CN106814189B - 一种检测艰难梭菌的试剂盒及其用途 - Google Patents

一种检测艰难梭菌的试剂盒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种艰难梭菌的酶联免疫法检测试剂盒，它包括如下组分：稀释液、封闭液、包被有艰难梭菌抗体的酶标板、酶标二抗、阳性对照品、洗涤液、显色液和终止液，其中，稀释液为每100ml含有1mlNP‑40、0.5～2mlTritonX‑100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸盐缓冲液。本发明还公开了前述试剂盒在检测艰难梭菌中的用途，本发明试剂盒可以高效检测艰难梭菌，应用前景良好。

Description

一种检测艰难梭菌的试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及一种用于检测艰难梭菌的试剂盒及其用途。
背景技术
艰难梭菌(C.DIFF)是一种革兰氏染色阳性、有芽孢、专性厌氧的梭状杆菌，是唯一能引起院内感染的厌氧菌，也是引起院内感染病原体中唯一能形成芽孢的细菌。艰难梭菌感染引起的腹泻主要原因是因为抗生素的使用导致菌群细菌组分改变引起菌群生态失调，从而使艰难梭菌菌群增殖，最终导致腹泻。较高的发生率已经被认为发生在那些长期暴露于抗生素以及具有严重潜在并存病的免疫能力低下的老年和儿童患者中。感染的症状变化范围广泛，从无症状状态或轻度艰难梭菌感染到严重及威胁生命的状态。自从21世纪初，艰难梭菌感染的发生率和严重性急剧上升，在发达国家，艰难梭菌是院内感染性腹泻的首要病因，高达20％报道的抗生素相关性腹泻以及近乎所有的假膜性结肠炎都是由艰难梭菌感染引起的。因此，高效检测艰难梭菌非常重要。
临床上各种各样的检测方式不断发展，包括从最初的产毒株培养，细胞毒性检测和毒素中和试验，到现在最常用的酶联免疫两步法、三步法和PCR基因检测法。PCR基因检测法检测灵敏度过高，但导致的假阳性率也高。酶联免疫法二步法也存在检测效果不佳的问题，需要进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新的用于检测艰难梭菌的试剂盒。
本发明艰难梭菌的酶联免疫法检测试剂盒，它包括如下组分：稀释液、封闭液、包被有艰难梭菌抗体的酶标板、酶标二抗、阳性对照品、洗涤液、显色液和终止液，其中，稀释液为每100ml含有1mlNP-40、0.5～2mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸盐缓冲液。
其中，稀释液为每100ml含有1mlNP-40、0.5～2mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸盐缓冲液。
所述稀释液为每100ml含有1mlNP-40、0.5～1mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸盐缓冲液；进一步优选所述稀释液为每100ml含有1mlNP-40、0.5mlTritonX-100、1gBSA，0.05mlTween20的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述封闭液每100ml含有2gBSA、1g-5g海藻糖、1ml-5mlFBS。进一步优选地，所述封闭液为每100ml含有2gBSA、2g-3g海藻糖、2ml-3mlFBS的磷酸盐缓冲液；优选所述封闭液为每100ml含有2gBSA、3g海藻糖、3mlFBS的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述酶标板上包被的艰难梭菌抗体为鼠抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体以及羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体和羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体的混合物。
优选地，所述包被有艰难梭菌抗体的酶标板按照如下方法制备：取抗体，稀释制成溶液，以抗体计0.2-0.5微克/孔加入酶标板的孔中，4℃包被10-14小时。
优选地，所述酶标二抗中的抗体分别为辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体以及辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体的混合物。
优选地，所述酶标二抗包括酶标二抗1和酶标二抗2，酶标二抗1为每100ml含有1g-2gBSA、5ml-20mlFBS、20-50μg辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体、50ml甘油的磷酸盐缓冲液；酶标二抗2为每100ml含有1g-2gBSA、5ml-20mlFBS、20-50μg辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体、20-50μg辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体、50ml甘油的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述洗涤液是含有0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液；
所述显色液包括含过氧化物的A液及含四甲基联苯胺的B液。
所述终止液是浓度为0.5M-2M的硫酸溶液。
本发明还提供了前述试剂盒在检测艰难梭菌中的用途。
NP-40：乙基苯基聚乙二醇。
TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚。
BSA：牛血清白蛋白。
Tween20：吐温20。
FBS：胎牛血清。
本发明稀释液通过各个组分的配合，可有效的帮助抗体捕获样本中的抗原，提高产品的敏感性。采用本发明试剂盒，应用酶联免疫法二步法可以高效快速检测艰难梭菌，应用前景良好。
下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
具体实施方式
实施例1本发明用于检测艰难梭菌的试剂盒
1、本发明试剂盒的组成
(1)本发明稀释液：
配方1：PBS(PH7.4)、1％NP-40、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
配方2：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
配方3：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
PBS：磷酸缓冲盐溶
(2)本发明封闭液
配方1：PBS、2％BSA、1％海藻糖、1％FBS
配方2：PBS、2％BSA、2％海藻糖、2％FBS
配方3：PBS、2％BSA、3％海藻糖、3％FBS
配方4：PBS、2％BSA、5％海藻糖、5％FBS
(3)其余组分：包被有特异性抗体的酶标板、HRP酶标二抗、阳性对照品(GLDH重组抗原，ToxinA/B重组抗原)、洗涤液、显色液、终止液。
特异性抗体的酶标板：特异性抗体为鼠抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体，羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体和羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体，均购自南京钟鼎生物技术有限公司；各抗体以碳酸盐稀释后，以0.2-0.5微克/孔加入，4℃包被10-14小时，其中，鼠抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体单独一个孔，羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体和羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体混在一起。
HRP酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体，购自武汉博欧特生物科技有限公司，制成每100ml含有1g-2gBSA、5ml-20mlFBS、抗体20-50微克(每种抗体20-50微克)、50ml甘油的磷酸盐缓冲液，pH5.0-7.0。
阳性对照品：含有谷氨酸脱氢酶重组抗原，ToxinA/B重组抗原的磷酸盐缓冲液。谷氨酸脱氢酶重组抗原，ToxinA/B重组抗原均购自南京中鼎生物技术有限公司。
洗涤液：每100ml含0.05mlTween20的磷酸盐缓冲液。
显色液：含过氧化物的A液及含TMB(四甲基联苯胺)的B液。购自北京索莱宝科技有限公司，使用时A液和B液等比混合后100微升/孔加入显色。
终止液：每1L含有0.5M-2M的硫酸溶液。
以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：
实验例1与现有通用稀释液的比较
1、实验材料
本发明试剂盒：采用本发明实施例1的试剂盒，其中封闭液为配方2，稀释液分别采用配方1～配方10的稀释液。
配方1：PBS(PH7.4)、1％NP-40、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
配方2：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
配方3：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
配方4：PBS(PH7.4)、0.1％NP-40、1％BSA、0.05％Tween20
配方5：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％BSA、0.05％Tween20
配方6：PBS(PH7.4)、5％NP-40、1％SDS、1％BSA，0.05％Tween20
配方7：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％SDS、1％BSA，0.05％Tween20
配方8：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％SDS、1％BSA，0.05％Tween20
配方9：PBS(PH7.4)、1％NP-40、1％SDS、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
配方10：PBS(PH7.4)、1％NP-40、2％SDS、0.5％TritonX-100、1％BSA，0.05％Tween20
对照试剂盒：除了稀释液为通用稀释液以外，其余组分同本发明试剂盒，通用稀释液为：PBS(PH7.4)、1％BSA、0.05％Tween20。
2、实验方法
取GLDH重组抗原、阳性样本1，2(产毒艰难梭菌培养上清)，阴性样本(普通大肠杆菌培养上清)和空白(空白为稀释液)，采用本发明试剂盒和对照试剂盒分别检测。
检测方法如下：
分别用不同的稀释液稀释重组抗原、阴性样本、阳性样本，并以稀释液作为空白对照，在包被有特异性抗体的酶标板孔里面分别加入50微升抗原/阴性样本/阳性样本/稀释液对照和50微升HRP酶标二抗，37℃孵育1小时后，TMB显色，显色结束后终止液终止，并在450nm波长读数。
3、实验结果
实验结果如下表1所示：
表1采用不同稀释液检测的结果
抗原/样本 通用稀释液 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5 配方6 配方7 配方8 配方9 配方10
GLDH重组抗原 1.550 1.659 1.067 0.998 1.086 1.894 0.252 0.452 0.332 0.898 0.776
阴性样本 0.119 0.140 0.100 0.230 0.056 0.117 0.408 0.034 0.068 0.200 0.170
阳性样本1 0.299 1.999 1.565 0.798 0.071 0.430 0.211 0.078 0.089 0.689 0.430
阳性样本2 0.278 1.966 1.047 0.490 0.075 0.405 0.243 0.069 0.035 0.442 0.331
空白 0.062 0.055 0.056 0.088 0.100 0.058 0.062 0.055 0.047 0.068 0.098
如上表1可知，使用通用稀释液检测阳性样本1和阳性样本2，其OD值低，结果呈弱阳性，接近本试剂盒的cutoff值，容易造成误判。
而使用本发明配方(配方1、2、3)，阳性样本的OD值远远高于通用稀释液，也高于其他的配方，用于实际检测时，产品的敏感性高，优选配方1和2，最优选配方1，检测时阳性样本1和阳性样本2为强阳性，同时阳性对照(重组抗原)的检测值不低于通用稀释液的检测值。
ToxinA和ToxinB对稀释液的验证实验：
表2 ToxinA和ToxinB验证结果
由于本试剂盒还包含了ToxinA/ToxinB两个抗原的检测，因此利用ToxinA/ToxinB两个抗原对本发明稀释液进行验证。验证结果如上表2所示，使用通用稀释液检测阳性样本1和阳性样本2，其OD值低，结果呈弱阳性，接近本试剂盒的cutoff值，容易造成误判。而使用本发明稀释液(配方1)可检测出阳性样本1和阳性样本2为强阳性，同时阳性对照(重组抗原)的检测值与通用稀释液的检测值无明显差异。因此，本发明稀释液(配方1)可有效提高本试剂盒产品的敏感性。
实验例2与现有通用封闭液的比较
1、实验材料
本发明试剂盒：采用本发明实施例1的试剂盒，其中封闭液为配方1～配方4，稀释液分别采用配方1。
对照试剂盒：除了稀释液为通用封闭液以外，其余组分同本发明试剂盒，通用封闭液为：PBS(PH7.4)、1％BSA、0.05％Tween20。
2、实验方法
取GLDH重组抗原、阳性样本1，2(产毒艰难梭菌培养上清)，阴性样本(普通大肠杆菌培养上清)和空白(空白为稀释液)，采用本发明试剂盒和对照试剂盒分别检测。
检测方法如下：
分别用不同的封闭液对包被有特异性抗体的酶标板进行封闭，各配方的封闭液封闭完以后，一部分于4℃保存，同时另一部分于37℃恒温培养箱中进行加速试验，10天后对各条件的酶标板进行ELISA检测。
检测步骤：在包被有特异性抗体的酶标板孔里面分别加入50微升抗原/阴性样本/阳性样本/稀释液对照和50微升HRP酶标二抗，37℃孵育1小时后，TMB显色，显色结束后终止液终止，并在450nm波长读数。
3、实验结果
实验结果如下表3所示：
表3采用不同封闭液检测的结果
如上表3可知，使用通用封闭液对酶标板进行封闭保护，酶标板在37℃加速10天后，其检测重组抗原和阳性样本的OD值均明显下降，证明酶标板内抗体活性下降，酶标板稳定性较差。而使用本发明封闭液(配方1-配方4)对酶标板进行封闭保护，酶标板在37℃加速10天后，其检测重组抗原和阳性样本的OD值与加速前(4℃保存)几乎无异，证明酶标板内抗体活性及基本保持不变，酶标板稳定性较好，其中，优选配方2和3，最优选配方3。
ToxinA和ToxinB对封闭液的验证实验：
表4 ToxinA和ToxinB验证结果
由于本试剂盒还包含了ToxinA/ToxinB两个抗原的检测，因此利用ToxinA/ToxinB两个抗原对本发明封闭液进行验证。验证结果如上表4所示，使用通用封闭液对酶标板进行封闭保护，酶标板在37℃加速10天后，其检测重组抗原和阳性样本的OD值均明显下降，证明酶标板内抗体活性下降，酶标板稳定性较差。而使用本发明封闭液(配方1-配方4)对酶标板进行封闭保护，酶标板在37℃加速10天后，其检测重组抗原和阳性样本的OD值与加速前(4℃保存)几乎无异，证明酶标板内抗体活性及基本保持不变，酶标板稳定性较好。
综上，本发明试剂盒可以高效检测艰难梭菌，且产品稳定性好，保质期长，应用前景良好。

Claims (7)

1.一种艰难梭菌的酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于：它包括如下组分：
稀释液、封闭液、包被有艰难梭菌抗体的酶标板、酶标二抗、阳性对照品、洗涤液、显色液和终止液，其中，稀释液为每l00 mL含有1 mL NP-40、0.5 mL TritonX-100、lg BSA，0.05mL Tween20的磷酸盐缓冲液；
所述封闭液每100mL含有2g BSA、lg-5g海藻糖、1mL-5mL FBS；
所述酶标板上包被的艰难梭菌抗体分别为羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体和羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体的混合物，以及鼠抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体；
所述酶标二抗中的抗体分别为辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体的混合物，以及辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体。
2.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭液为每100mL含有2g BSA、2g-3g海藻糖、2mL-3mL FBS的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭液为每100mL含有2g BSA、3g海藻糖、3mL FBS的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述包被有艰难梭菌抗体的酶标板按照如下方法制备：取抗体，稀释制成溶液，以各抗体计0. 2-0.5微克／孔加入酶标板的孔中，4℃包被10 -14小时。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗包括酶标二抗1和酶标二抗2，酶标二抗l为每l00mL含有lg-2gBSA、5ml-20mlFBS、20-50µg辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体、50ml甘油的磷酸盐缓冲液；酶标二抗2为每l00mL含有lg-2gBSA、5ml-20mlFBS、20-50µg辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素A多克隆抗体、20-50µg辣根过氧化物酶标记的羊抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体、50ml甘油的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液是含有0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液；
所述显色液包括含过氧化物的A液及含四甲基联苯胺的B液；
所述终止液是浓度为0. 5M-2M的硫酸溶液。
7.权利要求1-6任意一项所述试剂盒在制备检测艰难梭菌试剂中的用途。
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