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基含有不飽和化合物と、ヒドロキシエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミンオキシド等のアミンオキシド基含有化合物との反応生成物を用いて共重合したものも用いることができる。 As the vinyl-based polymer in the present invention, as described above, the tertiary amino group-containing unsaturated monomer (a) is oxidized and then polymerized with another monomer, and the tertiary amino group-containing unsaturated monomer (a). In addition to those obtained by polymerizing a monomer essential and oxidizing after obtaining a polymer, as a monomer, for example, an epoxy group-containing unsaturated compound such as glycidyl (meth) acrylate or isocyanate such as 2-isocyanatoethyl (meth) acrylate Copolymerization using a reaction product of a group-containing unsaturated compound and an amine oxide group-containing compound such as hydroxyethyl-N,N-dimethylamine oxide can also be used.
＜アミンオキシド基含有量＞
アミンオキシド基は、タンパク質の周辺環境を適切に制御し、機能の失活を抑える効果を発揮する。ポリマー（Ａ）中のアミンオキシド基含有量は、好ましくは１～１０ｍｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは２～８ｍｍｏｌ／ｇである。アミンオキシド基の含有量が上記範囲にあることによって、好適な水溶性を発現すると共に、タンパク質との過度な相互作用を抑え、周囲の環境を適切に制御することができる。
<Amine oxide group content>
An amine oxide group exerts the effect of appropriately controlling the surrounding environment of proteins and suppressing the deactivation of their functions. The amine oxide group content in the polymer (A) is preferably 1-10 mmol/g, more preferably 2-8 mmol/g. When the content of the amine oxide group is within the above range, suitable water solubility can be exhibited, excessive interaction with proteins can be suppressed, and the surrounding environment can be appropriately controlled.
ビニル系ポリマー（Ａ）中のアミンオキシド基含有量は、アミンオキシド基を有するモノマーを重合してポリマー（Ａ）を得る場合には、重合に用いたアミンオキシド基を有するモノマーの量から求めることができる。一方、３級アミノ基含有モノマー（ａ）を必須とするモノマーを重合した後に得られたポリマーをオキシド化する場合には、前述の数式１によって算出できる。 The amine oxide group content in the vinyl polymer (A) can be obtained from the amount of the monomer having an amine oxide group used in the polymerization when the polymer (A) is obtained by polymerizing a monomer having an amine oxide group. can be done. On the other hand, in the case of oxidizing the polymer obtained after polymerizing the monomer essentially containing the tertiary amino group-containing monomer (a), it can be calculated by Equation 1 above.
＜質量平均分子量（Ｍｗ）＞
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、好ましくは２，０００～１０，０００，０００であり、より好ましくは５，０００以上であり、さらに好ましくは１０，０００以上であり、特に好ましくは２０，０００以上である。より好ましくは、５００，０００以下であり、特に好ましくは、２００，０００以下である。分子量が上記範囲であることにより、増粘作用を低下させゲル化等の不具合を防ぐことができる。またピペット操作などの取り扱いが容易になる。
<Mass average molecular weight (Mw)>
The weight average molecular weight of the vinyl polymer (A) is preferably 2,000 to 10,000,000, more preferably 5,000 or more, still more preferably 10,000 or more, particularly preferably 20 , 000 or more. It is more preferably 500,000 or less, and particularly preferably 200,000 or less. When the molecular weight is within the above range, it is possible to reduce the thickening action and prevent problems such as gelation. In addition, handling such as pipetting is facilitated.
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準プルラン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては下記条件１を用いた。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８を参照した。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定した。また、ビニル系ポリマー（Ａ）の分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量とした。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件２によることを基本とした。 As the mass average molecular weight of the vinyl polymer (A), a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard pullulan was adopted. The following condition 1 was used as a measuring device and measuring conditions. For other matters, JISK7252-1 to 4:2008 were referred to. For poorly soluble polymer compounds, measurements were made at a soluble concentration under the following conditions. Moreover, when the molecular weight measurement of vinyl-type polymer (A) is difficult, the weight average molecular weight of the amine oxide precursor polymer was made into the weight average molecular weight of vinyl-type polymer (A). The mass-average molecular weight of the amine oxide precursor polymer was measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene, and the measurement apparatus and measurement conditions were based on Condition 2 below.
（条件１）
カラム：ＯＨｐａｋ ＳＢ－Ｇ、
ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０６Ｍ ＨＱを３本及び、
ＯＨｐａｋ ＳＢ－８０２．５ ＨＱを連結したもの。
キャリア：１／１５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０ リン酸緩衝液
（りん酸緩衝剤粉末１／１５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ７．０（富士フイルム和光純薬(株)製）をイオン交換水１Ｌに溶解させたもの）
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．５質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
(Condition 1)
Column: OHpak SB-G,
Three OHpak SB-806M HQ and,
Concatenated with OHpak SB-802.5 HQ.
Carrier: 1/15 mol/L pH 7.0 phosphate buffer (Phosphate buffer powder 1/15 mol/L pH 7.0 (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 1 L of ion-exchanged water. thing)
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.5% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
(Condition 2)
Column: TOSOH TSKgel Super AW4000,
A concatenation of TOSOHTSKgelSuperAW3000 and TOSOHTSKgelSuperAW2500.
Carrier: N,N-dimethylformamide (1 L), triethylamine (3.04 g), LiBr (0.87 g) mixed liquid Measurement temperature: 40 ° C.
Carrier flow rate: 0.6 mL/min
＜タンパク質の安定化方法＞
本発明のタンパク質安定化剤と、タンパク質を共存させることにより、タンパク質を安定に保管することができる。安定化剤とタンパク質は、共通の溶媒に溶解又は分散させることで共存させることができる。
<Protein stabilization method>
By coexisting the protein with the protein stabilizer of the present invention, the protein can be stably stored. The stabilizing agent and protein can coexist by dissolving or dispersing them in a common solvent.
安定化剤とタンパク質を共存させる溶媒は水系の溶媒が好ましい。例えば、水やリン酸緩衝生理食塩水やトリス緩衝生理食塩水があげられる。水はメタノールやエタノール、プロピルアルコール、テトラヒドロフランなど水と混合できる有機溶剤を一部含んでもよい。 The solvent in which the stabilizer and the protein are allowed to coexist is preferably an aqueous solvent. Examples include water, phosphate-buffered saline, and Tris-buffered saline. Water may partially contain organic solvents such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and tetrahydrofuran that are miscible with water.
タンパク質に対して本発明の安定化剤は質量で好ましくは１００倍、更に好ましくは１００００倍加えて使用する。安定化剤の添加量が不十分な場合、安定化効果が発現できない可能性がある。同じ理由から、安定化剤は溶液の全量に対して好ましくは０．０１％以上、更に好ましくは０．１％以上加えて使用する。 The stabilizer of the present invention is used in an amount of preferably 100-fold, more preferably 10000-fold by weight relative to the protein. If the amount of stabilizer added is insufficient, the stabilizing effect may not be exhibited. For the same reason, the stabilizer is used in an amount of preferably 0.01% or more, more preferably 0.1% or more, relative to the total amount of the solution.
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の権利範囲を何ら制限するものではない。尚、実施例及び比較例における「部」及び「％」は「質量部」及び「質量％」を表し、ｍｏｌとは物質量を表し、ｍｏｌ％は全単量体中の物質量の割合を表す。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the examples below do not limit the scope of the present invention. In addition, "parts" and "%" in Examples and Comparative Examples represent "parts by mass" and "% by mass", mol represents the amount of substance, and mol% represents the ratio of the amount of substance in all monomers. show.
＜質量平均分子量（Ｍｗ）の測定方法＞
ビニル系ポリマー（Ａ）の質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては、下記条件１によることを基本とし、試料の溶解性等により条件２とした。ただし、重合体種によっては、さらに適宜適切なキャリア（溶離液）及びそれに適合したカラムを選定した。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８に基づいた。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定した。
また、ポリマーの分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をポリマーの質量平均分子量とした。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件３によった。
（条件１）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺＭ－Ｈ、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ４０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ２０００を連結したもの。
キャリア：テトラヒドロフラン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷＭ－Ｈを２本連結したもの。
キャリア：１０ｍＭＬｉＢｒ／Ｎ－メチルピロリドン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件３）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
<Method for measuring mass average molecular weight (Mw)>
The weight average molecular weight of the vinyl polymer (A) was measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene. The measurement apparatus and measurement conditions were based on condition 1 below, and condition 2 was selected depending on the solubility of the sample and the like. However, depending on the type of polymer, a more appropriate carrier (eluent) and a column compatible with it were selected. Other matters were based on JISK7252-1 to 4:2008. For poorly soluble polymer compounds, measurements were made at a soluble concentration under the following conditions.
Moreover, when the molecular weight measurement of the polymer was difficult, the weight average molecular weight of the amine oxide precursor polymer was used as the weight average molecular weight of the polymer. The mass-average molecular weight of the amine oxide precursor polymer employs a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene.
(Condition 1)
Column: TOSOHTSKgelSuperHZM-H,
A combination of TOSOHTSKgelSuperHZ4000 and TOSOHTSKgelSuperHZ2000.
Carrier: Tetrahydrofuran Measuring temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
(Condition 2)
Column: Two columns of TOSOHTSKgelSuperAWM-H are connected.
Carrier: 10 mM LiBr/N-methylpyrrolidone Measurement temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
(Condition 3)
Column: TOSOH TSKgel Super AW4000,
A concatenation of TOSOHTSKgelSuperAW3000 and TOSOHTSKgelSuperAW2500.
Carrier: N,N-dimethylformamide (1 L), triethylamine (3.04 g), LiBr (0.87 g) mixed liquid Measurement temperature: 40 ° C.
Carrier flow rate: 0.6 mL/min
＜＜生化学分析用ブロッキング剤の実施例＞＞
＜ブロッキング剤の製造１＞
［製造例１］
（ビニル系ポリマー（Ａ）の調製）
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒として酢酸エチル１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミドを８０質量部、ブチルアクリレートを２０質量部、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを０．５質量部、溶媒として酢酸エチルを１０質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後６時間熟成した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、エタノール１５０部とオキシド化剤として３５％過酸化水素水を５０部（用いたＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルメタクリレートと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることでアミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、ビニル系ポリマー（Ａ）を得た。
得られたポリマーのアミンオキシド基含有量は、加えたＮ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルメタクリレート量と上述の式から４．７３ｍｍｏｌ／ｇであった。なお、２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に、得られたビニル系ポリマー（Ａ）を１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。
<<Example of Blocking Agent for Biochemical Analysis>>
<Production of blocking agent 1>
[Production Example 1]
(Preparation of vinyl polymer (A))
A reaction vessel equipped with a thermometer, a stirrer, a nitrogen inlet tube, a reflux condenser and a dropping tube was charged with 150 parts by mass of ethyl acetate as an organic solvent under a nitrogen stream, and heated at 80° C. for 30 minutes while stirring. 80 parts by mass of N,N-dimethylaminopropyl acrylamide as a monomer, 20 parts by mass of butyl acrylate, 0.5 parts by mass of azobisisobutyronitrile as a polymerization initiator, and 10 parts by mass of ethyl acetate as a solvent were added to a dropping tube. It was prepared and added dropwise over 2 hours. After completion of dropping, the mixture was aged for 6 hours. After that, the reaction was stopped by cooling to room temperature.
Next, 150 parts of ethanol and 50 parts of 35% aqueous hydrogen peroxide as an oxidizing agent (equimolar amount to the N,N-dimethylaminopropyl methacrylate used) are added and reacted at 70° C. for 16 hours to remove amino groups. Oxidation was carried out. Thereafter, the solvent was removed with a diaphragm pump to obtain a vinyl polymer (A).
The amine oxide group content of the resulting polymer was 4.73 mmol/g based on the amount of N,N-dimethylaminopropyl methacrylate added and the above formula. Into 99 g of ion-exchanged water at 25°C, 1 g of the obtained vinyl polymer (A) was added, stirred and dissolved, and then allowed to stand at 25°C for 24 hours. As a result, neither separation nor precipitation was observed, indicating that these resins were completely soluble and water-soluble.
（ブロッキング剤の製造）
上記で得られたビニル系ポリマー（Ａ）を、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ溶液）に溶かし、濃度：５質量％の製造例１のブロッキング剤を得た。
(Production of blocking agent)
The vinyl-based polymer (A) obtained above was dissolved in a phosphate-buffered saline (hereinafter referred to as PBS solution) to obtain a blocking agent of Production Example 1 having a concentration of 5% by mass.
［製造例２～１５］
表１に示す配合組成で、製造例１と同様の方法でビニル系ポリマー（Ａ）を合成し、ＰＢＳ溶液に溶解し、製造例２～１５のブロッキング剤を得た。なお、製造例１５におけるビニル系ポリマー（Ａ）は、製造例１と同様の方法でモノマーを重合し、オキシド化剤を反応させずに溶剤を除去したものである。
[Production Examples 2 to 15]
A vinyl-based polymer (A) was synthesized in the same manner as in Production Example 1 with the composition shown in Table 1 and dissolved in a PBS solution to obtain blocking agents of Production Examples 2-15. The vinyl-based polymer (A) in Production Example 15 was obtained by polymerizing the monomers in the same manner as in Production Example 1 and removing the solvent without reacting with the oxidizing agent.
表１中の記号は以下の通り。
ＤＭＡＰＡＡ： Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＤＥＡＥＭＡ： Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＶＰ：ビニルピリジン
ＶＩ：ビニルイミダゾール
ＢＡ：ブチルメタクリレート
２ＥＨＡ： ２－エチルヘキシルアクリレート
ＩＳＴＡ：イソステアリルアクリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＡＡ：アクリル酸
ＨＥＡ：ヒドロキシエチルアクリレート
Symbols in Table 1 are as follows.
DMAPAA: N,N-dimethylaminopropyl acrylamide DEAEMA: N,N-diethylaminoethyl methacrylate VP: vinylpyridine VI: vinylimidazole BA: butyl methacrylate 2EHA: 2-ethylhexyl acrylate ISTA: isostearyl acrylate MMA: methyl methacrylate St: styrene AA : acrylic acid HEA: hydroxyethyl acrylate
＜ブロッキング剤による処理及び性能評価＞
［アクチンの付着］
ヒト血小板由来アクチン（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）を１質量％となるようにＰＢＳ溶液で希釈し、評価用アクチン溶液を調整した。ニトロセルロース膜（メンブレン Ｌ-０８００２-０１０＿アズワン製）２枚、各１カ所に、前記評価用アクチン溶液を、マイクロピペッターを用いてそれぞれ２μＬずつ滴下し、静置し乾燥させた。
<Treatment with blocking agent and performance evaluation>
[Attachment of actin]
Human platelet-derived actin (manufactured by Cytoskeleton) was diluted with a PBS solution to 1% by mass to prepare an actin solution for evaluation. Two nitrocellulose membranes (membrane L-08002-010_manufactured by AS ONE) were dripped with 2 μL of the actin solution for evaluation using a micropipette, and left to stand and dried.
［ブロッキング剤による処理］
次いで、上記で調整したブロッキング剤に、アクチンを付着したニトロセルロース膜を入れ、室温で１時間振とうし、ブロッキング処理を行った。その後、ブロッキング剤からニトロセルロース膜を取り出し、取り出したニトロセルロース膜をＰＢＳ溶液に入れ、室温で１５分間振とうした。ＰＢＳ溶液を新しくし、同様の洗浄作業をもう１回繰り返し、余分なブロッキング剤を取り除いた。
[Treatment with blocking agent]
Next, the actin-attached nitrocellulose membrane was placed in the blocking agent prepared above and shaken at room temperature for 1 hour to perform blocking treatment. After that, the nitrocellulose membrane was taken out from the blocking agent, put into a PBS solution, and shaken at room temperature for 15 minutes. The PBS solution was refreshed and the same washing procedure was repeated one more time to remove excess blocking agent.
［アクチンに対する２種類の抗体の付着］
抗β-アクチン,モノクローナル抗体,ペルオキシダーゼ結合（和光純薬工業社製）を、
ＰＢＳ溶液に溶解し、濃度０．０１質量％のアクチン抗体希釈液を得た。また同様に、抗ＧＡＰＤＨ,モノクローナル抗体, ペルオキシダーゼ結合（和光純薬工業社製）を、ＰＢ
Ｓ溶液に溶解し、濃度０．０１質量％のＧＡＰＤＨ抗体希釈液を得た。余分なブロッキング剤を除去した前述のニトロセルロース膜を、それぞれの抗体希釈液に入れ、室温で１時間振とうした。次いで、抗体希釈液からニトロセルロース膜を取り出し、取り出したニトロセルロース膜をＰＢＳ溶液に入れ、室温で一時間振とうし、余分な抗体を取り除いた。なお、ＧＡＰＤＨとはグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの略である。
[Attachment of two types of antibodies to actin]
Anti-β-actin, monoclonal antibody, peroxidase conjugate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.),
It was dissolved in a PBS solution to obtain an actin antibody dilution having a concentration of 0.01% by mass. Similarly, anti-GAPDH, monoclonal antibody, peroxidase conjugate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), PB
It was dissolved in the S solution to obtain a GAPDH antibody dilution having a concentration of 0.01% by mass. The aforementioned nitrocellulose membrane from which excess blocking agent was removed was placed in each antibody diluent and shaken at room temperature for 1 hour. Next, the nitrocellulose membrane was taken out from the antibody dilution solution, the taken-out nitrocellulose membrane was placed in a PBS solution, shaken at room temperature for 1 hour, and excess antibody was removed. GAPDH is an abbreviation for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.
［染色と評価］
ＤＡＢ錠（３,３’-ジアミノベンジジン四塩酸塩、和光純薬工業製）１０ｍｇを０．０５ｍｏｌ／Ｌ トリス－塩酸バッファー５０ｍＬに溶解し、さらに３０％過酸化水素水を１０μＬ加えて染色液を調整した。余分な抗体を取り除いた前述の２枚のニトロセルロース膜をそれぞれ染色液で覆い、表面の余分な染色液はタオルで除去した。以下の基準に従い、２種類の抗体希釈液を用いた場合におけるアクチン付着部位の染色状態を評価し、評価結果を表２に示す。
[Staining and evaluation]
DAB tablet (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 10 mg was dissolved in 50 mL of 0.05 mol/L Tris-HCl buffer, and 10 μL of 30% hydrogen peroxide solution was added to prepare a staining solution. It was adjusted. Each of the two nitrocellulose membranes from which excess antibody had been removed was covered with a staining solution, and excess staining solution on the surface was removed with a towel. According to the following criteria, the stained state of the actin-attached site was evaluated in the case of using two types of antibody diluents, and the evaluation results are shown in Table 2.
「アクチン抗体希釈液を用いた場合」
○：明確な染色あり
△：ほとんど染色なし
×：染色なし
「ＧＡＰＤＨ抗体希釈液を用いた場合」
○：染色なし
△：染色あり
×：明確な染色あり
「総合評価」
○：アクチン抗体希釈液を用いた場合のみが染色され、ＧＡＰＤＨ抗体希釈液を用いた場合に染色が無い。
△：アクチン抗体希釈液を用いた場合染色が薄く、ＧＡＰＤＨ抗体希釈液を用いた場合とのコントラストが小さい、若しくは、アクチン抗体希釈液を用いた場合染色されるが、ＧＡＰＤＨ抗体希釈液を用いた場合にも明確な染色が見られる。
×：アクチン抗体希釈液を用いた場合とＧＡＰＤＨ抗体希釈液を用いた場合との染色程度は変わらない（ブロッキング性能無し）
"Using actin antibody diluent"
○: Clear staining △: Almost no staining ×: No staining "When using GAPDH antibody diluent"
○: No staining △: With staining ×: With clear staining "Comprehensive evaluation"
○: Stained only when the actin antibody diluent was used, and no staining was observed when the GAPDH antibody diluent was used.
Δ: Staining is faint when the actin antibody dilution is used, and the contrast with the GAPDH antibody dilution is low, or staining occurs when the actin antibody dilution is used, but the GAPDH antibody dilution is used. Clear staining can be seen in both cases.
×: There is no difference in the degree of staining between the case of using the actin antibody diluent and the case of using the GAPDH antibody diluent (no blocking performance)
表２に示すように、本発明の生化学分析用ブロッキング剤を用いることで、アクチンとアクチン抗体との生化学分析を行うことができた。これは本発明の生化学分析用ブロッキング剤に含まれる重合体（Ａ）がたんぱく質と適切に吸着することで、抗原抗体反応を阻害せず、非特異的な吸着反応を抑えることができたためであると考えられる。 As shown in Table 2, by using the blocking agent for biochemical analysis of the present invention, biochemical analysis of actin and actin antibody could be performed. This is because the polymer (A) contained in the blocking agent for biochemical analysis of the present invention properly adsorbs to the protein, so that the antigen-antibody reaction is not inhibited and the non-specific adsorption reaction can be suppressed. It is believed that there is.
それに対して、アミンオキシド基を１．０～１０．０ｍｍｏｌ／ｇ有さない重合体を使用した比較例１～３は、ＧＡＰＤＨ抗体希釈液を用いた場合でも染色が見られ、アクチン抗体希釈液を用いた場合と明確な差は見られなかった。よって分析として十分な感度を得ることができなかった。これは、ブロッキング剤が抗原、抗体の両者に強力に非特異的吸着を起こしてしまい、ブロッキング性能を発現しなかったためであると考えられる。ただし、比較例１は参考例である。 On the other hand, in Comparative Examples 1 to 3 using a polymer having no amine oxide group of 1.0 to 10.0 mmol/g, staining was observed even when the GAPDH antibody diluent was used, and the actin antibody diluent No clear difference was observed when using Therefore, it was not possible to obtain sufficient sensitivity for analysis. This is probably because the blocking agent caused strong non-specific adsorption to both the antigen and the antibody, and did not exhibit blocking performance. However, Comparative Example 1 is a reference example.
＜ブロッキング剤の製造２＞
＜アミンオキシド基含有ビニル系共重合体の製造＞
［実施例２－１］
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、ブタノールを２５．８部、３級アミノ基含有ビニル系モノマー（ａ２）としてジメチルアミノエチルメタクリレートを８０部（７８．３ｍｏｌ％）、炭素数１～１８のアルキル基含有ビニル系モノマー（ａ３）としてブチルメタクリレートを２０．０部（２１．７ｍｏｌ％）仕込んだ。さらにここに、チオール基含有化合物（ｘ）としてトリメチロールプロパントリス（３－メルカプトプロピオネート）を全ビニル系モノマーの合計量に対して３％になるように、３．０部加え、十分に窒素置換したのち、内温を９０℃に昇温した。別途ジメチル２,２'－アゾビス(２－メチルプロピネート)を０．１部とブタノール４２．８部を混合したものを準備し、これを１３分割して添加した。なお、ジメチル２,２'－アゾビス(２－メチルプロピネート)のブタノール溶液は、反応容器が９０℃で安定化した時点で１回目の添加を行い、
以後３０分おきに反応容器に添加した。合計反応時間が８時間となったところで固形分測定を行い、転化率が９８％超えたことを確認し、室温に冷却し反応を停止した。
次に、オキシド化剤として３５％過酸化水素水を４９．７部（用いたジメチルアミノエチルメタクリレートと等モル量）加え、８０℃で５０時間反応させることで３級アミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプでブタノールを除去し、アミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ－１）を得た。
得られたアミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ－１）のアミンオキシド基含有量は、加えたジメチルアミノエチルメタクリレート量と上述の数式１から４．５８ｍｍｏｌ／ｇであった。
得られたアミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ－１）を２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果、これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。
<Production of blocking agent 2>
<Production of amine oxide group-containing vinyl copolymer>
[Example 2-1]
25.8 parts of butanol and 80 parts (78.3 mol%) of dimethylaminoethyl methacrylate as a tertiary amino group-containing vinyl-based monomer (a2) were placed in a reaction vessel equipped with a stirrer, a thermometer, a dropping funnel, and a reflux device. , 20.0 parts (21.7 mol %) of butyl methacrylate was charged as an alkyl group-containing vinyl monomer (a3) having 1 to 18 carbon atoms. Furthermore, 3.0 parts of trimethylolpropane tris(3-mercaptopropionate) as a thiol group-containing compound (x) is added here so that the total amount of all vinyl monomers is 3%, and sufficiently After purging with nitrogen, the internal temperature was raised to 90°C. Separately, a mixture of 0.1 part of dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropinate) and 42.8 parts of butanol was prepared and added in 13 divided portions. The butanol solution of dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropinate) was added for the first time when the reaction vessel was stabilized at 90°C.
Thereafter, it was added to the reaction vessel every 30 minutes. When the total reaction time reached 8 hours, the solid content was measured, and it was confirmed that the conversion rate exceeded 98%, and the reaction was stopped by cooling to room temperature.
Next, 49.7 parts of 35% aqueous hydrogen peroxide as an oxidizing agent (an amount equivalent to the amount of dimethylaminoethyl methacrylate used) was added, and the mixture was reacted at 80°C for 50 hours to oxidize the tertiary amino group. rice field. Thereafter, butanol was removed with a diaphragm pump to obtain an amine oxide group-containing vinyl polymer (A-1).
The amine oxide group content of the obtained amine oxide group-containing vinyl polymer (A-1) was 4.58 mmol/g based on the amount of dimethylaminoethyl methacrylate added and Equation 1 above.
1 g of the resulting amine oxide group-containing vinyl polymer (A-1) was added to 99 g of ion-exchanged water at 25° C., stirred to dissolve, and allowed to stand at 25° C. for 24 hours. As a result, neither separation nor precipitation was observed, indicating that these resins were completely soluble and water-soluble.
［実施例２－２～２－１１]
表２－１に示す配合組成とした以外は実施例２－１と同様の方法で、アミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ－２～Ａ－１１）を合成した。
[Examples 2-2 to 2-11]
Amine oxide group-containing vinyl polymers (A-2 to A-11) were synthesized in the same manner as in Example 2-1, except that the formulations shown in Table 2-1 were used.
［比較例２－１］
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、ブタノールを２５．８部、ブチルメタクリレートを７０．０部（５４．２ｍｏｌ％）、アクリル酸を３０部（４５．８ｍｏｌ％）、仕込んだ。さらにここに、チオール基含有化合物（ｘ）としてトリメチロールプロパントリス（３－メルカプトプロピオネートを全ビニル系モノマーの合計量に対して３％になるように、３．０部加え、十分に窒素置換したのち、内温を９０℃に昇温した。別途ジメチル２,２'－アゾビス(２－メチルプロピネート)を０．１部とブタノール４２．８部を混合したものを準備し、これを１３分割して添加した。なお、ジメチル２,２'－アゾビス(２－メチルプロピネート)のブタノール溶液は、反応容器が９０℃で安定化した時点で１回目の添加を行い、以後３０分おきに反応容器に添加した。合計反応時間が８時間となったところで固形分測定を行い、転化率が９８％超えたことを確認し、室温に冷却し反応を停止した。その後、ダイヤフラムポンプでブタノールを除去し、ビニル系共重合体（ＨＡ－１）を得た。
[Comparative Example 2-1]
25.8 parts of butanol, 70.0 parts (54.2 mol%) of butyl methacrylate, and 30 parts (45.8 mol%) of acrylic acid were placed in a reaction vessel equipped with a stirrer, a thermometer, a dropping funnel, and a reflux vessel. , prepared. Further, 3.0 parts of trimethylolpropane tris (3-mercaptopropionate) as a thiol group-containing compound (x) is added to the total amount of all vinyl monomers to be 3%, and nitrogen is sufficiently added. After the substitution, the internal temperature was raised to 90° C. Separately, a mixture of 0.1 part of dimethyl 2,2′-azobis(2-methylpropinate) and 42.8 parts of butanol was prepared. The dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropionate) butanol solution was added once when the reaction vessel was stabilized at 90°C, and thereafter added at intervals of 30 minutes. When the total reaction time reached 8 hours, the solid content was measured, and it was confirmed that the conversion rate exceeded 98%, and the reaction was stopped by cooling to room temperature.Then, the butanol was stopped by a diaphragm pump. was removed to obtain a vinyl copolymer (HA-1).
［比較例２－２］
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、ブタノールを２５．８部、３級アミノ基含有ビニル系モノマー（ａ２）としてジメチルアミノエチルメタクリレートを５０部（４７．５ｍｏｌ％）、炭素数１～１８のアルキル基含有ビニル系モノマー（ａ３）としてブチルメタクリレートを５０．０部（５２．５ｍｏｌ％）仕込んだ。さらにここに、チオール基含有化合物（ｘ）としてトリメチロールプロパントリス（３－メルカプトプロピオネート）を全ビニル系モノマーの合計量に対して３％になるように、３．０部加え、十分に窒素置換したのち、内温を９０℃に昇温した。別途ジメチル２,２'－アゾビス(２－メチルプロピネート)を０．１部とブタノール４２．８部を混合したものを準備し、これを１３分割して添加した。なお、ジメチル２,２'－アゾビス(２－メチルプロピネート)のブタノール溶液は、反応容器が９０℃で安定化した時点で１回目の添加を行い、以後３０分おきに反応容器に添加した。合計反応時間が８時間となったところで固形分測定を行い、転化率が９８％超えたことを確認し、室温に冷却し反応を停止した。その後、ダイヤフラムポンプでブタノールを除去し、ビニル系共重合体（ＨＡ－２）得た。
[Comparative Example 2-2]
25.8 parts of butanol and 50 parts (47.5 mol%) of dimethylaminoethyl methacrylate as a tertiary amino group-containing vinyl-based monomer (a2) were placed in a reaction vessel equipped with a stirrer, a thermometer, a dropping funnel, and a reflux device. 50.0 parts (52.5 mol %) of butyl methacrylate was charged as a C 1-18 alkyl group-containing vinyl-based monomer (a3). Furthermore, 3.0 parts of trimethylolpropane tris(3-mercaptopropionate) as a thiol group-containing compound (x) is added here so that the total amount of all vinyl monomers is 3%, and sufficiently After purging with nitrogen, the internal temperature was raised to 90°C. Separately, a mixture of 0.1 part of dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropinate) and 42.8 parts of butanol was prepared and added in 13 divided portions. The butanol solution of dimethyl 2,2'-azobis(2-methylpropinate) was added to the reaction vessel for the first time when the reaction vessel was stabilized at 90°C, and then added to the reaction vessel every 30 minutes. When the total reaction time reached 8 hours, the solid content was measured, and it was confirmed that the conversion rate exceeded 98%, and the reaction was stopped by cooling to room temperature. Thereafter, butanol was removed with a diaphragm pump to obtain a vinyl copolymer (HA-2).
表２－１中の略称を以下に示す。
ＤＭＡＥＭＡ：ジメチルアミノエチルメタクリレート
ＤＥＡＰＡＡ：ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＶＰ：ビニルピリジン
ＶＩ：ビニルイミダゾール
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
２ＥＨＡ： ２－エチルヘキシルアクリレート
ＬＭＡ：ラウリルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＡＡ：アクリル酸
ＨＥＡ：ヒドロキシエチルアクリレート
ＴＭＭＰ：トリメチロールプロパントリス（３－メルカプトプロピオネート）
ＰＥＭＰ：ペンタエリスリトールテトラキス（３－メルカプトプロピオネート）
ＤＰＭＰ：（ジペンタエリスリトールヘキサキス（３－メルカプトプロピオネート）
Abbreviations in Table 2-1 are shown below.
DMAEMA: dimethylaminoethyl methacrylate DEAPAA: dimethylaminopropyl acrylamide VP: vinylpyridine VI: vinylimidazole MMA: methyl methacrylate BMA: butyl methacrylate 2EHA: 2-ethylhexyl acrylate LMA: lauryl methacrylate St: styrene AA: acrylic acid HEA: hydroxyethyl acrylate TMMP: trimethylolpropane tris (3-mercaptopropionate)
PEMP: pentaerythritol tetrakis (3-mercaptopropionate)
DPMP: (dipentaerythritol hexakis (3-mercaptopropionate)
＜ブロッキング剤の調製＞
［実施例２－１３］
（ブロッキング剤１溶液）
得られたアミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ－１）を、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ溶液）に溶かし、固形分５質量％のブロッキング剤１の溶液を得た。
<Preparation of blocking agent>
[Example 2-13]
(Blocking agent 1 solution)
The obtained amine oxide group-containing vinyl polymer (A-1) was dissolved in phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS solution) to obtain a solution of blocking agent 1 having a solid content of 5% by mass.
［実施例２－１４～２－２４、比較例２－３～２－４］
（ブロッキング剤２～１３溶液）
アミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ－１）を、アミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ－２～Ａ－１１）及び比較用のビニル系重合体（ＨＡ－１～ＨＡ－２）に変更した以外は、ブロッキング剤１溶液と同様にして、ブロッキング剤２～１３の溶液を得た。
なお、ビニル系共重合体（ＨＡ－１）はアクリル酸を全てジメチルアミノエタノールで中和したものを使用した。また、ビニル系共重合体（ＨＡ－２）はジメチルアミノエチルメタクリレート由来のアミノ基を全て酢酸で中和したものを用いた。
[Examples 2-14 to 2-24, Comparative Examples 2-3 to 2-4]
(Blocking agent 2-13 solution)
Amine oxide group-containing vinyl polymer (A-1) was added to amine oxide group-containing vinyl polymers (A-2 to A-11) and comparative vinyl polymers (HA-1 to HA-2). Solutions of blocking agents 2 to 13 were obtained in the same manner as the blocking agent 1 solution, except that the solutions were changed.
The vinyl-based copolymer (HA-1) used was obtained by neutralizing all the acrylic acid with dimethylaminoethanol. Also, the vinyl copolymer (HA-2) used was obtained by neutralizing all amino groups derived from dimethylaminoethyl methacrylate with acetic acid.
＜ブロッキング剤の評価＞
得られたブロッキング剤溶液について、下記の通り、［抗原抗体反応試験］及び［非特異吸着試験］を実施し、吸光度の差異を基準に評価した。結果を表２－２に示す。
<Evaluation of blocking agent>
[Antigen-Antibody Reaction Test] and [Non-Specific Adsorption Test] were performed on the obtained blocking agent solution as described below, and evaluation was made based on the difference in absorbance. The results are shown in Table 2-2.
［抗原抗体反応試験］
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
[Antigen-antibody reaction test]
(Solid phase antibody treatment of well plate)
Solid-phase CRP antibody ab8279 (manufactured by abcam) was adjusted with a PBS solution to a concentration of 25 μg/ml. Each 50 μl of this solid-phase CRP antibody solution was added to a PSt 96-well plate, allowed to stand at room temperature for 2 hours, and then the solution was removed by aspiration.
（抗原吸着処理）
ＣＲＰ抗原８Ｃ７２（Ｈｙｔｅｓｔ社製）が２μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＣＲＰ抗原溶液を、前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、４℃１２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
(antigen adsorption treatment)
CRP antigen 8C72 (manufactured by Hytest) was adjusted to 2 µg/ml with a PBS solution. 50 μl of this CRP antigen solution was added to each of the solid-phase antibody-treated 96-well plates, allowed to stand at 4° C. for 12 hours, and then the solution was removed by aspiration.
（ブロッキング処理）
得られたブロッキング剤溶液を、前述の抗原処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
(Blocking process)
50 μl of the obtained blocking agent solution was added to each of the antigen-treated 96-well plates, allowed to stand at room temperature for 2 hours, and then the solution was removed by aspiration.
（標識抗体吸着処理）
ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）が０．０８μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後各ウェルにＰＢＳ溶液２００μｌずつ添加し吸引除去し、これを３回繰り返した。
(Labeled antibody adsorption treatment)
HRP-labeled CRP antibody ab24462 (manufactured by abcam) was adjusted to 0.08 µg/ml with a PBS solution. 50 μl of this HRP-labeled CRP antibody solution was added to each of the aforementioned blocking-treated 96-well plates, allowed to stand at room temperature for 2 hours, and then the solution was removed by aspiration. After that, 200 μl of PBS solution was added to each well and removed by aspiration, and this was repeated three times.
（発色反応）
住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの発色剤１０ｍｌと基質液０．１ｍｌを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温１時間静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液１００μｌを添加した。
(color reaction)
A coloring solution was prepared using 10 ml of a coloring agent of a coloring kit for peroxidase manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. and 0.1 ml of a substrate solution. Each 100 μl of this coloring solution was added to each 96-well plate treated with labeled antibody adsorption treatment and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, 100 μl of a stop solution of a coloring kit for peroxidase manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. was added to each well.
（吸光度Ａ測定）
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（吸光度Ａという）を測定した。これは、抗原抗体反応（特異吸着）によりウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
(Absorbance A measurement)
The absorbance of each well at 450 nm (referred to as absorbance A) was measured. This is the absorbance representing the amount of antibody adsorbed to the well by antigen-antibody reaction (specific adsorption).
［非特異吸着試験］
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製ＥＬＩＳＡ用９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
[Non-specific adsorption test]
(Solid phase antibody treatment of well plate)
Solid-phase CRP antibody ab8279 (manufactured by abcam) was adjusted with a PBS solution to a concentration of 25 μg/ml. 50 μl of this solid-phase CRP antibody solution was added to each PSt 96-well plate for ELISA, left standing at room temperature for 2 hours, and then the solution was removed by aspiration.
（ブロッキング処理）
得られたブロッキング剤溶液を、前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
(Blocking process)
Each 50 μl of the obtained blocking agent solution was added to each of the solid-phase antibody-treated 96-well plates, allowed to stand at room temperature for 2 hours, and then the solution was removed by aspiration.
（標識抗体吸着処理）
ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）が０．０８μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後各ウェルにＰＢＳ溶液２００μｌずつ添加し吸引除去し、これを３回繰り返した。
(Labeled antibody adsorption treatment)
HRP-labeled CRP antibody ab24462 (manufactured by abcam) was adjusted to 0.08 µg/ml with a PBS solution. 50 μl of this HRP-labeled CRP antibody solution was added to each of the aforementioned blocking-treated 96-well plates, allowed to stand at room temperature for 2 hours, and then the solution was removed by aspiration. After that, 200 μl of PBS solution was added to each well and removed by aspiration, and this was repeated three times.
（発色反応）
住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの発色剤１０ｍｌと基質液０．１ｍｌを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μｌずつ添加し、室温１時間静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液１００μｌを添加した。
(color reaction)
A coloring solution was prepared using 10 ml of a coloring agent of a coloring kit for peroxidase manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. and 0.1 ml of a substrate solution. Each 100 μl of this coloring solution was added to each 96-well plate treated with labeled antibody adsorption treatment and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, 100 μl of a stop solution of a coloring kit for peroxidase manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. was added to each well.
（吸光度Ｂ測定）
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（吸光度Ｂという）を測定した。これは、抗原がないため、標識抗体の非特異吸着によるウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
(Absorbance B measurement)
The absorbance of each well at 450 nm (referred to as absorbance B) was measured. This absorbance represents the amount of antibody adsorbed to the well due to non-specific adsorption of the labeled antibody due to the absence of antigen.
［評価基準］
◎： １．０≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ） ：良好
〇： ０．８≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜１．０ ：使用可能
△： ０．５≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜０．８ ：使用不可
×： （吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜０．５ ：不良
[Evaluation criteria]
◎: 1.0 ≤ (absorbance A - absorbance B): good ○: 0.8 ≤ (absorbance A - absorbance B) < 1.0: usable △: 0.5 ≤ (absorbance A - absorbance B) < 0 .8: Unusable ×: (Absorbance A - Absorbance B) <0.5: Poor
表２－２に示すように、本発明の生化学分析用ブロッキング剤を用いることで、ＣＲＰ抗原抗体反応を利用した生化学分析を行うことができた。具体的には、本発明のアミンオキシド基含有ビニル系重合体（実施例２－１～２－１２）を使用した生化学分析用ブロッキング剤（実施例２－１３～２－２４）は、ＣＲＰ抗原抗体反応と非特異吸着反応の吸光度の差が大きく、ＣＲＰ抗原抗体反応を高感度に検出できた。すなわち、これは本発明の生化学分析用ブロッキング剤に含まれるアミンオキシド基含有ビニル系重合体（Ａ）が、アミンオキシド構造を有し且つ共重合体にチオール基由来の硫黄原子が導入されたため抗体との相互作用が適切に制御され、ＣＲＰの抗原抗体反応を阻害せず、ＣＲＰ抗原抗体反応以外の非特異的な吸着反応を抑えることができたためであると考えられる。特に、３官能以上のチオール基含有化合物を連鎖移動剤として用いて、共重合体に分岐構造を導入した実施例２－１３～２－１６、２－１８～２－２４は、より良好な結果であった。 As shown in Table 2-2, biochemical analysis using the CRP antigen-antibody reaction could be performed by using the blocking agent for biochemical analysis of the present invention. Specifically, the blocking agents for biochemical analysis (Examples 2-13 to 2-24) using the amine oxide group-containing vinyl polymer of the present invention (Examples 2-1 to 2-12) are CRP The absorbance difference between the antigen-antibody reaction and the non-specific adsorption reaction was large, and the CRP antigen-antibody reaction could be detected with high sensitivity. That is, this is because the amine oxide group-containing vinyl polymer (A) contained in the blocking agent for biochemical analysis of the present invention has an amine oxide structure and a sulfur atom derived from a thiol group is introduced into the copolymer. This is probably because the interaction with the antibody was properly controlled, the antigen-antibody reaction of CRP was not inhibited, and non-specific adsorption reactions other than the CRP antigen-antibody reaction could be suppressed. In particular, Examples 2-13 to 2-16 and 2-18 to 2-24 in which a branched structure was introduced into the copolymer using a trifunctional or higher thiol group-containing compound as a chain transfer agent gave better results. Met.
一方、チオール基含有化合物（ｘ）を用いておらず、さらにアミンオキシド構造を有しないビニル系共重合体（比較例２－１～２－２）を用いた生化学分析用ブロッキング剤（比較例２－３～２－４）は、ＣＲＰ抗原抗体反応と非特異吸着反応の吸光度の差が小さく、分析として十分な感度を得ることができなかった。これは、アミンオキシド構造とチオール基に由来する硫黄原子とを有しない場合は、ＣＲＰの抗原抗体反応以外の非特異的な吸着反応を抑えることができない、あるいは、ＣＲＰの抗原抗体反応自体を阻害したため、と推察される。 On the other hand, a blocking agent for biochemical analysis (comparative example In 2-3 to 2-4), the difference in absorbance between the CRP antigen-antibody reaction and the non-specific adsorption reaction was small, and sufficient sensitivity for analysis could not be obtained. This is because if it does not have an amine oxide structure and a sulfur atom derived from a thiol group, it is not possible to suppress non-specific adsorption reactions other than the antigen-antibody reaction of CRP, or the antigen-antibody reaction itself of CRP is inhibited. It is assumed that this is because
＜＜バイオフィルム形成抑制コート剤の実施例＞＞
＜酸価の測定方法＞
酸価は、樹脂１ｇ中に含有する酸基は中和するのに必要とする水酸化カリウムのｍｍｏｌで、測定方法は既知の方法でよく、一般的にはＪＩＳＫ００７０に準じて行われる。その手法を以下に示した。試料を０．５～２ｇ精秤する（固形分量：Ｓｇ）。精秤した試料に中性エタノール１０ｍＬを加え溶解させる。得られた溶液を０．１ｍｏｌ／ｌエタノール性水酸化カリウム溶液（力価：Ｆ）で電位差滴定を行なう。電位差曲線が極大となった点を終点とし、この時の滴定量（ＡｍＬ）を用い次の（式２）により酸価を求めた。
（式２） 酸価（ｍｍｏｌ／ｇ）＝（Ａ×Ｆ×０．１）／Ｓ
<<Example of biofilm formation suppressing coating agent>>
<Method for measuring acid value>
The acid value is expressed in mmol of potassium hydroxide required to neutralize acid groups contained in 1 g of resin, and may be measured by a known method, generally according to JIS K0070. The method is shown below. Accurately weigh 0.5 to 2 g of the sample (solid content: Sg). 10 mL of neutral ethanol is added to the precisely weighed sample to dissolve it. The obtained solution is subjected to potentiometric titration with 0.1 mol/l ethanolic potassium hydroxide solution (titer: F). The point at which the potential difference curve reached a maximum was defined as the end point, and the titration amount (AmL) at this time was used to determine the acid value by the following (Equation 2).
(Formula 2) Acid value (mmol/g) = (A x F x 0.1)/S
＜アミン価の測定方法＞
アミン価は、樹脂１ｇ中に含有するアミノ基を中和するのに必要とする塩酸の当量と同量の水酸化カリウムのｍｍｏｌである。アミン価の測定方法については、以下の方法により行った。試料を０．５～２ｇ精秤する（固形分量：Ｓｇ）。精秤した試料に中性エタノール１０ｍＬを加え溶解させる。得られた溶液を０．１ｍｏｌ／ｌエタノール性塩酸溶液（力価：ｆ）で電位差滴定を行なう。電位差曲線が極大となった点を終点とし、この時の滴定量（ＡｍＬ）を用い次の（式３）によりアミン価を求めた。
（式３） アミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）＝（Ａ×ｆ×０．１）／Ｓ
<Method for measuring amine value>
The amine number is the equivalent of hydrochloric acid in mmol of potassium hydroxide required to neutralize the amino groups contained in 1 g of resin. The amine value was measured by the following method. Accurately weigh 0.5 to 2 g of the sample (solid content: Sg). 10 mL of neutral ethanol is added to the precisely weighed sample to dissolve it. The resulting solution is subjected to potentiometric titration with a 0.1 mol/l ethanolic hydrochloric acid solution (titer: f). The point at which the potential difference curve reached a maximum was defined as the end point, and the titration amount (AmL) at this time was used to determine the amine value according to the following (Equation 3).
(Formula 3) Amine value (mmol/g) = (A x f x 0.1)/S
＜アミンオキシド基含有ポリマーの合成＞
（ポリマー溶液（Ｐ－１））
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、酢酸エチル１００部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、２，２’－アゾジイソブチロニトリルを０．３部、モノマー（Ａ）としてＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートを２０部、モノマー（Ｂ）としてアクリル酸を５部、モノマー（Ｃ）としてブチルアクリレートを７５部混合したものを、内温を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに５時間撹拌を続けた。固形分測定によって転化率が９８％超えたことを確認後、冷却して３級アミノ基を有するポリマーの溶液を得た。
次に、得られた３級アミノ基を有するポリマーの溶液に、オキシド化剤として３０％過酸化水素水を１４．４部（用いたＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることでアミノ基のオキシド化を行った。アミンオキシド変換率が９９％を超えたことを確認後、冷却して取り出し、オーブンで溶媒を完全に揮発させた後、エタノールに溶解して、固形分５０質量％のポリマー溶液（Ｐ－１）を得た。なお上記、アミンオキシド変換率は、特開平１０－１８２５８９に開示される方法に従い判断した。
得られたポリマーのアミンオキシド基含有量は、加えたＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート量と前述の数式１から１．２５ｍｍｏｌ／ｇであった。また得られたポリマーの質量平均分子量をＧＰＣにより測定したところ、６０，０００であった。
<Synthesis of amine oxide group-containing polymer>
(Polymer solution (P-1))
A reaction vessel equipped with a stirrer, a thermometer, a dropping funnel and a reflux vessel was charged with 100 parts of ethyl acetate, the internal temperature was raised to 75° C., and the inside was sufficiently replaced with nitrogen. Separately prepared, 0.3 parts of 2,2'-azodiisobutyronitrile, 20 parts of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate as monomer (A), 5 parts of acrylic acid as monomer (B), A mixture of 75 parts of butyl acrylate as the monomer (C) was added dropwise for 3 hours while maintaining the internal temperature at 75° C., and stirring was continued for 5 hours. After confirming that the conversion rate exceeded 98% by measuring the solid content, the solution was cooled to obtain a polymer solution having a tertiary amino group.
Next, 14.4 parts of 30% aqueous hydrogen peroxide as an oxidizing agent (equimolar amount of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate used) was added to the obtained polymer solution having a tertiary amino group, The amino group was oxidized by reacting at 70° C. for 16 hours. After confirming that the amine oxide conversion rate exceeded 99%, it was cooled and taken out, the solvent was completely volatilized in an oven, and then dissolved in ethanol to obtain a polymer solution (P-1) having a solid content of 50% by mass. got The amine oxide conversion rate was determined according to the method disclosed in JP-A-10-182589.
The amine oxide group content of the resulting polymer was 1.25 mmol/g based on the amount of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate added and Equation 1 above. The weight average molecular weight of the obtained polymer was measured by GPC and found to be 60,000.
（ポリマー溶液（Ｐ－２～１８、２０））
ポリマー溶液（Ｐ－１）と同様の方法で、表３－１の組成及び仕込み質量部に従って合成を行い、ポリマー溶液（Ｐ－２～１８、２０）を得た。
(Polymer solution (P-2 to 18, 20))
Polymer solutions (P-2 to 18, 20) were obtained by synthesizing in the same manner as the polymer solution (P-1) according to the composition and charged mass parts shown in Table 3-1.
（ポリマー溶液（Ｐ－１９））
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、酢酸エチル１００部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、２，２’－アゾジイソブチロニトリルを０．３部、モノマー（Ｂ）としてアクリル酸を５部、モノマー（Ｃ）としてブチルアクリレートを９５部混合したものを、内温を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに５時間撹拌を続けた。固形分測定によって転化率が９８％超えたことを確認後、冷却して取り出し、酢酸エチルで希釈して、固形分５０質量％のポリマー溶液（Ｐ－１９）を得た。
(Polymer solution (P-19))
A reaction vessel equipped with a stirrer, a thermometer, a dropping funnel and a reflux vessel was charged with 100 parts of ethyl acetate, the internal temperature was raised to 75° C., and the inside was sufficiently replaced with nitrogen. A separately prepared mixture of 0.3 parts of 2,2'-azodiisobutyronitrile, 5 parts of acrylic acid as the monomer (B), and 95 parts of butyl acrylate as the monomer (C) was heated to the internal temperature. was kept at 75° C., dropwise addition was continued for 3 hours, and stirring was further continued for 5 hours. After confirming that the conversion rate exceeded 98% by solid content measurement, it was cooled, taken out, and diluted with ethyl acetate to obtain a polymer solution (P-19) having a solid content of 50% by mass.
（ポリマー溶液（Ｐ－２１））
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、酢酸エチル１００部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、２，２’－アゾジイソブチロニトリルを０．３部、モノマー（Ａ）としてＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートを２０部、モノマー（Ｂ）としてアクリル酸を５部、モノマー（Ｃ）としてブチルアクリレートを９５部混合したものを、内温を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに５時間撹拌を続けた。固形分測定によって転化率が９８％超えたことを確認後、冷却して取り出し、エタノールで希釈して、固形分５０質量％の３級アミノ基を有するポリマー溶液（Ｐ－２１）を得た。
(Polymer solution (P-21))
A reaction vessel equipped with a stirrer, a thermometer, a dropping funnel and a reflux vessel was charged with 100 parts of ethyl acetate, the internal temperature was raised to 75° C., and the inside was sufficiently replaced with nitrogen. Separately prepared, 0.3 parts of 2,2'-azodiisobutyronitrile, 20 parts of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate as monomer (A), 5 parts of acrylic acid as monomer (B), A mixture of 95 parts of butyl acrylate as the monomer (C) was added dropwise for 3 hours while maintaining the internal temperature at 75° C., and stirring was continued for 5 hours. After confirming that the conversion rate exceeded 98% by solid content measurement, it was cooled, taken out, and diluted with ethanol to obtain a polymer solution (P-21) having a solid content of 50% by mass and having a tertiary amino group.
（ポリマー溶液（Ｐ－２２））
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、酢酸エチル６０部、イオン交換水４０部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、２，２’－アゾジイソブチロニトリルを０．３部、モノマー（Ｂ）としてアクリル酸を５部、モノマー（Ｃ）としてブチルアクリレートを７５部、メタクロイルコリンクロリド２０部混合したものを、内温を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに５時間撹拌を続けた。固形分測定によって転化率が９８％超えたことを確認後、冷却して取り出し、エタノールで希釈して、固形分５０質量％の４級アミノ基を有するポリマー溶液（Ｐ－２２）を得た。
(Polymer solution (P-22))
60 parts of ethyl acetate and 40 parts of ion-exchanged water were charged into a reaction vessel equipped with a stirrer, thermometer, dropping funnel, and reflux vessel, and the internal temperature was raised to 75° C. and the contents were sufficiently replaced with nitrogen. 0.3 parts of 2,2'-azodiisobutyronitrile, 5 parts of acrylic acid as monomer (B), 75 parts of butyl acrylate as monomer (C), and 20 parts of methacryloylcholine chloride, which were prepared separately The mixture was added dropwise for 3 hours while maintaining the internal temperature at 75° C., and was further stirred for 5 hours. After confirming that the conversion rate exceeded 98% by solid content measurement, it was cooled, taken out, and diluted with ethanol to obtain a polymer solution (P-22) having a solid content of 50% by mass and having a quaternary amino group.
得られたポリマーについて、特性値を表３－１に示す。 Table 3-1 shows the characteristic values of the obtained polymer.
以下に、表３－１中の略称を示す。
ＤＭＡＥＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート
ＤＥＡＥＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＤＭＡＰＡＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＶＰ：４－ビニルピリジン
ＶＩ：２－メチル－１－ビニルイミダゾール
ＡＡ：アクリル酸
ＨＥＡ：２－ヒドロキシエチルアクリレート
ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート
ＢＡ：ブチルアクリレート
ＯＡ：ｎ－オクチルアリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
ＴＭＡＥＭＣ：メタクロイルコリンクロリド
ＡＩＢＮ：２，２’－アゾジイソブチロニトリル
Abbreviations in Table 3-1 are shown below.
DMAEMA: N,N-dimethylaminoethyl methacrylate DEAEMA: N,N-diethylaminoethyl methacrylate DMAPAA: N,N-dimethylaminopropyl acrylamide VP: 4-vinylpyridine VI: 2-methyl-1-vinylimidazole AA: acrylic acid HEA : 2-hydroxyethyl acrylate GMA: glycidyl methacrylate BA: butyl acrylate OA: n-octyl arylate MMA: methyl methacrylate TMAEMC: methacryloylcholine chloride AIBN: 2,2'-azodiisobutyronitrile
＜バイオフィルム形成抑制コート剤の調整＞
［実施例３－１］
（バイオフィルム形成抑制コート剤１）
得られたアミンオキシド基含有ポリマー溶液（Ｐ－１）４．０部と、架橋剤としてＶ－０２（日清紡（株）製；カルボジライトＶ－０２）２．０部とを混合し、エタノール１６．０部で希釈し、１０％塗液を調製し、バイオフィルム形成抑制コート剤１を得た。
<Adjustment of biofilm formation suppression coating agent>
[Example 3-1]
(Biofilm formation suppression coating agent 1)
4.0 parts of the obtained amine oxide group-containing polymer solution (P-1) and 2.0 parts of V-02 (manufactured by Nisshinbo Co., Ltd.; Carbodilite V-02) as a cross-linking agent were mixed, and 16.0 parts of ethanol was added. A 10% coating solution was prepared by diluting with 0 parts to obtain a coating agent 1 for inhibiting biofilm formation.
［実施例３－２～３－１５、３－１７～３－２６］
（バイオフィルム形成抑制コート剤２～１５、１７～２６）
実施例１と同様にして、表３－２の組成及び仕込み質量部にてバイオフィルム形成抑制コート剤２～１５、１７～２６を調整した。
[Examples 3-2 to 3-15, 3-17 to 3-26]
(Biofilm formation inhibitor coating agents 2 to 15, 17 to 26)
In the same manner as in Example 1, biofilm formation suppression coating agents 2 to 15 and 17 to 26 were prepared with the composition and charged mass parts shown in Table 3-2.
［実施例３－１６］
（バイオフィルム形成抑制コート剤１６）
得られたアミンオキシド基含有ポリマー（Ｐ－１２）４．０部をエタノール１６部で希釈し、１０％塗液を調製し、バイオフィルム形成抑制コート剤１６を得た。
[Example 3-16]
(Biofilm formation suppression coating agent 16)
4.0 parts of the resulting amine oxide group-containing polymer (P-12) was diluted with 16 parts of ethanol to prepare a 10% coating solution, and a biofilm formation-inhibiting coating agent 16 was obtained.
以下に、表３－２中の略称を示す。
Ｖ－０２：カルボジイミド基含有化合物（日清紡（株）製；カルボジライトＶ－０２）
Ｖ－１０：カルボジイミド基含有化合物（日清紡（株）製；カルボジライトＶ－１０）
Ｖ－０９：イソシアネート基含有化合物（日清紡（株）製；カルボジライトＶ－０９）
ＭＤＩ：イソシアネート含有化合物（２，２’－ジフェニルメタンジイソシアネート）
４０Ｅ：エポキシ基含有化合物（共栄社化学（株）製；エポライト４０Ｅ）
ＬＶ１１：アミノ基含有化合物（三菱ケミカル（株）製；エポキシ樹脂硬化剤ｊＥＲキュア）
ＥｔＯＨ：エタノール
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
Abbreviations in Table 3-2 are shown below.
V-02: Carbodiimide group-containing compound (manufactured by Nisshinbo; Carbodilite V-02)
V-10: Carbodiimide group-containing compound (manufactured by Nisshinbo; Carbodilite V-10)
V-09: isocyanate group-containing compound (manufactured by Nisshinbo Corp.; Carbodilite V-09)
MDI: isocyanate-containing compound (2,2'-diphenylmethane diisocyanate)
40E: Epoxy group-containing compound (manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd.; Epolite 40E)
LV11: amino group-containing compound (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation; epoxy resin curing agent jER cure)
EtOH: ethanol EtOAc: ethyl acetate
＜バイオフィルム形成抑制コート剤の評価＞
実施例及び比較例で得られたバイオフィルム形成抑制コート剤（塗液）について、以下の評価を行った。結果を表３－３に示す。
<Evaluation of biofilm formation inhibitor coating agent>
The biofilm formation-inhibiting coating agents (coating liquids) obtained in Examples and Comparative Examples were evaluated as follows. The results are shown in Table 3-3.
［耐水性］
得られたコート剤を、精密秤量した浅型金属容器に２．０ｇ添加し、１５０℃で１０分加熱し乾燥させた。オーブンから取り出し、浅型金属容器ごと精密秤量した後、浅型金属容器にイオン交換水５．０ｇを加え一晩静置した。浅型金属容器からイオン交換水を吸引排出した後、再度１５０℃で１０分乾燥し、浅型金属容器を精密秤量した。下記式で水への溶解度を算出し、耐水性を４段階の評価基準に基づいて評価した。
水への溶解度（％）＝１００－［（ｚ－ｘ）／（ｙ－ｘ）］×１００
ｘ：浅型金属容器の質量（ｇ）
ｙ：イオン交換水で処理する前の質量（ｇ）
ｚ：イオン交換水で処理した後の質量（ｇ）
◎：水への溶解度≦２％：非常に良好
○：２％＜水への溶解度≦４％：良好
△：４％＜水への溶解度≦１０％：使用可能
×：１０％＜水への溶解度：使用不可
[water resistant]
2.0 g of the resulting coating agent was added to a precisely weighed shallow metal container and dried by heating at 150° C. for 10 minutes. After taking out from the oven and precisely weighing together with the shallow metal container, 5.0 g of ion-exchanged water was added to the shallow metal container and allowed to stand overnight. After the ion-exchanged water was sucked out from the shallow metal container, it was again dried at 150° C. for 10 minutes, and the shallow metal container was precisely weighed. The solubility in water was calculated by the following formula, and the water resistance was evaluated based on the four-level evaluation criteria.
Water solubility (%) = 100-[(zx)/(yx)] x 100
x: mass of shallow metal container (g)
y: Mass (g) before treatment with ion-exchanged water
z: Mass (g) after treatment with ion-exchanged water
◎: water solubility ≤ 2%: very good ○: 2% < water solubility ≤ 4%: good △: 4% < water solubility ≤ 10%: usable ×: 10% < water solubility Solubility: not available
＜バイオフィルム形成抑制積層体の製造と評価＞
得られたコート剤１－２６を、各々７５μｍ厚ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム（パナック（株）製；ルミラー＃７５、表面オゾン処理済）上に、乾燥後膜厚が１．０μｍになるようバーコーターで塗工し、８０℃で２分乾燥した後、８０℃で２４時間加熱し、積層体１－２６を得た。別途、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ ２５９２３）を、３７℃で２４時間前培養し、増殖させた。菌液をリン酸緩衝水（ＰＢＷ）に加えて、１％菌液を調製した。
得られた積層体を、１．５ｃｍ×１．５ｃｍの大きさに切り取り、塗工面が上向きになるように２４ウェルマイクロプレート（ファルコン社製）の各ウェルに１枚ずつセットし、滅菌水１．０ｍＬ加え、３７℃で２４時間浸漬した。
次いで、２４ウェルマイクロプレートから、滅菌水１．０ｍＬを除去し、別途調製した黄色ブドウ球菌液１．０ｍＬを加え、２５℃で２４時間又は２５℃で１６８時間、それぞれ培養した。２４時間又は１６８時間培養後、菌液を除去し、塗膜を滅菌水１．２ｍＬで３回洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット水溶液（和光純薬工業株式会社製）を添加し、２０分間静置してバイオフィルムを染色した。その後、滅菌水１．２ｍＬで３回洗浄し、風乾して、バイオフィルムが染色された積層体を得た。
上記染色された積層体について、３３％酢酸溶液２．０ｍＬを用いてクリスタルバイオレットを抽出し、マイクロプレートリーダーを用いて、抽出液の吸光度を測定した。
バイオフィルム形成抑制性を、吸光度から以下の４段階の評価基準で評価した。結果を表３－３に示す。
◎：吸光度≦０．１０：非常に良好
○：０．１０＜吸光度≦０．１３：良好
△：０．１３＜吸光度≦０．２０：使用可能
×：０．２０＜吸光度：使用不可
<Production and evaluation of biofilm formation suppressing laminate>
Each of the obtained coating agents 1-26 was coated on a 75 μm thick polyethylene terephthalate (PET) film (manufactured by Panac Co., Ltd.; Lumirror #75, surface ozone-treated) and coated with a bar so that the film thickness after drying was 1.0 μm. After coating with a coater and drying at 80° C. for 2 minutes, it was heated at 80° C. for 24 hours to obtain Laminate 1-26. Separately, Staphylococcus aureus (ATCC 25923) was pre-incubated for 24 hours at 37° C. and grown. The bacterial solution was added to phosphate buffered water (PBW) to prepare a 1% bacterial solution.
The resulting laminate was cut into a size of 1.5 cm x 1.5 cm, and placed in each well of a 24-well microplate (manufactured by Falcon) so that the coated surface faces upward. 0 mL was added and immersed at 37° C. for 24 hours.
Then, 1.0 mL of sterilized water was removed from the 24-well microplate, 1.0 mL of separately prepared Staphylococcus aureus solution was added, and cultured at 25° C. for 24 hours or 25° C. for 168 hours. After culturing for 24 hours or 168 hours, remove the bacterial solution, wash the coating film with 1.2 mL of sterile water three times, add 0.1% crystal violet aqueous solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and continue for 20 minutes. The biofilm was stained on standing. Then, it was washed with 1.2 mL of sterilized water three times and air-dried to obtain a biofilm-stained laminate.
Crystal violet was extracted from the stained laminate using 2.0 mL of a 33% acetic acid solution, and the absorbance of the extract was measured using a microplate reader.
The biofilm formation inhibitory property was evaluated from the absorbance according to the following four stages of evaluation criteria. The results are shown in Table 3-3.
◎: absorbance ≤ 0.10: very good ○: 0.10 < absorbance ≤ 0.13: good △: 0.13 < absorbance ≤ 0.20: usable ×: 0.20 < absorbance: not usable
表３－３から、比較例１で用いたポリマーは、アミンオキシド基を有していないため、培養２４時間後、及び、１６８時間後のバイオフィルム形成抑制性が乏しかった。比較例３－２で用いたポリマーは、分子量が小さく、コーティングしたポリマーが剥がれ落ちたため、培養２４時間後のバイオフィルム形成抑制性が乏しかった。比較例３－３で用いたポリマーは、３級アミノ基を有するがアミンオキシドを含有しないポリマーであるため、バイオフィルム形成抑制性を示さなかった。比較例３－４で用いたポリマーは、４級アミノ基を有するがアミンオキシドを含有しないポリマーであるため、バイオフィルム形成抑制性を示さなかった。
一方、アミンオキシド基を含み、かつ、質量平均分子量が２，０００～１０，０００，０００であるポリマーを含むバイオフィルム形成抑制コート剤は、耐水性に優れ、かつ、長期的なバイオフィルム形成抑制性能で優れた効果を示すことが確認された。特に、ポリマー（ａ）中のアミンオキシド基含有量が、０．２５～５ｍｍｏｌ／ｇであると、長時間水中に浸漬しても最適なバイオフィルム形成抑制能を維持することを確認した。中でも、０．５～２ｍｍｏｌ／ｇである場合に、非常に優れた長期的なバイオフィルム形成抑制能を発揮した。また、架橋性基を有するモノマー（Ｂ）としてカルボキシル基含有モノマーを用いた場合に、耐水性及び長期バイオフィルム形成抑制能に優れることが示された。
From Table 3-3, since the polymer used in Comparative Example 1 does not have an amine oxide group, the biofilm formation inhibitory property was poor after 24 hours and 168 hours of culture. The polymer used in Comparative Example 3-2 had a small molecular weight, and the coating polymer was peeled off, so the biofilm formation suppression property was poor after 24 hours of culture. Since the polymer used in Comparative Example 3-3 has a tertiary amino group but does not contain an amine oxide, it did not exhibit biofilm formation inhibitory properties. Since the polymer used in Comparative Example 3-4 has a quaternary amino group but does not contain an amine oxide, it did not exhibit biofilm formation inhibitory properties.
On the other hand, the biofilm formation suppression coating agent containing a polymer having an amine oxide group and a mass average molecular weight of 2,000 to 10,000,000 has excellent water resistance and long-term biofilm formation suppression. It was confirmed that excellent effects were exhibited in terms of performance. In particular, it was confirmed that when the amine oxide group content in the polymer (a) is 0.25 to 5 mmol/g, the optimum biofilm formation suppressing ability is maintained even when immersed in water for a long period of time. Among them, when it was 0.5 to 2 mmol/g, a very excellent long-term biofilm formation suppressing ability was exhibited. In addition, it was shown that when a carboxyl group-containing monomer was used as the monomer (B) having a crosslinkable group, excellent water resistance and long-term biofilm formation suppression ability were obtained.
＜＜細胞培養器材処理剤の実施例＞＞
＜質量平均分子量（Ｍｗ）の測定方法＞
ポリマー（ａ）の質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては、下記条件１によることを基本とし、試料の溶解性等により条件２とした。ただし、重合体種によっては、さらに適宜適切なキャリア（溶離液）及びそれに適合したカラムを選定した。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２－１～４：２００８に基づいた。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定した。
また、ポリマー（ａ）の分子量測定が困難な場合は、アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量をポリマー（ａ）の質量平均分子量とした。アミンオキシド前駆体ポリマーの質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用し、測定装置及び測定条件としては、下記条件３によった。
（条件１）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺＭ－Ｈ、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ４０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ２０００を連結したもの。
キャリア：テトラヒドロフラン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷＭ－Ｈを２本連結したもの。
キャリア：１０ｍＭＬｉＢｒ／Ｎ－メチルピロリドン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件３）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
<<Example of cell cultureware treatment agent>>
<Method for measuring mass average molecular weight (Mw)>
The mass average molecular weight of polymer (a) was measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene. The measurement apparatus and measurement conditions were based on condition 1 below, and condition 2 was selected depending on the solubility of the sample and the like. However, depending on the type of polymer, a more appropriate carrier (eluent) and a column compatible with it were selected. Other matters were based on JISK7252-1 to 4:2008. For poorly soluble polymer compounds, measurements were made at a soluble concentration under the following conditions.
Moreover, when the molecular weight measurement of the polymer (a) is difficult, the weight average molecular weight of the amine oxide precursor polymer was used as the weight average molecular weight of the polymer (a). The mass-average molecular weight of the amine oxide precursor polymer employs a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene.
(Condition 1)
Column: TOSOHTSKgelSuperHZM-H,
A combination of TOSOHTSKgelSuperHZ4000 and TOSOHTSKgelSuperHZ2000.
Carrier: Tetrahydrofuran Measuring temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
(Condition 2)
Column: Two columns of TOSOHTSKgelSuperAWM-H are connected.
Carrier: 10 mM LiBr/N-methylpyrrolidone Measurement temperature: 40°C
Carrier flow rate: 1.0 mL/min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
(Condition 3)
Column: TOSOH TSKgel Super AW4000,
A concatenation of TOSOHTSKgelSuperAW3000 and TOSOHTSKgelSuperAW2500.
Carrier: N,N-dimethylformamide (1 L), triethylamine (3.04 g), LiBr (0.87 g) mixed liquid Measurement temperature: 40 ° C.
Carrier flow rate: 0.6 mL/min
＜アミンオキシド基含有ビニル系ポリマーの合成＞
（ポリマー（Ｐ－１））
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、酢酸エチル１００部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、２，２’－アゾジイソブチロニトリルを１．５部、３級アミノ基含有モノマー（Ａ）としてＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートを５０部、他のモノマー（Ｃ）としてブチルアクリレート４５部を混合したもの、架橋性基含有モノマー（Ｂ）としてアクリル酸５部を混合したものを、内温を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに２時間撹拌を続けた。固形分測定によって転化率が９８％超えたことを確認後、冷却して３級アミノ基を有するポリマーの溶液を得た。
次に、得られた３級アミノ基を有するポリマーの溶液に、オキシド化剤として３５％過酸化水素水を３０．９部（用いたＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレートと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることでアミノ基のオキシド化を行った。アミンオキシド変換率が９８％を超えたことを確認後、冷却して取り出し、その後、ダイヤフラムポンプで溶媒を完全に揮発させ、アミンオキシド基含有ポリマー（Ｐ－１）を得た。
得られた（Ｐ－１）のアミンオキシド基含有量は、加えたＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート量と前述の数式１から３．０ｍｍｏｌ／ｇであった。また、得られたポリマーの質量平均分子量をＧＰＣにより測定したところ、１３１，３００であった。
<Synthesis of amine oxide group-containing vinyl-based polymer>
(Polymer (P-1))
A reaction vessel equipped with a stirrer, a thermometer, a dropping funnel and a reflux vessel was charged with 100 parts of ethyl acetate, the internal temperature was raised to 75° C., and the inside was sufficiently replaced with nitrogen. Separately prepared, 1.5 parts of 2,2'-azodiisobutyronitrile, 50 parts of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate as a tertiary amino group-containing monomer (A), other monomers (C) A mixture of 45 parts of butyl acrylate and a mixture of 5 parts of acrylic acid as a crosslinkable group-containing monomer (B) were added dropwise for 3 hours while maintaining the internal temperature at 75 ° C., and stirring was continued for 2 hours. . After confirming that the conversion rate exceeded 98% by measuring the solid content, the solution was cooled to obtain a polymer solution having a tertiary amino group.
Next, 30.9 parts of 35% aqueous hydrogen peroxide as an oxidizing agent (equimolar amount of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate used) was added to the resulting polymer solution having a tertiary amino group, The amino group was oxidized by reacting at 70° C. for 16 hours. After confirming that the amine oxide conversion rate exceeded 98%, it was cooled and taken out, and then the solvent was completely volatilized with a diaphragm pump to obtain an amine oxide group-containing polymer (P-1).
The amine oxide group content of the obtained (P-1) was 3.0 mmol/g based on the amount of N,N-dimethylaminoethyl methacrylate added and Equation 1 above. Moreover, when the mass average molecular weight of the obtained polymer was measured by GPC, it was 131,300.
（ポリマー（Ｐ－２～９、１１））
ポリマー（Ｐ－１）と同様の方法で、表１の組成及び仕込み質量部に従って合成を行い、ポリマー（Ｐ－２～９、１１）を得た。
(Polymer (P-2 to 9, 11))
Polymers (P-2 to 9, 11) were obtained by synthesizing in the same manner as the polymer (P-1) according to the composition and charged mass parts shown in Table 1.
（ポリマー（Ｐ－１０））
ガス導入管、温度計、コンデンサー、攪拌機を備えた反応容器に、１－ブタノール９８．０ 部を仕込み、窒素ガスで置換した。反応容器内を１１０℃に加熱して、ブチルアク
リレート２０部、スチレン５０部、アクリル酸３０部、及び２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）１部の混合物を２時間かけて滴下し、重合反応を行った。滴下終了後、さらに１１０℃で３時間反応させた後、固形分測定によって転化率が９８％超えたことを確認後、室温まで冷却し反応を停止した。その後、ダイヤフラムポンプで１－ブタノールを除去し、ポリマー（Ｐ－１０）を得た。また、得られたポリマーの質量平均分子量は、１３３，０００であった。
(Polymer (P-10))
A reaction vessel equipped with a gas inlet tube, a thermometer, a condenser and a stirrer was charged with 98.0 parts of 1-butanol and purged with nitrogen gas. The inside of the reaction vessel is heated to 110° C., and a mixture of 20 parts of butyl acrylate, 50 parts of styrene, 30 parts of acrylic acid, and 1 part of 2,2′-azobis(isobutyronitrile) is added dropwise over 2 hours, A polymerization reaction was carried out. After completion of the dropwise addition, the mixture was further reacted at 110° C. for 3 hours, and after confirming that the conversion rate exceeded 98% by solid content measurement, the reaction was stopped by cooling to room temperature. After that, 1-butanol was removed with a diaphragm pump to obtain a polymer (P-10). Moreover, the mass average molecular weight of the obtained polymer was 133,000.
表４－１中の略称を以下に示す。
ＤＭＡＥＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリレート
ＤＥＡＥＭＡ：Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＤＭＡＰＡＡ：ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＶＰ：２－ビニルピリジン
ＶＩ：１－ビニルイミダゾール
ＤＣＰＡ：ジシクロペンテニルオキシエチルアクリレ－ト
ＢＡ：ブチルアクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＭＥＡ：２－メトキシエチルアクリレート
ＡＡ：アクリル酸
ＨＥＡ：２－ヒドロキシエチルアクリレート
ＡＩＢＮ：２,２'-アゾジイソブチロニトリル
ＨＰＯ：３５％過酸化水素
Abbreviations in Table 4-1 are shown below.
DMAEMA: N,N-dimethylaminoethyl methacrylate DEAEMA: N,N-diethylaminoethyl methacrylate DMAPAA: dimethylaminopropyl acrylamide VP: 2-vinylpyridine VI: 1-vinylimidazole DCPA: dicyclopentenyloxyethyl acrylate BA: Butyl acrylate St: styrene MEA: 2-methoxyethyl acrylate AA: acrylic acid HEA: 2-hydroxyethyl acrylate AIBN: 2,2'-azodiisobutyronitrile HPO: 35% hydrogen peroxide
＜細胞培養器材処理剤の製造＞
［実施例４－１］
（細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１））
得られたポリマー（Ｐ－１）１０．０部と、架橋剤としてカルボジイミド基含有化合物（日清紡ホールディングス（株）製；カルボジライトＶ－０２）５．０部とをエタノールで希釈して１０％溶液を調製し、細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１）を得た。
<Production of cell cultureware treatment agent>
[Example 4-1]
(Cell cultureware treatment agent (PC-1))
10.0 parts of the resulting polymer (P-1) and 5.0 parts of a carbodiimide group-containing compound (manufactured by Nisshinbo Holdings Inc.; Carbodilite V-02) as a cross-linking agent were diluted with ethanol to form a 10% solution. A cell cultureware treatment agent (PC-1) was obtained.
［実施例４－２～４－９、比較例４－１～４－２］
（細胞培養器材処理剤（ＰＣ－２～１１））
表２の組成及び仕込み質量部に変更した以外は（ＰＣ－１）と同様にして、細胞培養器材処理剤（ＰＣ－２～１１）を調整した。
[Examples 4-2 to 4-9, Comparative Examples 4-1 to 4-2]
(Cell cultureware treatment agent (PC-2 to 11))
Cell cultureware treatment agents (PC-2 to 11) were prepared in the same manner as (PC-1), except that the compositions and charged mass parts were changed to those shown in Table 2.
＜細胞培養器材処理剤の評価＞
得られた細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１～１１）について、以下の評価を実施した。結果を表２に示す。
<Evaluation of cell cultureware treatment agent>
The following evaluations were performed on the obtained cell cultureware treatment agents (PC-1 to 11). Table 2 shows the results.
［評価項目１．＜耐水性＞］
細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１～１１）を、精密秤量した浅型金属容器に２．０ｇ添加し、１５０℃で１０分加熱し乾燥させた。オーブンから取り出し、浅型金属容器ごと精密秤量した後、浅型金属容器にイオン交換水５．０ｇを加え一晩静置した。浅型金属容器からイオン交換水を吸引排出した後、再度１５０℃で１０分乾燥し、浅型金属容器を精密秤量した。下記式で水への溶解度を算出し、耐水性を４段階の評価基準に基づいて評価した。耐水性が高いほど耐久性が良好である。
水への溶解度（％）＝１００－［（ｚ－ｘ）／（ｙ－ｘ）］×１００
ｘ：浅型金属容器の質量（ｇ）
ｙ：イオン交換水で処理する前の質量（ｇ）
ｚ：イオン交換水で処理した後の質量（ｇ）
（評価基準）
◎：水への溶解度≦２％：非常に良好
○：２％＜水への溶解度≦４％：良好
△：４％＜水への溶解度≦１０％：使用可能
×：１０％＜水への溶解度：使用不可
[Evaluation item 1. <Water resistance>]
2.0 g of the cell cultureware treatment agent (PC-1 to 11) was added to a precisely weighed shallow metal container and dried by heating at 150° C. for 10 minutes. After taking out from the oven and precisely weighing together with the shallow metal container, 5.0 g of ion-exchanged water was added to the shallow metal container and allowed to stand overnight. After the ion-exchanged water was sucked out from the shallow metal container, it was again dried at 150° C. for 10 minutes, and the shallow metal container was precisely weighed. The solubility in water was calculated by the following formula, and the water resistance was evaluated based on the four-level evaluation criteria. The higher the water resistance, the better the durability.
Water solubility (%) = 100-[(zx)/(yx)] x 100
x: mass of shallow metal container (g)
y: Mass (g) before treatment with ion-exchanged water
z: Mass (g) after treatment with ion-exchanged water
(Evaluation criteria)
◎: water solubility ≤ 2%: very good ○: 2% < water solubility ≤ 4%: good △: 4% < water solubility ≤ 10%: usable ×: 10% < water solubility Solubility: not available
表４－２中の略称を以下に示す。
Ｖ－０２：カルボジイミド基含有化合物（日清紡ホールディングス（株）製；カルボジライトＶ－０２）
Ｖ－１０：カルボジイミド基含有化合物（日清紡ホールディングス（株）製；カルボジライトＶ－１０）
ＭＤＩ：イソシアネート含有化合物（２，２’－ジフェニルメタンジイソシアネート）
Abbreviations in Table 4-2 are shown below.
V-02: Carbodiimide group-containing compound (manufactured by Nisshinbo Holdings Inc.; Carbodilite V-02)
V-10: Carbodiimide group-containing compound (manufactured by Nisshinbo Holdings Inc.; Carbodilite V-10)
MDI: isocyanate-containing compound (2,2'-diphenylmethane diisocyanate)
＜細胞培養器材の製造と評価＞
得られた細胞培養器材処理剤を用いて以下のとおり細胞培養器材を作製した。また得られた細胞培養器材について、以下の評価を行った。結果を表４－３～４－５に示す。
<Manufacturing and evaluation of cell cultureware>
A cell culture ware was prepared as follows using the obtained cell culture ware treatment agent. Moreover, the following evaluation was performed about the obtained cell cultureware. The results are shown in Tables 4-3 to 4-5.
［実施例４－１０～４－１８、比較例４－３、４－４］
（細胞培養器材（Ｄ－１～１１））
Ｕ字底９６ウェルプレートに、細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１～１１）を各ウェルに約０．５ｍｌずつ注入した。これを吸引排出した後、５０℃ で３時間乾燥させることにより、ウェルプレート内部が細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１～１１）で被覆された、細胞培養器材（Ｄ－１～１１）を作製した。
[Examples 4-10 to 4-18, Comparative Examples 4-3, 4-4]
(Cell cultureware (D-1 to 11))
About 0.5 ml of cell cultureware treatment agents (PC-1 to 11) were injected into each well of a U-bottomed 96-well plate. After sucking and discharging this, the well plate was dried at 50°C for 3 hours to prepare cell cultureware (D-1 to 11) in which the inside of the well plate was coated with the cell cultureware treatment agent (PC-1 to 11). did.
［評価項目２．＜スフェロイド形成試験＞］
細胞培養器材（Ｄ－１～１１）をエチレンオキサイドガス滅菌した後、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを培地とし、マウス線維芽細胞用細胞株（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）を１ウェルあたり１×１０4個播種し、５％ＣＯ2／３７℃のインキュベーターで５日目まで培養し、５日後の細胞培養状態を透過式光学顕微鏡４０倍で写真撮影し、細胞の形態を観察することによって評価した。
（評価基準）
○：１つのスフェロイドを形成
△：複数個のスフェロイドを形成
×：スフェロイドを形成しない
[Evaluation item 2. <Spheroid formation test>]
After sterilizing the cell culture equipment (D-1 to 11) with ethylene oxide gas, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) was added with 10% fetal bovine serum (FBS) as a medium, and cell lines for mouse fibroblasts ( NIH/3T3 cells) were seeded at 1×10 4 cells per well, cultured in an incubator at 5% CO 2 /37° C. until day 5, and the state of cell culture after 5 days was photographed with a transmission optical microscope at a magnification of 40. and evaluated by observing cell morphology.
(Evaluation criteria)
○: Forms one spheroid △: Forms multiple spheroids ×: Does not form spheroids
［実施例４－１９～４－２７、比較例４－５、４－６］
（細胞培養器材（Ｄ－１２～２２））
スライドガラス上に、細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１～１１）を、膜厚１．０μｍになるようにスピンコートし、９０℃２分加熱処理して、ガラス上に細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１～１１）で被覆された、細胞培養器材（Ｄ－１２～２２）を得た。
[Examples 4-19 to 4-27, Comparative Examples 4-5, 4-6]
(Cell cultureware (D-12 to 22))
On a slide glass, the cell cultureware treatment agent (PC-1 to 11) was spin-coated so that the film thickness was 1.0 μm, and heat-treated at 90° C. for 2 minutes to apply the cell cultureware treatment agent (PC-1 to 11) on the glass. Cell cultureware (D-12 to 22) coated with PC-1 to 11) were obtained.
［評価項目３．＜水との接触角＞］
得られた細胞培養器材（Ｄ－１２～２２）の細胞培養器材処理剤塗工面について、水との接触角を、ＪＩＳＫ ６７８８（ＩＳＯ８２９６）に基づいて測定した。
[Evaluation item 3. <Contact angle with water>]
The contact angle with water of the surface of the obtained cell cultureware (D-12 to D-22) coated with the treatment agent was measured according to JISK 6788 (ISO8296).
［評価項目４．＜抗体蛋白質吸着性＞］
Ｕ字の２４ウェルプレートに、細胞培養器材（Ｄ－１～１１）を１１ｍｍ角にカットして入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１００００倍希釈したＨＰＲ-ＩｇＧ溶液１
ｍｌを添加して浸漬させた。室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ-Ｔ（０．１％
Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて各ウェルを４回洗浄した。染色液を各ウェルに１ｍｌずつ分注し、室温で１０分間インキュベートした後、反応停止液を各ウェルに１ｍｌずつ分注後、４５０ｎｍ（副波長６５０ｎｍ）の吸光度Ａλを、ＭＩＴＨＲＡＳ２ ＬＤ９４３－Ｍ２Ｍマイクロプレートリーダーを用いて測定した。吸光度Ａλが小さいほど抗体蛋白質吸着性が低く良好である。以下の基準で評価した。
染色液：ＴＭＢＺ溶液（３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン）
反応停止液：タカラバイオ社製 ＷＡＳＨ ａｎｄ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ Ｗｉｔｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｓｕｌｆｕｒｉｃ Ａｃｉｄ
ＨＰＲ-ＩｇＧ：酵素、抗体（ＨＯＲＳＥＲＡＤＩＨ ＰＥＲＯＸＩＤＡＳＥ ＩＭＭＵ
ＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮＧ）
ＰＢＳ-Ｔ：ＰＢＳに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を添加したもの
（評価基準）
◎：Ａλ≦０．２（極めて良好）
○：０．２＜Ａλ≦０．６（良好）
△：０．６＜Ａλ≦０．８（使用可能）
×：０．８＜Ａλ（不良）
[Evaluation item 4. <Antibody protein adsorption>]
HPR-IgG solution 1 diluted 10,000-fold with phosphate-buffered saline (PBS) by cutting the cell cultureware (D-1 to 11) into 11 mm squares and placing them in a U-shaped 24-well plate
ml was added and allowed to soak. After incubating for 1 hour at room temperature, PBS-T (0.1%
Each well was washed 4 times with Tween 20). Dispense 1 ml of the staining solution into each well and incubate at room temperature for 10 minutes. After distributing 1 ml of the reaction stopping solution into each well, absorbance Aλ at 450 nm (sub-wavelength 650 nm) was measured in a MITHRAS2 LD943-M2M microplate. Measured using a reader. The smaller the absorbance Aλ, the lower the antibody protein adsorption and the better. Evaluation was made according to the following criteria.
Staining solution: TMBZ solution (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)
Reaction stop solution: WASH and Stop Solution For ELISA With Solution for ELISA without Sulfuric Acid manufactured by Takara Bio Inc.
HPR-IgG: enzyme, antibody (HORSERADIH PEROXIDASE IMMU
NO GLOBULING)
PBS-T: PBS with 0.1% Tween 20 added (evaluation criteria)
◎: A ≤ 0.2 (extremely good)
○: 0.2 < Aλ ≤ 0.6 (good)
△: 0.6 < Aλ ≤ 0.8 (usable)
×: 0.8<Aλ (defective)
［実施例４－２８～４－３６、比較例４－７、４－８］
（細胞培養器材（Ｄ－２３～３３））
幅２００μｍ、高さ５０μｍの流路を有するＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）製標準チップ（フルイドウェアテクノロジーズ社製）流路に、細胞培養器材処理剤（ＰＣ－１～１１）を流し込み、５０℃加熱した状態で４時間精置した後、純水で３回、ＰＢＳ（林純薬工業株式会社製；リン酸緩衝生理食塩水）で１回洗浄し、未吸着成分を除去して、細胞培養器材（Ｄ－２３～３３）を得た。
[Examples 4-28 to 4-36, Comparative Examples 4-7, 4-8]
(Cell cultureware (D-23 to 33))
A cell cultureware treatment agent (PC-1 to 11) was poured into a PDMS (polydimethylsiloxane) standard chip (manufactured by Fluidware Technologies) flow path having a width of 200 μm and a height of 50 μm, and heated at 50 ° C. After leaving for 4 hours in this state, the cell cultureware ( D-23 to 33) were obtained.
［評価項目５．＜血液送液試験＞］
得られた細胞培養器材（Ｄ－２３～３３）において、血液検体を一定圧力下、２μＬ／ｍｉｎの入口スピードで１２分間送液し、送液直後から１分後の１分間に流路出口から流出した血液検体量と、送液開始５分後から６分後の１分間に流路出口から流出した血液検体量と、送液開始１０分後から１１分後の１分間に流路出口から流出した血液検体量と、をそれぞれ測定した。流出した血液検体量が多く、経時で減少せず一定であるほど良好である。
[Evaluation item 5. <Blood transfer test>]
In the obtained cell cultureware (D-23 to D-33), the blood sample was sent under a constant pressure at an inlet speed of 2 μL / min for 12 minutes, and 1 minute after 1 minute immediately after the liquid was sent, from the flow channel outlet The amount of blood sample that flowed out, the amount of blood sample that flowed out from the flow path outlet in 1 minute from 5 to 6 minutes after the start of liquid feeding, and the amount of blood sample that flowed out from the flow path outlet in 1 minute from 10 to 11 minutes after the start of liquid feeding. and the amount of blood sample that flowed out were measured, respectively. The more blood samples flowed out and the more constant it is without decreasing over time, the better.
表４－２～４－５に示すように、本発明の細胞培養器材処理剤は耐水性が高く、該処理剤を用いた細胞培養器材は、抗体蛋白質吸着性が抑えられており、優れた血液送液性を示した。特に、ビニル系ポリマーが架橋性基を有し且つ架橋剤を含む場合に、耐水性に優れていた。一方、数平均分子量が２，０００未満のポリマー（ａ）を用いた場合は耐水性が大きく劣る結果となった。また、特にアミンオキシド基含有量が０．５～５ｍｍｏｌ／ｇであると、蛋白質吸着抑制及び血液送液性に優れていた。
このように、本発明の細胞培養器材処理剤が耐水性に優れ、該処理剤を用いてなる細胞培養器材は、スフェロイド形成性が高く且つ優れた蛋白質、細胞接着防止効果を発揮し、血液送液性にも優れているため、メディカルデバイスとして有用であることが示された。
As shown in Tables 4-2 to 4-5, the cell cultureware treatment agent of the present invention has high water resistance, and the cell cultureware using the treatment agent has suppressed antibody protein adsorption, and is excellent. It showed blood transferability. In particular, the water resistance was excellent when the vinyl polymer had a crosslinkable group and contained a crosslinker. On the other hand, when the polymer (a) having a number average molecular weight of less than 2,000 was used, the water resistance was greatly inferior. In particular, when the amine oxide group content was 0.5 to 5 mmol/g, the inhibition of protein adsorption and blood transfer were excellent.
As described above, the agent for treating cell cultureware of the present invention has excellent water resistance, and the cell cultureware obtained by using the agent exhibits high spheroid formation, excellent protein and cell adhesion prevention effects, and blood transport. It was shown to be useful as a medical device because of its excellent liquid properties.
＜＜細胞培養培地添加剤の実施例＞＞
＜細胞培養培地添加剤の製造＞
［実施例５－１］
（細胞培養培地添加剤１）
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒として酢酸エチル１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてジメチルアミノプロピルアクリルアミドを８０質量部、ブチルアクリレートを２０質量部、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを０．５質量部、溶媒として酢酸エチルを１０質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後６時間加熱を継続した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、エタノール１５０部とオキシド化剤として３５％過酸化水素水を５０部（用いたジメチルアミノプロピルアクリルアミドと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることで３級アミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ－１）を得た。
得られたビニル系ポリマー（Ａ－１）のアミンオキシド基含有量は、加えたジメチルアミノプロピルアクリルアミド量と上述の数式１から４．７３ｍｍｏｌ／ｇであった。
次に、２５℃のリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳという）９９ｇ中に、得られたビニル系ポリマー（Ａ－１）を１ｇ入れて撹拌して溶解させた後、２５℃で２４時間放置して、ＰＢＳで１質量％に希釈された細胞培養培地添加剤１を得た。
その結果、ビニル系ポリマー（Ａ－１）の分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、ＰＢＳに対して可溶であることが示された。
<<Examples of cell culture medium additives>>
<Production of cell culture medium additives>
[Example 5-1]
(Cell culture medium additive 1)
A reaction vessel equipped with a thermometer, a stirrer, a nitrogen inlet tube, a reflux condenser and a dropping tube was charged with 150 parts by mass of ethyl acetate as an organic solvent under a nitrogen stream, and heated at 80° C. for 30 minutes while stirring. 80 parts by mass of dimethylaminopropyl acrylamide as monomers, 20 parts by mass of butyl acrylate, 0.5 parts by mass of azobisisobutyronitrile as a polymerization initiator, and 10 parts by mass of ethyl acetate as a solvent were added to a dropping tube for 2 hours. dripped over. Heating was continued for 6 hours after the end of dropping. After that, the reaction was stopped by cooling to room temperature.
Next, 150 parts of ethanol and 50 parts of 35% hydrogen peroxide solution as an oxidizing agent (equimolar amount of dimethylaminopropylacrylamide used) are added, and the mixture is reacted at 70° C. for 16 hours to oxidize the tertiary amino group. did Thereafter, the solvent was removed with a diaphragm pump to obtain a vinyl polymer (A-1) having an amine oxide group.
The amine oxide group content of the obtained vinyl-based polymer (A-1) was 4.73 mmol/g based on the amount of dimethylaminopropylacrylamide added and Equation 1 above.
Next, 1 g of the obtained vinyl polymer (A-1) was added to 99 g of phosphate-buffered saline (hereinafter referred to as PBS) at 25° C., stirred to dissolve, and then heated at 25° C. for 24 hours. On standing, cell culture medium additive 1 diluted to 1% by weight with PBS was obtained.
As a result, neither separation nor precipitation of the vinyl polymer (A-1) was observed, indicating that the vinyl polymer (A-1) was completely soluble and soluble in PBS.
［実施例５－２～５－１２、比較例５－１、５－２］
（細胞培養培地添加剤２～１４）
表５－１に示す組成に変更した以外は、細胞培養培地添加剤１と同様にして、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ－２～１２）及び、アミンオキシド基を有しないビニル系ポリマー（Ａ－１３、１４）を得た後、ＰＢＳに溶解させて、ＰＢＳで１質量％に希釈された細胞培養培地添加剤２～１４を得た。
なお、アミンオキシド基を有しないビニル系ポリマー（Ａ－１３、１４）は、オキシド化剤を反応させずに溶剤を除去した後、ＰＢＳで1質量％に希釈したところ、完全に溶解
せず、ＰＢＳに対して不溶であることが示されたが、上澄み部分を評価に用いた。
[Examples 5-2 to 5-12, Comparative Examples 5-1, 5-2]
(Cell culture medium additives 2 to 14)
Vinyl polymers having amine oxide groups (A-2 to 12) and vinyl polymers having no amine oxide groups in the same manner as cell culture medium additive 1, except that the compositions were changed to those shown in Table 5-1. After obtaining (A-13, 14), they were dissolved in PBS to obtain cell culture medium additives 2 to 14 diluted to 1% by mass with PBS.
The vinyl polymers (A-13, 14) having no amine oxide group did not dissolve completely when diluted to 1% by mass with PBS after removing the solvent without reacting with the oxidizing agent. Although shown to be insoluble in PBS, the supernatant portion was used for evaluation.
表５－１中の略称を以下に示す。
ＤＭＡＰＡＡ： ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＤＥＡＥＭＡ： ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＶＰ：ビニルピリジン
ＶＩ：ビニルイミダゾール
ＢＡ：ブチルメタクリレート
２ＥＨＡ： ２－エチルヘキシルアクリレート
ＩＳＴＡ：イソステアリルアクリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＡＡ：アクリル酸
ＨＥＡ：ヒドロキシエチルアクリレート
Abbreviations in Table 5-1 are shown below.
DMAPAA: dimethylaminopropyl acrylamide DEAEMA: diethylaminoethyl methacrylate VP: vinylpyridine VI: vinylimidazole BA: butyl methacrylate 2EHA: 2-ethylhexyl acrylate ISTA: isostearyl acrylate MMA: methyl methacrylate St: styrene AA: acrylic acid HEA: hydroxyethyl acrylate
＜細胞培養培地添加剤の評価＞
得られた細胞培養培地添加剤について、以下の評価を実施した。結果を表５－２に示す。
<Evaluation of cell culture medium additives>
The following evaluations were performed on the resulting cell culture medium additives. The results are shown in Table 5-2.
［細胞凝集塊の形成性］
培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを使用した（以下、「１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地」とも呼ぶ。）。１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地にマウス線維芽細胞用細胞株（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）を加え、ＮＩＨ／３Ｔ３の濃度が１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液１００μＬを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。さらに、得られた細胞培養培地添加剤を、ビニル系ポリマー（Ａ）の濃度が０．０５質量％及び０．５質量％になるようにそれぞれ添加し、ピペッティングした。その後、５％ＣＯ2／３７℃のインキュベーターで５日目まで培養した。細胞凝集塊の形成性は、５日目の細胞培養状態を透過式光学顕微鏡４０倍で写真撮影し、細胞の形態を目視観察することによって評価した。
ａ：１つのスフェロイドを形成 ：良好
ｂ：複数個のスフェロイドを形成 ：使用不可
ｃ：スフェロイドを形成しない ：不良
[Formation of cell aggregates]
The medium used was Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (hereinafter also referred to as "10% FBS-DMEM medium"). A mouse fibroblast cell line (NIH/3T3 cells) was added to a 10% FBS-DMEM medium to prepare a cell suspension with an NIH/3T3 concentration of 100,000 cells/ml. 100 μL of the resulting cell suspension was seeded into each well of a sterile polystyrene U-bottom 96-well plate. Furthermore, the resulting cell culture medium additives were added and pipetted so that the concentrations of the vinyl polymer (A) were 0.05% by mass and 0.5% by mass, respectively. Thereafter, the cells were cultured in a 5% CO 2 /37° C. incubator until day 5. The formation of cell aggregates was evaluated by photographing the state of cell culture on day 5 with a transmission optical microscope at a magnification of 40 and visually observing the morphology of the cells.
a: Forms one spheroid: Good b: Forms multiple spheroids: Unusable c: Does not form spheroids: Poor
［細胞のＡＴＰアッセイ］
上記５日目まで培養した細胞のＡＴＰ（アデノシン－５’－三リン酸）アッセイを行い、生細胞の割合を評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μｌのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００ｍｌの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。
生細胞の割合＝（培養５日後の発光量）／（細胞培養培地添加剤を加えずに５日間培養した際の発光量）×１００
ａ：５０％以上 ：良好
ｂ：２０％以上５０％未満 ：使用可能
ｃ：２０％未満 ：不良
[Cellular ATP assay]
ATP (adenosine-5'-triphosphate) assay was performed on the cells cultured up to the 5th day above to evaluate the percentage of viable cells. Specifically, 100 μl of ATP reagent (“Kagumi” ATP measurement reagent: manufactured by Toyo Benet Co., Ltd.) was added to the wells after culture, pipetted 5 times, and allowed to stand at room temperature for 5 minutes. - The cell lysate was dispensed onto another plate and stirred for 1 minute. The amount of luminescence was measured using Mithras LB940 (manufactured by Berthold).
Percentage of viable cells = (luminescence level after 5 days of culture)/(luminescence level when cultured for 5 days without addition of cell culture medium additives) x 100
a: 50% or more: good b: 20% or more and less than 50%: usable c: less than 20%: poor
表５－２に示すように、本発明の細胞培養培地添加剤を用いることで１つのスフェロイドを形成し、細胞凝集塊の形成性が良好であることが示された。また、ＡＴＰアッセイの結果、細胞死は起こっておらず、使用可能水準の生細胞数であることが示された。これは本発明の細胞培養培地添加剤に含まれるビニル系ポリマー（Ａ）がタンパク質と適切に吸着することで、細胞同士の接着が優先され、細胞と基材との接着性が阻害されたためであると考えられる。それに対して、アミンオキシド基を有しないビニル系ポリマーを使用した比較例５－１～５－２は、細胞凝集塊が形成されなかった。また、ＡＴＰアッセイの結果、生細胞の割合が大きく減っていた。これは、アミンオキシド基を有していないことにより、細胞の周囲の環境を適切に制御できなかったためであると考えられる。 As shown in Table 5-2, one spheroid was formed by using the cell culture medium additive of the present invention, indicating good cell aggregate formation. Moreover, the results of ATP assay showed that cell death did not occur and the number of viable cells was at a usable level. This is because the vinyl-based polymer (A) contained in the cell culture medium additive of the present invention properly adsorbs to proteins, giving priority to adhesion between cells and inhibiting adhesion between cells and substrates. It is believed that there is. In contrast, no cell aggregates were formed in Comparative Examples 5-1 and 5-2 using vinyl polymers having no amine oxide group. In addition, as a result of ATP assay, the proportion of viable cells was greatly reduced. This is probably because the environment around the cells could not be controlled appropriately due to the lack of an amine oxide group.
＜抗体産生細胞培養培地添加剤の製造＞
［実施例６－１］
（細胞培養培地添加剤１）
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒として酢酸エチル１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてジメチルアミノプロピルアクリルアミドを８０質量部、ブチルアクリレートを２０質量部、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを０．５質量部、溶媒として酢酸エチルを１０質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後６時間加熱を継続した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、エタノール１５０部とオキシド化剤として３５％過酸化水素水を５０部（用いたジメチルアミノプロピルアクリルアミドと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることで３級アミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ－１）を得た。
得られたビニル系ポリマー（Ａ－１）のアミンオキシド基含有量は、加えたジメチルアミノプロピルアクリルアミド量と上述の数式１から４．７３ｍｍｏｌ／ｇであった。
次に、２５℃のリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳという）９９ｇ中に、得られたビニル系ポリマー（Ａ－１）を１ｇ入れて撹拌して溶解させた後、２５℃で２４時間放置して、ＰＢＳで１質量％に希釈された細胞培養培地添加剤１を得た。
その結果、ビニル系ポリマー（Ａ－１）の分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、ＰＢＳに対して可溶であることが示された。
<Production of antibody-producing cell culture medium additive>
[Example 6-1]
(Cell culture medium additive 1)
A reaction vessel equipped with a thermometer, a stirrer, a nitrogen inlet tube, a reflux condenser and a dropping tube was charged with 150 parts by mass of ethyl acetate as an organic solvent under a nitrogen stream, and heated at 80° C. for 30 minutes while stirring. 80 parts by mass of dimethylaminopropyl acrylamide as monomers, 20 parts by mass of butyl acrylate, 0.5 parts by mass of azobisisobutyronitrile as a polymerization initiator, and 10 parts by mass of ethyl acetate as a solvent were added to a dropping tube for 2 hours. dripped over. Heating was continued for 6 hours after the end of dropping. After that, the reaction was stopped by cooling to room temperature.
Next, 150 parts of ethanol and 50 parts of 35% hydrogen peroxide solution as an oxidizing agent (equimolar amount of dimethylaminopropylacrylamide used) are added, and the mixture is reacted at 70° C. for 16 hours to oxidize the tertiary amino group. did Thereafter, the solvent was removed with a diaphragm pump to obtain a vinyl polymer (A-1) having an amine oxide group.
The amine oxide group content of the obtained vinyl-based polymer (A-1) was 4.73 mmol/g based on the amount of dimethylaminopropylacrylamide added and Equation 1 above.
Next, 1 g of the obtained vinyl polymer (A-1) was added to 99 g of phosphate-buffered saline (hereinafter referred to as PBS) at 25° C., stirred to dissolve, and then heated at 25° C. for 24 hours. On standing, cell culture medium additive 1 diluted to 1% by weight with PBS was obtained.
As a result, neither separation nor precipitation of the vinyl polymer (A-1) was observed, indicating that the vinyl polymer (A-1) was completely soluble and soluble in PBS.
［実施例６－２～６－１２、比較例６－１、６－２］
（細胞培養培地添加剤２～１４）
表６－１に示す組成に変更した以外は、細胞培養培地添加剤１（実施例６－１）と同様にして、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ－２～１２）及び、アミンオキシド基を有しないビニル系ポリマー（Ａ－１３、１４）を得た後、ＰＢＳに溶解させて、ＰＢＳで１質量％に希釈された細胞培養培地添加剤２～１４を得た。
なお、アミンオキシド基を有しないビニル系ポリマー（Ａ－１３、１４）は、オキシド化剤を反応させずに溶剤を除去した後、ＰＢＳで1質量％に希釈したところ、完全に溶解せず、ＰＢＳに対して不溶であることが示されたが、上澄み部分を評価に用いた。
[Examples 6-2 to 6-12, Comparative Examples 6-1, 6-2]
(Cell culture medium additives 2 to 14)
Vinyl-based polymers having amine oxide groups (A-2 to 12) and amine oxide in the same manner as cell culture medium additive 1 (Example 6-1), except that the composition was changed to that shown in Table 6-1. After obtaining vinyl-based polymers (A-13, 14) having no group, they were dissolved in PBS to obtain cell culture medium additives 2 to 14 diluted to 1% by mass with PBS.
The vinyl polymers (A-13, 14) having no amine oxide group did not dissolve completely when diluted to 1% by mass with PBS after removing the solvent without reacting with the oxidizing agent. Although shown to be insoluble in PBS, the supernatant portion was used for evaluation.
表６－１中の略称を以下に示す。
ＤＭＡＰＡＡ： ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＤＥＡＥＭＡ： ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＶＰ：ビニルピリジン
ＶＩ：ビニルイミダゾール
ＢＡ：ブチルメタクリレート
２ＥＨＡ： ２－エチルヘキシルアクリレート
ＩＳＴＡ：イソステアリルアクリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＡＡ：アクリル酸
ＨＥＡ：ヒドロキシエチルアクリレート
Abbreviations in Table 6-1 are shown below.
DMAPAA: dimethylaminopropyl acrylamide DEAEMA: diethylaminoethyl methacrylate VP: vinylpyridine VI: vinylimidazole BA: butyl methacrylate 2EHA: 2-ethylhexyl acrylate ISTA: isostearyl acrylate MMA: methyl methacrylate St: styrene AA: acrylic acid HEA: hydroxyethyl acrylate
＜抗体産生細胞培養培地添加剤の評価＞
得られた細胞培養培地添加剤について、以下の評価を実施した。結果を表６－２に示す。
<Evaluation of antibody-producing cell culture medium additives>
The following evaluations were performed on the resulting cell culture medium additives. The results are shown in Table 6-2.
［抗体産生細胞凝集物の発生抑制性］
培地はＤｙｎａｍｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製）を用い、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎを１質量％になるように添加した。以後、これを基礎培地と呼ぶ。これを２セット用意し、得られた抗体産生細胞培養培地添加剤をビニル系ポリマー（Ａ）の濃度が０．０５質量％又は０．５質量％になるようにそれぞれ添加した。ビニル系ポリマー（Ａ）の濃度が異なる２種の培地にそれぞれＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ製ＣＲＬ－１２４５５）を加え、ＣＨＯ細胞株の濃度が１，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液２０ｍＬを、１２５ｍＬの三角フラスコに播種し、３７℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に３～４日に一度、上澄み液１５ｍＬを回収し、新たな基礎培地１５ｍＬと交換し、これを５回繰り返した。
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性は、培地交換を５回繰り返した後の三角フラスコの液面付近を目視観察することによって評価した。
ａ：凝集物が三角フラスコの液面付近に発生していない ：良好
ｂ：凝集物が三角フラスコの液面付近に僅かに発生している ：使用可
ｃ：凝集物が三角フラスコの液面付近に一様に発生している ：使用不可
[Inhibition of generation of antibody-producing cell aggregates]
Dynamis Medium (manufactured by Gibco) was used as the medium, and L-glutamine was added to 1% by mass. Henceforth, this is called a basal medium. Two sets of this were prepared, and the obtained antibody-producing cell culture medium additive was added so that the concentration of the vinyl polymer (A) was 0.05% by mass or 0.5% by mass. A CHO cell line (CRL-12455 manufactured by ATCC) that introduces an IgG gene and secretes and produces an IgG antibody was added to each of two media with different concentrations of the vinyl polymer (A), and the concentration of the CHO cell line was 1,000. A cell suspension containing 000 cells/ml was prepared. 20 mL of the resulting cell suspension was seeded in a 125 mL Erlenmeyer flask and cultured at 37°C. During the culture, 15 mL of the supernatant was collected once every 3 to 4 days before the nutrient source was depleted and replaced with 15 mL of fresh basal medium, which was repeated 5 times.
The ability to suppress the development of antibody-producing cell aggregates was evaluated by visually observing the vicinity of the liquid surface in the Erlenmeyer flask after repeating medium exchange five times.
a: Aggregates are not generated near the liquid surface of the Erlenmeyer flask: Good b: Aggregates are slightly generated near the liquid surface of the Erlenmeyer flask: Usable c: Aggregates are near the liquid surface of the Erlenmeyer flask Uniformly occurring in : Unusable
［抗体生産性］
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性評価と同様にして細胞培養を行い、培地交換を５回繰り返した後の三角フラスコの上澄み液中の抗体量を、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＨｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔを用いて測定した。抗体産生細胞培養培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
ａ：１．２以上 ：良好
ｂ：１以上～１．２未満 ：使用可
ｃ：１未満 ：使用不可
[Antibody productivity]
Cell culture was performed in the same manner as in the antibody-producing cell aggregate development inhibitory evaluation, and the amount of antibody in the supernatant of the Erlenmeyer flask after repeating the medium exchange five times was measured using the Human IgG ELISA Quantitation Set manufactured by Bethyl Laboratories, Inc. was measured using The results were determined relative to the results obtained by culturing without the addition of antibody-producing cell culture medium additives as 1.
a: 1.2 or more: good b: 1 or more to less than 1.2: usable c: less than 1: unusable
表６－２に示すように、アミンオキシド基を有し、かつ、質量平均分子量が２，０００以上であるビニル系ポリマー（Ａ）を含む、本発明の抗体産生細胞培養培地添加剤を培地に添加することで、優れた抗体生産性を示した。また、培養中の抗体産生細胞凝集物の発生が抑制され、抗体の精製が容易となることが示された。これは、ビニル系ポリマー（Ａ）の極性が制御され、抗体産生細胞の周囲の環境を適切に制御したため抗体産生細胞の増殖性、生存性及び抗体生産性の面で有効に働いたためであると考えられる。
それに対して、アミンオキシド基を有しないビニル系ポリマーを使用した比較例６－１、６－２は、抗体産生細胞凝集物が三角フラスコ壁に付着した。また、抗体生産性を測定した結果、抗体量の割合が大きく減少していた。これは、アミンオキシド基を有していないことにより、細胞の周囲の環境を適切に制御できなかったためであると考えられる。
As shown in Table 6-2, the antibody-producing cell culture medium additive of the present invention containing a vinyl polymer (A) having an amine oxide group and a mass average molecular weight of 2,000 or more is added to the medium. By adding, excellent antibody productivity was shown. It was also shown that the generation of antibody-producing cell aggregates during culture was suppressed, facilitating antibody purification. This is because the polarity of the vinyl-based polymer (A) is controlled and the environment surrounding the antibody-producing cells is appropriately controlled, which works effectively in terms of the proliferation, viability, and antibody productivity of the antibody-producing cells. Conceivable.
On the other hand, in Comparative Examples 6-1 and 6-2 using a vinyl polymer having no amine oxide group, aggregates of antibody-producing cells adhered to the wall of the Erlenmeyer flask. Moreover, as a result of measuring the antibody productivity, the ratio of the amount of antibody was significantly decreased. This is probably because the environment around the cells could not be controlled appropriately due to the lack of an amine oxide group.
＜＜タンパク質安定化剤の実施例＞＞
＜ビニル系ポリマー（Ａ）の調製＞
［製造例１］
（ビニル系ポリマー（Ａ－１））
温度計、撹拌機、窒素導入管、還流冷却器、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒として酢酸エチル１５０質量部を仕込み、撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマーとしてジメチルアミノプロピルアクリルアミドを８０質量部、ブチルアクリレートを２０質量部、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを０．５質量部、溶媒として酢酸エチルを１０質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後６時間加熱を継続した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、エタノール１５０部とオキシド化剤として３５％過酸化水素水を５０部（用いたジメチルアミノプロピルアクリルアミドと等モル量）加え、７０℃で１６時間反応させることで３級アミノ基のオキシド化を行った。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ－１）を得た。
得られたビニル系ポリマーのアミンオキシド基含有量は、加えたジメチルアミノプロピルアクリルアミド量と上述の数式１から４．７３ｍｍｏｌ／ｇであった。
なお、２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に、得られたビニル系ポリマー（Ａ－１）を１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。
<<Example of Protein Stabilizer>>
<Preparation of Vinyl Polymer (A)>
[Production Example 1]
(Vinyl-based polymer (A-1))
A reaction vessel equipped with a thermometer, a stirrer, a nitrogen inlet tube, a reflux condenser and a dropping tube was charged with 150 parts by mass of ethyl acetate as an organic solvent under a nitrogen stream, and heated at 80° C. for 30 minutes while stirring. 80 parts by mass of dimethylaminopropyl acrylamide as monomers, 20 parts by mass of butyl acrylate, 0.5 parts by mass of azobisisobutyronitrile as a polymerization initiator, and 10 parts by mass of ethyl acetate as a solvent were added to a dropping tube for 2 hours. dripped over. Heating was continued for 6 hours after the end of dropping. After that, the reaction was stopped by cooling to room temperature.
Next, 150 parts of ethanol and 50 parts of 35% hydrogen peroxide solution as an oxidizing agent (equimolar amount of dimethylaminopropylacrylamide used) are added, and the mixture is reacted at 70° C. for 16 hours to oxidize the tertiary amino group. did Thereafter, the solvent was removed with a diaphragm pump to obtain a vinyl polymer (A-1) having an amine oxide group.
The amine oxide group content of the resulting vinyl-based polymer was 4.73 mmol/g based on the amount of dimethylaminopropylacrylamide added and Equation 1 above.
1 g of the obtained vinyl polymer (A-1) was added to 99 g of ion-exchanged water at 25° C., dissolved by stirring, and allowed to stand at 25° C. for 24 hours. As a result, neither separation nor precipitation was observed, indicating that these resins were completely soluble and water-soluble.
［製造例２～１４］
（ビニル系ポリマー（Ａ－２～１４））
表７－１に示す組成に変更した以外は、製造例１と同様にして、アミンオキシド基を有するビニル系ポリマー（Ａ－２～１２）及びアミンオキシド基を有しないビニル系ポリマー（Ａ－１３、１４）を得た。なお、ビニル系ポリマー（Ａ－１３、１４）は、オキシド化剤を反応させずに溶剤を除去したものである。
[Production Examples 2 to 14]
(Vinyl-based polymer (A-2 to 14))
Vinyl polymers having amine oxide groups (A-2 to 12) and vinyl polymers not having amine oxide groups (A-13) were prepared in the same manner as in Production Example 1, except that the compositions were changed to those shown in Table 7-1. , 14). The vinyl polymers (A-13, 14) were obtained by removing the solvent without reacting with the oxidizing agent.
表７－１中の略称を以下に示す。
ＤＭＡＰＡＡ： ジメチルアミノプロピルアクリルアミド
ＤＥＡＥＭＡ： ジエチルアミノエチルメタクリレート
ＶＰ：ビニルピリジン
ＶＩ：ビニルイミダゾール
ＢＡ：ブチルメタクリレート
２ＥＨＡ： ２－エチルヘキシルアクリレート
ＩＳＴＡ：イソステアリルアクリレート
ＭＭＡ：メチルメタクリレート
Ｓｔ：スチレン
ＡＡ：アクリル酸
ＨＥＡ：ヒドロキシエチルアクリレート
Abbreviations in Table 7-1 are shown below.
DMAPAA: dimethylaminopropyl acrylamide DEAEMA: diethylaminoethyl methacrylate VP: vinylpyridine VI: vinylimidazole BA: butyl methacrylate 2EHA: 2-ethylhexyl acrylate ISTA: isostearyl acrylate MMA: methyl methacrylate St: styrene AA: acrylic acid HEA: hydroxyethyl acrylate
＜タンパク質安定化剤水溶液の調製＞
［実施例７－１］
（タンパク質安定化剤水溶液（ＡＳ－１））
得られたビニル系ポリマー（Ａ－１）を、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ溶液）に溶かし、固形分濃度０．１質量％のタンパク質安定化剤水溶液（ＡＳ－１）を得た。
<Preparation of protein stabilizer aqueous solution>
[Example 7-1]
(Protein stabilizer aqueous solution (AS-1))
The resulting vinyl polymer (A-1) was dissolved in phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS solution) to obtain an aqueous protein stabilizer solution (AS-1) having a solid concentration of 0.1% by mass.
［実施例７－２～７－１２、比較例７－１～７－２］
（タンパク質安定化剤水溶液（ＡＳ－２～１４））
ビニル系ポリマー（Ａ－１）を、表７－２に示すビニル系ポリマーに変更した以外は、実施例７－１と同様にして、それぞれタンパク質安定化剤水溶液（ＡＳ－２～１４）を得た。
[Examples 7-2 to 7-12, Comparative Examples 7-1 to 7-2]
(Protein stabilizer aqueous solution (AS-2 to 14))
Aqueous protein stabilizer solutions (AS-2 to 14) were obtained in the same manner as in Example 7-1, except that the vinyl polymer (A-1) was changed to the vinyl polymer shown in Table 7-2. rice field.
［比較例７－３］
（タンパク質安定化剤水溶液（ＡＳ－１５））
３５％Ｎ，Ｎ-ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド溶液（富士フィルムワコーケミカ
ル製）をＰＢＳ溶液で希釈し、固形分濃度０．１質量％のタンパク質安定化剤水溶液（ＡＳ－１５）を得た。Ｎ，Ｎ-ジメチルドデシルアミンＮ－オキシドはアミンオキシド基含
有低分子化合物（分子量２２９．４６）である。
[Comparative Example 7-3]
(Protein stabilizer aqueous solution (AS-15))
A 35% N,N-dimethyldodecylamine N-oxide solution (manufactured by Fujifilm Wako Chemical) was diluted with a PBS solution to obtain an aqueous protein stabilizer solution (AS-15) with a solid content concentration of 0.1% by mass. N,N-dimethyldodecylamine N-oxide is an amine oxide group-containing low molecular weight compound (molecular weight: 229.46).
＜タンパク質安定化剤の評価＞
得られたタンパク質安定化剤について以下の評価を実施した。結果を表７－２に示す。
<Evaluation of protein stabilizer>
The obtained protein stabilizer was evaluated as follows. The results are shown in Table 7-2.
［評価用酵素水溶液の調整］
ＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体（ａｂｃａｍ社製）を８．０ｎｇ／ｍｌとなるように、得られたタンパク質安定化剤水溶液１ｍｌで希釈・混合し、評価用の酵素水溶液を作成した。評価用酵素水溶液は濃度変化がないよう、よく密閉し２５℃暗所で保管した。
[Adjustment of aqueous enzyme solution for evaluation]
An HRP-labeled CRP antibody (manufactured by abcam) was diluted and mixed with 1 ml of the obtained protein stabilizer aqueous solution so as to have a concentration of 8.0 ng/ml to prepare an aqueous enzyme solution for evaluation. The aqueous enzyme solution for evaluation was well sealed and stored in a dark place at 25° C. so as not to change the concentration.
［酵素活性評価］
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用い、発色剤（３，３‘，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液）を１０ｍｌと基質液（過酸化水素水）１００μｌを混合し発色液を得た。
この発色液１００μｌと、評価用酵素水溶液１００μｌとを９６穴ウェルプレートに加え、３０℃暗所で２０分間静置した。これに停止液（硫酸水溶液）を１００μｌ加え反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｉｔｈｒａｓ２ ＬＢ９４３（ＢＥＲＴＨＯＬＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）で測定し、反応により生じたＴＭＢＺ酸化物の量を定量した。ＴＭＢＺの酸化反応はＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体の活性と相関するため、得られた吸光度を酵素活性の指標として使用することができる。
[Enzyme activity evaluation]
Using a coloring kit for peroxidase (manufactured by Sumitomo Bakelite), 10 ml of coloring agent (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ) solution) and 100 μl of substrate solution (hydrogen peroxide solution) were mixed to obtain a coloring solution. got
100 μl of this coloring solution and 100 μl of an enzyme aqueous solution for evaluation were added to a 96-well plate and allowed to stand in the dark at 30° C. for 20 minutes. 100 μl of stop solution (sulfuric acid aqueous solution) was added thereto to stop the reaction. The absorbance at 450 nm was measured with a plate reader Multimode Reader Mithras2 LB943 (manufactured by BERTHOLD TECHNOLOGIES) to quantify the amount of TMBZ oxide produced by the reaction. Since the oxidation reaction of TMBZ correlates with the activity of the HRP-labeled CRP antibody, the absorbance obtained can be used as an index of enzymatic activity.
［タンパク質安定化効果の評価］
上記酵素活性評価を、評価用酵素水溶液の保管前と２５℃３０日間保管後の２回行い、吸光度を測定した。保管前の吸光度を１００％としたときの、保管後の吸光度の比率を計算して相対吸光度とし、下記基準にてタンパク質の変性を評価した。
[Evaluation of protein stabilization effect]
The enzyme activity evaluation was performed twice before and after the aqueous enzyme solution for evaluation was stored at 25° C. for 30 days, and the absorbance was measured. The relative absorbance was calculated by calculating the ratio of the absorbance after storage to the absorbance before storage as 100%, and protein denaturation was evaluated according to the following criteria.
３０日保管後の相対吸光度
◎：９５％以上（極めて良好）
○：９０％以上、９５％未満（良好）
△：８０％以上、９０％未満（使用可能）
×：８０％未満（使用不可）
Relative absorbance after storage for 30 days ◎: 95% or more (extremely good)
○: 90% or more and less than 95% (good)
△: 80% or more and less than 90% (usable)
×: less than 80% (cannot be used)
表７－２に示すように、本発明のアミンオキシド基を有するビニル系ポリマーを含むタンパク質安定化剤を用いることで、高いタンパク質安定化効果が得られた。
一方、アミンオキシド基を有しないビニル系ポリマーを使用した比較例７－１～７－２及びアミンオキシド基を有するが質量平均分子量が２，０００未満である低分子化合物を用いた比較例７－３は、タンパク質と共存させ保管しても十分な安定化効果が得られないことが分かった。これはアミンオキシド基を有していない、又はアミンオキシド基を有していても低分子量であることにより、タンパク質の外部環境を適切に制御できなかったためであると考えられる。
As shown in Table 7-2, a high protein stabilizing effect was obtained by using the protein stabilizer containing the vinyl polymer having an amine oxide group of the present invention.
On the other hand, Comparative Examples 7-1 and 7-2 using a vinyl polymer having no amine oxide group and Comparative Example 7-using a low molecular weight compound having an amine oxide group but having a mass average molecular weight of less than 2,000 It was found that 3 does not have a sufficient stabilizing effect even when stored in the presence of protein. It is considered that this is because the protein does not have an amine oxide group, or has a low molecular weight even if it has an amine oxide group, so that the external environment of the protein could not be controlled appropriately.
Claims (23)
前記ビニル系ポリマー（Ａ）が、エチレン性不飽和基を有するモノマーを重合してなるポリマーと酸化剤との反応生成物であり、
前記エチレン性不飽和基を有するモノマーが、少なくとも、１分子中に１つのエチレン性不飽和基と３級アミノ基とを有するモノマー（ａ）と、炭素数１～１８のアルキル基を有するモノマー（ｃ）とを含む、蛋白質、細胞又は微生物の接着抑制剤。 Suppression of adhesion of proteins, cells, or microorganisms, comprising a vinyl polymer (A) having an amine oxide group, a mass average molecular weight of 2,000 or more, and an amine oxide group content of 1 mmol /g or more is an agent
The vinyl polymer (A) is a reaction product of a polymer obtained by polymerizing a monomer having an ethylenically unsaturated group and an oxidizing agent,
The monomer having an ethylenically unsaturated group comprises at least a monomer (a) having one ethylenically unsaturated group and a tertiary amino group in one molecule and a monomer having an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms ( c) a protein, cell or microorganism adhesion inhibitor comprising
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022187087A JP7425946B2 (en) | 2017-08-31 | 2022-11-24 | Adhesion inhibitors for proteins, cells or microorganisms, and their uses |
Applications Claiming Priority (14)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017166423 | 2017-08-31 | ||
| JP2017166423 | 2017-08-31 | ||
| JP2018032837 | 2018-02-27 | ||
| JP2018032837 | 2018-02-27 | ||
| JP2018058758 | 2018-03-26 | ||
| JP2018058758 | 2018-03-26 | ||
| JP2018124035 | 2018-06-29 | ||
| JP2018124035 | 2018-06-29 | ||
| JP2018136206 | 2018-07-19 | ||
| JP2018136206 | 2018-07-19 | ||
| JP2018141443 | 2018-07-27 | ||
| JP2018141443 | 2018-07-27 | ||
| JP2018160459 | 2018-08-29 | ||
| JP2018160459 | 2018-08-29 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022187087A Division JP7425946B2 (en) | 2017-08-31 | 2022-11-24 | Adhesion inhibitors for proteins, cells or microorganisms, and their uses |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020038059A JP2020038059A (en) | 2020-03-12 |
| JP7192314B2 true JP7192314B2 (en) | 2022-12-20 |
Family
ID=69737792
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018163701A Active JP7192314B2 (en) | 2017-08-31 | 2018-08-31 | Adhesion inhibitor for proteins, cells or microorganisms, and uses thereof |
| JP2022187087A Active JP7425946B2 (en) | 2017-08-31 | 2022-11-24 | Adhesion inhibitors for proteins, cells or microorganisms, and their uses |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022187087A Active JP7425946B2 (en) | 2017-08-31 | 2022-11-24 | Adhesion inhibitors for proteins, cells or microorganisms, and their uses |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JP7192314B2 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023005522A (en) * | 2021-06-29 | 2023-01-18 | 国立大学法人九州大学 | Osmoregulator |
| JP7425947B1 (en) | 2022-12-22 | 2024-02-01 | ａｒｔｉｅｎｃｅ株式会社 | Cell culture substrate, method for producing cell culture substrate, and method for producing spheroids |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001512565A (en) | 1997-01-15 | 2001-08-21 | ユニバーシティー オブ ユタ リサーチ ファンデーション | Compositions and methods for modulating the attachment of cells and biomolecules to hydrophobic surfaces |
| JP2001310915A (en) | 2000-04-28 | 2001-11-06 | Mitsubishi Chemicals Corp | Hydrophilic copolymer having amine oxide group and hair cosmetic containing the same |
| WO2009076722A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-06-25 | The University Of Melbourne | Method of protecting a surface from biological fouling |
| JP2010163429A (en) | 2008-12-17 | 2010-07-29 | Kao Corp | Method for inhibiting biofilm formation |
| JP2016509084A (en) | 2012-12-19 | 2016-03-24 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | Polyoxazoline copolymer |
| WO2017082201A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | 大阪ガスケミカル株式会社 | Microorganism-controlling agent and miticidal composition |
| US20170152462A1 (en) | 2014-04-11 | 2017-06-01 | Novozymes A/S | Detergent Composition |
| JP2017104027A (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | 東洋インキＳｃホールディングス株式会社 | Member for cell culture |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4306609A1 (en) * | 1993-03-03 | 1994-09-08 | Basf Ag | Process for the preparation of polyvinylpyridine-N-oxides |
| JP3892033B2 (en) * | 1993-06-09 | 2007-03-14 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | Dye transfer inhibiting composition containing bleach |
| US5824756A (en) * | 1994-10-25 | 1998-10-20 | Reilly Industries, Inc. | H2 O2 -catalyzed polymerizations for linear polyvinylpyridines |
| JPH09918A (en) * | 1995-06-13 | 1997-01-07 | Masashi Funayama | Physiologically active substance adsorbing carrier |
-
2018
- 2018-08-31 JP JP2018163701A patent/JP7192314B2/en active Active
-
2022
- 2022-11-24 JP JP2022187087A patent/JP7425946B2/en active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001512565A (en) | 1997-01-15 | 2001-08-21 | ユニバーシティー オブ ユタ リサーチ ファンデーション | Compositions and methods for modulating the attachment of cells and biomolecules to hydrophobic surfaces |
| JP2001310915A (en) | 2000-04-28 | 2001-11-06 | Mitsubishi Chemicals Corp | Hydrophilic copolymer having amine oxide group and hair cosmetic containing the same |
| WO2009076722A1 (en) | 2007-12-19 | 2009-06-25 | The University Of Melbourne | Method of protecting a surface from biological fouling |
| JP2010163429A (en) | 2008-12-17 | 2010-07-29 | Kao Corp | Method for inhibiting biofilm formation |
| JP2016509084A (en) | 2012-12-19 | 2016-03-24 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | Polyoxazoline copolymer |
| US20170152462A1 (en) | 2014-04-11 | 2017-06-01 | Novozymes A/S | Detergent Composition |
| WO2017082201A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | 大阪ガスケミカル株式会社 | Microorganism-controlling agent and miticidal composition |
| JP2017104027A (en) | 2015-12-07 | 2017-06-15 | 東洋インキＳｃホールディングス株式会社 | Member for cell culture |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7425946B2 (en) | 2024-02-01 |
| JP2020038059A (en) | 2020-03-12 |
| JP2023027114A (en) | 2023-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7425946B2 (en) | Adhesion inhibitors for proteins, cells or microorganisms, and their uses | |
| JP6372544B2 (en) | Cell adhesion inhibitor | |
| US10774165B2 (en) | Polymer composition, article, medical device, article production method, and cell cluster production method | |
| JP5874859B1 (en) | Medical device for contact with body fluid and biocompatible polymer | |
| US10597540B2 (en) | Surface treatment agent for surface configured from inorganic material, tool and device having modified surface, and method for manufacturing tool and device | |
| CN109563463A (en) | Coating film with thin films step spreadability, the structural matrix for having the film | |
| WO2009113158A1 (en) | Method for immobilizing biologically active substance | |
| JP2021091872A (en) | Biocompatible resin, culture medium additive for cells, culture medium for cell culture, and coating agent for cell culture including the same, and use thereof | |
| JP2017104027A (en) | Member for cell culture | |
| JP2012521472A (en) | Improved biofouling prevention coating | |
| JP2006176720A (en) | High polymer for medical material and polymer solution using the same | |
| JP6852419B2 (en) | Polymer-type antibacterial and antifungal agents, and their use | |
| JP6578919B2 (en) | Cell culture components | |
| JP2019178200A (en) | Biofilm formation inhibiting coating agent and biofilm formation inhibiting laminate | |
| JP2018123275A (en) | Cell adhesion inhibitor | |
| JP6299862B2 (en) | COATING COMPOSITION AND USE THEREOF | |
| JP2017186291A (en) | N-phenylmaleimide derivative and manufacturing method therefor, precursor of n-phenylmaleimide derivative, polymer, protein adhesion prevention agent and medical device | |
| JP2019206685A (en) | Block copolymer, cell culture substrate treatment agent including the block copolymer, and use therefor | |
| JP2021045117A (en) | Cell culture member and production method thereof | |
| EP4234236A1 (en) | Biological substance low-adhesion material comprising copolymer | |
| WO2015133461A1 (en) | Ion complex material having function for preventing adherence to biological material | |
| JP2019180274A (en) | Cell culture appliance processing agent, cell culture appliance, medical device and production method of cell culture appliance | |
| US20220135806A1 (en) | Method for producing polymer compatible with biomaterials | |
| JP2019183021A (en) | Biofilm formation suppression coat agent, and biofilm formation suppression laminate |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210507 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220309 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220315 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220513 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220705 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220822 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221108 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221121 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7192314 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |