JP2021091872A - Biocompatible resin, culture medium additive for cells, culture medium for cell culture, and coating agent for cell culture including the same, and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規な生体適合性樹脂、それを用いてなる細胞用培地添加剤、細胞培養用培地、細胞培養用コート剤およびその利用に関する。 The present invention relates to a novel biocompatible resin, a cell culture medium additive using the same, a cell culture medium, a cell culture coating agent, and its use.
近年、動物細胞を大量培養することにより、モノクローナル抗体をはじめ有用な生理活性物質（ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、ビタミンやミネラル、酵素、核酸など）を工業的に量産することが非常に多くなってきている。その際には増殖因子として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清が頻繁に使用される。具体的にはＲＰＭＩ１６４０、イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＦ１２などの合成基礎培地に１０〜２０％程度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清を添加した培養液が一般に用いられる。 In recent years, by mass-culturing animal cells, it has become extremely common to industrially mass-produce useful physiologically active substances (hormones, neurotransmitters, cytokines, vitamins and minerals, enzymes, nucleic acids, etc.) such as monoclonal antibodies. It's coming. In that case, animal serum such as fetal bovine serum (FBS) is frequently used as a growth factor. Specifically, a culture medium obtained by adding about 10 to 20% of animal serum such as fetal bovine serum (FBS) to a synthetic basal medium such as RPMI1640, Eagle MEM, or Ham's F12 is generally used.
しかしながら、培地添加剤として使用されるウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清は、その供給に制限があり、一般的に高価なものである。これにより、培地のコスト上昇を招き、生理活性物質の製造コストの上昇へとつながる。また、血清由来のタンパク質を含む培養液から目的とする生理活性物質を単離することが困難になる欠点にもつながる。さらに、血清にはロット間に品質のばらつきがみられる。そこで血清の使用に先立ってロットチェックを十分に行い、使用可能な血清を選択する必要があるが、この血清の選択には多くの労力を要する。それに加え、動物由来の血清に関しては、狂牛病、ウシ海綿状脳症、感染性海綿状脳、更にはクロイツフェルト・ヤコブ病といったプリオン関連の疾患に関する問題点の他、動物由来の血清はオートクレーブなどで滅菌できないため、ウイルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があり、感染症などのリスク（安全性面）の問題が生じる。 However, animal sera such as fetal bovine serum (FBS) used as a medium additive have limited supply and are generally expensive. This leads to an increase in the cost of the medium and an increase in the production cost of the physiologically active substance. In addition, it also leads to a drawback that it becomes difficult to isolate the desired physiologically active substance from the culture solution containing the serum-derived protein. In addition, serum quality varies from lot to lot. Therefore, it is necessary to perform a sufficient lot check prior to the use of serum and select a usable serum, but selection of this serum requires a lot of labor. In addition, regarding animal-derived sera, there are problems related to prion-related diseases such as mad cow disease, bovine spongiform encephalopathy, infectious spongiform brain, and Creutzfeldt-Jakob disease. Because it cannot be sterilized with, it may be contaminated with virus or mycoplasma, which raises risk (safety) problems such as infectious diseases.
上記の問題を解決すべく、血清を用いない培地（無血清培地）の検討が行われてきた。
例えば、特許文献１には、グリシルグリシンを培地に添加することで、動物細胞に高濃度に有用物質を生産させることができることが開示されている。また、特許文献２には、リン脂質類似構造を有するポリマーを含有する培地で細胞培養した場合に、生理活性物質を効率的に生産できることが開示されている。また、特許文献３には、疎水性Ｄ−アミノ酸を含有する培地が、細胞増殖を促進させ、有用物質の生産量を増大させることが開示されている。
しかし、このような培地添加剤（血清代替物）を含む培地の多くは、抗体産生細胞の増殖性、生存性および抗体生産性の面で血清含有培地に比べて十分なものとは言えない。さらに血清代替物も天然物由来のものが多く、供給制限があり、一般的に高価である。
In order to solve the above problems, a serum-free medium (serum-free medium) has been studied.
For example, Patent Document 1 discloses that by adding glycylglycine to a medium, animal cells can produce a useful substance at a high concentration. Further, Patent Document 2 discloses that a physiologically active substance can be efficiently produced when cells are cultured in a medium containing a polymer having a phospholipid-like structure. Further, Patent Document 3 discloses that a medium containing a hydrophobic D-amino acid promotes cell proliferation and increases the production of useful substances.
However, many of the media containing such a medium additive (serum substitute) are not sufficient as compared with the serum-containing medium in terms of proliferation, viability and antibody productivity of antibody-producing cells. In addition, many serum substitutes are derived from natural products, have limited supply, and are generally expensive.
以上のことから、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に代わる培地添加剤（血清代替物）の開発が期待されている。また、培地添加剤を用いる方法以外の生理活性物質産生技術も期待されている。 From the above, the development of a medium additive (serum substitute) to replace fetal bovine serum (FBS) is expected. In addition, techniques for producing physiologically active substances other than the method using a medium additive are also expected.
このような生理活性物質の産生以外にも、細胞培養技術は多く利用されている。例えば、化学物質や医薬品等の薬効及び毒性評価、再生医療等の分野が挙げられ、利用される動物細胞は、シャーレやマルチウェルプレート、袋状容器などの培養容器内で培養されることが多い。
培養容器内の細胞は、例えば、培養容器の表面に接着し、培養容器の培養面上で伸展することにより２次元的に増殖する。しかし、２次元的に増殖した細胞は生体内と環境が大きく異なるため、生体内における形態や機能を発現しない場合があり、３次元的な細胞凝集塊（細胞スフェロイド）を形成させる方が、その機能維持に有利であると言われている。
従来、細胞スフェロイドの作製方法として、例えば、（１）住友ベークライト社のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ等の、非接着性の丸底面へ細胞を沈降させる手法、（２）ＪＳＲ社のＮａｎｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ、日立製作所のＮａｎｏ ＰｉｌｌａｒＰｌａｔｅ等の、レーザー加工により平滑面を規則正しい凹凸面にすることによって培養面に接着した細胞の遊走性を高め、これにより、培養面において細胞の自己組織化を誘導する方法、（３）クラレ社のＥｌｐｌａｓｉａ、ＡＧＣ社のＥＺＳＰＨＥＲＥ等の、直径１００〜５００μm、深さ５００μm程度の無数の穴が配置された培養皿を用いて、各穴の底面へ各穴に播種した細胞を沈降させる手法、（４）シャーレなどのデバイスの天井から液滴をぶら下げ、その中で細胞を培養するハンギングドロップ法、等が開発されている。
In addition to the production of such bioactive substances, cell culture techniques are widely used. For example, fields such as drug efficacy and toxicity evaluation of chemical substances and pharmaceuticals, regenerative medicine, etc. are mentioned, and the animal cells used are often cultured in culture containers such as petri dishes, multi-well plates, and bag-shaped containers. ..
The cells in the culture vessel grow two-dimensionally by adhering to the surface of the culture vessel and extending on the culture surface of the culture vessel, for example. However, since the environment of two-dimensionally proliferated cells is significantly different from that in the living body, they may not express their morphology and function in the living body, and it is better to form three-dimensional cell aggregates (cell spheroids). It is said to be advantageous for maintaining function.
Conventionally, as a method for producing cell spheroids, for example, (1) a method of precipitating cells on a non-adhesive round bottom such as Prime Surface of Sumitomo Bakelite, (2) Nano Culture Plate of JSR, Nano Pillar Plate of Hitachi, Ltd. (3) A method of inducing self-organization of cells on the culture surface by increasing the migration of cells adhering to the culture surface by making the smooth surface into a regular uneven surface by laser processing. A method of precipitating cells seeded in each hole on the bottom surface of each hole using a culture dish in which innumerable holes having a diameter of 100 to 500 μm and a depth of about 500 μm are arranged, such as Elplasmia and AGC's EZSPHERE, (4). ) A hanging drop method has been developed in which droplets are hung from the ceiling of a device such as a petri dish and cells are cultured in the droplets.
しかし、（１）は均一なサイズのスフェロイドを作製できる利点はあるが、培地交換やスフェロイドの回収操作などが煩雑となる。（２）は微細な凹凸の作製が容易ではなく加工コストがかかるという問題がある。（３）も微細な凹凸の作製が容易ではなく加工コストがかかるという問題がある。また、液体培地を基材表面に適用したときに基材表面上に気泡が残りやすいため、基材表面に液体培地を添加した後に脱泡処理が必要であるという問題もある。（４）はスフェロイドのサイズを制御しやすいという利点はあるが、大量生産には適していない。以上のことから、これらの課題を解決できる細胞スフェロイドの作製方法が求められている。 However, although (1) has an advantage that spheroids having a uniform size can be produced, medium exchange and spheroid recovery operations become complicated. (2) has a problem that it is not easy to produce fine irregularities and processing costs are high. (3) also has a problem that it is not easy to produce fine irregularities and processing costs are high. Further, when the liquid medium is applied to the surface of the base material, air bubbles tend to remain on the surface of the base material, so that there is also a problem that a defoaming treatment is required after adding the liquid medium to the surface of the base material. (4) has the advantage that the size of spheroids can be easily controlled, but is not suitable for mass production. From the above, there is a demand for a method for producing a cell spheroid that can solve these problems.
一方で、特許文献４では、本発明のようにグルカミンやグルコサミンなどのアミノ糖を側鎖に有するポリマーが開示されているが、モノマーの合成方法がマイケル付加によるものであるため目的生成物であるモノマーの収率が悪い。また、特許文献４の用途は細胞培養に関する記載はない。 On the other hand, Patent Document 4 discloses a polymer having an amino sugar such as glucamine or glucosamine in the side chain as in the present invention, but it is a target product because the method for synthesizing the monomer is by adding Michael. Poor monomer yield. Further, the use of Patent Document 4 does not describe cell culture.
上記事情に鑑み、本発明の目的は、コストや手間の増加を伴わずに生理活性物質の生産性を高める、もしくは、３次元的な細胞スフェロイドを作製するための、生体適合性樹脂、該樹脂を含む細胞用培地添加剤、細胞培養用培地、コート剤、細胞スフェロイドの製造方法を提供することにある。 In view of the above circumstances, an object of the present invention is a biocompatible resin for increasing the productivity of a physiologically active substance or producing a three-dimensional cell spheroid without increasing cost and labor. It is an object of the present invention to provide a cell culture medium additive, a cell culture medium, a coating agent, and a method for producing a cell spheroid.
すなわち、本発明は以下の〔１〕〜〔１５〕に関する。
〔１〕４つ以上の水酸基と、アミド結合またはウレア結合とを有する構造単位（Ｇ）を有するポリマー（Ａ）を含むことを特徴とする生体適合性樹脂。
〔２〕ポリマー（Ａ）が、質量平均分子量が２，０００以上１，０００，０００以下のビニル系ポリマーである上記生体適合性樹脂。
〔３〕４つ以上の水酸基と、アミド結合またはウレア結合とを有する構造単位（Ｇ）が、アミノ糖由来である、上記生体適合性樹脂。
〔４〕ポリマー（Ａ）が、５つの水酸基と、アミド結合またはウレア結合とを有するモノマー（ａ）の共重合体である、上記生体適合性樹脂。
〔５〕モノマー（ａ）が、下記一般式（１）〜（６）で示されるモノマーから選ばれる少なくとも一種類であることを特徴とする上記生体適合性樹脂。
一般式（１）
一般式（２）
一般式（３）
一般式（４）
一般式（５）
一般式（６）
（式中、
ＲおよびＲ１は、水素原子または炭素数１〜８のアルキル基を示し、
Ｙは、アミノ糖構造を示す。）
〔６〕 上記生体適合性樹脂を含む細胞用培地用添加剤。
〔７〕 上記細胞用培地用添加剤を含む細胞用培地。
〔８〕 ポリマー（Ａ）の培地中の濃度が０．００１〜１質量％である、上記細胞用培地。
〔９〕 上記細胞用培地中で細胞を培養することを特徴とする生理活性物質又はスフェロイドの製造方法。
〔１０〕上記生体適合性樹脂を含む、タンパク質産生用コート剤。
〔１１〕上記タンパク質産生用コート剤からなる塗膜を有する細胞培養用部材。
〔１２〕上記細胞培養用部材により細胞を培養することを特徴とする生理活性物質の製造方法。
〔１３〕上記生体適合性樹脂を含む、細胞培養用コート剤。
〔１４〕上記細胞培養用コート剤からなる細胞培養用塗膜を有する細胞培養用部材であって、分化機能を有しない接着細胞の培養に用いられる細胞培養用部材。
〔１５〕上記細胞培養用部材により、分化機能を有しない接着細胞を培養することを特徴とする、スフェロイドの形成方法。
That is, the present invention relates to the following [1] to [15].
[1] A biocompatible resin comprising a polymer (A) having a structural unit (G) having four or more hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond.
[2] The biocompatible resin, wherein the polymer (A) is a vinyl-based polymer having a mass average molecular weight of 2,000 or more and 1,000,000 or less.
[3] The biocompatible resin, wherein the structural unit (G) having four or more hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond is derived from an amino sugar.
[4] The biocompatible resin, wherein the polymer (A) is a copolymer of a monomer (a) having five hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond.
[5] The biocompatible resin, wherein the monomer (a) is at least one selected from the monomers represented by the following general formulas (1) to (6).
General formula (1)
General formula (2)
General formula (3)
General formula (4)
General formula (5)
General formula (6)
(During the ceremony,
R and R 1 represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
Y indicates an amino sugar structure. )
[6] An additive for a cell culture medium containing the biocompatible resin.
[7] A cell culture medium containing the above-mentioned cell culture medium additive.
[8] The cell culture medium having a concentration of the polymer (A) in the medium of 0.001 to 1% by mass.
[9] A method for producing a physiologically active substance or spheroid, which comprises culturing cells in the above-mentioned cell culture medium.
[10] A coating agent for protein production containing the above biocompatible resin.
[11] A cell culture member having a coating film made of the above-mentioned protein-producing coating agent.
[12] A method for producing a physiologically active substance, which comprises culturing cells with the above-mentioned cell culture member.
[13] A coating agent for cell culture containing the above biocompatible resin.
[14] A cell culture member having a cell culture coating made of the above cell culture coating agent and used for culturing adherent cells having no differentiation function.
[15] A method for forming a spheroid, which comprises culturing adherent cells having no differentiation function using the cell culture member.
本発明の、４つ以上の水酸基と、アミド結合またはウレア結合とを有する構造単位を有するポリマーを含む生体適合性樹脂は、細胞やタンパク質に対する接着性が低いという性能を安定して発現できる。この生体適合性樹脂を細胞培養用部材の表面にコーティングすること、または培地に添加することで、簡便に細胞スフェロイドの作製を行うことが可能になる。また、この生体適合性樹脂を含む培地添加剤を培地に添加したり、コート剤を細胞培養用部材の表面にコーティングしたりすることで、生理活性物質の生産量を増大させることが可能である。特にＤＮＡ量当たりの生理活性物質の生産量を増大させることが可能である。更には、所望の生理活性物質の産生性を促進することができるため、製造コストや手間を大幅に少なくすることができる点でも有用である。例えば、抗体の場合は抗体医薬品などのバイオ医薬品の製造に関して、大量供給に大きく貢献することができる。 The biocompatible resin of the present invention containing a polymer having a structural unit having four or more hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond can stably exhibit the performance of low adhesion to cells and proteins. By coating the surface of the cell culture member with this biocompatible resin or adding it to the medium, it becomes possible to easily produce cell spheroids. Further, by adding a medium additive containing this biocompatible resin to the medium or coating the surface of the cell culture member with a coating agent, it is possible to increase the production amount of the physiologically active substance. .. In particular, it is possible to increase the amount of bioactive substance produced per amount of DNA. Furthermore, since it is possible to promote the production of a desired physiologically active substance, it is also useful in that the production cost and labor can be significantly reduced. For example, in the case of an antibody, it can greatly contribute to mass supply in the production of biopharmaceuticals such as antibody drugs.
すなわち、本発明により、コストや手間の増加を伴わずに生理活性物質の生産性を高める、もしくは、３次元的な細胞スフェロイドを作製するための、生体適合性樹脂、該樹脂を含む細胞培養用培地、細胞培養用コート剤、該添加剤、コート剤を用いた細胞スフェロイドの製造方法を提供することができる。 That is, according to the present invention, a biocompatible resin for increasing the productivity of a physiologically active substance or producing a three-dimensional cell spheroid without increasing cost and labor, for cell culture containing the resin. It is possible to provide a medium, a coating agent for cell culture, an additive, and a method for producing a cell spheroid using the coating agent.
［生体適合性樹脂］
本発明の生体適合性樹脂は、４つ以上の水酸基と、アミド結合またはウレア結合とを有する構造単位（Ｇ）を有するポリマー（Ａ）を含むものである。
構造単位（Ｇ）は、４つ以上の水酸基の水酸基と、アミド結合またはウレア結合をもつ構造であれば、特に限定されないが、用途に応じて任意に選択することができる。
構造単位（Ｇ）の４つ以上の水酸基は、アミノ糖由来であることが好ましい。また、構造単位（Ｇ）のアミド結合またはウレア結合は、アミノ糖に含まれるアミノ基が、カルボキシル基またはイソシアネート基と反応することでアミド結合またはウレア結合を形成したものであることが好ましい。
[Biocompatible resin]
The biocompatible resin of the present invention contains a polymer (A) having a structural unit (G) having four or more hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond.
The structural unit (G) is not particularly limited as long as it has a structure having four or more hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond, but can be arbitrarily selected depending on the intended use.
The four or more hydroxyl groups of the structural unit (G) are preferably derived from amino sugars. Further, the amide bond or urea bond of the structural unit (G) is preferably one in which the amino group contained in the amino sugar reacts with the carboxyl group or the isocyanate group to form an amide bond or a urea bond.
アミノ糖とはアミノ基を１つ含む糖類似構造であり、４つ以上の水酸基を有するものである。例えば、グルカミン、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、ヘキソサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、キトビオースなどが挙げられる。グルカミンが好ましく使用される。グルカミンは、例えば、Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（メグルミン）、Ｎ−エチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−オクチル−Ｄ−グルカミンなどが挙げられる。 The amino sugar has a sugar-like structure containing one amino group and has four or more hydroxyl groups. For example, glucamine, glucosamine, galactosamine, mannosamine, hexosamine, neuraminic acid, muramic acid, chitobiose and the like can be mentioned. Glucamine is preferably used. Glucamine includes, for example, D-glumine, N-methyl-D-glumine (meglumine), N-ethyl-D-glumine, N-octyl-D-glumine and the like.
構造単位（Ｇ）の好ましい形態としては、下記の構造が挙げられる。
（アミド結合を有する構造）
一般式（７）
一般式（８）
一般式（９）
一般式（１０）
The following structure is mentioned as a preferable form of the structural unit (G).
(Structure with amide bond)
General formula (7)
General formula (8)
General formula (9)
General formula (10)
（ウレア結合を有する構造）
一般式（１１）
一般式（１２）
（式中、
Ｒは、水素原子または炭素数１〜８のアルキル基を示し、
Ｙは、アミノ糖構造を示し、
＊＊は、ポリマーの主鎖との結合位置を示す。）
(Structure with urea bond)
General formula (11)
General formula (12)
(During the ceremony,
R represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
Y indicates an amino sugar structure,
** indicates the bonding position with the main chain of the polymer. )
ポリマー（Ａ）中に構造単位（Ｇ）を導入する方法は特に限定されないが、例えば、４つ以上の水酸基、好ましくは５つの水酸基と、アミド結合もしくはウレア結合を有するモノマー（ａ）の共重合体として得る方法が挙げられる。
モノマー（ａ）は、例えば、カルボキシル基またはイソシアネート基を有するモノマーと、アミノ糖とを反応させて得ることができる。カルボキシル基を有するモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸２−カルボキシエチル、あるいはエチレンオキサイドやプロピレンオキサイドなどのアルキレンオキサイドの繰り返し付加した末端にカルボキシル基を有するアルキレンオキサイド付加系コハク酸（メタ）アクリレートなどが挙げられる。イソシアネート基を有するモノマーとしては、２−イソシアナトエチルアクリレート、２−イソシアナトエチルメタクリレートなどが挙げられる。モノマー（ａ）の好ましい形態としては、下記の構造が挙げられる。
The method for introducing the structural unit (G) into the polymer (A) is not particularly limited, but for example, the copolymerization of four or more hydroxyl groups, preferably five hydroxyl groups, and the monomer (a) having an amide bond or a urea bond. There is a method of obtaining it as a coalescence.
The monomer (a) can be obtained, for example, by reacting a monomer having a carboxyl group or an isocyanate group with an amino sugar. Examples of the monomer having a carboxyl group include (meth) acrylic acid, 2-carboxyethyl (meth) acrylate, or an alkylene oxide addition system having a carboxyl group at the end of repeatedly adding an alkylene oxide such as ethylene oxide or propylene oxide. Examples thereof include succinic acid (meth) acrylate. Examples of the monomer having an isocyanate group include 2-isocyanatoethyl acrylate and 2-isocyanatoethyl methacrylate. Preferred forms of the monomer (a) include the following structures.
アミド結合を有するものとしては、
一般式（１）
一般式（２）
一般式（３）
一般式（４）
Those having an amide bond include
General formula (1)
General formula (2)
General formula (3)
General formula (4)
ウレア結合を有するものとしては、
一般式（５）
一般式（６）
（式中、
ＲおよびＲ１は、水素原子または炭素数１〜８のアルキル基を示し、
Ｙは、アミノ糖構造を示す。）
Those with a urea bond include
General formula (5)
General formula (6)
(During the ceremony,
R and R 1 represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
Y indicates an amino sugar structure. )
ポリマー（Ａ）中に構造単位（Ｇ）を導入する別の方法としては、カルボキシル基またはイソシアネート基を有するモノマー（ｂ）の共重合体を得た後、５つの水酸基と１つのアミノ基を有する化合物（Ｇ´）を反応させて得る方法が挙げられる。化合物（Ｇ´）は、アミノ糖が好ましい。この方法は、合成後の分子量測定が容易であるという点で好ましい。 As another method for introducing the structural unit (G) into the polymer (A), a copolymer of the monomer (b) having a carboxyl group or an isocyanate group is obtained, and then the polymer (A) has five hydroxyl groups and one amino group. Examples thereof include a method obtained by reacting the compound (G'). The compound (G') is preferably an amino sugar. This method is preferable in that it is easy to measure the molecular weight after synthesis.
［他のモノマー（ｃ）］
ポリマー（Ａ）を得る際に、上記モノマー（ａ）、（ｂ）以外の他のモノマーを用いることができる。他のモノマーを共重合することで、極性やＴｇ、溶媒溶解性などを制御することができる。
その他モノマー（ｃ）としては、炭素数１〜１８のアルキル基を有するモノマーを用いることが、合成の容易さ、細胞生存率の観点から好ましい。より好ましくは、炭素数４〜１８のアルキル基を有するモノマーである。
[Other monomer (c)]
When obtaining the polymer (A), monomers other than the above-mentioned monomers (a) and (b) can be used. By copolymerizing other monomers, polarity, Tg, solvent solubility and the like can be controlled.
As the other monomer (c), it is preferable to use a monomer having an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms from the viewpoint of ease of synthesis and cell viability. More preferably, it is a monomer having an alkyl group having 4 to 18 carbon atoms.
モノマー（ｃ）としては、特に限定はされないが、例えば、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、セチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレートなどのアルキル（メタ）アクリレート；１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセンなどのα−オレフィン系エチレン性不飽和モノマーなどが挙げられる。さらに、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレートなどアルキル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、プロポキシエチル（メタ）アクリレート、ブトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシプロピル（メタ）アクリレートなどのアクリルエステル（メタ）アクリレート；フェニル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレートなどの芳香族エステル（メタ）アクリレート；（メタ）アクリル酸アリル、（メタ）アクリル酸１−メチルアリル、（メタ）アクリル酸２−メチルアリル、（メタ）アクリル酸１−ブテニル、（メタ）アクリル酸２−ブテニル、（メタ）アクリル酸３−ブテニル、（メタ）アクリル酸１，３−メチル−３−ブテニル、（メタ）アクリル酸２−クロルアリル、（メタ）アクリル酸３−クロルアリル、（メタ）アクリル酸ｏ−アリルフェニル、（メタ）アクリル酸２−（アリルオキシ）エチル、（メタ）アクリル酸アリルラクチル、（メタ）アクリル酸シトロネリル、（メタ）アクリル酸ゲラニル、（メタ）アクリル酸ロジニル、（メタ）アクリル酸シンナミル、ジアリルマレエート、ジアリルイタコン酸、（メタ）アクリル酸ビニル、クロトン酸ビニル、オレイン酸ビニル，リノレン酸ビニル、（メタ）アクリル酸２−（２’−ビニロキシエトキシ）エチルなどのエチレン性不飽和基含有（メタ）アクリル酸エステル類；パーフルオロメチルメチル（メタ）アクリレート、パーフルオロエチルメチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロブチルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロオクチルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロイソノニルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロノニルエチル（メタ）アクリレート、２−パーフルオロデシルエチル（メタ）アクリレート、パーフルオロプロピルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルプロピル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルアミル（メタ）アクリレート、パーフルオロオクチルウンデシル（メタ）アクリレートなどの炭素数１〜２０のパーフルオロアルキル基を有するパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和モノマーなどの（メタ）アクリレート系モノマー；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−（メタ）アクリロイロキシエチル−２−ヒドロキシエチルフタル酸、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシビニルベンゼン、１−エチニル−１−シクロヘキサノール、アリルアルコール、グリセリンモノ（メタ）アクリレートなどの３つ以下の水酸基を有するモノマー； The monomer (c) is not particularly limited, but for example, butyl (meth) acrylate, pentyl (meth) acrylate, heptyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, octyl (meth) acrylate, and nonyl (meth). ) Alkyl (meth) acrylates such as acrylates, decyl (meth) acrylates, dodecyl (meth) acrylates, stearyl (meth) acrylates, cetyl (meth) acrylates, cyclohexyl (meth) acrylates; 1-butene, 1-pentene, 1- Examples thereof include α-olefin-based ethylenically unsaturated monomers such as hexene, 1-octene, 1-nonene, and 1-decene. Further, methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate and other alkyl (meth) acrylate, isobonyl (meth) acrylate, methoxyethyl (meth) acrylate, ethoxyethyl (meth) acrylate, propoxyethyl (meth). ) Acrylic ester (meth) acrylate such as acrylate, butoxyethyl (meth) acrylate, ethoxypropyl (meth) acrylate; Aromatic ester (meth) such as phenyl (meth) acrylate, benzyl (meth) acrylate, phenoxyethyl (meth) acrylate ) Acrylic; allyl (meth) acrylate, 1-methylallyl (meth) acrylate, 2-methylallyl (meth) acrylate, 1-butenyl (meth) acrylate, 2-butenyl (meth) acrylate, (meth) acrylic 3-butenyl acid, 1,3-methyl-3-butenyl (meth) acrylate, 2-chloroallyl (meth) acrylate, 3-chloroallyl (meth) acrylate, o-allylphenyl (meth) acrylate, (meth) ) 2- (Allyloxy) ethyl acrylate, allyllactyl (meth) acrylate, citronellyl (meth) acrylate, geranyl (meth) acrylate, rosinyl (meth) acrylate, cinnamyl (meth) acrylate, diallyl maleate, diallyl Ethyl unsaturated group-containing (meth) acrylics such as itaconic acid, vinyl (meth) acrylate, vinyl crotonate, vinyl oleate, vinyl linolenate, 2- (2'-vinyloxyethoxy) ethyl (meth) acrylate. Acid esters; perfluoromethylmethyl (meth) acrylate, perfluoroethylmethyl (meth) acrylate, 2-perfluorobutylethyl (meth) acrylate, 2-perfluorohexylethyl (meth) acrylate, 2-perfluorooctylethyl (Meta) acrylate, 2-perfluoroisononyl ethyl (meth) acrylate, 2-perfluorononyl ethyl (meth) acrylate, 2-perfluorodecylethyl (meth) acrylate, perfluoropropylpropyl (meth) acrylate, perfluoro Perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated models having 1 to 20 carbon atoms such as octylpropyl (meth) acrylate, perfluorooctylamyl (meth) acrylate, and perfluorooctylundecyl (meth) acrylate. (Meta) acrylate-based monomers such as Nomer; 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate, 4-hydroxybutyl (meth) acrylate, 2- (meth) acryloyloxyethyl-2-hydroxy Monomers having 3 or less hydroxyl groups such as ethylphthalic acid, glycerol mono (meth) acrylate, 4-hydroxyvinylbenzene, 1-ethynyl-1-cyclohexanol, allyl alcohol, glycerin mono (meth) acrylate;
マレイン酸、フマル酸、イタコン酸、シトラコン酸、又は、これらのアルキル若しくはアルケニルモノエステル、フタル酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、イソフタル酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、テレフタル酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、コハク酸β−（メタ）アクリロキシエチルモノエステル、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、けい皮酸などのカルボン酸基、若しくはその無水物を有するモノマー；
ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸などのスルホン酸基を有するモノマー；（２−ヒドロキシエチル）メタクリレートアシッドホスフェートなどのリン酸基を有するモノマー；（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−メトキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロポキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ペントキシメチル−（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル−Ｎ−メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−エトキシメチル−Ｎ−プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル−Ｎ−（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−ブトキシメチル−Ｎ−（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−メトキシメチル−Ｎ−（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ダイアセトン（メタ）アクリルアミドなどの１〜３級アミド基を有するモノマー；
（メタ）アクリル酸ジメチルアミノエチルメチルクロライド塩、トリメチル−３−（１−（メタ）アクリルアミド−１，１−ジメチルプロピル）アンモニウムクロライド、トリメチル−３−（１−（メタ）アクリルアミドプロピル）アンモニウムクロライド、及びトリメチル−３−（１−（メタ）アクリルアミド−１，１−ジメチルエチル）アンモニウムクロライドなどの４級アミノ基を有するモノマー；ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ブトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、プロポキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ブトキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、フェノキシテトラエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシヘキサエチレングリコール（メタ）アクリレートなどのポリエーテル鎖を有するモノマー；
Maleic acid, fumaric acid, itaconic acid, citraconic acid, or alkyl or alkenyl monoesters of these, phthalic acid β- (meth) acryloxyethyl monoester, isophthalic acid β- (meth) acryloxyethyl monoester, terephthalic acid Monomer having a carboxylic acid group such as β- (meth) acryloxyethyl monoester, succinic acid β- (meth) acryloxyethyl monoester, acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, citraconic acid, or an anhydride thereof;
Monomers having sulfonic acid groups such as vinyl sulfonic acid and styrene sulfonic acid; Monomers having phosphoric acid groups such as (2-hydroxyethyl) methacrylate acid phosphate; (meth) acrylamide, N-vinyl-2-pyrrolidone, N-methoxy Methyl- (meth) acrylamide, N-ethoxymethyl- (meth) acrylamide, N-propoxymethyl- (meth) acrylamide, N-butoxymethyl- (meth) acrylamide, N-pentoxymethyl- (meth) acrylamide, N, N-di (methoxymethyl) acrylamide, N-ethoxymethyl-N-methoxymethylmethacrylamide, N, N-di (ethoxymethyl) acrylamide, N-ethoxymethyl-N-propoxymethylmethacrylamide, N, N-di ( Propoxymethyl) acrylamide, N-butoxymethyl-N- (propoxymethyl) metaacrylamide, N, N-di (butoxymethyl) acrylamide, N-butoxymethyl-N- (methoxymethyl) metaacrylamide, N, N-di ( Pentoxymethyl) acrylamide, N-methoxymethyl-N- (pentoxymethyl) metaacrylamide, N, N-dimethylaminopropylacrylamide, N, N-diethylaminopropylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N, N-diethyl Monomers having 1-3-order amide groups such as acrylamide and diacetone (meth) acrylamide;
Dimethylaminoethylmethyl chloride salt (meth) acrylate, trimethyl-3- (1- (meth) acrylamide-1,1-dimethylpropyl) ammonium chloride, trimethyl-3- (1- (meth) acrylamide propyl) ammonium chloride, And monomers having a quaternary amino group such as trimethyl-3- (1- (meth) acrylamide-1,1-dimethylethyl) ammonium chloride; polyethylene glycol (meth) acrylate, methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol. (Meta) acrylate, propoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, n-butoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, n-pentoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, phenoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, polypropylene glycol (meth) acrylate, methoxy Polypropylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, propoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, n-butoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, n-pentoxypolypropylene glycol (meth) acrylate, phenoxypolypropylene glycol (meth) Polyethers such as acrylates, polytetramethylene glycol (meth) acrylates, methoxypolytetramethylene glycol (meth) acrylates, phenoxytetraethylene glycol (meth) acrylates, hexaethylene glycol (meth) acrylates, and methoxyhexaethylene glycol (meth) acrylates. Monomer with chains;
ラクトン変性（メタ）アクリレートなどのポリエステル鎖を有するエチレン性不飽和化合物などの側鎖に高分子構造を有する（メタ）アクリレート系モノマー；スチレン、α−メチルスチレン、２−メチルスチレン、クロロスチレン、アリルベンゼン、エチニルベンゼンなどの芳香族ビニルモノマー；（メタ）アクリロニトリルなどのニトリル基含有エチレン性不飽和モノマー；酢酸ビニル、酪酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ヘキサン酸ビニル、カプリル酸ビニル、ラウリル酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ステアリン酸ビニルなどの脂肪酸ビニル系化合物；ブチルビニルエーテル、エチルビニルエーテルなどのビニルエーテル系エチレン性不飽和モノマー；
酢酸アリル、シアン化アリルなどのアリルモノマー；シアン化ビニル、ビニルシクロヘキサン、ビニルメチルケトンなどのビニルモノマー；アセチレン、エチニルトルエンなどのエチニルモノマーパーフルオロブチルエチレン、パーフルオロヘキシルエチレン、パーフルオロオクチルエチレン、パーフルオロデシルエチレンなどのパーフルオロアルキル、アルキレン類などのパーフルオロアルキル基含有エチレン性不飽和化合物などの、（メタ）アクリレートではないエチレン性不飽和結合を有するモノマーなどが挙げられる。
溶解性やハンドリング性の観点から、ポリエーテル鎖を有するモノマーおよび／またはポリエステル鎖を有するモノマーを共重合することが好ましく、モノマーの合計１００質量％に対して、１０質量％以上が好ましく、２０質量％以上がより好ましい。
(Meta) acrylate-based monomer having a polymer structure on the side chain such as an ethylenically unsaturated compound having a polyester chain such as lactone-modified (meth) acrylate; styrene, α-methylstyrene, 2-methylstyrene, chlorostyrene, allyl Aromatic vinyl monomers such as benzene and ethynylbenzene; nitrile group-containing ethylenically unsaturated monomers such as (meth) acrylonitrile; vinyl acetate, vinyl butyrate, vinyl propionate, vinyl hexanoate, vinyl caprylate, vinyl laurate, palmitic acid Fatty fatty acid vinyl compounds such as vinyl and vinyl stearate; vinyl ether ethylenically unsaturated monomers such as butyl vinyl ether and ethyl vinyl ether;
Allyl monomers such as allyl acetate and allyl cyanide; vinyl monomers such as vinyl cyanide, vinyl cyclohexane and vinyl methyl ketone; ethynyl monomers such as acetylene and ethynyl toluene Perfluorobutylethylene, perfluorohexylethylene, perfluorooctylethylene, per Examples thereof include monomers having an ethylenically unsaturated bond other than (meth) acrylate, such as perfluoroalkyl such as fluorodecylethylene and perfluoroalkyl group-containing ethylenically unsaturated compounds such as alkylenes.
From the viewpoint of solubility and handleability, it is preferable to copolymerize a monomer having a polyether chain and / or a monomer having a polyester chain, and 10% by mass or more is preferable, and 20% by mass is preferable with respect to 100% by mass of the total of the monomers. % Or more is more preferable.
本発明において、ポリマー（Ａ）は、公知の方法により合成できる。例えば、溶液重合、塊状重合、乳化重合、分散（沈殿）重合などが好ましく、溶液重合や分散（沈殿）重合がより好ましい。 In the present invention, the polymer (A) can be synthesized by a known method. For example, solution polymerization, bulk polymerization, emulsion polymerization, dispersion (precipitation) polymerization and the like are preferable, and solution polymerization and dispersion (precipitation) polymerization are more preferable.
［共重合組成］
ポリマー（Ａ）の共重合組成について説明する。
ポリマー（Ａ）は、構造単位（Ｇ）を１〜１００ｍｏｌ％含んでいることが好ましい。
また、ポリマー（Ａ）は、培地添加剤としては、構造単位（Ｇ）を２０〜１００ｍｏｌ％含んでいることが好ましい。培地への溶解性やハンドリング性の観点から、９５ｍｏｌ％以下で使用することが好ましく、９０ｍｏｌ％以下で使用することがより好ましい。また、細胞用培地での機能発揮の観点から、２０ｍｏｌ％以上で使用することが好ましく、特に４０ｍｏｌ％以上で使用することがより好ましい。
また、ポリマー（Ａ）は、抗体産生を目的とするコート剤としては、構造単位（Ｇ）を１〜７０ｍｏｌ％含んでいることが好ましい。耐水性やハンドリング性の観点から、６５ｍｏｌ％以下で使用することが好ましく、６０ｍｏｌ％以下で使用することがより好ましい。また、細胞培養時の機能発揮の観点から、１ｍｏｌ％以上で使用することが好ましく、特に３ｍｏｌ％以上で使用することがより好ましい。
また、ポリマー（Ａ）は、スフェロイド形成促進を目的とするコート剤としては、構造単位（Ｇ）を１〜１００ｍｏｌ％含んでいることが好ましい。
[Copolymerization composition]
The copolymerization composition of the polymer (A) will be described.
The polymer (A) preferably contains 1 to 100 mol% of the structural unit (G).
Further, the polymer (A) preferably contains 20 to 100 mol% of the structural unit (G) as a medium additive. From the viewpoint of solubility in a medium and handleability, it is preferably used in an amount of 95 mol% or less, and more preferably 90 mol% or less. Further, from the viewpoint of exerting the function in the cell medium, it is preferably used in an amount of 20 mol% or more, and more preferably 40 mol% or more.
Further, the polymer (A) preferably contains 1 to 70 mol% of the structural unit (G) as a coating agent for the purpose of producing an antibody. From the viewpoint of water resistance and handleability, it is preferably used in an amount of 65 mol% or less, and more preferably 60 mol% or less. Further, from the viewpoint of exerting the function at the time of cell culture, it is preferably used in an amount of 1 mol% or more, and more preferably 3 mol% or more.
Further, the polymer (A) preferably contains 1 to 100 mol% of the structural unit (G) as a coating agent for the purpose of promoting spheroid formation.
ポリマー（Ａ）の質量平均分子量は、取り扱い性および基材へ塗布するまたは培地への溶解性の観点から、２，０００〜１，０００，０００であることが好ましく、より好ましくは、５，０００〜５００，０００である。
また、ポリマー（Ａ）は、培地添加剤としては、質量平均分子量は、２，０００以上が好ましく、好ましくは２，０００〜１，０００，０００であり、より好ましくは２，０００〜８００，０００であり、さらに好ましくは３，０００〜８００，０００である。分子量が２，０００以上であることにより、細胞膜透過および細胞取り込みを抑制し、細胞障害性を低下させることができる。また、細胞取り込み抑制によって、細胞膜表面のタンパク質に認識されやすくなり、高い抗体生産量の効果を発揮する。さらに、分子量が１，０００，０００以下であると、培地への溶解性が高く好ましい。
また、ポリマー（Ａ）は、抗体産生を目的とするコート剤としては、質量平均分子量は、２，０００以上が好ましく、好ましくは２，０００〜１，０００，０００であり、より好ましくは２，０００〜８００，０００であり、さらに好ましくは３，０００〜８００，０００である。分子量が２，０００以上であることにより、細胞膜透過および細胞取り込みを抑制し、細胞障害性を低下させることができる。また、細胞取り込み抑制によって、細胞膜表面のタンパク質に認識されやすくなり、高い抗体生産量の効果を発揮する。さらに、分子量が１，０００，０００以下であると、培地への溶解性が高く好ましい。
また、ポリマー（Ａ）は、スフェロイド形成促進を目的とするコート剤としては、２，０００〜１，０００，０００であることが好ましく、より好ましくは、５，０００〜５００，０００である。
The mass average molecular weight of the polymer (A) is preferably 2,000 to 1,000,000, more preferably 5,000, from the viewpoint of handleability and solubility in a substrate or a medium. ~ 500,000.
As a medium additive, the polymer (A) preferably has a mass average molecular weight of 2,000 or more, preferably 2,000 to 1,000,000, and more preferably 2,000 to 800,000. It is more preferably 3,000 to 800,000. When the molecular weight is 2,000 or more, cell membrane permeation and cell uptake can be suppressed, and cytotoxicity can be reduced. In addition, by suppressing cell uptake, it becomes easier to be recognized by proteins on the cell membrane surface, and the effect of high antibody production is exhibited. Further, when the molecular weight is 1,000,000 or less, the solubility in the medium is high, which is preferable.
The polymer (A) preferably has a mass average molecular weight of 2,000 or more, preferably 2,000 to 1,000,000, and more preferably 2, as a coating agent for the purpose of producing an antibody. It is 000 to 800,000, more preferably 3,000 to 800,000. When the molecular weight is 2,000 or more, cell membrane permeation and cell uptake can be suppressed, and cytotoxicity can be reduced. In addition, by suppressing cell uptake, it becomes easier to be recognized by proteins on the cell membrane surface, and the effect of high antibody production is exhibited. Further, when the molecular weight is 1,000,000 or less, the solubility in the medium is high, which is preferable.
The polymer (A) is preferably 2,000 to 1,000,000, more preferably 5,000 to 500,000 as a coating agent for promoting spheroid formation.
［重合開始剤］
ポリマー（Ａ）の重合は、ラジカル重合開始剤（以下、重合開始剤という）を使用することが好ましい。ラジカル重合を開始する能力を有するものであれば使用でき、公知の油溶性重合開始剤や水溶性重合開始剤を使用することができる。
油溶性重合開始剤としては、例えば、ベンゾイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシベンゾエート、ｔｅｒｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ（２−エチルヘキサノエート）、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−３，５，５−トリメチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；
２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１’−アゾビス−シクロヘキサン−１−カルボニトリルなどのアゾビス化合物などが挙げられる。これらは１種類または２種類以上を混合して使用することができる。これら重合開始剤は、エチレン性不飽和単量体１００質量部に対して、０．１〜１０質量部の量を用いるのが好ましい。
本発明においては水溶性重合開始剤を使用することが好ましく、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化水素、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド、など、従来既知のものを好適に使用することができる。
[Polymerization initiator]
For the polymerization of the polymer (A), it is preferable to use a radical polymerization initiator (hereinafter referred to as a polymerization initiator). Any material having the ability to initiate radical polymerization can be used, and known oil-soluble polymerization initiators and water-soluble polymerization initiators can be used.
Examples of the oil-soluble polymerization initiator include benzoyl peroxide, tert-butylperoxybenzoate, tert-butylhydroperoxide, tert-butylperoxy (2-ethylhexanoate), and tert-butylperoxy-3. Organic peroxides such as 5,5-trimethylhexanoate, di-tert-butyl peroxide;
2,2'-azobisisobutyronitrile, 2,2'-azobis-2,4-dimethylvaleronitrile, 2,2'-azobis (4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile), 1,1 Examples thereof include azobis compounds such as'-azobis-cyclohexane-1-carbonitrile. These can be used alone or in admixture of two or more. It is preferable to use 0.1 to 10 parts by mass of these polymerization initiators with respect to 100 parts by mass of the ethylenically unsaturated monomer.
In the present invention, it is preferable to use a water-soluble polymerization initiator, for example, ammonium persulfate, potassium persulfate, hydrogen peroxide, 2,2'-azobis (2-methylpropion amidine) dihydrochloride, etc., which are conventionally known. Can be preferably used.
本発明の生体適合性樹脂は、培地添加剤として好適に使用できる。また本発明の生体適合性樹脂は、コート剤（細胞培養用足場形成材料）としても好適に使用できる。 The biocompatible resin of the present invention can be suitably used as a medium additive. The biocompatible resin of the present invention can also be suitably used as a coating agent (scaffold forming material for cell culture).
本発明の生体適合樹脂は、スフェロイド形成促進剤として好適に使用できる。使用される形態としては特に限定されないが、細胞培養用コート剤（細胞培養用足場形成材料）、細胞培養用培地への添加剤等が挙げられる。 The biocompatible resin of the present invention can be suitably used as a spheroid formation promoter. The form used is not particularly limited, and examples thereof include a cell culture coating agent (cell culture scaffold forming material), an additive to a cell culture medium, and the like.
［細胞培養用コート剤］
本発明において、細胞培養用コート剤はポリマー（Ａ）を含む生体適合性樹脂および溶媒、任意に架橋剤を含むものである。細胞培養用基材の表面に、細胞培養用コート剤を塗工し、次いで乾燥し、細胞培養用塗膜を設けることで、細胞が培養部材に接着しなくなり、細胞スフェロイドの形成が可能となる。
[Coating agent for cell culture]
In the present invention, the cell culture coating agent contains a biocompatible resin containing the polymer (A), a solvent, and optionally a cross-linking agent. By applying a cell culture coating agent to the surface of the cell culture substrate, then drying, and providing a cell culture coating film, the cells do not adhere to the culture member, and cell spheroids can be formed. ..
ポリマー（Ａ）は、細胞培養用コート剤として使用する場合、架橋剤と反応し得る官能基を有するモノマーを共重合させることができる。官能基を有するモノマーとしては、カルボキシル基含有モノマー、水酸基含有モノマー、エポキシ基含有モノマー、アミノ基含有モノマー、イソシアネート基含有モノマーなどを使用することができる。
例えば、カルボキシル基が導入された共重合体は、エポキシ化合物やアジリジン化合物、カルボジイミド化合物、金属キレート化合物、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミド化合物により架橋することができる。水酸基が導入された共重合体は、イソシアネート化合物、カルボジイミド化合物等により架橋することができる。アミノ基が導入された共重合体は、エポキシ化合物により架橋することができる。イソシアネート基が導入された共重合体は、水酸基含有化合物により架橋することができる。これら、架橋点となる官能基を有するモノマーの使用量は、全モノマーの合計１００質量％中、１０質量％以下で使用することが好ましい。１０質量％以下で使用することで、架橋剤を併用した場合に適度な架橋密度を有する塗膜を得ることができる。
When the polymer (A) is used as a coating agent for cell culture, a monomer having a functional group capable of reacting with a cross-linking agent can be copolymerized. As the monomer having a functional group, a carboxyl group-containing monomer, a hydroxyl group-containing monomer, an epoxy group-containing monomer, an amino group-containing monomer, an isocyanate group-containing monomer and the like can be used.
For example, a copolymer having a carboxyl group introduced therein can be crosslinked with an epoxy compound, an aziridine compound, a carbodiimide compound, a metal chelate compound, or an N-hydroxyethylacrylamide compound. The copolymer into which a hydroxyl group has been introduced can be crosslinked with an isocyanate compound, a carbodiimide compound, or the like. The copolymer into which the amino group has been introduced can be crosslinked with an epoxy compound. The copolymer into which an isocyanate group has been introduced can be crosslinked with a hydroxyl group-containing compound. The amount of these monomers having a functional group serving as a cross-linking point is preferably 10% by mass or less based on 100% by mass of the total of all the monomers. By using it in an amount of 10% by mass or less, a coating film having an appropriate crosslinking density can be obtained when a crosslinking agent is used in combination.
［架橋剤］
本発明において用いることのできる架橋剤としては、例えば、エポキシ基、イソシアネート基、およびアジリジニル基から選ばれる少なくとも一種の官能基を有するものの他、金属キレート化合物、カルボジイミド基含有化合物等が挙げられる。これらの架橋剤は、塗膜の弾性率や耐性を上げる目的で使用したり、接着力を調製したりするために用いることができる。
[Crosslinking agent]
Examples of the cross-linking agent that can be used in the present invention include those having at least one functional group selected from an epoxy group, an isocyanate group, and an aziridinyl group, a metal chelate compound, a carbodiimide group-containing compound, and the like. These cross-linking agents can be used for the purpose of increasing the elastic modulus and resistance of the coating film, and for adjusting the adhesive force.
［エポキシ基を有する架橋剤］
本発明で用いられるエポキシ基を有する架橋剤としては、１分子中に２個以上のエポキシ基を有するものであればよく、特に限定されるものではない。
２官能エポキシ基を有する架橋剤としては、例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレンオキサイドジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、１，６-ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、ポリブタジエンジグリシジルエーテル等の脂肪族エポキシ化合物、ビスフェノールＡ型エポキシ樹脂、ビスフェノールＦ型エポキシ樹脂、ビスフェノールＳ型エポキシ樹脂、ビフェノール型エポキシ樹脂、ジヒドロキシベンゾフェノンジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ヒドロキノンジグリシジルエーテル、ジヒドロキシアントラセン型エポキシ樹脂、ビスフェノールフルオレンジグリシジルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジグリシジルアニリン等の芳香族エポキシ化合物、上記記載の芳香族エポキシ化合物の水素添加物、ヘキサヒドロフタル酸ジグリシジルエステル等の脂環式エポキシ化合物などが挙げられる。
エポキシ基を３つ以上有する架橋剤としては、例えば、トリグリシジルイソシアヌレート、トリスフェノール型エポキシ化合物、テトラキスフェノール型エポキシ化合物、フェノールノボラック型エポキシ化合物等が挙げられる。
[Crosslinking agent with epoxy group]
The cross-linking agent having an epoxy group used in the present invention is not particularly limited as long as it has two or more epoxy groups in one molecule.
Examples of the cross-linking agent having a bifunctional epoxy group include ethylene glycol diglycidyl ether, polyethylene oxide diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, tetramethylene glycol diglycidyl ether, and polytetramethylene glycol diglycidyl. Aliphatic epoxy compounds such as ether, 1,6-hexanediol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polybutadiene diglycidyl ether, bisphenol A type epoxy resin, bisphenol F type epoxy resin, bisphenol S type epoxy resin, biphenol type Aromatic epoxy compounds such as epoxy resin, dihydroxybenzophenone diglycidyl ether, resorcinol diglycidyl ether, hydroquinone diglycidyl ether, dihydroxyanthracene type epoxy resin, bisphenol full orange glycidyl ether, N, N-diglycidyl aniline, and the aromatics described above. Examples thereof include hydrogenated epoxy compounds and alicyclic epoxy compounds such as hexahydrophthalic acid diglycidyl ester.
Examples of the cross-linking agent having three or more epoxy groups include triglycidyl isocyanurate, trisphenol type epoxy compound, tetrakisphenol type epoxy compound, phenol novolac type epoxy compound and the like.
［イソシアネート基を有する架橋剤］
本発明で用いられるイソシアネート基を有する架橋剤としては、１分子中に２個以上のイソシアネート基を有した化合物であればよく、特に限定されるものではない。
２官能イソシアネート化合物としては、例えば、２，２’−ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、２，４−トリレンジイソシアネート、２，６−トリレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート等を挙げることができる。
３官能イソシアネート化合物としては、上記で説明したジイソシアネートのトリメチロールプロパンアダクト体、水と反応したビュウレット体、イソシアヌレート環を有する３量体が挙げられる。
また、イソシアネート基を有する架橋剤中のイソシアネート基は、ブロック化されていてもよいし、ブロック化されていなくてもよい。
本発明で用いられるブロック化イソシアネート架橋剤としては、前記イソシアネート化合物中のイソシアネート基がε−カプロラクタム、ＭＥＫオキシム、シクロヘキサノンオキシム、ピラゾール、フェノール等でブロックされたブロック化イソシアネート化合物であればよく、特に限定されるものではない。
[Crosslinking agent with isocyanate group]
The cross-linking agent having an isocyanate group used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having two or more isocyanate groups in one molecule.
Examples of the bifunctional isocyanate compound include 2,2'-diphenylmethane diisocyanate, 2,4'-diphenylmethane diisocyanate, 4,4'-diphenylmethane diisocyanate, 2,4-tolylene diisocyanate, 2,6-tolylene diisocyanate, and hexa. Examples thereof include methylene diisocyanate and isophorone diisocyanate.
Examples of the trifunctional isocyanate compound include the trimethylolpropane adduct of diisocyanate described above, a biuret compound that has reacted with water, and a trimer having an isocyanurate ring.
Further, the isocyanate group in the cross-linking agent having an isocyanate group may or may not be blocked.
The blocked isocyanate cross-linking agent used in the present invention may be a blocked isocyanate compound in which the isocyanate group in the isocyanate compound is blocked with ε-caprolactam, MEK oxime, cyclohexanone oxime, pyrazole, phenol or the like, and is particularly limited. It is not something that is done.
［アジリジニル基を有する架橋剤］
本発明で用いられるアジリジン化合物としては、１分子中に２個以上のアジリジン基を有した化合物であればよく、特に限定されるものではない。アジリジン化合物としては、例えば、２，２’−ビスヒドロキシメチルブタノールトリス［３−（１−アジリジニル）プロピオネート］、４，４−ビス（エチレンイミノカルボニルアミノ）ジフェニルメタン等が挙げられる。
[Crosslinking agent having an aziridinyl group]
The aziridine compound used in the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having two or more aziridine groups in one molecule. Examples of the aziridine compound include 2,2'-bishydroxymethylbutanoltris [3- (1-aziridinyl) propionate], 4,4-bis (ethyleneiminocarbonylamino) diphenylmethane and the like.
［カルボジイミド基含有化合物］
本発明で用いられるカルボジイミド基含有化合物としては、日清紡績株式会社のカルボジライトシリーズを用いることができ、Ｖ−０２、Ｖ−０４、Ｖ−０６、Ｖ−１０などの水性タイプ、Ｖ−０１、Ｖ−０３、Ｖ−０５、Ｖ―０７、Ｖ―０９などの油性タイプ等が挙げられる。
[Carbodiimide group-containing compound]
As the carbodiimide group-containing compound used in the present invention, the carbodilite series of Nisshinbo Holdings Co., Ltd. can be used, and aqueous types such as V-02, V-04, V-06, and V-10, V-01. , V-03, V-05, V-07, V-09 and other oil-based types.
［β−ヒドロキシアルキルアミド基含有化合物］
β−ヒドロキシアルキルアミド基含有化合物としては、分子内にβ−ヒドロキシアルキルアミド基を含有する化合物であればよく、特に限定されるものではない。β−ヒドロキシアルキルアミド基含有化合物としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）アジパミド（エムスケミー社製ＰｒｉｍｉｄＸＬ−５５２）をはじめとする種々の化合物を挙げることができる。
[Β-Hydroxyalkylamide group-containing compound]
The β-hydroxyalkylamide group-containing compound is not particularly limited as long as it is a compound containing a β-hydroxyalkylamide group in the molecule. Examples of the β-hydroxyalkylamide group-containing compound include various compounds such as N, N, N', N'-tetrakis (hydroxyethyl) adipamide (PrimidXL-552 manufactured by Ems-Chemie).
溶媒はコーティングにより表面層を形成可能なものであり、かつ基材層を浸食しないものであれば特に限定されないが、水、メタノール、エタノール、アセトン、メチルエチルケトン（以下、ＭＥＫという）、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の溶媒等が挙げられる。 The solvent is not particularly limited as long as it can form a surface layer by coating and does not erode the base material layer, but is not particularly limited, but water, methanol, ethanol, acetone, methyl ethyl ketone (hereinafter referred to as MEK), acetonitrile, dimethylformamide. Etc., and the like.
［細胞培養用部材］
本発明の細胞培養用部材は、基材上に、本発明のコート剤からなる塗膜を有するものである。塗膜を形成する方法としては、基材に応じて、様々な塗膜形成方法（塗工・印刷・乾燥方法）を選択することができる。
[Cell culture member]
The cell culture member of the present invention has a coating film made of the coating agent of the present invention on a substrate. As a method for forming a coating film, various coating film forming methods (coating / printing / drying methods) can be selected depending on the substrate.
基材としては、上記用途で従来公知に用いられる基材であれば制限無く使用することができ、ポリオレフィン、ポリシクロオレフィン、ポリスチレン、ガラス、シリコーン等が好適に挙げられる。
細胞培養用部材の形態は、立体的な成型体の他、シート状、プレート状、ディッシュ形状であってもよい。シート状のものとしては、フィルム、不織布、紙等が挙げられる。プレート状のものとしては、６穴、１２穴、２４穴、９６穴等の平底プレートが挙げられる。ディッシュ形状のものとしては、直径３５ｍｍ、６０ｍｍ、９０ｍｍ、１００ｍｍ等のディッシュが挙げられる。
培養層を形成する方法としては特に限定されないが、ポリマー（Ａ）を基材上にコーティングする方法が好ましい。コーティング剤は、ポリマー（Ａ）、溶媒、任意に架橋剤を含み、ポリマー（Ａ）の含有量は、コーティング剤の総量中０．１〜１０質量％が好ましく、０．５〜３質量％がより好ましい。この範囲であると、表面層の平均表面粗さＲａを好適な範囲に調整することが容易である。
コーティング方法は、塗工および平均表面粗さＲａの調整の容易さの観点からスピンコート方法が好適であるが、刷毛、浸漬、ローラ、スプレー、注入、塗工機など種々の塗布方法により基材に溶液を塗布することもできる。塗布後、溶媒を除去した後の塗膜の膜厚は限定されないが、１００μｍ以下が好ましい。１０μｍ以下がより好ましく、５μｍ以下がより好ましい。
本発明の表面層の平均表面粗さＲａは好ましくは１０ｎｍ以下であり、より好ましくは５ｎｍ以下である。平均表面粗さＲａは５ｎｍ以下が好ましく、３ｎｍ以下がより好ましい。
As the base material, any base material conventionally known in the above-mentioned applications can be used without limitation, and polyolefins, polycycloolefins, polystyrenes, glasses, silicones and the like are preferably used.
The form of the cell culture member may be a sheet shape, a plate shape, or a dish shape as well as a three-dimensional molded body. Examples of the sheet-like material include films, non-woven fabrics, and papers. Examples of the plate-shaped plate include flat-bottomed plates having 6 holes, 12 holes, 24 holes, 96 holes and the like. Examples of the dish shape include dishes having diameters of 35 mm, 60 mm, 90 mm, 100 mm and the like.
The method for forming the culture layer is not particularly limited, but a method of coating the polymer (A) on the substrate is preferable. The coating agent contains a polymer (A), a solvent, and optionally a cross-linking agent, and the content of the polymer (A) is preferably 0.1 to 10% by mass, preferably 0.5 to 3% by mass, based on the total amount of the coating agent. More preferred. Within this range, it is easy to adjust the average surface roughness Ra of the surface layer to a suitable range.
As the coating method, the spin coating method is preferable from the viewpoint of ease of coating and adjustment of the average surface roughness Ra, but the base material can be coated by various coating methods such as brush, dipping, roller, spray, injection, and coating machine. The solution can also be applied to. The film thickness of the coating film after coating and after removing the solvent is not limited, but is preferably 100 μm or less. 10 μm or less is more preferable, and 5 μm or less is more preferable.
The average surface roughness Ra of the surface layer of the present invention is preferably 10 nm or less, more preferably 5 nm or less. The average surface roughness Ra is preferably 5 nm or less, more preferably 3 nm or less.
［細胞培養用培地］
本発明において、細胞培養用培地は、ポリマー（Ａ）を含む生体適合性樹脂を含むものである。ポリマー（Ａ）を含む生体適合性樹脂を培地に添加することで、細胞が培養部材に接着しなくなり、細胞同士の接着性を促進し、細胞スフェロイドの形成が可能となる。
ポリマー（Ａ）を添加する細胞用培地としては、従来公知の細胞用培地を使用することができる、例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）や、これらの組み合わせが挙げられる。
ポリマー（Ａ）の培地中の濃度は０．００１〜１質量％が好ましく、０．０１〜０．８質量％がより好ましく、０．０１〜０．５質量％がさらに好ましい。
細胞用培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２−メルカプトエタノールなど）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清など）、血清代替物などを添加するのが好ましい。
[Medium for cell culture]
In the present invention, the cell culture medium contains a biocompatible resin containing the polymer (A). By adding the biocompatible resin containing the polymer (A) to the medium, the cells do not adhere to the culture member, the adhesion between the cells is promoted, and cell spheroids can be formed.
As the cell medium to which the polymer (A) is added, a conventionally known cell medium can be used, for example, various commercially available media (αMEM, MEM, DMEM, IMDM, RPMI1640, DMEM / F12, etc.). And these combinations can be mentioned.
The concentration of the polymer (A) in the medium is preferably 0.001 to 1% by mass, more preferably 0.01 to 0.8% by mass, still more preferably 0.01 to 0.5% by mass.
Various growth factors (epithelial growth factor, insulin-like growth factor, nerve growth factor, hepatocellular growth factor, vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, transferrin, steroid hormone) are added to the cell medium as needed. , 2-Mercaptoethanol, etc.), various animal serums (fetal bovine serum (FBS), bovine serum, etc.), serum substitutes, etc. are preferably added.
［生理活性物質の製造方法］
本発明の細胞培養用部材上で細胞を培養することで、生理活性物質を高効率で生産することができる。
[Manufacturing method of bioactive substances]
By culturing cells on the cell culture member of the present invention, a physiologically active substance can be produced with high efficiency.
本実施形態に係る生理活性物質とは、例えば、抗体タンパク質（以下抗体という）やアルブミンなどである。ここで産生される抗体は特に限定されず、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体である。また、免疫グロブリンのクラスは特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）である。 The physiologically active substance according to the present embodiment is, for example, an antibody protein (hereinafter referred to as an antibody), albumin, or the like. The antibody produced here is not particularly limited, and is, for example, a mouse monoclonal antibody, a humanized monoclonal antibody, or a human monoclonal antibody. The class of immunoglobulin is not particularly limited, but is, for example, IgG (for example, IgG1, IgG2, etc.).
本発明で培養される細胞は特に限定されず、生理活性物質の生産に使用可能な細胞であればよい。特に抗体生産可能な細胞であれば、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ｒｏｄｅｎｔｍｙｅｌｏｍａ細胞、（ＳＰ２／Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞などのマウス骨髄腫細胞など）、ハイブリドーマ、および、それらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が挙げられる。 The cells cultured in the present invention are not particularly limited as long as they can be used for the production of physiologically active substances. In particular, if the cells are capable of producing antibodies, for example, CHO cells, BHK cells, HepG2 cells, rodentmyeloma cells (SP2 / O cells, mouse myeloma cells such as NSO cells, etc.), hybridoma, and foreign cells thereof. Examples include transformed cells into which a gene has been introduced.
細胞用培地としては、従来公知の細胞用培地を使用することができる、例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）や、これらの組み合わせが挙げられる。 As the cell medium, a conventionally known cell medium can be used, for example, various commercially available media (αMEM, MEM, DMEM, IMDM, RPMI1640, DMEM / F12, etc.) and combinations thereof. Be done.
細胞用培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２−メルカプトエタノールなど）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清など）、血清代替物などを添加するのが好ましい。 Various growth factors (epithelial growth factor, insulin-like growth factor, nerve growth factor, hepatocellular growth factor, vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, transferrin, steroid hormone) are added to the cell medium as needed. , 2-Mercaptoethanol, etc.), various animal serums (fetal bovine serum (FBS), bovine serum, etc.), serum substitutes, etc. are preferably added.
培養液から細胞を採取するには、浮遊細胞の場合は、例えば、培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集める。接着細胞の場合は、例えば０．２５％トリプシン−０．０２％ＥＤＴＡ液を添加して細胞を浮遊させた後、遠心分離やろ過により集める。 To collect cells from the culture medium, in the case of suspended cells, for example, the culture medium is directly collected by centrifuging or filtering. In the case of adherent cells, for example, 0.25% trypsin-0.02% EDTA solution is added to suspend the cells, and then the cells are collected by centrifugation or filtration.
細胞培養によって生産される生理活性物質、特に抗体は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過または遠心分離により上澄み液を得、これから採取される。また、細胞内に蓄積される物質の場合には、ろ過または遠心分離により得た細胞をホモジナイズ、超音波処理、化学薬品処理などを施し、生産物を抽出した上澄み液を得る。 Physiologically active substances produced by cell culture, especially antibodies, are collected from the supernatant obtained by filtration or centrifugation when the substance accumulates in the culture medium. In the case of substances accumulated in cells, the cells obtained by filtration or centrifugation are subjected to homogenization, sonication, chemical treatment, etc. to obtain a supernatant from which the product has been extracted.
上記上澄みから抗体を分離、精製するには、公知の方法を適宜組み合わせて行う。例えば、硫安沈殿、透析、限外ろ過、電気泳動、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどが好ましい。 In order to separate and purify the antibody from the above supernatant, a known method is appropriately combined. For example, ammonium sulfate precipitation, dialysis, ultrafiltration, electrophoresis, gel filtration, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography and the like are preferable.
［細胞スフェロイドの製造方法］
本実施形態に係る細胞スフェロイドの製造方法では、前述の生体適合性樹脂を含む細胞培養用培地を用いて、細胞スフェロイドを形成する。前述の生体適合性樹脂を培地に添加することにより、細胞が培養部材に接着しなくなり、細胞同士の接着性を促進する。そのため、本実施形態に係る製造方法では、静置培養にて細胞凝集塊を容易に形成することができる。
細胞培養用培地を用いた場合に適用可能な動物細胞は特に限定されない。このような動物細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来細胞が挙げられる。
また、本実施形態に係る細胞スフェロイドの製造方法では、前述の生体適合性樹脂を含む細胞培養用コート剤を用いて、細胞スフェロイドを形成する。前述の生体適合性樹脂を細胞培養用部材の表面に塗布することにより、細胞が培養部材に接着しなくなり、細胞同士の接着性を促進する。そのため、本実施形態に係る製造方法では、静置培養にて細胞凝集塊を容易に形成することができる。
コート剤からなる塗膜を有する細胞培養用部材は、分化機能を有しない接着細胞の培養に好適に使用できる。分化機能を有さない接着細胞とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞である。本発明に用いられる分化機能を有さない細胞は、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｕＨ−７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞などが挙げられる。
本実施形態における培養条件は、通常の動物細胞の培養条件でよく、例えば、５％ＣＯ２雰囲気で、温度が３７℃である条件とすることができる。
[Method for producing cell spheroids]
In the method for producing a cell spheroid according to the present embodiment, a cell spheroid is formed by using a cell culture medium containing the above-mentioned biocompatible resin. By adding the above-mentioned biocompatible resin to the medium, the cells do not adhere to the culture member, and the adhesion between the cells is promoted. Therefore, in the production method according to the present embodiment, cell aggregates can be easily formed by static culture.
The animal cells that can be applied when the cell culture medium is used are not particularly limited. Examples of such animal cells include cells derived from mammals such as humans, mice, and rats.
Further, in the method for producing a cell spheroid according to the present embodiment, a cell spheroid is formed by using the above-mentioned coating agent for cell culture containing a biocompatible resin. By applying the above-mentioned biocompatible resin to the surface of the cell culture member, the cells do not adhere to the culture member, and the adhesion between the cells is promoted. Therefore, in the production method according to the present embodiment, cell aggregates can be easily formed by static culture.
A cell culture member having a coating film made of a coating agent can be suitably used for culturing adherent cells having no differentiation function. Adherent cells that do not have a differentiation function are generally cells that need to adhere themselves to a suitable surface for proliferation. The cells having no differentiation function used in the present invention are cells that can be cultured even when suspended in a medium, and are, for example, CHO cells, HEK293 cells, HuH-7 cells, Vero cells, NIH / 3T3 cells, and the like. Can be mentioned.
The culture conditions in the present embodiment may be normal animal cell culture conditions, for example, a 5% CO 2 atmosphere and a temperature of 37 ° C.
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の権利範囲を何ら制限するものではない。尚、実施例及び比較例における「部」は「質量部」を表し、ｍｏｌとは物質量を表し、ｍｏｌ％は全単量体中の物質量の割合を表す。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the following Examples do not limit the scope of rights of the present invention at all. In the examples and comparative examples, "parts" represents "parts by mass", mol represents the amount of substance, and mol% represents the ratio of the amount of substance in all the monomers.
＜モノマー（ｇ−１）〜（ｇ−３）の製造＞
・［製造例１］〜［製造例３］
製造したモノマーの構造を下記に示す。
<Manufacturing of monomers (g-1) to (g-3)>
-[Manufacturing Example 1] to [Manufacturing Example 3]
The structure of the produced monomer is shown below.
・モノマー（ｇ−１）
・ Monomer (g-1)
・モノマー（ｇ−２）
・ Monomer (g-2)
・モノマー（ｇ−３）
［製造例１］モノマー（ｇ−１）
攪拌機、温度計、還流冷却器、窒素導入管を備えた反応容器に、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（東京化成工業（株）製）１０．５質量部、エタノール３０質量部を、滴下層に２−イソシアナトエチルメタクリレート（昭和電工（株）製）１０．０質量部、エタノール２０質量部をそれぞれ仕込み、窒素気流下、室温で滴下層の混合液を反応層に１時間かけて滴下し、滴下後３０℃で５時間反応させた。反応終了後に酢酸エチルを添加し、析出した白色固体を濾過、精製することでモノマー（ｇ−１）を得た。
[Production Example 1] Monomer (g-1)
In a reaction vessel equipped with a stirrer, thermometer, reflux condenser, and nitrogen introduction tube, 10.5 parts by mass of N-methyl-D-glucamine (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and 30 parts by mass of ethanol were added to the dropping layer. 2-Isocyanatoethyl methacrylate (manufactured by Showa Denko KK) 10.0 parts by mass and 20 parts by mass of ethanol were charged, and the mixed solution of the dropping layer was dropped onto the reaction layer at room temperature under a nitrogen stream over 1 hour. After the dropping, the reaction was carried out at 30 ° C. for 5 hours. After completion of the reaction, ethyl acetate was added, and the precipitated white solid was filtered and purified to obtain a monomer (g-1).
［製造例２］モノマー（ｇ−２）
攪拌機、温度計、還流冷却器、窒素導入管を備えた反応容器に、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（東京化成工業（株）製）１０．９質量部、エタノール３０質量部を、滴下層にソシアン酸３−イソプロペニル-α,α-ジメチルベンジル１２．１質量部、エタノール２０質量部をそれぞれ仕込み、窒素気流下、室温で滴下層の混合液を反応層に１時間かけて滴下し、滴下後３０℃で５時間反応させた。反応終了後に酢酸エチルを添加し、析出した白色固体を濾過、精製することでモノマー（ｇ−２）を得た。
[Production Example 2] Monomer (g-2)
In a reaction vessel equipped with a stirrer, thermometer, reflux condenser, and nitrogen introduction tube, 10.9 parts by mass of N-methyl-D-glucamine (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and 30 parts by mass of ethanol were added to the dropping layer. 12.1 parts by mass of 3-isopropenyl-α, α-dimethylbenzyl-α, α-dimethylbenzyl and 20 parts by mass of ethanol were charged, and the mixed solution of the dropping layer was added dropwise to the reaction layer at room temperature under a nitrogen stream over 1 hour. After that, the reaction was carried out at 30 ° C. for 5 hours. After completion of the reaction, ethyl acetate was added, and the precipitated white solid was filtered and purified to obtain a monomer (g-2).
［製造例３］モノマー（ｇ−３）
攪拌機、温度計、還流冷却器、窒素導入管を備えた反応容器に、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（東京化成工業（株）製）１０．９質量部、エタノール３０質量部を、滴下層にアクリル酸４．３質量部、エタノール２０質量部をそれぞれ仕込み、窒素気流下、室温で滴下層の混合液を反応層に１時間かけて滴下し、滴下後３０℃で５時間反応させた。反応終了後に酢酸エチルを添加し、析出した白色固体を濾過、精製することでモノマー（ｇ−３）を得た。
[Production Example 3] Monomer (g-3)
In a reaction vessel equipped with a stirrer, thermometer, reflux condenser, and nitrogen introduction tube, 10.9 parts by mass of N-methyl-D-glucamine (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and 30 parts by mass of ethanol were added to the dropping layer. 4.3 parts by mass of acrylic acid and 20 parts by mass of ethanol were charged, and the mixed solution of the dropping layer was added dropwise to the reaction layer at room temperature under a nitrogen stream, and the reaction was carried out at 30 ° C. for 5 hours after the dropping. After completion of the reaction, ethyl acetate was added, and the precipitated white solid was filtered and purified to obtain a monomer (g-3).
＜ポリマー（Ａ）の製造＞
［合成例１］
攪拌機、窒素導入管、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒としてＤＭＦ１２０質量部仕込み撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマー（ａ）としてモノマー（ｇ−１）１５．３質量部、モノマー（ｃ）としてＢＭＡ２４．７質量部、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルを０．２質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後８時間熟成した。その後、室温に冷却し反応を停止した。その後、真空ポンプで溶剤を除去し、５つの水酸基と、ウレア結合を持つ構造単位（Ｇ）を含むポリマー（Ｐ−１）を得た。質量平均分子量（Ｍｗ）をゲルパーミエーションクロマトグラフィーで測定すると、１５５，０００であった。
<Manufacturing of polymer (A)>
[Synthesis Example 1]
A reaction vessel equipped with a stirrer, a nitrogen introduction tube, and a dropping tube was charged with 120 parts by mass of DMF as an organic solvent under a nitrogen stream and heated at 80 ° C. for 30 minutes with stirring. Add 15.3 parts by mass of monomer (g-1) as monomer (a), 24.7 parts by mass of BMA as monomer (c), and 0.2 parts by mass of azobisisobutyronitrile as a polymerization initiator in the dropping tube. Dropped over time. After completion of the dropping, the mixture was aged for 8 hours. Then, it was cooled to room temperature and the reaction was stopped. Then, the solvent was removed by a vacuum pump to obtain a polymer (P-1) containing 5 hydroxyl groups and a structural unit (G) having a urea bond. The mass average molecular weight (Mw) was measured by gel permeation chromatography and was 155,000.
［質量平均分子量（Ｍｗ）の測定方法］
ポリマー（Ａ）の質量平均分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリスチレン換算で計測した値を採用した。測定装置及び測定条件としては、下記条件１によることを基本とし、試料の溶解性などにより条件２とした。ただし、重合体種によっては、さらに適宜適切なキャリア（溶離液）及びそれに適合したカラムを選定した。その他の事項については、ＪＩＳＫ７２５２−１〜４：２００８に基づいた。なお、難溶の高分子化合物については下記条件の下、溶解可能な濃度で測定した。
（条件１）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺＭ−Ｈ、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ４０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＨＺ２０００を連結したもの。
キャリア：テトラヒドロフラン
測定温度：４０℃
キャリア流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
試料濃度：０．１質量％
検出器：ＲＩ（屈折率）検出器
注入量：０．１ｍＬ
（条件２）
カラム：ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ４０００、
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ３０００ 及び
ＴＯＳＯＨＴＳＫｇｅｌＳｕｐｅｒＡＷ２５００を連結したもの。
キャリア：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１Ｌ）、トリエチルアミン（３．０４ｇ）、ＬｉＢｒ（０．８７ｇ）の混合液
測定温度：４０℃
キャリア流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
[Measurement method of mass average molecular weight (Mw)]
For the mass average molecular weight of the polymer (A), a value measured by gel permeation chromatography (GPC) in terms of standard polystyrene was adopted. The measuring device and the measuring conditions were basically based on the following condition 1, and were set to condition 2 depending on the solubility of the sample and the like. However, depending on the polymer type, an appropriate carrier (eluent) and a column suitable for the carrier (eluent) were selected as appropriate. Other matters were based on JISK7252-1-4: 2008. The poorly soluble polymer compound was measured at a soluble concentration under the following conditions.
(Condition 1)
Column: TOSOHTSKgelSuperHZM-H,
A combination of TOSOHTSKgelSuperHZ4000 and TOSOHTSKgelSuperHZ2000.
Carrier: Tetrahydrofuran Measurement temperature: 40 ° C
Carrier flow rate: 1.0 mL / min
Sample concentration: 0.1% by mass
Detector: RI (refractive index) detector Injection volume: 0.1 mL
(Condition 2)
Column: TOSOHTSKgelSuperAW4000,
A combination of TOSOHTSKgelSuperAW3000 and TOSOHTSKgelSuperAW2500.
Carrier: Mixed solution of N, N-dimethylformamide (1L), triethylamine (3.04g), LiBr (0.87g) Measurement temperature: 40 ° C.
Carrier flow rate: 0.6 mL / min
［合成例２］、［合成例１９］、［合成例２０］、［合成例３８〜４０］、［合成例４３〜４５］
ポリマー（Ｐ−１）と同様の方法で、表１の組成および仕込み質量部に従って合成を行い、ポリマー（Ｐ−２）、（Ｐ−２２〜２３）、（Ｐ−４４〜４６）、（Ｐ−５１〜５３）を得た。
[Synthesis Example 2], [Synthesis Example 19], [Synthesis Example 20], [Synthesis Example 38-40], [Synthesis Example 43-45]
Synthesis was carried out according to the composition and mass parts charged in Table 1 in the same manner as for the polymer (P-1), and the polymers (P-2), (P-22-23), (P-44 to 46), (P). -51-53) was obtained.
［合成例３］
攪拌機、窒素導入管、滴下管を備えた反応容器に、窒素気流下、有機溶媒としてトルエン１２０質量部仕込み撹拌下８０℃で３０分加熱した。滴下管にモノマー（ｂ）として２−イソシアナトエチルメタクリレート８．６質量部、重合開始剤としてＡＩＢＮを０．２質量部仕込み、２時間かけて滴下した。滴下終了後８時間熟成した。その後、室温に冷却し反応を停止した。
次に、４つ以上の水酸基と１つのアミノ基を有する化合物（Ｇ´）としてＤ−グルカミン１０質量部およびエタノール４０質量部加え、室温で５時間反応させた。その後、ダイヤフラムポンプで溶剤を除去し、４つ以上の水酸基を有する化合物と、アミド結合もしくはウレア結合とを有するポリマー（Ａ）（Ｐ−３）を得た。
[Synthesis Example 3]
A reaction vessel equipped with a stirrer, a nitrogen introduction tube, and a dropping tube was charged with 120 parts by mass of toluene as an organic solvent under a nitrogen stream and heated at 80 ° C. for 30 minutes under stirring. 8.6 parts by mass of 2-isocyanatoethyl methacrylate as the monomer (b) and 0.2 parts by mass of AIBN as the polymerization initiator were charged in the dropping tube, and the mixture was added dropwise over 2 hours. After completion of the dropping, the mixture was aged for 8 hours. Then, it was cooled to room temperature and the reaction was stopped.
Next, 10 parts by mass of D-glucamine and 40 parts by mass of ethanol were added as a compound (G') having four or more hydroxyl groups and one amino group, and the mixture was reacted at room temperature for 5 hours. Then, the solvent was removed by a diaphragm pump to obtain polymers (A) and (P-3) having a compound having four or more hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond.
［合成例４〜１８］、［合成例２１〜３４］、［合成例３５〜３７］、［合成例４１〜４２］
ポリマー（Ｐ−３）と同様の方法で、表１の組成および仕込み質量部に従って合成を行い、ポリマー（Ｐ−４〜１８）、（Ｐ−２４〜３７）、（Ｐ−４１〜４３）、（Ｐ−４９〜５０）を得た。
[Synthesis Examples 4 to 18], [Synthesis Examples 21 to 34], [Synthesis Examples 35 to 37], [Synthesis Examples 41 to 42]
Synthesis was carried out in the same manner as for the polymer (P-3) according to the composition and the mass portion charged in Table 1, and the polymers (P-4 to 18), (P-24 to 37), (P-41 to 43), and the like. (P-49-50) were obtained.
［比較合成例１〜９］
（Ｐ−３）と同様の方法で、表１の組成および仕込み質量部に従って合成を行い、ポリマー（Ｐ−１９〜２１）、（Ｐ−３８〜４０）、（Ｐ−４７〜４８）、（Ｐ−５４）を得た。
[Comparative Synthesis Examples 1 to 9]
Synthesis was carried out in the same manner as in (P-3) according to the composition and mass parts charged in Table 1, and the polymers (P-19-21), (P-38-40), (P-47-48), ( P-54) was obtained.
表１に記載したモノマー及び試薬を下記に示す。
・ＭＯＩ：２−イソシアナトエチルメタクリレート
・ＡＯＩ：２−イソシアナトエチルアクリラート
・ＭＡＡ：メタクリル酸
・ＢＭＡ：ブチルメタクリレート
・ＭＥＡ：メトキシエチルアクリレート
・ＩＥＭＡ：Ｎ−(イソブトキシメチル)アクリルアミド
・ＡＭＥ−４００：日油社製ブレンマー（登録商標）（メトキシポリエチレングリコールアクリレート）
・ＨＥＭＡ：メタクリル酸２−ヒドロキシエチル
・ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
・ＥｔＯＨ：エチルアルコール（エタノール）
・ＡＩＢＮ：２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）
・Ｖ−６０１：ジメチル２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）
The monomers and reagents listed in Table 1 are shown below.
-MOI: 2-isocyanatoethyl methacrylate-AOI: 2-isocyanatoethylacryllate-MAA: methacrylic acid-BMA: butyl methacrylate-MEA: methoxyethyl acrylate-IEMA: N- (isobutoxymethyl) acrylamide-AME-400 : Blemmer (registered trademark) manufactured by Nichiyu Co., Ltd. (methoxypolyethylene glycol acrylate)
-HEMA: 2-hydroxyethyl methacrylate-DMF: N, N-dimethylformamide-EtOH: ethyl alcohol (ethanol)
-AIBN: 2,2'-azobis (2-methylpropionitrile)
V-601: Dimethyl 2,2'-azobis (2-methylpropionate)
＜タンパク質産生用コート剤の実施例＞［実施例１］〜［実施例１９］、［比較例１〜９］ <Examples of coating agents for protein production> [Example 1] to [Example 19], [Comparative Examples 1 to 9]
［ポリマー溶液（コーティング液）の調製］
コーティング液は、ポリマー（Ａ）を任意の溶液に溶解させることで調製でき、培養容器の表面にポリマーをコーティングする際に用いることができる。コーティング液の調製のため、［合成例１〜１８］及び［比較合成例１〜３］で得られた各ポリマーをポリマー濃度が１質量％となるようエタノールに希釈し、表２に記載のポリマー溶液（コーティング液）（ＣＴ−１〜２８）を調製した。
[Preparation of polymer solution (coating solution)]
The coating liquid can be prepared by dissolving the polymer (A) in an arbitrary solution, and can be used when coating the polymer on the surface of the culture vessel. For the preparation of the coating solution, each polymer obtained in [Synthetic Examples 1 to 18] and [Comparative Synthesis Examples 1 to 3] was diluted with ethanol so that the polymer concentration was 1% by mass, and the polymers shown in Table 2 were prepared. A solution (coating solution) (CT-1 to 28) was prepared.
［細胞培養用部材（Ｓ−１〜３、Ｓ−５〜２８）の作製］
下記の直径３５ｍｍの未処理ディッシュ（Ｄ−１）に、表２に記載の上述のコーティング液を１ｍＬ添加し、３０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。室温で２４時間乾燥させ、コーティング液で内面が被覆された細胞培養用部材（Ｓ−１〜３、Ｓ−５〜２８）を作製した。
［細胞培養用部材（Ｓ−４）の作製］
下記の細胞培養用９６Ｕ字ウェルプレート（Ｄ−２）に、表２に記載の上述のコーティング液を約０．４ｍＬ添加し、すぐにコーティング液を除去した。室温で２４時間乾燥させ、コーティング液で内面が被覆された細胞培養用部材（Ｓ−４）を作製した。
・未処理細胞培養用部材（Ｄ−１）
コーニング製細胞培養用ディッシュ（材質：ポリスチレン）（培養表面は未処理）を使用した。
・未処理細胞培養用部材（Ｄ−２）
コーニング製細胞培養用９６Ｕ字ウェルプレート（材質：ポリスチレン）（培養表面は未処理）を使用した。
[Preparation of cell culture members (S-1 to 3, S-5 to 28)]
To the following untreated dish (D-1) having a diameter of 35 mm, 1 mL of the above-mentioned coating liquid shown in Table 2 was added, and spin coating was performed at 3000 rpm for 30 seconds. The cells were dried at room temperature for 24 hours to prepare cell culture members (S-13, S-5 to 28) whose inner surfaces were coated with a coating solution.
[Preparation of cell culture member (S-4)]
Approximately 0.4 mL of the above-mentioned coating liquid shown in Table 2 was added to the 96U-shaped well plate (D-2) for cell culture below, and the coating liquid was immediately removed. The cells were dried at room temperature for 24 hours to prepare a cell culture member (S-4) whose inner surface was coated with a coating solution.
-Untreated cell culture member (D-1)
A Corning cell culture dish (material: polystyrene) (culture surface was untreated) was used.
-Untreated cell culture member (D-2)
A 96U-shaped well plate (material: polystyrene) (culture surface was untreated) manufactured by Corning for cell culture was used.
＜耐水性試験＞
得られた細胞培養用コート剤を、精密秤量した浅型金属容器に２．０ｇ添加し、１５０℃で１０分加熱し乾燥させた。オーブンから取り出し、浅型金属容器ごと精密秤量した後、浅型金属容器にイオン交換水５．０ｇを加え一晩静置した。浅型金属容器からイオン交換水を吸引排出した後、再度１５０℃で１０分乾燥し、浅型金属容器を精密秤量した。下記式で水への溶解度を算出し、耐水性を４段階の評価基準に基づいて評価した。
水への溶解度（％）＝１００−［（ｚ−ｘ）／（ｙ−ｘ）］×１００
ｘ：浅型金属容器の質量（ｇ）
ｙ：イオン交換水で処理する前の質量（ｇ）
ｚ：イオン交換水で処理した後の質量（ｇ）
◎：水への溶解度≦２％
○：２％＜水への溶解度≦４％
△：４％＜水への溶解度≦１０％
×：１０％＜水への溶解度
<Water resistance test>
2.0 g of the obtained coating agent for cell culture was added to a precision-weighed shallow metal container, and the mixture was heated at 150 ° C. for 10 minutes and dried. After taking out from the oven and precisely weighing the whole shallow metal container, 5.0 g of ion-exchanged water was added to the shallow metal container and allowed to stand overnight. After sucking and discharging the ion-exchanged water from the shallow metal container, it was dried again at 150 ° C. for 10 minutes, and the shallow metal container was precisely weighed. The solubility in water was calculated by the following formula, and the water resistance was evaluated based on a four-step evaluation standard.
Solubility in water (%) = 100-[(zx) / (yx)] x 100
x: Mass of shallow metal container (g)
y: Mass (g) before treatment with ion-exchanged water
z: Mass (g) after treatment with ion-exchanged water
⊚: Solubility in water ≤ 2%
◯: 2% <solubility in water ≤ 4%
Δ: 4% <solubility in water ≤ 10%
X: 10% <solubility in water
＜細胞のＡＴＰアッセイ＞
細胞培養用コート剤の細胞毒性を細胞のＡＴＰを測定することで評価した。Ｕ字底９６ウェルプレートに、上記コーティング液（ＣＴ−１〜２８）を各ウェルに約０．４ｍＬずつ注入した。これを吸引排出した後、５０℃で３時間乾燥させることにより、ポリマー溶液で内面が被覆されたプレートを調製した。
これをエチレンオキサイドガス滅菌した後、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを培地とし、マウス線維芽細胞用細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）を１ウェルあたり１×１０４個／１００μＬ播種し、５％ＣＯ２／３７℃のインキュベーターで５日目まで培養した。
細胞毒性は、１，５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μＬのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００ｍＬの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。
細胞毒性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
◎：５０％以上（非常に良好）
○：２０％以上５０％未満（良好）
△：１５％以上２０％未満（やや不良）
×：１５％未満（不良）
<Cell ATP assay>
The cytotoxicity of the cell culture coating agent was evaluated by measuring the ATP of cells. About 0.4 mL of the above coating liquid (CT-1 to 28) was injected into each well into a U-shaped bottom 96-well plate. After sucking and discharging this, the plate was dried at 50 ° C. for 3 hours to prepare a plate whose inner surface was coated with a polymer solution.
After sterilizing this with ethylene oxide gas, 10% of fetal bovine serum (FBS) was added to Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) as the medium, and a mouse fibroblast cell line (NIH3T3 cells) was added to 1 × per well. 10 4/100 [mu] L were seeded and cultured to 5 days in 5% CO 2/37 ℃ incubator.
Cytotoxicity was assessed by performing an ATP assay after 1.5 days. Specifically, 100 μL of ATP reagent (“lump” ATP measurement reagent: manufactured by Toyo Venet Co., Ltd.) is added to the well after culturing, pipetting 5 times, allowing to stand at room temperature for 5 minutes, and then 100 mL of reagent. -The cytolytic solution was separated into a separate plate and stirred for 1 minute. The amount of light emitted from this was measured using MisrasLB940 (manufactured by Berthold).
Cytotoxicity = (luminance after 5 days of culture) / (luminance after 1 day of culture) x 100
⊚: 50% or more (very good)
◯: 20% or more and less than 50% (good)
Δ: 15% or more and less than 20% (slightly defective)
×: Less than 15% (defective)
＜抗体産生性の評価＞
培地はＤｙｎａｍｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製）を用い、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎを１質量％になるように添加し、基礎培地とした。細胞培養用部材（Ｓ−１〜２８）に、基礎培地およびＩｇＧ遺伝子を導入した。続いて、該細胞培養用部材にＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ製ＣＲＬ−１２４５５）を２００，０００ｃｅｌｌｓ加え、３７℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に３〜４日に一度、上澄み液を回収し、新たな基礎培地を加えて交換し、これを５回交換した。培地交換を５回繰り返した後の細胞培養液を遠心分離することで、培地上清を回収した。培地中の抗体量を、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＨｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。ポリマー（Ｐ１−１）を含まない細胞培養用部材（Ｄ−１）で培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１．０３以上１．２未満（良好）
△：１以上１．０３未満（やや不良）
×：１未満（不良）
<Evaluation of antibody production>
As the medium, Dynamis Medium (manufactured by Gibco) was used, and L-Glutamine was added so as to be 1% by mass to prepare a basal medium. The basal medium and the IgG gene were introduced into the cell culture members (S-1 to 28). Subsequently, 200,000 cells of a CHO cell line (CRL-12455 manufactured by ATCC) secreting and producing IgG antibody was added to the cell culture member, and the cells were cultured at 37 ° C. During culturing, the supernatant was collected once every 3 to 4 days before the nutrient source was depleted, and a new basal medium was added and replaced, which was replaced 5 times. The culture medium supernatant was collected by centrifuging the cell culture medium after repeating the medium exchange 5 times. The amount of antibody in the medium was measured using Human IgG ELISA Quantitation Set manufactured by Bethyl Laboratories, Inc. In addition, the amount of DNA in the precipitated cell group was also quantified and calculated as the amount of antibody produced per unit amount of DNA. Judgment was made by a relative value when the result when cultured in the cell culture member (D-1) containing no polymer (P1-1) was 1.
⊚: 1.2 or more (very good)
◯: 1.03 or more and less than 1.2 (good)
Δ: 1 or more and less than 1.03 (slightly defective)
×: Less than 1 (defective)
＜アルブミン産生性の評価＞
Ｌ−グルタミン含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）に、最終濃度が１０％となるようにウシ胎児血清、および最終濃度が１％になるように抗生物質ペニシリンを加え、撹拌し基礎培地を用意した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように上記基礎培地に添加し、細胞懸濁培地を調製した。本細胞懸濁培地を、上記コート剤がコーティングされた細胞培養用部材（Ｓ−１）に２ｍＬ分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後のＨｅｐＧ２細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで培地上清を回収した。培地中のアルブミン量を、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。ポリマー（Ｐ１−１）を含まない細胞培養用部材（Ｄ−１）で培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１．０３以上１．２未満（良好）
△：１以上１．０３未満（やや不良）
×：１未満（不良）
<Evaluation of albumin productivity>
Fetal bovine serum to a final concentration of 10% and the antibiotic penicillin to a final concentration of 1% in Dulvecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium (manufactured by Sigma-Aldrich) containing L-glutamine. Was added, and the mixture was stirred to prepare a basal medium. Human liver cancer cell line HepG2 cells were added to the above-mentioned basal medium so as to have a concentration of 50,000 cells / mL to prepare a cell suspension medium. 2 mL of this cell suspension medium was dispensed into a cell culture member (S-1) coated with the above coating agent. Then, this plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a static state for 3 days. After culturing for 3 days, the culture solution containing HepG2 cells was collected, and the culture medium supernatant was collected by centrifugation. The amount of albumin in the medium was measured using Bethyl Laboratories, Inc. Albumin ELISA Quantation Set. In addition, the amount of DNA in the precipitated cell group was also quantified and calculated as the amount of antibody produced per unit amount of DNA. Judgment was made by a relative value when the result when cultured in the cell culture member (D-1) containing no polymer (P1-1) was 1.
⊚: 1.2 or more (very good)
◯: 1.03 or more and less than 1.2 (good)
Δ: 1 or more and less than 1.03 (slightly defective)
×: Less than 1 (defective)
表２に記載した樹脂を下記に示す。
・ＰＥＧ２０００：ポリエチレングリコール、平均分子量＝２０００
・ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、平均分子量＝１００００
・ＰＶＡｃ：ポリビニル酢酸、平均分子量＝２５０００
・ベタイン：Ｎ−メチルカルボキシベタインポリマー、平均分子量＝２００００
・ＭＣ：メチルセルロース、平均分子量＝５００００
・ＣＳ：コンドロイチン硫酸、平均分子量＝５０００
The resins listed in Table 2 are shown below.
PEG2000: Polyethylene glycol, average molecular weight = 2000
-PVP: Polyvinylpyrrolidone, average molecular weight = 10000
PVAC: polyvinyl acetic acid, average molecular weight = 25000
-Betaine: N-methylcarboxybetaine polymer, average molecular weight = 20000
-MC: Methyl cellulose, average molecular weight = 50,000
-CS: Chondroitin sulfate, average molecular weight = 5000
表２の通り、本発明のコート剤は従来技術に対して優位か効果を示すことを確認した。 As shown in Table 2, it was confirmed that the coating agent of the present invention is superior or effective over the prior art.
［実施例２０］〜［実施例４１］、［比較例１０〜１８］
合成例で得られたポリマーを培地添加剤として用いて、表３に従って、ポリマー種およびポリマー濃度を調整して培地を作製し、下記の手順で評価した。
[Example 20] to [Example 41], [Comparative Examples 10 to 18]
Using the polymer obtained in the synthetic example as a medium additive, a medium was prepared by adjusting the polymer species and polymer concentration according to Table 3, and evaluated by the following procedure.
＜リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）への溶解性＞
得られた細胞用培地添加剤について、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）への溶解性を評価した。ＰＢＳ溶液は細胞生物学や生化学などの細胞を扱う実験で使用される緩衝液であり、生体内に存在する普遍的なイオンで構成されている。本溶液にポリマーが溶解しなければ細胞用培地添加剤として用いることができない。市販の１０倍濃縮のＰＢＳ溶液を用いて、表３に記載の細胞用培地添加剤の濃度を表３の通りに調製し、ポリマーのＰＢＳへの溶解性を目視で評価した。結果は以下の指標を基に表３に示した。
◎：室温で迅速に溶解（非常に良好）
○：室温で３０分以内に溶解（良好）
△：４０℃加熱で溶解（やや不良）
×：不溶（不良）
<Solubility in phosphate buffered saline (PBS)>
The solubility of the obtained cell medium additive in phosphate buffered saline (PBS solution) was evaluated. PBS solution is a buffer solution used in experiments dealing with cells such as cell biology and biochemistry, and is composed of universal ions existing in the living body. If the polymer is not dissolved in this solution, it cannot be used as a medium additive for cells. Using a commercially available 10-fold concentrated PBS solution, the concentrations of the cell medium additives shown in Table 3 were prepared as shown in Table 3, and the solubility of the polymer in PBS was visually evaluated. The results are shown in Table 3 based on the following indicators.
◎: Quickly dissolves at room temperature (very good)
◯: Dissolved within 30 minutes at room temperature (good)
Δ: Melted by heating at 40 ° C (slightly defective)
×: Insoluble (defective)
＜ハンドリング性能評価＞
培地用添加剤として用いるためには、適切な粘度とする必要があり、これをハンドリング性能として評価した。培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを使用した（以下、「１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地」とも呼ぶ）。この１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地に、表３に記載の細胞用培地添加剤を表３に記載の最終濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。本培地組成物の粘度は３７℃条件下でＢ型粘度計（株式会社東京計器製）により、＃３ローターを使用して１００ｒｐｍの回転数で５分間測定したときの粘度を示す。評価結果を表３に示す。
◎：５０ｍＰａｓ未満（非常に良好）
○：５０ｍＰａｓ以上、１００ｍＰａｓ未満（良好）
△：１００ｍＰａｓ以上、５００ｍＰａｓ未満（やや不良）
×：５００ｍＰａｓ以上（不良）
<Handling performance evaluation>
In order to use it as an additive for a medium, it is necessary to have an appropriate viscosity, which was evaluated as handling performance. As the medium, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) was used (hereinafter, also referred to as "10% FBS-DMEM medium"). A medium composition was prepared by adding the cell culture medium additives shown in Table 3 to the 10% FBS-DMEM medium to the final concentrations shown in Table 3 and stirring the mixture. The viscosity of this medium composition shows the viscosity when measured by a B-type viscometer (manufactured by Tokyo Keiki Co., Ltd.) under 37 ° C. at a rotation speed of 100 rpm for 5 minutes using a # 3 rotor. The evaluation results are shown in Table 3.
⊚: Less than 50 mPas (very good)
◯: 50 mPas or more and less than 100 mPas (good)
Δ: 100 mPas or more and less than 500 mPas (slightly defective)
X: 500 mPas or more (defective)
＜細胞のＡＴＰアッセイ＞
細胞用培地添加剤の細胞毒性を細胞のＡＴＰを測定することで評価した。９６ウェルプレートに、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したものを培地とし、表３に記載の細胞用培地添加剤を表３に記載の最終濃度になるように添加しマウス線維芽細胞要細胞株（ＮＩＨ／３Ｔ３細胞）を１ウェルあたり１×１０４個／１００μＬ播種し、５％ＣＯ２／３７℃のインキュベーターで５日まで培養した。
続いて、５日目まで培養した細胞のＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸）アッセイを行い、生細胞の割合を評価した。培養後のウェルに１００μＬのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００ｍＬの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。
生細胞の割合＝（培養５日後の発光量）／（細胞培養培地添加剤を加えずに５日間培養した際の発光量）×１００
◎：５０％以上（非常に良好）
○：２０％以上５０％未満（良好）
△：１５％以上２０％未満（やや不良）
×：１５％未満（不良）
<Cell ATP assay>
The cytotoxicity of the cell culture medium additive was evaluated by measuring the ATP of the cells. A 96-well plate supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) in Dalveco's modified Eagle's medium (DMEM) was used as the medium, and the cell medium additive shown in Table 3 was adjusted to the final concentration shown in Table 3. added to 1 × 10 4 cells / 100 [mu] L seeded per well mouse fibroblast essential cell lines (NIH / 3T3 cells) were cultured to 5 days at 5% CO 2/37 ℃ incubator.
Subsequently, ATP (adenosine-5'-triphosphate) assay of cells cultured up to the 5th day was performed to evaluate the proportion of living cells. Add 100 μL of ATP reagent (“lump” ATP measurement reagent: manufactured by Toyo Beanet Co., Ltd.) to the well after culturing, pipet it 5 times, let stand at room temperature for 5 minutes, and then add 100 mL of reagent / cytolysis solution. The cells were separated into separate plates and stirred for 1 minute. The amount of light emitted from this was measured using MisrasLB940 (manufactured by Berthold).
Percentage of living cells = (amount of luminescence after 5 days of culturing) / (amount of luminescence when cultivated for 5 days without adding a cell culture medium additive) × 100
⊚: 50% or more (very good)
◯: 20% or more and less than 50% (good)
Δ: 15% or more and less than 20% (slightly defective)
×: Less than 15% (defective)
＜抗体産生性の評価＞
培地はＤｙｎａｍｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製）を用い、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎを１質量％になるように添加した。以後、これを基礎培地と呼ぶ。これを２セット用意し、得られた表３に記載の細胞用培地添加剤を表３に記載の最終濃度になるように添加した。ポリマーを含む細胞用培地添加剤の濃度が異なる培地にそれぞれＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ製ＣＲＬ−１２４５５）を加え、ＣＨＯ細胞株の濃度が１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液２０ｍＬを、１２５ｍＬの三角フラスコに播種し、３７℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に３〜４日に一度、上澄み液１５ｍＬを回収し、新たな基礎培地１５ｍＬと交換し、これを５回繰り返した。培地交換を５回繰り返した後の細胞培養液を遠心分離することで、培地上清を回収した。培地中の抗体量を、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＨｕｍａｎ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。ポリマーを含む細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１．０３以上１．２未満（良好）
△：１以上１．０３未満（やや不良）
×：１未満（不良）
<Evaluation of antibody production>
The medium was Dynamis Medium (manufactured by Gibco), and L-Glutamine was added in an amount of 1% by mass. Hereinafter, this is referred to as a basal medium. Two sets of these were prepared, and the obtained cell medium additives shown in Table 3 were added to the final concentrations shown in Table 3. A CHO cell line (CRL-12455 manufactured by ATCC), which secretes and produces IgG antibodies by introducing the IgG gene into media having different concentrations of cell medium additives containing a polymer, was added, and the concentration of the CHO cell line was 100,000 cells / mL. A cell suspension was prepared. 20 mL of the obtained cell suspension was seeded in a 125 mL Erlenmeyer flask and cultured at 37 ° C. During culturing, 15 mL of the supernatant was collected once every 3 to 4 days before the nutrient source was depleted, replaced with 15 mL of a new basal medium, and this was repeated 5 times. The culture medium supernatant was collected by centrifuging the cell culture medium after repeating the medium exchange 5 times. The amount of antibody in the medium was measured using Human IgG ELISA Quantitation Set manufactured by Bethyl Laboratories, Inc. In addition, the amount of DNA in the precipitated cell group was also quantified and calculated as the amount of antibody produced per unit amount of DNA. The result was determined by a relative value when the result when the cells were cultured without adding the cell medium additive containing the polymer was 1.
⊚: 1.2 or more (very good)
◯: 1.03 or more and less than 1.2 (good)
Δ: 1 or more and less than 1.03 (slightly defective)
×: Less than 1 (defective)
＜アルブミン産生性の評価＞
１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地に表３に記載の細胞用培地添加剤を表３に記載の最終濃度になるように添加し、攪拌をすることで培地組成物を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、２５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように上記の樹脂微粒子を含む細胞用培地添加剤を添加した培地組成物に播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後の肝細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで培地上清を回収した。培地中のアルブミン量を、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。樹脂微粒子を含む細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。評価結果を表２に示す。
◎：１．２以上（非常に良好）
○：１．０３以上１．２未満（良好）
△：１以上１．０３未満（やや不良）
×：１未満（不良）
<Evaluation of albumin productivity>
The medium composition for cells shown in Table 3 was added to 10% FBS-DMEM medium to the final concentration shown in Table 3 and stirred to prepare a medium composition. Human liver cancer cell line HepG2 cells were seeded in a medium composition to which the above-mentioned cell medium additive containing resin fine particles was added so as to be 250,000 cells / mL, and then in the wells of a 96-well U-bottom microplate. The cells were dispensed to 200 μL per well. Then, this plate was cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) in a static state for 3 days. After culturing for 3 days, the culture solution containing hepatocytes was collected, and the culture medium supernatant was collected by centrifugation. The amount of albumin in the medium was measured using Bethyl Laboratories, Inc. Albumin ELISA Quantation Set. In addition, the amount of DNA in the precipitated cell group was also quantified and calculated as the amount of antibody produced per unit amount of DNA. Judgment was made by a relative value when the result when the cells were cultured without adding the cell medium additive containing the resin fine particles was set to 1. The evaluation results are shown in Table 2.
⊚: 1.2 or more (very good)
◯: 1.03 or more and less than 1.2 (good)
Δ: 1 or more and less than 1.03 (slightly defective)
×: Less than 1 (defective)
表３に記載した樹脂を下記に示す。
・ＰＥＧ２０００：ポリエチレングリコール、平均分子量＝２０００
・ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、平均分子量＝１００００
・ＰＶＡｃ：ポリビニル酢酸、平均分子量＝２５０００
・ベタイン：Ｎ−メチルカルボキシベタインポリマー、平均分子量＝２００００
・ＭＣ：メチルセルロース、平均分子量＝５００００
・ＣＳ：コンドロイチン硫酸、平均分子量＝５０００
The resins listed in Table 3 are shown below.
PEG2000: Polyethylene glycol, average molecular weight = 2000
-PVP: Polyvinylpyrrolidone, average molecular weight = 10000
PVAC: polyvinyl acetic acid, average molecular weight = 25000
-Betaine: N-methylcarboxybetaine polymer, average molecular weight = 20000
-MC: Methyl cellulose, average molecular weight = 50,000
-CS: Chondroitin sulfate, average molecular weight = 5000
表３に記載の通り、本発明の細胞用培地添加剤は従来技術に対して優位な結果を示すことを確認した。 As shown in Table 3, it was confirmed that the cell culture medium additive of the present invention showed superior results to the prior art.
＜スフェロイド形成用コート剤の実施例＞［実施例４２］〜［実施例５３］、［比較例１９〜２２］ <Examples of coating agents for spheroid formation> [Example 42] to [Example 53], [Comparative Examples 19 to 22]
［ポリマー溶液（コーティング液）の調製］
［合成例３５〜４０］及び［比較合成例７〜８］で得られた各ポリマーをエタノール／水＝９０／１０質量部からなる混合溶媒で１質量％に希釈し、コーティング液（Ｃ１〜８）を調製した。
[Preparation of polymer solution (coating solution)]
Each polymer obtained in [Synthesis Examples 35-40] and [Comparative Synthesis Examples 7-8] was diluted to 1% by mass with a mixed solvent consisting of ethanol / water = 90/10 parts by mass, and the coating liquid (C1-8). ) Was prepared.
［細胞培養用部材（Ｓ−２９〜３６）の作成］
Ｕ字底未処理９６ウェルプレート（コーニング製、材質：ポリスチレン）に、表４に記載の本コーティング液（Ｃ−１〜８）を各ウェルに約０．３ｍＬずつ注入した。これを吸引排出した後８０℃で４時間乾燥させることにより、コーティング剤で内面が被覆されたプレート（Ｓ−２９〜３６）を作製した。
[Preparation of cell culture members (S-29 to 36)]
About 0.3 mL of the present coating liquid (C-1 to 8) shown in Table 4 was injected into each well into a U-shaped bottom untreated 96-well plate (manufactured by Corning, material: polystyrene). After sucking and discharging this, it was dried at 80 ° C. for 4 hours to prepare a plate (S-29 to 36) whose inner surface was coated with a coating agent.
［細胞培養用部材（Ｓ−３７〜４４）の作製］
直径３５ｍｍの未処理ディッシュ（コーニング製、材質：ポリスチレン）に、表５に記載の本コーティング液（Ｃ−１〜８）を１ｍＬ添加し、３０００ｒｐｍで３０秒間スピンコートした。室温で２４時間乾燥により、コーティング剤で内面が被覆されたディッシュ（Ｓ−３７〜４４）を作製した。
[Preparation of cell culture members (S-37 to 44)]
To an untreated dish (manufactured by Corning, material: polystyrene) having a diameter of 35 mm, 1 mL of the present coating liquid (C-1 to 8) shown in Table 5 was added and spin-coated at 3000 rpm for 30 seconds. A dish (S-37 to 44) whose inner surface was coated with a coating agent was prepared by drying at room temperature for 24 hours.
＜細胞毒性＞
細胞培養用部材（Ｓ−２９〜４４）をエチレンオキサイドガス滅菌した後、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地を培地とし、マウス線維芽細胞用細胞株（以下、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞とも呼ぶ）を１ウェルあたり１×１０4個(細胞培養用部材（Ｓ−２９〜３６）)、または、１．５×１０5個(細胞培養用部材（Ｓ−３７〜４４）)をそれぞれに播種し、５％ＣＯ２／３７℃のインキュベーターで５日目まで培養した。
細胞毒性は、１，５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後の細胞培養用部材に、１ウェルあたり１００μＬ(細胞培養用部材（Ｓ−２９〜３６）)、または、２ｍＬ(細胞培養用部材（Ｓ−３７〜４４）)のＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００μＬ(細胞培養用部材（Ｓ−２９〜４４）)の試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。評価結果を表４および表５に示す。
細胞毒性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
〇 ： ８０％≦ 細胞毒性
△ ： ２０％≦ 細胞毒性＜８０％
× ： 細胞毒性＜２０％
<Cytotoxicity>
After sterilizing the cell culture members (S-29 to 44) with ethylene oxide gas, a 10% FBS-DMEM medium was used as a medium, and a cell line for mouse fibroblasts (hereinafter, also referred to as NIH / 3T3 cells) was used per well. 1 × 10 4 pieces (cell culture member (S-29 to 36)) or 1.5 × 10 5 pieces (cell culture member (S-37 to 44)) were seeded in each and 5% CO. up to 5 days in an incubator of 2/37 ℃ and culture.
Cytotoxicity was assessed by performing an ATP assay after 1.5 days. Specifically, 100 μL (cell culture member (S-29 to 36)) or 2 mL (cell culture member (S-37 to 44)) of ATP per well is added to the cell culture member after culture. Add a reagent (ATP measurement reagent for "lump": manufactured by Toyo Beanet Co., Ltd.), pipet it 5 times, let stand at room temperature for 5 minutes, and then 100 μL (cell culture member (S-29 to 44)) reagent. -The cell lysate was separated into a separate plate and stirred for 1 minute. The amount of light emitted from this was measured using MisrasLB940 (manufactured by Berthold). The evaluation results are shown in Tables 4 and 5.
Cytotoxicity = (luminance after 5 days of culture) / (luminance after 1 day of culture) x 100
〇: 80% ≤ cytotoxicity Δ: 20% ≤ cytotoxicity <80%
×: Cytotoxicity <20%
＜スフェロイド形成性＞
細胞培養用部材（Ｓ−２９〜４４）が細胞非接着性であるかどうか検証するためにスフェロイド形成性を評価した。スフェロイドを形成すれば細胞非接着性であるといえる。
スフェロイド形成性は、上記と同様の方法で調整したＵ字ウェルプレート、ディッシュを用い、５日後の細胞培養状態を透過式光学顕微鏡４０倍で写真撮影し、細胞の形態を観察することによって評価した。評価結果を表４および表５に示す。
〇：１つまたは複数個のスフェロイドを形成
×：スフェロイドを形成しない
<Spheroid forming>
Spheroid formation was evaluated to verify whether the cell culture members (S-29-44) were cell non-adhesive. If spheroids are formed, it can be said that the cells are non-adhesive.
The spheroid formation property was evaluated by taking a photograph of the cell culture state after 5 days with a transmission optical microscope at 40 times and observing the cell morphology using a U-shaped well plate and a dish adjusted in the same manner as described above. .. The evaluation results are shown in Tables 4 and 5.
〇: Form one or more spheroids ×: Do not form spheroids
＜スフェロイド形成用培地添加剤の実施例＞［実施例５４］〜［実施例６３］、［比較例２４］ <Examples of medium additive for spheroid formation> [Example 54] to [Example 63], [Comparative Example 24]
［細胞培養用培地（Ｂ−１〜６）の調製］
２５℃のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したもの（以下、「１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地」とも呼ぶ）９９質量部中に、表６に記載のポリマーを１質量部入れて撹拌して溶解させた後、２５℃で２４時間放置して、細胞培養用培地（Ｂ−１〜６）を得た。
[Preparation of cell culture medium (B-1 to 6)]
The polymer shown in Table 6 was added to 99 parts by mass of fetal bovine serum (FBS) added to Dalveco's modified Eagle's medium (DMEM) at 25 ° C. (hereinafter, also referred to as “10% FBS-DMEM medium”). After 1 part by mass was added and stirred to dissolve, the mixture was left at 25 ° C. for 24 hours to obtain a cell culture medium (B-1 to 6).
［細胞培養用培地（Ｂ−７〜１２）の調製］
２５℃の１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地９９．２５質量部中に、表７に記載のポリマーを０．７５質量部入れて撹拌して溶解させた後、２５℃で２４時間放置して、細胞培養用培地（Ｂ−７〜１２）を得た。
[Preparation of cell culture medium (B-7-12)]
0.75 parts by mass of the polymer shown in Table 7 was added to 99.25 parts by mass of 10% FBS-DMEM medium at 25 ° C., stirred and dissolved, and then left at 25 ° C. for 24 hours for cell culture. Medium (B-7-12) was obtained.
＜ハンドリング性能評価＞
培地として用いるためには、適切な粘度とする必要があり、これをハンドリング性能として評価した。細胞培養培地（Ｂ−１〜１２）の粘度は３７℃条件下でＢ型粘度計（株式会社東京計器製）により、＃３ローターを使用して１００ｒｐｍの回転数で５分間測定したときの粘度を示す。評価結果を表６および表７に示す。
○：５０ｍＰａｓ以上、１００ｍＰａｓ未満（良好）
△：１００ｍＰａｓ以上、５００ｍＰａｓ未満（やや不良）
×：５００ｍＰａｓ以上（不良）
<Handling performance evaluation>
In order to use it as a medium, it was necessary to have an appropriate viscosity, which was evaluated as handling performance. The viscosity of the cell culture medium (B-1 to 12) is the viscosity when measured with a B-type viscometer (manufactured by Tokyo Keiki Co., Ltd.) under 37 ° C. at a rotation speed of 100 rpm for 5 minutes using a # 3 rotor. Is shown. The evaluation results are shown in Tables 6 and 7.
◯: 50 mPas or more and less than 100 mPas (good)
Δ: 100 mPas or more and less than 500 mPas (slightly defective)
X: 500 mPas or more (defective)
＜細胞毒性評価＞
Ｕ字底未処理９６ウェルプレート（コーニング製、材質：ポリスチレン）をエチレンオキサイドガス滅菌した後、細胞培養用培地（Ｂ−１〜６）を用いて、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１ウェルあたり１×１０4個（細胞培養用培地（Ｂ−１〜６））播種し、５％ＣＯ２／３７℃のインキュベーターで５日目まで培養した。直径３５ｍｍの未処理ディッシュ（コーニング製、材質：ポリスチレン）をエチレンオキサイドガス滅菌した後、細胞培養用培地（Ｂ−７〜１２）を用いて、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１．５×１０5個（細胞培養用培地（Ｂ−７〜１２））播種し、５％ＣＯ２／３７℃のインキュベーターで５日目まで培養した。
細胞毒性は、１，５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μＬ（細胞培養用培地（Ｂ−１〜６））、ディッシュに２ｍＬ（細胞培養用培地（Ｂ−７〜１２））のＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬： 東洋ビーネット社製） を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００μＬの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。評価結果を表６および表７に示す。
細胞毒性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
○：２０％以上（良好）
△：１５％以上２０％未満（やや不良）
×：１５％未満（不良）
<Cytotoxicity evaluation>
After sterilizing a U-shaped bottom untreated 96-well plate (manufactured by Corning, material: polystyrene) with ethylene oxide gas, NIH / 3T3 cells were 1 × 10 per well using a cell culture medium (B-1 to 6). 4 (for cell culture media (B-1 to 6)) were seeded and cultured to 5 days in 5% CO 2/37 ℃ incubator. After sterilizing an untreated dish (manufactured by Corning, material: polystyrene) having a diameter of 35 mm with ethylene oxide gas, 1.5 × 10 5 NIH / 3T3 cells (1.5 × 10 5 cells) were used in a cell culture medium (B-7 to 12). the medium for cell culture (B-7~12)) were seeded and cultured to 5 days in 5% CO 2/37 ℃ incubator.
Cytotoxicity was assessed by performing an ATP assay after 1.5 days. Specifically, 100 μL (cell culture medium (B-1 to 6)) in the well after culturing and 2 mL (cell culture medium (B-7 to 12)) in the dish ATP reagent (“lump” ATP). Measurement reagent: manufactured by Toyo Beanet Co., Ltd.) was added, pipetting was performed 5 times, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and then 100 μL of the reagent / cell lysate was separated into a separate plate and stirred for 1 minute. The amount of light emitted from this was measured using MisrasLB940 (manufactured by Berthold). The evaluation results are shown in Tables 6 and 7.
Cytotoxicity = (luminance after 5 days of culture) / (luminance after 1 day of culture) x 100
◯: 20% or more (good)
Δ: 15% or more and less than 20% (slightly defective)
×: Less than 15% (defective)
＜スフェロイド形成性＞
細胞培養培地（Ｂ−１〜１２）が細胞非接着性であるかどうか検証するためにスフェロイド形成性を評価した。スフェロイドを形成すれば細胞非接着性であるといえる。
スフェロイド形成性は、上記スフェロイド形成用コート剤と同様の方法で調整したウェルプレート、ディッシュを用い、５日後の細胞培養状態を透過式光学顕微鏡４０倍で写真撮影し、細胞の形態を観察することによって評価した。評価結果を表６および表７に示す。
〇：１つまたは複数個のスフェロイドを形成
×：スフェロイドを形成しない
<Spheroid forming>
Spheroid formation was evaluated to verify whether the cell culture medium (B-1-12) was non-adhesive. If spheroids are formed, it can be said that the cells are non-adhesive.
For spheroid-forming property, use a well plate and a dish prepared in the same manner as the above-mentioned spheroid-forming coating agent, and photograph the cell culture state after 5 days with a transmission optical microscope at 40 times to observe the cell morphology. Evaluated by. The evaluation results are shown in Tables 6 and 7.
〇: Form one or more spheroids ×: Do not form spheroids
表に示すように、本発明の生体適合性樹脂を含む細胞培養用部材を用いることで１つまたは複数個のスフェロイドを形成し、細胞毒性、細胞スフェロイドの形成性が良好であることが示された。これは本発明の細胞培養用部材に含まれるポリマー（Ａ）が、細胞毒性を示さず、細胞同士の接着が優先され、細胞と基材との接着性を阻害したためであると考えられる。
それに対して、４つ以上の水酸基と、アミド結合またはウレア結合とを有する構造単位（Ｇ）を有しないポリマーは、細胞毒性がやや不良であり、細胞同士の接着を阻害してしまったと考える。
表に示すように、本発明の生体適合性樹脂を含む細胞培養用培地を用いることで１つまたは複数個のスフェロイドを形成し、細胞毒性を示さず、細胞凝集塊の形成性が良好であることが示された。これは本発明の細胞培養用培地に含まれるポリマー（Ａ）が細胞同士の接着を優先し、細胞と基材との接着性を阻害したためであると考えられる。
それに対して、５つの水酸基と、アミド結合またはウレア結合とを有する構造単位（Ｇ）を有しないポリマーは、細胞毒性がやや不良であり、細胞同士の接着を阻害してしまったと考える。
As shown in the table, one or more spheroids are formed by using the cell culture member containing the biocompatible resin of the present invention, and it is shown that the cytotoxicity and the formability of the cell spheroids are good. It was. It is considered that this is because the polymer (A) contained in the cell culture member of the present invention does not show cytotoxicity, the adhesion between cells is prioritized, and the adhesion between the cells and the substrate is inhibited.
On the other hand, it is considered that the polymer having no structural unit (G) having four or more hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond has a slightly poor cytotoxicity and inhibits the adhesion between cells.
As shown in the table, by using the cell culture medium containing the biocompatible resin of the present invention, one or more spheroids are formed, no cytotoxicity is exhibited, and the formability of cell aggregates is good. Was shown. It is considered that this is because the polymer (A) contained in the cell culture medium of the present invention gives priority to the adhesion between cells and inhibits the adhesion between the cells and the substrate.
On the other hand, it is considered that the polymer having no structural unit (G) having five hydroxyl groups and an amide bond or a urea bond has a slightly poor cytotoxicity and inhibits the adhesion between cells.
Claims (15)
一般式（１）
一般式（２）
一般式（３）
一般式（４）
一般式（５）
一般式（６）
（式中、
ＲおよびＲ１は、水素原子または炭素数１〜８のアルキル基を示し、
Ｙは、アミノ糖構造を示す。） The biocompatible resin according to claim 4, wherein the monomer (a) is at least one kind selected from the monomers represented by the following general formulas (1) to (6).
General formula (1)
General formula (2)
General formula (3)
General formula (4)
General formula (5)
General formula (6)
(During the ceremony,
R and R 1 represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms.
Y indicates an amino sugar structure. )
A method for forming a spheroid, which comprises culturing adherent cells having no differentiation function using the cell culture member according to claim 14.
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