JP2002516295A - Ａａｖベクターの対流増加送達 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ウイルスベクター、特に組換えＡＡＶビリオンをＣＮＳに送達する方法が提供される。パーキンソン病を処置する方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般的に、ウイルスベクターのＣＮＳへの効率的な送達に関する。
より詳細には、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（特に、神経伝達物質であ
るドパミンに関与する中枢神経系障害）の処置のための遺伝子治療に関する。

【０００２】 （発明の背景） ＣＮＳ障害は、主な公衆衛生問題である。パーキンソン病（ＰＤ）のみで、合
衆国において１００万人を超える人々が罹患している。臨床的に、ＰＤは、突発
的な運動、歩行困難、***不安定性、硬直、および震えにおける減少によって特
徴付けられる。パーキンソン病は、ドパミンの有効性の減少をもたらす脳の黒質
における色素沈着ニューロンの変性によって引き起こされる。ドパミンの変性し
た代謝はまた、脳の特定領域におけるドパミンの増大を示す神経***病患者にお
いても関係している。

【０００３】 現在、多くのＣＮＳ障害（例えば、ＰＤ）は、治療剤の全身投与によって処置
される。しかし、全身投与はしばしば、血液脳関門を通過するための薬物の不能
性が理由で、そして多くの薬物は末梢性の副作用を引き起こすので、有効ではな
い。従って、多くの潜在的に有用な化合物（例えば、タンパク質）は、全身的に
投与され得ない。これらの化合物が血液脳関門を貫通する際に首尾よい場合、こ
れらはまた、中枢神経系の副作用もまた誘導し得る。現在、ＰＤの処置は、しば
しば、ドパをドパミンへと脱カルボキシル化させる酵素である芳香族アミノ酸デ
カルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）の末梢インヒビターであるカルビドパのような化
合物との組み合わせにおける、ドパミン前駆体であるＬ−ドパの経口投与を含む
。しかし、患者の大半において、罹患した脳領域におけるＡＡＤＣの生成は、Ｐ
Ｄの進行につれて減少し、結果として、より多用量のＬ−ドパが必要とされ、患
者の治療的効果を減少させ、そして副作用を増大させる。

【０００４】 現在の全身的療法の制限を考慮すると、遺伝子送達は、ＰＤのようなＣＮＳ障
害の処置のための有望な方法である。遺伝子移入目的のために多くのウイルスに
基いた系が記載されている（例えば、この目的のために現在最も広範に使用され
るウイルスベクター系であるレトロウイルス系）。種々のレトロウイルス系の説
明については、例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒおよび
Ｒｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０-９９０；
Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
１：５-１４；Ｓｃａｒｐａら、（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８０：８４
９-８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９０：８０３３-８０３７；ならびに、Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅお
よびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．
３：１０２−１０９を参照のこと。

【０００５】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系は、遺伝子治療における使用のための優れた
候補として存在する。ＡＡＶは、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属するヘルパー
依存性ＤＮＡパルボウイルスである。ＡＡＶは、増殖性感染を起こすために、無
関係のヘルパーウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、または痘疹のい
ずれか）との感染を必要とする。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶ複製の大半の工程
に必要である付属機能（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を供給する。
ＡＡＶの概説については、例えば、ＢｅｒｎｓおよびＢｏｈｅｎｚｋｙ（１９８
７）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）３２：２４３−３０７を参照のこと。

【０００６】 ＡＡＶは広範な組織に感染し、そして他のウイルスベクターで観察された、動
物モデルにおける細胞傷害性効果および有害な免疫反応を誘発しなかった（例え
ば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｆｌｏｔｔ
ｅら（１９９３）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：１０６１３−１０６１７；Ｋａｓｓ
−ｅｉｓｅｒら（１９９２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：３９５−４０２；
Ｙａｎｇｅら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：４４０７−４４１１；Ｃｏｎｒａｄら
（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６５８−６６８；Ｙａｎｇら（１
９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１３７−１４４；Ｂｒｙｎｅｓら（１
９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６：３０４５−３０５５を参照のこと）。Ａ
ＡＶは、非***組織を形質導入し得るので、ＡＡＶは、遺伝子を中枢神経系（Ｃ
ＮＳ）に送達するために十分に適合され得る。米国特許第５，６７７，１５８号
は、ＡＡＶベクターを作製する方法を記載する。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ
）プロモーターの制御下にある治療用遺伝子を含むＡＡＶベクターは、哺乳動物
の脳を形質導入すること、および疾患のモデルにおいて機能的効果を有すること
が示されている。

【０００７】 導入遺伝子を保有するＡＡＶベクターは、例えば、Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９
４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１４８−１５３；ＷＯ９５／２８４
９３（１９９５年１０月２６日公開）；ＷＯ９５／３４６７０（１９９５年１２
月２１日公開）；Ｄｕｒｉｎｇら（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：
８２０−８２７；Ｍａｎｄｅｌら（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：４
２７１−４２８４；Ｓｚｃｙｐｋａら（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ ２２：１６７
−１７８に記載されている。しかし、ＡＡＶベクターのＣＮＳへの送達は、困難
であることが証明されている。ＡＡＶは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子をマ
ウスの実験的神経膠腫に移入させるために使用されており、そしてＡＡＶ−ｔｋ
が、ガンシクロビルの細胞殺傷効果に対してこれらの脳腫瘍を感受性にさせる能
力が実証されている。Ｏｋａｄａら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３
：９５９−９６４；Ｍｉｚｕｎｏら（１９９８）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．８９：７６−８０。ヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）遺伝子（アミ
ノ酸チロシンのドパへの変換に関与する酵素）を含むＡＡＶ−ＣＭＶベクターの
、成体ラット脳への注入は、ニューロンおよびグリアの両方の形質導入をもたら
した（Ｋａｐｌｉｔｔら（１９９５）ＶＩＲＡＬ ＶＥＣＴＯＲＳ、ＧＥＮＥ
ＴＨＥＲＡＰＹ ＡＮＤ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ
、ＫａｐｌｉｔｔおよびＬｏｅｗｙ編、１２：１９３−２１０、Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら（１９９７）Ｅ
ｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１４７−１５６）。同じベクターのサル線条
への送達は、２．５ヶ月までの間に強力なＴＨ発現をもたらした（Ｄｕｒｉｎｇ
ら、前出）。さらに、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＴＨは、パーキンソン病のげっ歯目モデ
ルにおいて試験され、ここでこれは６−ヒドロキシドパミン病変ラットの回転挙
動において有意な改善を引き起こした（Ｆａｎら（１９９８）Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２５２７−２５３７；Ｍａｎｄｅｌら（１９９７）
ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９４：１４０８３−１４０８８）。

【０００８】 しかし、これらがＣＮＳを標的化するためのＡＡＶの可能性を実証するような
報告である一方で、それらはまた、ＣＮＳへのＡＡＶベクターの直接的注射が、
限られた数のトランスフェクトされた細胞をもたらし、そしてこのトランスフェ
クトされた細胞が注射経路付近の狭い領域に集中発生することを実証した（例え
ば、Ｄｕｒｉｎｇら、前出；Ｆａｎら、前出を参照のこと）。ＣＮＳへの複数回
の注射は、所望されない合併症を引き起こすので、最少数の注射部位を使用して
脳のより広い領域にＡＡＶベクターを送達する方法についての必要性が残存する
。さらに、注射されるベクターの用量と脳組織におけるその得られる分布との間
の関係は、以前に報告されていない。

【０００９】 さらに、ＰＤの遺伝子治療は、ドパミン合成に関与する酵素をコードする少な
くとも２つの遺伝子（すなわち、ＴＨおよびＡＡＤＣ）の送達に集中されてきた
。これらの方法は、上記に議論された送達問題のすべての対象であり、そしてさ
らに、これらの方法は、両方の遺伝子が適切な量で発現されることを必要とする
。従って、Ｌ−ドパと組み合わせてＡＡＶ−ＡＡＤＣを使用するＰＤの処置もま
た、実証されていない。

【００１０】 （発明の要旨） １つの局面において、本発明は、対流増加送達（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ−ｅｎ
ｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）を使用する、被検体（例えば、ヒ
ト）の中枢神経系（ＣＮＳ）への導入遺伝子を保有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ
）ビリオンを送達するための方法を提供する。ＣＥＤは、例えば、浸透圧ポンプ
または注入ポンプのいずれかを使用することによって実施され得る。好ましい実
施態様において、導入遺伝子は、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ
）またはその活性フラグメントをコードする。この導入遺伝子がＡＡＤＣをコー
ドする場合、ＣＮＳの線条内へｒＡＡＶビリオンを投与することが好ましい。

【００１１】 別の局面において、本発明は、組換えＡＡＶビリオンをＣＮＳ障害を有する被
検体に送達するための方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンは、適切な治療用ポリ
ペプチドをコードし、そしてＣＥＤを使用して被検体のＣＮＳに投与される。好
ましい実施態様において、ＣＮＳ障害は、パーキンソン病（ＰＤ）であり、ｒＡ
ＡＶビリオンは、ＣＮＳの線条に投与され、そしてこの核酸配列は、ＡＡＤＣを
コードする。

【００１２】 別の局面においては、被検体における神経変性疾患を処置するための方法が提
供される。形質導入された細胞において発現可能な治療用核酸配列を保有する組
換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンの調製物は、対流増加送達（ＣＥ
Ｄ）を使用して、ＣＮＳに投与される。１つの実施態様において、神経変性疾患
はＰＤであり、そして治療用ポリペプチドはＡＡＤＣである。なお別の実施態様
において、神経変性疾患を処置する方法はまた、少なくとも１つのさらなる治療
用化合物を被検体に投与する工程、例えば、Ｌ−ドパおよび必要に応じてカルビ
ドパを、全身的に投与する工程を含む。

【００１３】 なお別の局面において、被検体のＣＮＳにおけるドパミン活性のレベルを測定
する方法が提供される。標識されたトレーサが、被検体に投与される。トレーサ
は、好ましくは、ドパミンを利用する細胞に結合する化合物であり、そして標識
は、好ましくは、ラジオアイソトープ（例えば、６−［¹⁸Ｆ］−フルオロ−Ｌ−
ｍ−チロシン（¹⁸Ｆ−ＦＭＴ））である。標識の検出は、トレーサの結合を介し
たドパミン活性の指標である。好ましくは、例えば、陽子射出断層撮影法（ＰＥ
Ｔ）走査を使用することによって、被検体のＣＮＳは画像化される。

【００１４】 神経変性疾患を処置する方法における使用のための、第１および第２の医薬の
製造における第１および第２の治療用化合物の使用（ここで、第１の医薬は、治
療用ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）
ビリオンを含み、この第１の医薬は、対流増加送達（ＣＥＤ）によって被検体に
投与され、そしてここでこの第２の医薬は、被検体に全身的に投与される治療用
化合物を含む）もまた、提供される。

【００１５】 本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮して、当業者
に容易に考え付く。

【００１６】 （発明の詳細な説明） 本発明の実施は、他に指示がなければ、当該分野の技術範囲内のウイルス学、
微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。この
ような技術は、参考文献に十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（最新版）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、最新版）；ＤＮＡ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ
．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（
Ｎ．Ｇａｉｔ編，最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，最新版）；Ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．
Ｈｉｇｇｉｎｓ編，最新版）；ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ，第ＩおよびＩＩ巻（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ編）；Ｆｕｎｄａｍｅ
ｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，第ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄ
ｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。

【００１７】 本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ
」、および「ｔｈｅ」は、内容が明確に他を指示しない限り、複数の表示を含む
。

【００１８】 （定義） 本発明を記載する際に、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように定義
されることが意図される。

【００１９】 「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、宿主細胞に外来ＤＮＡを確実に挿入
するための方法または系をいう。このような方法は、組み込まれていない移入Ｄ
ＮＡの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複
製および発現、または宿主細胞のゲノムＤＮＡへの移入された遺伝子材料の組み
込みを生じ得る。遺伝子移入は、後天性疾患および遺伝性疾患の処置への独特の
アプローチを提供する。多くの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発
されている。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。

【００２０】 「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色
体、ウイルス、ビリオンなどのような、任意の遺伝エレメントを意味する。これ
は適切な制御エレメントと結合した場合に複製可能であり、そして細胞間で遺伝
子配列を移入し得る。従って、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒ
クル、ならびにウイルスベクターを包含する。

【００２１】 「組換えウイルス」とは、例えば、粒子への異種核酸構築物の付加または挿入
によって、遺伝的に改変されているウイルスを意味する。

【００２２】 「ＡＡＶビリオン」とは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子（ＡＡＶキャプ
シドタンパク質コートと結合した直鎖状の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）のよ
うな完全なウイルス粒子を意味する。これに関して、相補的センス（例えば、「
センス」鎖または「アンチセンス」鎖）のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、
任意の１つのＡＡＶビリオンにパッケージされ得、そして両鎖は等しく感染性で
ある。

【００２３】 「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は、本明細書中では、
両側にＡＡＶ ＩＴＲが隣接している目的の異種核酸配列をキャプシド化してい
る、ＡＡＶタンパク質外皮から構成される感染性の複製欠損性ウイルスとして定
義される。ｒＡＡＶビリオンは、その中に導入されるＡＡＶベクター、ＡＡＶヘ
ルパー機能、および付属機能を有している適切な宿主細胞において産生される。
この様式において、宿主細胞は、引き続く遺伝子送達のために、ＡＡＶベクター
（目的の組換えヌクレオチド配列を含む）を感染性組換えビリオン粒子にパッケ
ージするために必要なＡＡＶポリペプチドをコードし得るようにされる。

【００２４】 用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうた
めに使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内部に導入された場合に「
トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が、一般に当
該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、
５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（
１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ、ＥｌｓｅｖｉｅｒおよびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７
を参照のこと。このような技術は、適切な宿主細胞内に１つ以上の外因性ＤＮＡ
部分（例えば、ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子）を導入する
ために使用され得る。

【００２５】 用語「宿主細胞」は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、ア
クセサリ機能ベクター、または他の移入ＤＮＡのレシピエントであり得るか、レ
シピエントであったか、またはレシピエントとして使用される、例えば、微生物
、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を示す。この用語は、トランスフェ
クトされた本来の細胞の子孫を含む。従って、本明細書中で使用される「宿主細
胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞をいう。単一
の親細胞の子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異に起因して、本来の
親細胞と、形態学においてもしくはゲノムにおいて、または全体的なＤＮＡの相
補性において必ずしも完全に同一でなくてもよいことが理解される。

【００２６】 本明細書中で使用される用語「細胞株」は、インビトロでの継続的または延長
された増殖および***を行い得る細胞の集団をいう。しばしば、細胞株は、単一
の祖先細胞に由来するクローン集団である。自発的または誘導された変化が、こ
のようなクローン集団の保存または移動の間に核型において生じ得ることは当該
分野でさらに公知である。従って、この細胞株由来の細胞は、祖先細胞または培
養物と正確に同一でなくてもよいといわれ、そしてこの細胞株は、このような改
変体を含むといわれる。

【００２７】 用語「異種」は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、
通常はともに連結されていない、および／または特定の細胞と通常は関連してい
ない配列を示す。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、他の分
子に関連して天然では見出されない別の核酸分子の内の、またはこれに結合した
核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、コード配列に関連
して天然では見出されない配列に隣接したコード配列を含み得る。異種コード配
列の別の例は、コード配列自体が天然で見出されない構築物である（例えば、ネ
イティブの遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常
は存在しない構築物で形質転換した細胞は、本発明の目的のために異種であると
考えられる。対立遺伝子改変または天然に存在する変異事象は、本明細書で使用
されるように、異種ＤＮＡを生じない。

【００２８】 「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節
配列の制御下におかれる場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写
され（ＤＮＡの場合）そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コ
ード配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カルボキシ
）末端での翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物または
真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲ
ノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列を包含し得るが、これらに限定さ
れない。転写終結配列は、通常コード配列の３’側に位置する。

【００２９】 「核酸」配列とは、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、例えば
、以下のＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含むが、これらに限
定されない配列を表す：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチル
アデノシン、アジリジニルシトシン（ａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）
、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カル
ボキシヒドロキシル−メチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウ
ラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５− カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−
イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル（
ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、１−メチルグアニン、１−メチルイ
ノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン
、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチ
ルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−
２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニ
ルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテ
ニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキ
シ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシ
ル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チ
オウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキ
シ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュー
オシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。

【００３０】 用語、ＤＮＡ「制御配列」とは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル
、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「Ｉ
ＲＥＳ」）、エンハンサーなどを集合的にいい、これはレシピエント細胞におい
てコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード
配列が適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳され得る限り、これらの
制御配列のすべてが常に存在する必要はない。

【００３１】 用語「プロモーター領域」は、通常の意味において、調節配列が、ＲＮＡポリ
メラーゼと結合し得、そして下流の（３’方向）コード配列の転写を開始し得る
遺伝子由来であるＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域をいうために、本明細
書中で使用される。

【００３２】 「作動可能に連結される（た）」とは、このように記載された成分がそれらの
通常の機能を行うように構成されている、エレメントの配置をいう。従って、コ
ード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現をもたらし得る
。制御配列は、それらがその発現に指向するように機能する限り、コード配列と
連続する必要はない。従って、例えば、介在性の非翻訳であるが転写される配列
は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列
は、コード配列となお「作動可能に連結される」と考えられ得る。

【００３３】 「単離される（た）」により、ヌクレオチド配列をいう場合、同じ型の他の生
物学的高分子の実質的非存在下で示された分子が存在することが意味される。従
って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」とは、対象とな
るポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子をいう
；しかし、この分子は、組成物の基本的な特徴に有害な影響を及ぼさない、いく
つかのさらなる塩基または部分を含んでいてもよい。

【００３４】 本出願全体を通して、特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置
を記載する目的で、例えば、特定のヌクレオチド配列が別の配列に関して「上流
」、「下流」、「３’」、または「５’」に配置されると記載される場合、これ
は、当該分野において慣習的にそのようにいわれる、ＤＮＡ分子の「センス」鎖
または「コード」鎖における配列の位置であると理解される。

【００３５】 「遺伝子」とは、転写または翻訳された後に、特定のポリペプチドまたはタン
パク質をコードし得る少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポ
リヌクレオチドをいう。本明細書中に記載される任意のポリヌクレオチド配列を
使用して、それらが関連する遺伝子のより大きなフラグメントまたは全長コード
配列を同定し得る。より大きなフラグメント配列を単離する方法は当業者に公知
である。

【００３６】 ２つの核酸フラグメントは、本明細書中に記載されるように「選択的にハイブ
リダイズ」すると考えられる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、この
ような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を及ぼす。
部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズする
ことを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一の配列のハイブリダイゼーショ
ンの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイを使用して評価
され得る（例えば、サザンブロット、ノザンブロット、溶液ハイブリダイゼーシ
ョンなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。このようなアッセイは、選択性の
変化する程度を使用して、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェン
シーまで変化する条件を使用して行われ得る。低ストリンジェンシーの条件が使
用される場合、非特異的結合の非存在が、部分的程度の配列同一性すら欠如する
二次プローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ
）を使用して評価され得、その結果、非特異的結合事象の非存在下では二次プロ
ーブは、標的にハイブリダイズしない。

【００３７】 ハイブリダイゼーションベースの検出系が利用される場合、標的核酸配列に相
補的な核酸プローブ、次いで、このプローブおよび標的配列が、ハイブリッド分
子を互いに形成するように「選択的にハイブリダイズする」か、または結合する
適切な条件の選択により選択される。「中程度にストリンジェント」な条件下で
標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的に、選択された核
酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０
〜１４のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダ
イズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的に、選択
された核酸プローブの配列と約９０〜９５％を超える配列同一性を有する、少な
くとも約１０〜１４のヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プロ
ーブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用な、プローブおよび標的が特異
的程度の配列同一性を有するハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知で
あるとおり、決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍ
ｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎ
ｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。

【００３８】 ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関しては、多く
の等価な条件を使用して、例えば、以下の因子を変化させることにより特定のス
トリンジェンシーを確立し得ることは、当該分野で周知である：プローブおよび
標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイ
ゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（
例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、およびポリエチレングリコール）の
存在または非存在、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメーター、
ならびに洗浄条件を変化させること。特定のハイブリダイゼーション条件のセッ
トの選択は、当該分野で選択された以下の標準的な方法である（例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。

【００３９】 用語「芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ」または「ＡＡＤＣ」とは、ドパを
ドパミンにカルボキシル基を除去するポリペプチドをいう。従って、この用語は
、全長ＡＡＤＣポリペプチド、その活性なフラグメントまたは機能的ホモログを
含む。

【００４０】 所定のポリペプチドの「機能的ホモログ」または「機能的等価物」とは、ネイ
ティブなポリペプチド配列から誘導された分子、ならびに組換え生成されたか、
または化学合成されたポリペプチドを含む。これらは、所望の結果を達成するよ
うに参照分子と類似の様式で機能する。従って、ＡＡＤＣの機能的ホモログは、
活性の完全性が残存する限り、それらのポリペプチドの誘導体およびアナログを
含む−そのアミノ末端もしくはカルボキシ末端の内部でまたはそれらの末端で生
じる任意の単一のまたは複数のアミノ酸の付加、置換および／または欠失を含む
。

【００４１】 核酸およびアミノ酸の「配列同一性」または「相同性」を決定するための技術
もまた、当該分野で公知である。代表的には、このような技術は、遺伝子につい
てのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによって
コードされたアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列と第２のヌク
レオチドもしくはアミノ酸配列とを比較することを含む。一般に、「同一性」と
は、２つのポリヌクレオチド配列もしくはポリペプチド配列の、ヌクレオチド対
ヌクレオチドもしくはアミノ酸対アミノ酸のそれぞれの正確な対応をいう。２つ
以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「パーセント同一
性」を決定することにより比較され得る。２つの配列のパーセント同一性（核酸
またはアミノ酸の配列にかかわらず）は、２つの整列された配列間の正確なマッ
チの数をより短い配列の長さで割って、そして１００を乗じた数である。核酸配
列の適切な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉ
ｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１
）の局所的相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙ
ｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５増補、３：３５３−３５８
、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．ＵＳＡにより開発されたスコアリング
マトリクスを使用する事によりアミノ酸配列に適用され得、そしてＧｒｉｂｓｋ
ｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９
８６）により正規化され得る。配列のパーセント同一性を決定するためのこのア
ルゴリズムの例示的な実行は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕ
ｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプ
リケーションにおいて提供される。この方法のためのデフォルトパラメーターは
、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、バージョン８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）に記
載される。本発明の文脈でパーセント同一性を確立する好ましい方法は、Ｊｏｈ
ｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され
、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈにより著作権保護され、そ
してＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，
ＣＡ）により配給されるＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することであ
る。総合ソフトウェアパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリ
ズムは、デフォルトパラメーター（例えば、ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ
が１２、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙが１、およびｇａｐが６
）がスコアリング表のために使用される場合に利用され得る。生成したデータか
ら、「Ｍａｔｃｈ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一
性または類似性を算出するための他の適切なプログラムは、一般的に、当該分野
で公知である（例えば、別の整列プログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルト
パラメーターが使用される）。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以
下のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ
＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕ
ｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ
ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａ
ｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａ
ｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これら
のプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳ
Ｔ。

【００４２】 あるいは、相同性は、相同な領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーション、次いで、一本鎖特異的ヌクレアーゼで
消化し、そして消化したフラグメントのサイズ決定により決定され得る。２つの
ＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して決定される
ように、これらの配列が、規定された長さの分子に対して少なくとも約８０〜８
５％、好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約
９５〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細
書中で使用される実質的に相同は、特定されたＤＮＡ配列またはポリペプチド配
列に完全な同一性を示す配列もいう。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特
定のシステムについて規定されるストリンジェントな条件下でサザンハイブリダ
イゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を
規定することは、当業者の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前
出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄ
ｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。

【００４３】 「対流増加送達（Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒ
ｙ）」とは、薬剤の任意の非手動送達をいう。本発明の文脈において、ＡＡＶの
対流増加送達（ＣＥＤ）の例は、注入ポンプまたは浸透圧ポンプにより達成され
得る。

【００４４】 用語「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、脳の全ての細胞および組織ならびに
脊椎動物の脊髄を含む。従って、この用語は、神経細胞、グリア細胞、星状細胞
、脳脊髄液（ｃｅｒｅｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）（ＣＦＳ）、間隙腔
、骨、軟骨などを含むが、これらに限定されない。「頭蓋腔」とは、頭蓋（ｓｋ
ｕｌｌ）（頭蓋（ｃｒａｎｉｕｍ））の下部の領域をいう。ＣＮＳの領域は、種
々の行動および／または機能と関連している。例えば、脳の脳幹神経節は、運動
機能（特に随意運動）と関連している。脳幹神経節は、６つの対形成した核から
構成される：尾状核、被殻、淡蒼球（ｇｌｏｂｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ）（また
は淡蒼球（ｐａｌｌｉｄｕｍ））、側坐核（ｎｕｃｌｅｕｓ ａｃｃｕｍｂｅｎ
ｓ）、視床下核および黒質。尾状核および被殻は、内包により分離されているが
、細胞構築、化学的特性および生理学的特性を共有し、そしてしばしば、線条体
といわれ、または単に「線条」といわれる。黒質は、パーキンソン患者において
変性しており、脳幹神経節への主要なドパミン作動性入力を提供する。

【００４５】 用語「被験体」、「個体」または「患者」は、本明細書中で交換可能に使用さ
れ、そして脊椎動物、好ましくは、哺乳動物をいう。哺乳動物としては、マウス
、類人猿、ヒト、家畜、競技用動物およびペットが挙げられるが、これらに限定
されない。

【００４６】 「有効量」は、有益な、または所望の結果をもたらすに十分な量である。有効
量は、１回以上の投与、適用、または投薬において投与され得る。

【００４７】 用語「標識されたトレーサー」とは、インビボでの規定された活性を追跡また
は検出するために使用され得る任意の分子をいう。例えば、好ましいトレーサー
は、ドパミンを利用する細胞に結合するトレーサーである。好ましくは、標識さ
れたトレーサーは、例えば、陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャニングまたは
他のＣＮＳ画像化技術により、動物全体で見出され得るトレーサーである。適切
な標識としては、放射性同位体、蛍光色素、化学発光化合物、色素、およびタン
パク質（酵素を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００４８】 （本発明の一般的全体像） 本発明の中心は、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を動物のＣＮＳに効率
的に送達することを可能にする方法の開発である。以前、研究者らは、脳の広範
な領域にウイルスベクターを送達させることにほとんど成功していなかった。対
流増加送達デバイス（例えば、浸透圧ポンプまたは注入ポンプ）を使用すると、
ウイルスベクターは脳の大きな領域にわたる多くの細胞に送達され得る。さらに
、送達されたベクターは、ＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン細胞またはグリア細
胞）中で導入遺伝子を効率的に発現する。

【００４９】 本明細書中で記載されるウイルスベクター送達の方法を使用すると、ＣＮＳ障
害（例えば、パーキンソン病）のための新規な遺伝子治療処置が考案され得る。
１つの実施態様において、パーキンソン病（ＰＤ）は、全身的なＬ−ドパおよび
／またはカルビドパ治療と、ＡＡＤＣ（ドパミン代謝に関与する酵素）をコード
する導入遺伝子を運ぶＡＡＶベクターのＣＮＳ投与（例えば、ＣＥＤを介して）
とを組み合わせることにより処置され得る。

【００５０】 本発明の利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）
ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）のＣＮＳへの効率的かつ広範な送達；（ｉ
ｉ）ウイルスベクターによって運ばれた核酸（例えば、導入遺伝子）の発現；（
ｉｉｉ）プロドラッグの投与と組み合わせた１つの導入遺伝子の送達を含むパー
キンソン病の治療レジメンの同定；および（ｉｖ）ＰＥＴスキャンを使用してＣ
ＮＳ遺伝子治療を非侵襲的にモニターする能力。

【００５１】 （ウイルスベクターの構築） 本発明の実施において有用な遺伝子送達ビヒクルは、分子生物学分野で周知の
方法論を利用して構築され得る（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉ
ｓ、前出を参照のこと）。代表的には、導入遺伝子を有するウイルスベクターは
、導入遺伝子、適切な調節エレメントおよび細胞形質導入を媒介するウイルスタ
ンパク質の生成に必要なエレメントをコードするポリヌクレオチドからアセンブ
ルされる。例えば、好ましい実施態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
ベクターが使用される。

【００５２】 （一般的方法） ウイルスベクターのヌクレオチド成分を得る好ましい方法は、ＰＣＲである。
ＰＣＲのための一般的手順は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に教示されている。各適用反応の
ためのＰＣＲ条件は、経験的に決定され得る。多くのパラメーターが反応の出来
に影響を及ぼす。これらのパラメーターの中には、アニーリング温度および時間
、伸長時間、Ｍｇ²⁺およびＡＴＰ濃度、ｐＨならびにプライマー、テンプレート
およびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度がある。例示的なプライマーは、
実施例において以下に記載される。増幅後に、得られるフラグメントをアガロー
スゲル電気泳動、次いで、エチジウムブロマイド染色および紫外線照射での可視
化により検出し得る。

【００５３】 ポリヌクレオチドを得るための別の方法は、酵素消化による。例えば、ヌクレ
オチド配列は、適切な認識制限酵素を用いた適切なベクターの消化により生成さ
れ得る。次いで、得られるフラグメントは、適切であれば、ともに連結され得る
。

【００５４】 ポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を使用してベクターゲノムに挿入
される。例えば、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡは、適切な条件下で制限酵素
と接触させ、互いに対形成し得る各分子上に相補的末端または平滑末端を作製し
、そしてこれをリガーゼを用いて連結し得る。あるいは、合成核酸リンカーをポ
リヌクレオチドの末端に連結し得る。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡ
における特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。他の手段は、当該分野
で公知であり、かつ利用可能である。

【００５５】 （レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター） 多数の、ウイルスに基づく系が遺伝子送達に用いられてきた。例えば、レトロ
ウイルス系が、公知であり、そして一般に組み込まれた欠損プロウイルス（「ヘ
ルパー」）を有するパッケージング株を使用する。このプロウイルスは、ウイル
スの全遺伝子を発現するがパッケージングシグナル（ｐｓｉ配列として公知）の
欠失により自分自身のゲノムをパッケージし得ない。従って、この細胞株は空の
ウイルス外殻を生成する。プロデューサー株は、パッケージング株から誘導され
得る。このパッケージング株は、ヘルパーに加えて、ウイルスの複製およびパッ
ケージングのためにｃｉｓに必要な配列（長末端反復配列（ＬＴＲ）として公知
）を含むウイルスベクターを含む。目的の遺伝子は、ベクターに挿入され得、そ
してレトロウイルスヘルパーにより合成されたウイルス外殻にパッケージングさ
れ得る。次いで、この組換えウイルスは、単離されそして被験体に送達され得る
。（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号を参照のこと）。代表的なレトロ
ウイルスベクターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：例えば
米国特許第５，２１９，７４０号に記載されるＬＨＬ、Ｎ２、ＬＮＳＡＬ、ＬＳ
ＨＬおよびＬＨＬ２ベクターのようなベクター、ならびに本明細書中に記載され
る改変Ｎ２ベクターのような、これらのベクターの誘導体。レトロウイルスベク
ターは、当該分野で周知の技術を用いて構築され得る。例えば、米国特許第５，
２１９，７４０号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３〜１５９を
参照のこと。

【００５６】 アデノウイルスに基づく系は、遺伝子送達のために開発されており、そして本
明細書に記載の方法による送達のために適切である。ヒトアデノウイルスは、レ
セプター媒介エンドサイトーシスにより細胞に入る二本鎖ＤＮＡウイルスである
。これらのウイルスは、遺伝子移入に特によく適応する。なぜなら、それらは、
増殖および操作が容易であり、そしてインビボおよびインビトロにおいて広範な
宿主域を示すからである。例えば、アデノウイルスは、造血起源、リンパ起源お
よび骨髄系起源のヒト細胞に感染し得る。さらに、アデノウイルスは、休止状態
の標的細胞および複製中の標的細胞に感染する。宿主ゲノムに組み込むレトロウ
イルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外で存続し、これにより挿入変異誘
発に関連する危険性が最小になる。このウイルスは、容易に高力価で生成され、
そして安定であり、精製されかつ貯蔵され得る。複製コンピテントな形態でさえ
、アデノウイルスは、低レベルの罹患率しか生じず、そしてヒトの悪性疾患には
関連しない。従って、これらの利点を利用するアデノウイルスベクターが開発さ
れてきた。アデノウイルスベクターおよびそれらの使用の詳細については、例え
ば、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
５７：２６７〜２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１
１〜５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６８：９３３〜９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １
：５１〜５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ ６：６１６〜６２９；Ｒｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ ４：４６１〜４７６を参照のこと。

【００５７】 （ＡＡＶ 発現ベクター） 好ましい実施態様において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。「
ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、Ａ
ＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを制限することなく含む、アデノ随伴ウイルス血清型
由来のベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、全体または部分、好ましくはｒ
ｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を欠失し、ただし、隣接する機能的なＩ
ＴＲ配列は保持する、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以上を有し得る。機能的ＩＴＲ
配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに必須である
。従って、ＡＡＶベクターは、本明細書において、ウイルスの複製およびパッケ
ージングのためｃｉｓに必要な少なくともそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ
）を含むことが規定される。このＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列には必要で
なく、そして、この配列が機能的レスキュー、複製およびパッケージングを提供
する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換により変化されてもよ
い。

【００５８】 ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を用いて構築され、少なくとも、転写開始
領域、目的のＤＮＡおよび転写終結領域を含む制御エレメントを、転写の方向に
作動可能に連結された成分として提供する。制御エレメントは、哺乳動物筋細胞
において機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含む生じ
た構築物は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列に結合（５’および３’）している。

【００５９】 「アデノ随伴ウイルス逆方向末端配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」とは、ＡＡ
Ｖゲノムのそれぞれの末端で見出される、ＤＮＡ複製起点としておよびウイルス
のパッケージングシグナルとしてｃｉｓに一緒に機能する当該分野で認識されて
いる領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード配列と一緒に、
２つの隣接するＩＴＲに間に挟まれたヌクレオチド配列からの効率的な切除およ
びレスキューならびに哺乳動物ゲノムへのこの配列の組み込みを提供する。

【００６０】 ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。ＡＡＶ−２配列につい
ては、例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ ５；７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「パルボウイルスおよ
びそれらの複製」、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．
Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。本明細書中に使
用される「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、記載された野生型ヌクレオチド配列を有する必
要はないが、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換により、改変され
得る。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡ
Ｖ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などを含むがこれらに限定されない、いくつか
のＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶベクターにおいて選択
されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺
伝子産物が細胞に存在する場合、ＩＴＲが意図されたように機能（すなわち、宿
主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列の切除およびレスキューを可能にし
、そして異種配列の、レシピエント細胞ゲノムへの組み込みを可能にする）して
いる限り、必ずしも同一であるか、または同一のＡＡＶ血清型もしくは単離物に
由来している必要はない。

【００６１】 さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得、
この血清型は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５
、ＡＡＶＸ７などを含むがこれらに限定されない。さらに、ＡＡＶ発現ベクター
中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、ＡＡＶ
Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞に存在する場合、ＩＴＲが意図されたように機能（すな
わち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除およびレスキュー
を可能にし、そしてＤＮ分子のレシピエント細胞への組み込みを可能にする）し
ている限り、それらが必ずしも同一であるか、または同一のＡＡＶ血清型もしく
は単離物に由来している必要はない。

【００６２】 ＡＡＶベクターにおける使用のための適切なＤＮＡ分子は、約５キロベース（
ｋｂ）未満のサイズであり、そして、例えば、レシピエント被験体から欠損また
は消失しているタンパク質をコードする遺伝子、または所望の生物学的または治
療的効果（例えば、抗細菌機能、抗ウイルス機能、または抗腫瘍機能）を有する
タンパク質をコードする遺伝子を含む。好ましいＤＮＡ分子は、ドパミン代謝に
関連する分子、例えば、ＡＡＤＣまたはＴＨを含む。ＡＡＶ−ＡＡＤＣベクター
およびＡＡＶ−ＴＨベクターは、例えば、Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら（１９９７）
Ｅｘｐｅｒ’ｔ Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：１４７〜１５６；Ｆａｎら（１９９８
）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２５２７〜２５３５、および国
際公開 ＷＯ９５／２８４９３（１９９５年１０月２６日公開）に記載されてい
る。

【００６３】 選択されたヌクレオチド配列（例えば、ＡＡＤＣまたは目的の別の遺伝子）は
、被験体においてインビボでその転写または発現を指向する制御エレメントに作
動可能に連結される。このような制御エレメントは、選択された遺伝子と通常関
連する制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が用いられ得る。有用な異
種制御配列には、一般的に、哺乳動物もしくはウイルスの遺伝子をコードする配
列に由来する制御配列が含まれる。例としては、ＳＶ４０早期プロモーター；マ
ウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター
（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター；サイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、ＣＭＶ極初期プロモーター領域（
ＣＭＶＩＥ））；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；合成プロモータ
ー；ハイブリッドプロモーター；などが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、非ウイルス遺伝子（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子）由来の配
列もまた、本明細書中での使用を見出す。このようなプロモーター配列は、例え
ば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。

【００６４】 本発明の目的のためには、異種プロモーターおよび他の制御エレメント（例え
ば、ＣＮＳ特異的プロモーターおよび誘導性プロモーター、エンハンサーなど）
の両方が、特に有用である。異種プロモーターの例としては、ＣＭＢプロモータ
ーが挙げられる。ＣＮＳ特異的プロモーターの例としては、ミエリン塩基性タン
パク質（ＭＢＰ）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびニュー
ロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）由来の遺伝子から単離されたプロモーターが挙
げられる。誘導性プロモーターの例としてはエクジソン、テトラサイクリン、低
酸素症およびアウフィン（ａｕｆｉｎ）についてのＤＮＡ応答性エレメントが挙
げられる。

【００６５】 ＡＡＶ ＩＴＲに結合された目的のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは
、選択された配列（単数または複数）を、そこから主要なＡＡＶオープンリーデ
ィングフレーム（「ＯＲＦ」）が切り取られているＡＡＶゲノム中に直接挿入す
ることにより構築され得る。複製およびパッケージング機能を可能にするに十分
な部分のＩＴＲが残される限り、ＡＡＶゲノムの他の部分もまた欠失させ得る。
このような構築物は、当該分野において周知の技術を使用して設計され得る。例
えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際
公開第ＷＯ ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日公開）および同第ＷＯ
９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９
８８） Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎ
ｃｅｎｔら（１９９０） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．
（１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２） Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ
． １５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４） Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍ
ｉｔｈ（１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９；ならび
にＺｈｏｕら（１９９４） Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７９：１８６７−１８７
５を参照のこと。

【００６６】 あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノムまたはＡＡＶ ＩＴＲを含むＡ
ＡＶベクターから切り取られ、そして標準的な連結技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら（前出）に記載の連結技術）を使用して、別のベクターに存在する選択さ
れた核酸構築物の５’および３’に融合され得る。例えば、連結は、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、３
３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ ＮａＣｌ、そして４０μＭ ＡＴ
Ｐ、０℃の０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「
粘着末端」連結用）か、または１ｍＭ ＡＴＰ、１４℃の０．３〜０．６（Ｗｅ
ｉｓｓ）単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」連結用）のいずれか、にお
いて達成され得る。分子間「粘着末端」連結は、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌ
の総ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの総末端濃度）にて実行される。ＩＴＲを含む
ＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている
。特に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」）から、受託
番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、および５３２２６の下
で入手可能ないくつかのＡＡＶベクターが上記特許明細書に記載されている。

【００６７】 さらに、キメラ遺伝子は、１つ以上の選択された核酸配列の５’および３’に
配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むように合成的に産生され得る。哺乳動物Ｃ
ＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現のために好ましいコドンが使用され得
る。完全なキメラ配列が、標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオ
チドから組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２
：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；
Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１を参照のこ
と。

【００６８】 ｒＡＡＶビリオンを産生するため、ＡＡＶ発現ベクターが、トランスフェクシ
ョンのような公知の技術を用いて適切な宿主細胞に導入される。多くのトランス
フェクション技術が当該分野で一般的に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら
（１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら （１
９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら （１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、
およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。特に適切な
トランスフェクション方法は、リン酸カルシウム共沈殿（Ｇｒａｈａｍら（１９
７３）Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６−４６７）、培養した細胞中への直接マイクロ
インジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８０）Ｃｅｌｌ ２２：
４７９−４８８）、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａら （１９８
８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２−７５１）、リポソーム媒介遺伝
子移入（Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８
２−６９０）、脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７）、および高速
度マイクロプロジェクタイルを使用する核酸送達（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３）を包含する。

【００６９】 本発明の目的のために、ｒＡＡＶビリオンを産生するために適切な宿主細胞は
微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含み、それは、異種ＤＮＡ
分子のレシピエントとして使用され得るか、または使用されている。この用語は
、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。このように、本明細書中に使
用される「宿主細胞」は、通常、外因性ＤＮＡ配列によってトランスフェクトさ
れた細胞をいう。安定なヒト細胞株２９３（例えば、アメリカンタイプカルチャ
ーコレクションから受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３で容易に入手可能）に由
来する細胞が本発明の実施において好ましい。特に、ヒト細胞株２９３は、アデ
ノウイルス５型のＤＮＡフラグメントで形質転換したヒト胚腎細胞株であり（Ｇ
ｒａｈａｍら、（１９７７） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９）、
アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら（１９７
９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９４：４６０）。２９３細胞株は、容易にトランスフェ
クトされ、そしてｒＡＡＶビリオンを産生するための特に便利なプラットフォー
ムを提供する。

【００７０】 （ＡＡＶヘルパー機能） 上記のＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するヌク
レオチド配列を複製しそしてキャプシド形成してｒＡＡＶビリオンを産生するた
めに、ＡＡＶヘルパー機能を提供し得るようにならなければならない。ＡＡＶヘ
ルパー機能は、通常、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由
来コード配列である。次いで、この遺伝子産物は、増殖性ＡＡＶ複製のためにト
ランスで機能する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターに欠損している
必要なＡＡＶ機能を相補するために本明細書中で使用される。このように、ＡＡ
Ｖヘルパー機能は、１つまたは両方の主要なＡＡＶ ＯＲＦ、つまりｒｅｐおよ
びｃａｐコード領域、またはその機能的ホモログを含む。

【００７１】 Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合およびニ
ッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または、他の異種の）プロ
モーターからの転写の調節を含む多くの機能を有することが示されてきた。この
Ｃａｐ発現産物は、必須のパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能
は、ＡＡＶベクターに欠損しているＡＡＶ機能をトランスで相補するために本明
細書中で使用される。

【００７２】 用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列の送達の
ための形質導入ベクターを作製するために用いられるＡＡＶベクターに欠失して
いるＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子をいう。ＡＡＶへル
パー構築物は、通常、溶解性のＡＡＶ複製に必須である欠損ＡＡＶ機能を相補す
るためＡＡＶのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子の一過性発現を提供す
るために用いられる。しかし、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠き、そし
てそれ自身を複製もパッケージングもし得ない。ＡＡＶへルパー構築物は、プラ
スミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態
であり得る。多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。これは、例えば、
Ｒｅｐ発現産物およびＣａｐ発現産物の両方をコードする、通常用いられるプラ
スミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９−４５である。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋ
ｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＣａ
ｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６〜２９４５を参照のこと
。Ｒｅｐ発現産物および／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクタ
ーが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。

【００７３】 「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ
６８、Ｒｅｐ ５２、およびＲｅｐ ４０をコードするＡＡＶゲノムの当該分野
で認識された領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ
起点の認識、結合およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（
または、他の異種の）プロモーターからの転写の調節を含む多くの機能を有する
ことが示されてきた。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するのに集団的に
必要である。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の記載については、例えば、Ｍｕｚｙｃ
ｚｋａ， Ｎ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７−１２９；およびＫ
ｏｔｉｎ， Ｒ．Ｍ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
５：７９３−８０１を参照のこと。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適切なホモロ
グは、ＡＡＶ−２ ＤＮＡ複製を媒介することも知られているヒトヘルペスウイ
ルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９４） Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ ２０４：３０４−３１１）を含む。

【００７４】 「ＡＡＶ ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、
およびＶＰ３、あるいはそれらの機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの当
該分野で認識された領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノ
ムをパッケージングするのに集団的に必要とされるパッケージング機能を供給す
る。ＡＡＶ ｃａｐコード領域の記載については、例えば、 Ｍｕｚｙｃｚｋａ
， Ｎ． およびＫｏｔｉｎ， Ｒ．Ｍ．（上記）を参照のこと。

【００７５】 ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前、ま
たは同時のいずれかで、ＡＡＶヘルパー構築物で宿主細胞をトランスフェクトす
ることにより宿主細胞に導入される。このように、ＡＡＶヘルパー構築物は、増
殖性ＡＡＶ感染のために必要な欠損ＡＡＶ機能を相補するために、ＡＡＶ ｒｅ
ｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために使用
される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠損しており、そして、自
身を複製もパッケージすることをもし得ない。これらの構築物は、プラスミド、
ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得
る。ＲｅｐおよびＣａｐの両方の発現産物をコードする、一般に使用されるプラ
スミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５のような多くのＡＡＶヘルパー構
築物が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．６５：２９３６−２９４５を参照のこと。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ
発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。例えば、米国特許
第５，１３９，９４１号を参照のこと。

【００７６】 ＡＡＶ発現ベクターおよびＡＡＶヘルパー構築物の両方が、１つ以上の任意の
選択マーカーを含むように構築され得る。適切なマーカーには、選択マーカーを
含む核酸構築物でトランスフェクトされている細胞が適切な選択培地中で増殖さ
れる場合、それらの細胞に抗生物質耐性もしくは感受性を与えるか、色を与える
か、または抗原特徴を変化させる遺伝子が挙げられる。本発明の実施に有用ない
くつかの選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ
， ＭＯから入手可能）に対する耐性を与えることによって哺乳動物細胞での選
択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（アミノグリコシドホスホトラン
スフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードする）を含む。他の適切なマーカーは当業者に
公知である。

【００７７】 （ＡＡＶ付属機能） 宿主細胞（またはパッケージング細胞）はまた、ｒＡＡＶビリオンを産生する
ために、非ＡＡＶ由来の機能すなわち「付属機能」を提供し得るようにならなけ
ればならない。付属機能は、ＡＡＶがその複製を依存する、非ＡＡＶ由来のウイ
ルスおよび／または細胞機能である。このように、付属機能は、少なくとも、Ａ
ＡＶ遺伝子転写、時期特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮ
Ａ複製、Ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドアセンブリの合成の活
性化に関連するものを含む、ＡＡＶ複製に必要な非ＡＡＶタンパク質およびＲＮ
Ａを含む。ウイルスベースの付属機能は、公知のヘルパーウイルスのいずれかに
由来し得る。

【００７８】 特に、付属機能は、当業者に公知である方法を使用して宿主細胞に導入され得
、次いで発現され得る。一般に、付属機能は、関連のないヘルパーウイルスでの
宿主細胞の感染によって提供される。アデノウイルス；単純ヘルペスウイルス１
型および２型のようなヘルペスウイルス；ならびにワクシニアウイルスを含む、
多くの適切なヘルパーウイルスが公知である。任意の種々の公知の薬剤を使用し
た細胞同期化により提供される付属機能のような非ウイルス付属機能も、本発明
における使用を見出す。例えば、Ｂｕｌｌｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
４０：２４１−２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１４７：２１７−２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １５２：１１０−１１７を参照のこと。

【００７９】 あるいは、付属機能は、付属機能ベクターを使用して提供され得る。付属機能
ベクターは、１つ以上の付属機能を提供するヌクレオチド配列を含む。付属機能
ベクターは、宿主細胞中の効率的なＡＡＶビリオン産生を支持するために、適切
な宿主細胞に導入され得る。付属機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トラ
ンスポゾン、またはコスミドの形態であり得る。付属ベクターはまた、適切な制
御エレメントおよび酵素と会合する場合、宿主細胞において転写され得るか、ま
たは発現され得て付属機能を提供し得る、１つ以上の線状化ＤＮＡまたはＲＮＡ
フラグメントの形態であり得る。例えば、１９９７年５月１５日公開の国際公開
番号ＷＯ９７／１７５４８を参照のこと。

【００８０】 付属機能を提供する核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムのような天然源
から得られ得るか、または、当該分野で公知の組換え方法または合成方法を使用
して構築され得る。この意味で、アデノウイルス由来付属機能は、広範に研究さ
れており、付属機能に関連する多数のアデノウイルス遺伝子が、同定され、そし
て部分的に特徴づけられている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９０）
「アデノ随伴ウイルスヘルパー機能」 ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａ
ｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、第一巻（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）；およびＭｕｚｙｃｚ
ｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９を参照のこと。特に、初期アデノウイ
ルス遺伝子領域Ｅ１ａ、Ｅａ２、Ｅ４、ＶＡＩ ＲＮＡおよび、潜在的に、Ｅ１
ｂは、付属プロセスに参加していると考えられる。Ｊａｎｉｋら、（１９８１）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５−１９２９。
ヘルペスウイルス由来付属機能が記載されている。例えば、Ｙｏｕｎｇら（１９
７９）Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．２５：１１３を参照のこと。ワクシニア
ウイルス由来付属機能もまた、記載されている。例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ
．（１９９０）、上記、Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら、（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ １５２：１１０−１１７を参照のこと。

【００８１】 宿主細胞のヘルパーウイルスでの感染、または宿主細胞の付属機能ベクターで
のトランスフェクションの結果として、ＡＡＶ Ｒｅｐおよび／またはＣａｐタ
ンパク質を産生するためにＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性化する付属機能
が発現される。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組換えＤＮＡ（目的
のＤＮＡを含む）を切り出す。Ｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを２倍に
するために作用する。発現したＣａｐタンパク質はキャプシドへと組み立てられ
、そして組換えＡＡＶゲノムはキャプシド中にパッケージされる。このように、
増殖性ＡＡＶ複製が起こり、そしてＤＮＡはｒＡＡＶビリオンにパッケージされ
る。

【００８２】 組換えＡＡＶ複製の後、ｒＡＡＶビリオンは、ＣｓＣｌ勾配のような種々の従
来の精製方法を使用して宿主細胞から精製され得る。さらに、感染が付属機能を
発現するために用いられる場合、残りのヘルパーウイルスは、公知の方法を使用
して不活性化され得る。例えば、アデノウイルスは、例えば、２０分以上、約６
０℃の温度まで加熱することによって不活性化され得る。この処理はヘルパーの
みを効率的に不活性化する。なぜなら、ＡＡＶは非常に熱安定性であるが、一方
ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるからである。

【００８３】 次いで、得られたｒＡＡＶビリオンは、被験体のＣＮＳ（例えば、頭蓋腔）へ
のＤＮＡ送達のための使用に用意される。

【００８４】 （ウイルスベクターの送達） ウイルスベクターの送達方法としては、動脈内経路、筋肉内経路、静脈内経路
、経鼻経路および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ｒ
ＡＡＶビリオンは、インビボ形質導入技術またはインビトロ形質導入技術のいず
れかを用いてＣＮＳの細胞中に導入され得る。インビトロで形質導入された場合
、所望のレシピエント細胞は、被験体から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで形質
導入され、そしてその被験体に再導入される。あるいは、同系または異系の細胞
が不適切な免疫応答を被験体において産生しない場合、それらの細胞が使用され
得る。

【００８５】 形質導入細胞の被験体への送達および導入のための適切な方法が記載されてい
る。例えば、組換えＡＡＶビリオンは、ＣＮＳ細胞と（例えば、適切な培地中で
）組み合わせられることによって細胞はインビトロで形質導入され得、そして目
的のＤＮＡを有する細胞に対するスクリーニングは、サザンブロットおよび／ま
たはＰＣＲのような従来技術を使用して、または選択マーカーを使用することに
よってスクリーニングされ得る。次いで、形質導入細胞は、薬学的組成物に処方
され得（以下にさらに十分に記載される）、そしてその組成物は、グラフティン
グ（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射といった種々
の技術により被験体に導入され得る。

【００８６】 インビボ送達については、ｒＡＡＶビリオンが、薬学的組成物に処方され、そ
して一般に、非経口的に（例えば、骨格筋または心筋への直接的な筋肉内注射に
よってか、またはＣＮＳへの注射によって）投与される。

【００８７】 しかし、従来の方法（例えば、注射）は、ウイルスベクターの被験体の脳への
広範な送達を提供することが示されていないので、ウイルスベクターを対流増加
送達（ＣＥＤ：ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）
系を介してＣＮＳに効率的に送達する発見が、本発明の中心をなす。本発明者ら
は、ＣＥＤがウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を動物の脳（例えば、線条体
）の広い領域に対して効率的に送達し得ることを初めて記載し、そして初めてそ
れを実証する。以下に詳細に記載されそして例示されるように、これらの方法は
、種々のウイルスベクター、例えば、レポーター遺伝子（例えば、チミジンキナ
ーゼ（ｔｋ））または治療的遺伝子（例えば、ＡＡＤＣおよびｔｋ）を有するＡ
ＡＶベクター、に適している。

【００８８】 任意の対流増加送達デバイスが、ウイルスベクターの送達に適切であり得る。
好ましい実施態様において、このデバイスは、浸透ポンプまたは注入ポンプであ
る。浸透ポンプおよび注入ポンプの両方は、種々の供給元から市販されている（
例えば、Ａｌｚｅｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎ，Ａｌｚａ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ）。代表的には、ウイルスベクターは、以下のように、ＣＥＤデバイスを介し
て送達される。カテーテル、カニューレまたは他の注射デバイスが、選択した被
験体のＣＮＳ組織に挿入される。本明細書中の教示から、当業者は、ＣＮＳのど
の一般の領域が適切な標的であるかを容易に決定し得る。例えば、ＰＤを処置す
るためにＡＡＶ−ＡＡＤＣを送達する場合、線条体が、脳の標的にするには適切
な領域である。定位マップ（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｍａｐ）およびポジシ
ョニングデバイスが利用可能である（例えば、ＡＳＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
，Ｗａｒｒｅｎ ＭＩから）。ポジショニングはまた、被験体の脳のＣＴ画像化
および／またはＭＲＩ画像化により得られた解剖学的マップを使用して行われ、
これは選択した標的への注射デバイスの誘導を補助し得る。さらに、本明細書に
記載される方法は、脳の比較的に広い領域がウイルスベクターを吸収するように
行われ得るので、注入カニューレをほとんど必要としない。外科的合併症は穿通
の回数に関連するので、本明細書に記載される方法はまた、従来の送達技術にお
いて見られた副作用を減少させるのに役立つ。

【００８９】 薬学的組成物は、目的のタンパク質の治療的な有効量（すなわち、問題の疾患
状態の症状を低減もしくは改善するに充分な量、または所望の有益性を与えるに
充分な量）を産生するに充分な遺伝物質を含む。この薬学的組成物はまた、薬学
的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤は、それ自身がその組成物を受
ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導せず、そして過度な毒性なく投与され
得る、任意の薬学的薬剤を含む。薬学的に受容可能な賦形剤としては、ソルビト
ール、Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに水、生理的食塩水、グリセロール、およびエタ
ノールのような液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能
な塩は、本明細書においては、例えば、塩酸塩、臭酸塩、リン酸塩、硫酸塩など
のような無機酸塩；ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩
などのような有機酸塩を含み得る。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝物
質などのような補助物質は、このようなビヒクル中に存在し得る。薬学的に受容
可能な賦形剤の詳細な議論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴ
ＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で
入手可能である。

【００９０】 本明細書の教示から当業者に明らかであるように、添加されなければならない
ウイルスベクターの有効量は経験的に決定され得る。投与は、処置過程を通して
連続的または断続的に１用量にて行われ得る。投与の最も有効な手段および投薬
量を決定する方法は、当業者に周知であり、そしてウイルスベクター、治療組成
物、標的細胞、および処置されている被験体により変化する。単回投与および複
数回投与が、処置する医師により選択されている用量レベルおよびパターンで行
われ得る。

【００９１】 １より多いトランスジーンが、送達されるウイルスベクターにより発現され得
ることが理解されるべきである。あるいは、別々のベクター（各々が１以上の異
なるトランスジーンを発現する）がまた、本明細書に記載されるようにＣＮＳに
送達され得る。さらに、本発明の方法により送達されるウイルスベクターが、他
の適切な組成物および治療と組み合わせられることもまた意図される。例えば、
以下の実施例で詳細に記載されるように、パーキンソン病は、ＡＡＤＣを発現す
るＡＡＶベクターをＣＮＳに（例えば、尾状核または線条体の被殻に）同時投与
することによって処置され得、そしてさらなる薬剤（例えば、ドパミン前駆体（
例えば、Ｌ−ドパ）、ドパミン合成のインヒビター（例えば、カルビドパ）、ド
パミン異化作用のインヒビター（例えば、ＭａＯＢインヒビター）、ドパミンア
ゴニストもしくはドパミンアンタゴニスト）が、ＡＡＤＣをコードするベクター
の投与の前に、それに続いて、またはそれと同時に投与され得る。例えば、Ｌ−
ドパ（および必要に応じてカルビドパ）が、全身的に投与され得る。このように
して、ＰＤ患者において自然に枯渇しているドパミンが、Ｌ−ドパをドパミンに
変換し得るＡＡＤＣの発現によって明らかに回復される。トランスジーン（例え
ば、ＡＡＤＣ）が誘導性プロモーターの制御化にある場合、このトランスジーン
の発現を調節するために、ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）、ポナステ
ロン（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎ）、テトラシリン（ｔｅｔｒａｃｙｌｉｎｅ）また
はアウフィン（ａｕｆｉｎ）のような、全身送達される特定の化合物が投与され
得る。

【００９２】 （ＣＮＳ障害の処置） 治療的トランスジーンを発現するウイルスベクターを使用して、治療的なタン
パク質またはペプチドを提供することによって種々のＣＮＳ障害を処置し得る。
好ましい実施態様において、ウイルスベクターは、本明細書に記載されるＣＥＤ
法を介してＣＮＳに送達される。なぜなら、これらの方法は、広範囲に分布する
ウイルスベクターの第１の効果的様式をＣＮＳに提供するからである。処置され
得る障害の限定されない例としては、腫瘍、発作および神経変性疾患から生じる
障害が挙げられる。

【００９３】 （パーキンソン病） 本発明の好ましい実施態様において、酵素ＡＡＤＣを提供するウイルスベクタ
ーが、パーキンソン病の処置のために使用される。上記したように、パーキンソ
ン病は、ドパミン作用性黒質線状体ニューロンの選択的な損失から生じ、その結
果、黒質からの線条体への入力の損失を生じる。ＰＤの動物モデルが、例えば、
ドパミン作用性細胞を破壊する６−ヒドロキシドパミン（６−ＯＨＤＡ）でラッ
トまたは霊長類を処置することによってか、または神経毒である１−メチル−４
−フェニル−１，２，３，４−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）（これはパー
キンソン病様の疾患を生じる）で霊長類を病変させることによって作製されてい
る。

【００９４】 本発明は、パーキンソン病患者（例えば、ＭＰＴＰで病変したサル）のドパミ
ン作用性活性が、ＡＡＤＣのトランスジーンを有するウイルスベクターを、Ｌ−
ドパおよび（必要に応じてカルビドパ）の全身的（例えば、経口）投与と組み合
わせて投与することによって回復され得るという初めての証拠を提供する。パー
キンソン病のための遺伝子治療に関する以前の示唆は、疾患の進行に伴うチロシ
ンヒドロキシラーゼの欠乏について焦点を当ててきた。したがって、これらの示
唆により、インサイチュでドパミンを生成するためには、少なくとも３つのトラ
ンスジーン（チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子；補因子ビオプリテン（ｂｉｏｐ
ｔｒｅｎｅ）であるＧＴＰ−シクロヒドロキシラーゼ−１の遺伝子；およびＡＡ
ＤＣの遺伝子）の首尾のよい発現による黒質線状体経路におけるドパミン合成の
回復が要求される。３つの遺伝子を適切なレベルで送達することに付随する問題
に加えて、このアプローチを使用してドパミンレベルの調節を制御することは困
難である。

【００９５】 本発明者らは、Ｌ−ドパと組み合わせた１つのトランスジーン（例えば、ＡＡ
ＤＣ）が治療的有用性を提供することを実証した。ＡＡＤＣはドパミン生合成の
最終工程に関与する酵素であり、これは、Ｌ−ドパをドパミンに変換する。従っ
て、ドパミン作用性活性を回復するためのＡＡＤＣ治療的アプローチの明らかな
利点は、たった１つの遺伝子が送達されなければならず、そしてドパミンレベル
の調節がＬ−ドパの末梢レベルを制御することによって可能であることである。
さらに、ＡＡＤＣ遺伝子だけを送達することによって、Ｌ−ドパはプロドラッグ
として使用され、線条体におけるドパミンレベルを調節し得る。

【００９６】 ＡＡＶベクターによって送達されるＡＡＤＣをコードするヌクレオチドは、主
に、線条体ニューロンで発現されるようなので、別の重要な治療的利点は、Ｌ−
ドパに関する機構を緩衝する処置の提供である。運動異常症のような多くの副作
用が、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ）のヒトの脳の非効率な緩衝
作用に起因する。本明細書に記載される方法は、代謝されないＬ−ドパがニュー
ロンに貯蔵されることを可能にすることによってこの問題を回避する。以下に例
示されるように、ＭＰＴＰ処置された線条体へのＡＡＤＣの送達が、線条体ニュ
ーロンによる、Ｌ−ドパのドパミンへの変換、引き続くＤＯＰＡＣおよびＨＶＡ
への代謝を可能にする。ＦＭＴ ＰＥＴデータに基いて、ＦＭＴが線条体ニュー
ロン領域において可視化されたので、線条体ニューロンはまたドパミンを貯蔵し
得るようである。事実、ＡＡＤＣ遺伝子の転入の後でのＬ−ドパのドパミンへの
変換速度は、頑強でありかつ正常な線条体で見られたものより優れていた（例え
ば、図７を参照のこと）。さらに、パーキンソン病は進行性の障害ではあるが、
進行中の変性プロセスは、線条体ニューロンでのＡＡＤＣ発現に影響しないよう
である。なぜなら、これらは、代表的に、特発性パーキンソン病によって影響さ
れないからである。

【００９７】 特発性パーキンソン病に罹患する患者のドパミン作用系の変性は、均一ではな
い。黒質線状体経路は中脳辺縁系経路より非常に速い速度で変性し、これは、こ
の２つの経路の活性の間の平衡異常を有する患者を残す。この疾患が進行するに
つれ、黒質線状体経路の変性を補償するには、より高レベルのＬ−ドパが必要と
されるが、これはまた、核の側坐核（ａｃｃｕｍｂｅｎｓ）および中脳辺縁系の
他の部分において、さらにより高いドパミンレベルを生じる。このような過剰刺
激は、幻覚のようなＬ−ドパ処置に関連するいくつかの副作用の原因となり得る
。同様に、ＭＰＴＰは、中脳辺縁系ドパミン作用性系を相対的に乏しくした（例
えば、図７を参照のこと、尾状核および被殻においてはドパミン作用性神経支配
が存在せず、部分的な病変が核の側坐核に見られる）。図７に示されるように、
ＡＡＶ−ＡＡＤＣは、この平衡異常をほぼ正常な均衡まで回復し得る。したがっ
て、ＡＡＤＣ酵素レベルの回復後に、より低用量のＬ−ドパが必要とされ、そし
てＬ−ドパのドパミンへの変換速度を改善することが可能である。これは、順々
に、中脳辺縁系の過剰刺激を減少し得、その結果、Ｌ−ドパ／カルビドパに関連
する副作用をより少なくする。

【００９８】 上記で説明したように、ＡＡＶ−ＡＡＤＣベクターは、任意の適切な方法によ
って送達され得る。これらの方法としては、例えば、インジェクション、グラフ
ティング、注入、このベクターを有する細胞の移植などが挙げられる。好ましい
実施態様において、このベクターは、本明細書に記載されるＣＥＤ法によって送
達される。以下に例示するように、このような送達方法は、ＣＮＳニューロンで
の広範囲の分布および発現を提供して、それによってＰＤについての新規な処置
レジメを提供する。

【００９９】 （画像化） 本発明はまた、酵素または他の分子のインビボでの活性を決定する方法を提供
する。さらに詳細には、標的とされる活性を特異的に追跡するトレーサーが選択
されそして標識される。好ましい実施態様において、このトレーサーは、ドパミ
ン活性（例えば、ドパミンを利用する細胞に結合するフルオロ−Ｌ−ｍ−チロシ
ン（ＦＭＴ））を追跡する。選択したトレーサーに適切な標識としては、分光器
的、光化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的な手段によって検出可
能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、放射標識
（例えば、¹⁸Ｆ、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、³²Ｐなど）、酵素、比色標識、蛍光色素な
どが挙げられる。好ましい実施態様において、標識¹⁸Ｆは、ドパミン活性を定量
するためにＦＭＴとともに使用される。

【０１００】 標識を検出する手段は、当業者に周知である。例えば、放射標識は、画像化技
術、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出され得る。
好ましい実施態様において、この標識は、画像化技術（例えば、陽子射出断層投
影法（ＰＥＴ））によって、被験体の脳においてインビボで検出される。ＰＥＴ
技術は、以下の実施例３に詳細に議論される。

【０１０１】 （実施例） 以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。この実施例は、
例示の目的のみのために提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲
を限定することを意図しない。

【０１０２】 使用される数値（例えば、量、温度など）について正確さを確保するための試
みがなされたが、当然、若干の実験的な誤差および偏差は許容されるべきである
。

【０１０３】 （実施例１：ＡＡＶ−ｔｋの構築および生成） ＡＡＶ−ｔｋベクターを、ｐＵＣベースのプラスミド（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能）におけるサイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）前初期プロモーターの転写制御下に単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を配置することにより構築した。β−グロブリンの
イントロンをｔｋ遺伝子の上流に直接的に配置し、そしてヒト成長ホルモンのポ
リＡを下流に配置した。このカセット全体を、遺伝子の発現、複製、およびウイ
ルス粒子へのパッケージングに必要とされるＡＡＶの逆方向末端配列（ＩＴＲ）
に隣接させた。

【０１０４】 組換えＡＡＶビリオンを、以下のように、ヒト２９３細胞（例えば、アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション（受諾番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）から容
易に入手可能）中で産生した。この２９３細胞株を、完全ＤＭＥＭ（Ｂｉｏｗｈ
ｉｔｔａｋｅｒ）（４．５ｇ／Ｌ グルコース、１０％ 熱失活ウシ胎仔血清（
ＦＣＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および２ｍＭ グルタミンを含む）中で培養した。
サブコンフルエントな２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿（例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋらを参照のこと）により、ＩＴＲに隣接したＡＡＶ−ｔｋ発現カセット
ならびにＡＡＶ（ｐｗ１９０９（ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含
む））とアデノウイルス（ｐＬａｄｅｎｏｌ（Ｅ２ａ、Ｅ４、およびアデノウイ
ルスＶＡ₁ＲＮＡ遺伝子およびＶＡ₁₁ＲＮＡ遺伝子を含む））との両方に由来す
るヘルパープラスミドで同時トランスフェクトした。６時間後、この培地を、血
清を含まないＤＭＥＭに交換し、そしてインキュベーションを３７℃、５％ Ｃ
Ｏ₂にて７２時間続けた。ペレット化した細胞を、Ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）中で凍結／融解を３回行って
溶解させ、そして溶解物を１０，０００ｇ、１５分間の遠心分離によって細胞片
から清澄化した。非ウイルスタンパク質をペレットにするために、ＣａＣｌ₂を
最終濃度２５ｍＭまで添加し、そして０℃にて１時間インキュベートした後に、
この清澄化した溶解物を１０，０００ｇで１５分間遠心分離した。得られた上清
にポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ）を添加した（最終濃度＝８％）；
この溶液を０℃にて３時間インキュベートし、そして３０００×ｇで３０分間遠
心分離した。ベクターを含むペレットを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ Ｎａ／１５０
ｍＭ ＮａＣｌ／２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で可溶化させ、そして１
０，０００×ｇで１５分間遠心分離してペレットにし、そして不溶性物質を除去
した。

【０１０５】 塩化セシウム等密度（ｉｓｏｐｙｃｎｉｃ）勾配遠心分離を行い、そしてＡＡ
Ｖ−ｔｋを、得られた勾配から平均密度１．３８ｇ／ｍｌを有する画分を単離す
ることにより回収した。ベクターを濃縮するためにＰＥＧを再び使用した。次い
で、これを２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ Ｎａ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
中に再懸濁し、そして記載したように遠心分離して不溶性物質を除去した。この
ストックをＤＮＡｓｅ処理し、そしてベクター力価を定量的ドットブロットハイ
ブリダイゼーションにより決定した。

【０１０６】 （実施例２：ＡＡＶ−ｔｋのインビボ送達：用量および方法） 脳への導入に適切な用量のＡＡＶを決定するために、以下の研究を行った。Ａ
ＡＶベクターに対する用量応答を試験するために、その比較的に大きな同構造組
織の領域ゆえに、ならびに線条体は、神経変性疾患および他の中枢神経系障害の
処置に対する標的なので線条体を使用した。

【０１０７】 さらに、ベクターをＣＮＳに送達する効率的な方法を決定した。治療剤の単純
な定位的インジェクションは、脳において限られた容積の分布を生じることが示
されている（Ｋｒｏｌｌら，（１９９６）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ３８：７
４６−７５４）。したがって、頭蓋内送達の間の圧力勾配を維持するために、低
速度注入ポンプを使用した。低分子、中程度分子、および大きな分子の脳への送
達に関する以前の研究により、低速度注入ポンプが、広範でかつ均質な組織分布
を生じることが実証されている。

【０１０８】 ベクターの頭蓋内インジェクションを投与するにはどの方法が最も効率的であ
るかを研究するために、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａ
ｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＡｌｚｅｔ皮下浸透
ポンプ（Ａｌｚａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）を使用することによって、ラットに２．５×１０¹⁰粒子のＡＡＶを
与えた。雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ）（Ｃｈ
ａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，
ＭＡ）から）を、ケタミン（体重１ｋｇあたり１００ｍｇ）およびキシラジン（
体重１ｋｇあたり１０ｍｇ）の腹腔内注射により麻酔し、そして手術のために調
製した。手術の間、鎮静を、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）（Ａｔｔ
ｒａｎｅ．Ｏｍｅｄａ ＰＰＤ Ｉｎｃ．，Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＮＪ）を用いて維
持し、そしてＯ₂流速を０．３〜０．５Ｌ／ｍで維持した。各々のラットの頭部
を耳棒（ｅａｒｂａｒ）で定位装置（Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｓｔｅｒｅｏ
ｔａｃｔｉｃ Ｆｒａｍｅ；ＡＳＩ Ｉｎｓｔｒｕｅｍｎｔｓ，Ｗａｒｒｅｎ，
ＭＩ）にて固定し、そして皮膚を通じて正中切開して頭蓋骨を露出させた。小さ
な歯科用ドリルを使用して、ブレグマから１ｍｍ前方および正中線から２．６ｍ
ｍ後方の頭蓋骨に穿孔を作製した。注入ポンプまたは皮下浸透ポンプを使用して
、ベクターを左半球の深さ５ｍｍに送達した。

【０１０９】 投薬研究のために、３つの群の動物（一群あたり６匹の動物）が存在した。各
々の動物に、ＡＡＶ−ｋｔを、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプを使用して８μｌ／ｈ
の速度にて２．５時間連続して投与した。ローディングチャンバー（Ｔｅｆｌｏ
ｎチュービング１／１６ｔｈ「ＯＤ×０．０３」ＩＤ）および付属注入チャンバ
ー（１／１６「ＯＤ×０．０２」ＩＤ）を、総容量２０μｌの人工脳脊髄液（ｃ
ｓｆ）（１４８ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＫＣｌ，１．４ｍＭ ＣａＣｌ₂・２
Ｈ₂Ｏ，０〜８ｍＭ ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ，１．３ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ，
０．２ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ）中２．５×１０⁸、２．５×１０⁹、または
２．５×１０¹⁰粒子のＡＡＶ−ｋｔで満たした。融合シリカ（ｆｕｓｅｄ ｓｉ
ｌｉｃａ）にはめ込んだ２７ゲージ針により送達を行い、これを注入の後に徐々
に１５ｍで取り除いた。

【０１１０】 あるいは、ベクターを６匹の動物の１つの群に送達するために、皮下浸透ポン
プを使用した。各々のラットに、ＡＡＶ−ｔｋをＡｌｚｅｔ浸透ポンプ（モデル
番号２００１Ｄ）（ＡＬＺＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して８μｌ／ｈの速度にて２４時間連続して投与
した。このポンプのリザーバーおよび付属カテーテル（ポリエチレン６０チュー
ビング）を、総容量２００μｌの人工脳脊髄液（ｃｓｆ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ａ
ｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ）中２．５×１０ ¹⁰ 粒子のＡＡＶ−ｔｋで満たした。融合シリカにはめ込んだ２７ゲージカニュー
レにより送達を行った。定位配置の後、このカニューレを小さなステンレス綱ね
じおよび歯科用接着剤で頭蓋骨に固定し、そしてポンプを背中の肩甲中央領域（
ｍｉｄ−ｓｃａｐｕｌａｒ ａｒｅａ）の皮下に移植した。手術部位を解剖学的
層（ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｌａｙｅｒ）にて９ｍｍの創傷クリップを用いて閉
じた。２４時間後、カテーテルを留めてそして密封してポンプを除去したが、代
わりに移植したカニューレを残した。バーホール（ｂｕｒｒ ｈｏｌｅ）は骨ろ
うで充填した。

【０１１１】 全ての外科的手順、動物の世話および飼育、ならびに組織の回収を、Ｂｅｒｋ
ｅｌｅｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）のＲｉｃｈｍ
ｏｎｄの施設にて行った。

【０１１２】 （組織学） 動物を、ペントバルビタール過剰量（用量）で安楽死させ、そして氷冷ＰＢＳ
および４％中性緩衝化パラホルムアルデヒドを用いて上行大動脈を介して灌流し
た。脳を頭蓋骨から取り出し、同じ固定液中での２４時間の液浸によって次の固
定を行い、３０％スクロースで平衡化し、そして−７０℃のイソペンタン中で凍
結した。次いで、これらを低温槽に配置し、そして４０ミクロンの切片を前頭葉
前部の皮質から中脳まで連続的に収集した。各々の脳は約１５０切片を生じ、こ
れは、前方−後方（ＡＰ）が６〜８ｍｍの長さであった。慣用的な組織学的分析
のために、全てのＩＰ切片をＨ＆Ｅで染色した。一般的な細胞密度を測定するた
めに、異なる脳領域を示す、選択した切片をクリスタルバイオレットで染色した
。結果を表１に示す。

【０１１３】

【表１】

【０１１４】 （ＰＣＲ分析） １群あたり２匹を有するラットのさらなる２つの群を、ベクターの組織分布を
決定する目的のために、２．５×１０¹⁰個の粒子のＡＡＶ−ｔｋで処置した。上
記のように、一方の群は、注入によってベクターを受け、そして他方は、浸透ポ
ンプによって受けた。動物を、３週間後にＣＯ₂吸入を使用して安楽死させ、そ
して各ラットから、右脳、左脳、脊髄、右目、左目、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾
臓、卵巣、胸腺、リンパ節、骨髄、および脚の筋肉を含む１５の器官および組織
からサンプルを採集した。滅菌技術を使用し、そして組織を各サンプル間で変化
するディスポーザブル縫合糸除去キットを使用して収集した。組織を、液体Ｎ₂
中で迅速に凍結し、そしてそれらをゲノムＤＮＡについて処理するまで−７０℃
で保存した。ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ
Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ、およびｔｋ配列由来の２つの３０マーのオリゴ（５’−ＡＡ
ＧＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＡＣＧＴＡＧＡＣＧＡＴＡＴＣ−３’（配列番
号１）および５’−ＡＴＡＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＣ
ＴＧＣ−３’（配列番号２））を使用して実施した。反応を、ＰＴＣ−１００熱
サイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅｒａｃｈ，Ｉｎｃ．）において実施し、そしてベク
ターが存在するサンプル中で生成物あたり１５８ｂｐを得た。

【０１１５】 （免疫組織化学） 免疫組織化学を使用して、Ｈ＆Ｅを用いて染色した直後に、切片毎におけるト
ランスジーン発現を検出した。従って、全１２個の切片のうち１つをＰＢＳで洗
浄し、３％Ｈ₂Ｏ₂で３０分間処理して内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし
て、ｄＨ₂ＯおよびＰＢＳで再びリンスし、そしてブロッキング溶液（ＰＢＳ中
の１０％ヤギ血清＋０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中で３０分間インキュ
ベートした。次に、サンプルを、多角形（ｐｏｌｙｇｏｎａｌ）の抗ｔｋ抗体（
Ｙａｌｅ）（１：１０００）中で１時間インキュベートし、ＰＢＳ中で３回洗浄
し、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）（１：３００）中で１時間
インキュベートし、そして再び洗浄した。抗体結合を、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉ
ｎ西洋ワサビペルオキシダーゼ（１：３００）およびＶＩＰ色原体（Ｖｅｃｔｏ
ｒ）を用いて可視化した。

【０１１６】 （定量分析） トランスジーン発現を、Ｋｅｎ−ａ−ｖｉｓｉｏｎマイクロプロジェクターを
使用して、ＡＲＴＺＩＩグラフタブレット（ｇｒａｐｈｉｃ ｔａｂｌｅｔ）上
でｔｋ−免疫染色した切片を投影することによって各脳について定量した。ＮＩ
Ｈ画像１．６プログラムを使用して、画像を獲得および分析した。各脳について
の陽性細胞の推定総数を、以下の式を使用して、１００倍の倍率で決定した： 総ｔｋ細胞数＝（ｎ１＋ｎ２＋ｎ３．．．）×１２×ｋ ｎ＝陽性細胞／切片 ｋ：Ａｍｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ方程式（１９４６）から誘導される補正係数 ｋ＝Ｔ／（Ｔ＋Ｄ） Ｔ＝切片の厚さ（４０μ）、Ｄ 細胞直径（１６μ）；
ｋ＝０．７１。 ｔｋ−免疫反応性領域の容量を、５０倍の倍率で投影した獲得された画像を使用
してｔｋ発現の面積を測定し、そして以下のように算出することによって決定し
た。

【０１１７】

【数１】

【０１１８】 （ここで、Ｌ＝染色のＡＰ距離（μ）＝ｎ×１２×４０ｕかつｎ＝染色した切
片の数）。

【０１１９】 どれほどのウイルスが脳組織を効率的に形質導入するために必要であるかを決
定するために、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプを介して２．５×１０⁸、２．５×１
０⁹、または２．５×１０¹⁰個のＡＡＶ−ｔｋ粒子を受けたラット間で、免疫染
色した切片の比較を実施した。

【０１２０】 測定される全てのパラメーターを用いて、明瞭な用量応答を観察した。最も高
い力価を受けた動物由来の注入された組織は、中程度の用量群についての１０ｍ
ｍ³の容量および低用量群についての１ｍｍ³未満の容量と比較して、平均３００
ｍｍ³の組織（すなわち、成体ラット大脳半球の約６０％（Ｌｅｙｄｅｎら（１
９９８）Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．８７：５９〜６７））において、ト
ランスジーン発現を実証した（図１ａ）。容量を、群間で有意な差もまた共に示
した染色の平均面積および距離から算出した（図１ｂ、ｃ）。形質導入した組織
の容量における発現は一様ではなかったが、染色の勾配を示した。注入部位を直
接的に囲む領域は強力に標識されたが、一方、針管からの距離が増大するにつれ
、検出され得る陽性細胞はより少なかった（図２）。最後に、図１ｄは、平均１
６９，０００と推定される、高用量群からの切片におけるｔｋ陽性細胞の総数が
、中程度の用量群のその総数よりも約１０倍高いことを示す。

【０１２１】 （注入対浸透ポンプ送達） 免疫染色した脳切片の比較は、２つのポンプのベクターを送達する能力におけ
る類似性および相違性を実証した。平均容量、面積、ＡＰ距離、および陽性細胞
の推定総数によって測定されるように、２つの群間のｔｋ発現における有意な差
異は存在しなかった（図３ａ〜ｄ）。浸透ポンプ送達群中での全サンプルの針管
の周囲のいくつかの組織の損失が存在したので（データは示さず）、推定される
陽性細胞の数についての、この群の真の平均値は、より高いものであり得る。そ
して、両方の送達方法が著しいトランスジーン発現を生じた間に、標識されるよ
うになる細胞の型において差異が存在した。ベクターを注入された組織は、ニュ
ーロンにおいてほとんど独占的にｔｋを発現し（図４ａ、ｂ）、そして浸透ポン
プを介してベクターを受けた組織は、ニューロンおよび注入の部位の近傍の反応
性グリア細胞において発現を示した（図４ｃ、ｄ）。

【０１２２】 （組織分布） 組換えＡＡＶが頭蓋内送達の部位から離れた位置で検出され得るか否かを決定
するために、ＰＣＲ分析を、高用量のベクターを受けた３匹のラットの各々由来
の１５の異なる器官および組織において実施した。送達方法（注入または浸透ポ
ンプ）に関わらず、ｔｋ遺伝子から４５８ｂｐのＰＣＲ産物を、Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎブロット分析を使用して、脊髄、脾臓、および脳の両半球において検出し得た
（図６）。このラットのうちの１匹において、ベクターのセットを、腎臓由来の
組織においても検出した。

【０１２３】 （毒性） 毒性が任意の送達方法に関連するか否かを評価するために、組織病理学を、各
群由来のＨ＆Ｅ切片に対して実施し、そしてその結果を表１に要約する。組織形
態全体を十分に保存し、そして凍結または他の人為結果は存在しなかった。注入
送達の群において、組織の損傷は、仮に存在したとしても最小であった。細胞性
浸潤はなく、針管における壊死はなく、そして数匹の動物において最小の皮質性
壊死が存在した。新たな出血を、高用量のラットのうちの１匹において見出し、
そしてヘモジデリン沈着（過去における中程度の出血を示す）を、高用量動物の
うちの４匹において見出した。あるいは、深刻な損傷が、針管、細胞性浸潤、お
よびヘモジデリン沈着の周りの大きな壊死性領域を含む浸透ポンプ送達群の全て
の動物において見られた。

【０１２４】 従って、２．５×１０¹⁰個のＡＡＶ−ｔｋ粒子の、８μｌ／時間で２．５時間
での注入は、組織の３００ｍｍ³の容量に対してＡＡＶベクターを部分的に分布
させるために十分である。この領域において、発現の勾配は、注入部位の直接的
な周囲を強力に染色することによって観察され、そしてより遠くで陽性細胞がよ
り少なくなる。分布は、２つの異なるポンプ送達系が比較される場合、用量（粒
子数）の関数であるようであるが、送達時間またはサンプル容量の関数でなない
ようである：２．５×１０¹⁰個の粒子の分布は、浸透ポンプ（容量＝２００μｌ
、速度＝８μｌ／時間、時間＝２４時間）か、または注入ポンプ（容量＝２０μ
ｌ、速度＝８μｌ／時間、時間＝２．５時間）によって送達される場合に同じで
あった。さらに、著しく異なるレベルの発現を、３つの注入送達群の間で観察し
た。ここで、サンプル容量、速度、および送達時間は、一定に保たれ、そして粒
子数のみが可変であった。

【０１２５】 ＡＡＶの対流を増強する送達を用いて得られたこれらの結果は、大きな高分子
（例えば、ラット脳に対する超磁性体（ｓｕｐｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）粒子）の
ＣＥＤ研究から得られる結果と一致する（Ｋｒｏｌｌら（１９９６）Ｎｅｕｒｏ
ｓｕｒｇ．３８：７４６〜７５４、米国特許第５，７２０，７２０号）。磁気共
鳴画像および組織化学染色を使用したＫｒｏｌｌらは、組織中の粒子の分布を最
大化することにおいて、用量が最も重要な変数であることを実証した。Ｋｒｏｌ
ｌは、注入容量が小さい（２μｌ）かもしくは中程度である（２４μｌ）か否か
、または注入速度が低い（６μｌ／時間）かもしくは高い（７２μｌ／時間）か
否かに関わらず、５．３から２６．５μｇへの粒子の増加が、組織中のこれらの
分布の容量において５倍程度の増加を生じたことを報告した。

【０１２６】 細胞型特異性に関して、ＡＡＶがニューロンを形質導入し得、そして現在の研
究がこの知見を確証することは、以前に報告されている。発現がニューロンにお
いて非常に顕著であるという事実は、ＣＭＶプロモーターを使用するＡＡＶ遺伝
子治療ベクターが、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾
患の処置において有用であることを示唆する。活性なグリオーシスが存在する乱
れた組織の小領域を除いては、成熟グリア細胞において発現は見られなかった。
しかし、本発明者らは、ＡＡＶ−ＣＭＶ−ｔｋベクターがグリア細胞において十
分に発現され、そしてプロドラッグガンシクロビルと組合わせて得られる場合、
これが、ヌードマウスにおける実験的なグリオームを処置することにおいて有用
であることを以前に実証した。ｔｋ「自殺」遺伝子は、***細胞に対して毒性で
あると考えられるので、これは、標的腫瘍細胞に対してのみ危険を引き起こし、
ニューロンの周囲に対しては危険を引き起こさないべきである。最後に、本研究
に使用されるＣＭＶプロモーターは、ニューロンにおける強力なトランスジーン
発現を可能にする一方、細胞型特異的プロモーターの選択は、稀突起膠細胞およ
びグリア細胞のような他のＣＮＳ成分へのＡＡＶの標的化を可能にする。

【０１２７】 本研究はまた、脳に送達されるＡＡＶが、主に中枢神経系において含まれるこ
とを示す。他は、脳の２つの半球の間のウイルスの逆行性輸送、および循環する
大脳脊髄液を介して脊髄に至るウイルスの能力を実証した。脾臓におけるベクタ
ーの外見は奇妙であり、そして２つの機構を示唆する。１つは、ウイルスが注入
プロセスの間の血流に進入することであり、脾臓を介して循環され、ここで、ウ
イルスは「除去される」。しかし、これが事実ならば、ＡＡＶによって誘導され
ることが示される他の組織が、ウイルスを取り込むこともまた予測される。別の
可能性のある機構は、樹状細胞によって示される機構であり得る。これらの細胞
は、主に皮膚において見出され、外来物質を取り込み、循環へ進入し、そして脾
臓において濃縮され、ここでこの外来物質はさらなるプロセシングまたは破壊を
待ちながら長期間の間存在し得る。いずれの場合において、本発明者らは、送達
の経路（筋肉内、静脈内、およびこの頭蓋内を含む）に関わらず、ベクターは、
脾臓において常に検出されることを見出した。

【０１２８】 要約すると、高用量のＡＡＶベクターの緩慢な頭蓋内注入は、齧歯類モデルに
おける有意な部分または脳を形質導入することが示された。ＡＡＶを使用して、
種々の中枢神経障害（腫瘍、発作から生じる損傷、および神経変性疾患を含む）
を標的し得る。

【０１２９】 （実施例３：パーキンソン病の遺伝子治療）ＡＡＤＣをコードする導入遺伝子
を保有するＡＡＶベクターの対流増加送達は、以下のように、サルにおけるＭＰ
ＴＰ誘導性パーキンソン病において、ドパミン作用系を回復させることを示す。

【０１３０】 （動物） パーキンソン病症状の進行に基づく移植のための候補としてアカゲザル（ｎ＝
４、３〜５ｋｇ）を選択した。安定な過剰に病変したヘミパーキンソン（ｈｅｍ
ｉ−ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉａｎ）症候群が達成されるまで、動物に２．５〜３．
５ｍｇのＭＰＴＰ−ＨＬＣを、右内頸動脈を通じて注入（同側性といわれる）し
、続いて０．３ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ−ＨＣＬを４Ｉ．Ｖ．用量注入（対側性と
いわれる）することにより病変させた（Ｅｂｅｒｌｉｎｇ，（１９９８）Ｂｒａ
ｉｎ Ｒｅｓ．８０５：２５９〜２６２）。霊長類ＭＰＴＰモデルは、ヒトへの
試行の前に、評価の金本位制モデルであると考えられる（Ｌａｇｓｔｏｎ（１９
８５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍｃｏｌ．Ｓｃｉ．６：３７５〜３７８）。ＭＰ
ＴＰは、ＣＮＳ中でモノアミンオキシダーゼＢによりＭＰＰ＋に転換される。Ｍ
ＰＰ＋は、パーキンソン病で見られるように、黒質ドパミン作用性ニューロンの
退化および黒質線条体ドパミン経路の欠損をもたらす強力な神経毒素である。Ｍ
ＰＴＰ病変動物を、手術前の５ヶ月間に、臨床的な評定尺度および活性のモニタ
リングを使用して、週に一度臨床的に評価した。

【０１３１】 ＭＰＴＰ投与後、これらの動物は、一般的な緩慢、運動緩徐、硬直、平衡障害
、および屈曲姿勢により明らかとなるパーキンソン病の臨床的徴候を発症させた
。全てのサルにおいて右腕よりも左腕のほうが使用頻度が減少し、そして全て震
えの徴候を示した。臨床的な評定尺度を用いて、全てのサルは、ＭＰＴＰ期間の
後５ヶ月の間に、重篤で安定なパーキンソン症候群評点（２３±１．７、２３±
１．２、２４±１．７、１９±３）に移和した。

【０１３２】 （ベクター産生） １．ｐＡＡＶ−ＡＡＤＣ： １．５ｋｂのＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩＩヒトＡＡＤＣ ｃＤＮＡ（Ｆａｎら（１
９９８）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２５２７〜２５３５）を
ＡＡＶ発現カセットｐＶ４．１ｃ中のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ部位にクローン
化した。この発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶスプライスドナーお
よびヒトβグロビンスプライスアクセプター部位からなるキメライントロン、ヒ
ト成長ホルモンポリアデニル化配列、および隣接ＡＡＶ ＩＴＲ（逆方向末端反
復）を含む（Ｈｅｒｚｏｇ，Ｒ．Ｗ．ら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ ５：５６〜６３）。

【０１３３】 ２．ｐＡＡＶ−ＬａｃＺ： ベクターｐＡＡＶ−ＬａｃＺを以下のように構築した。ｐＳｕｂ２０１（Ｓａ
ｍｕｌｓｋｉら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６１：３０９６−３１０１）のＡ
ＡＶコード領域を、ＸｂａＩ部位間でＥｃｏＲＩリンカーと置換して、プラスミ
ドｐＡＳ２０３を生成した。ｐＣＭＶβ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）のＥｃｏＲＩ〜
ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを平滑末端化し、そしてＫｌｅｎｏｗ処理したｐＡ
Ｓ２０３のＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、そしてｐＡＡｖ−ｌａｃＺを生成し
た。

【０１３４】 ３．ｐＨＬｐ１９： プラスミドＨ１９は、ＡＡＶベクターの産生を増強する一方、複製コンピテン
トな偽野生型ウイルスの産生を抑制するように設計された改変型ＡＡＶ−２ゲノ
ムをコードする。このプラスミドは、ｃａｐ遺伝子の３’位に移動されたＰ５プ
ロモーターを含み、そしてそのプロモーターは、主にＦＬＰリコンビナーゼ（ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）認識配列からなる５’非翻訳領域により置換される。ｐ
Ｈ１９を、ＡＡＶゲノムの３’末端および５’末端の間の任意の相同性領域を除
去するように構築した。さらに、ｐＨ１９ Ｐ５プロモーターの７塩基対のＴＡ
ＴＡボックスを、その配列をＧＧＧＧＧＧＧへ変異させることによって破壊した
。

【０１３５】 ｐＨ１９を、ＡＡＶ−２プロウイルスであるｐＳＭ６２０由来のＡＡＶ−２配
列を使用して、いくつかの処理工程において構築した。ｐＳＭ６２０を、Ｓｍａ
ＩおよびＰｖｕＩＩを用いて消化し、そしてＳｍａＩフラグメントをコードする
４５４３ｂｐのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をｐＵＣ１１９のＳｍａＩ部位
中にクローン化し、７７０５ｂｐのプラスミドであるｐＵＣｒｅｐｃａｐを生成
した。次いで、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子と隣接する残ったままのＩＴＲ
配列を、以下のオリゴヌクレオチド： １４５Ａ；５’−ＧＣＴ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＧ
ＧＴＧ ＧＡＧ ＴＣＧ−３’（配列番号３） １４５Ｂ；５’−ＴＡＡ ＴＣＡ ＴＴＡ ＡＣＴ ＡＣＡ ＧＣＣ ＣＧＧ
ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＣＴ−３’（配列番号４） を使用して、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発により欠失させた。

【０１３６】 得られたプラスミド、ｐＵＣＲｅｐＣａｐＭｕｔａｔｅｄ（ｐＵＣＲＣＭ）（
７５５９ｂｐ）は、任意のＩＴＲ配列（４３８９ｂｐ）をもたないＡＡＶ−２ゲ
ノム全体を含む。変異誘発性オリゴヌクレオチドにより一部導入されたＳｒｆＩ
部位は、この構築物において、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子と隣接する。Ａ
ＡＶ配列は、ＡＡＶ−２の１４６〜４，５３４位に対応する。

【０１３７】 Ｅｃｏ４７ＩＩＩ部位をＰ５プロモーターの３’末端で導入し、Ｐ５プロモー
ター配列の切除を容易にした。これを行うために、ｐＵＣＲＣＭは、プライマー
Ｐ５４７（５’−ＧＧＴ ＴＴＧ ＡＡＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＴＣＧ ＣＣＡ
ＴＧＣ−３’）（配列番号５）を用いて変異誘発した。得られた７５５９ｂｐの
プラスミドは、ｐＵＣＲＣＭ４７ＩＩＩと呼んだ。

【０１３８】 ｐＢＳＩＩｓｋ＋のポリリンカーを、ＢＳＳＨＩＩで元のものからの切除、お
よびオリゴヌクレオチドｂｌｕｎｔ１およびｂｌｕｎｔ２で置換することにより
変えた。得られたプラスミド、ｂｌｕｎｔｓｃｒｉｐｔは、２８３０ｂｐの長さ
であり、そして新規のポリリンカーは、制限部位ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩ、Ｓｒｆ
Ｉ、ＰｍｅＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩをコードする。ｂｌｕｎｔ１および２の配
列は、以下である： ｂｌｕｎｔ１；５’−ＣＧＣ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＴＴ ＡＡＣ ＧＣ
Ｃ ＣＧＧ ＧＣＧ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＡＧ ＣＧＣ ＴＧＧ−３’（配列番
号６） ｂｌｕｎｔ２；５’−ＣＧＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＧＣＴ ＧＴＴ ＴＡＡ ＡＣ
Ｇ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＧＴ ＴＡＡ ＣＧＡ ＴＡＴ ＣＧＧ−３’（配列番
号７）。

【０１３９】 ｐＨ１は、ｐＵＣＲＣＭ由来のＳｍａＩフラグメントをコードする、４３９８
ｂｐのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をｐＢｌｕｎｔｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ部位に
連結することによって構築され、その結果、ＨｐａＩ部位は、ｒｅｐ遺伝子に近
位であった。ｐＨ１は、７２２８ｂｐの長さである。

【０１４０】 ｐＨ２は、ｐＨ１のＰ５プロモーターがｐＧＮ１９０９の５’非翻訳領域によ
り置換されることを除くと、ｐＨ１と同一である。これを行うために、ｐＷ１９
０９ｌａｃＺ由来の５’非翻訳領域をコードする３２９ｂｐのＡｓｃＩ（ｂｌｕ
ｎｔ）−ＳｆｉＩフラグメントをｐＨ１の６８３１ｂｐのＳｍａＩ（部分的）−
ＳｆｉＩフラグメント中に連結してｐＨ２を作製した。ｐＨ２は、７１５６ｂｐ
の長さである。

【０１４１】 ｐＵＣＲＣＭ４７ＩＩＩ由来のｐ５プロモーターをコードする、１７２ｂｐの
ＳｍａＩ−Ｅｃｏ４３ＩＩＩフラグメントのｐＨ２中のＥｃｏ４７ＩＩＩ部位へ
の挿入により、Ｐ５プロモーターをｐＨ２の３’末端に付加した。３つのＡＡＶ
プロモーター全ての転写方向が同じになるように、このフラグメントを合わせた
。この構築物は、７３２７ｂｐの長さである。

【０１４２】 Ｐ５の３’側のＴＡＴＡボックス（ＡＡＶ−２は、２５５〜２６１に位置し、
配列は、ＴＡＴＴＴＡＡ）を、変異誘発性オリゴヌクレオチド５ＤＩＶＥ２（５
’−ＴＧＴ ＧＧＴ ＣＡＣ ＧＣＴ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＣ ＣＣ
Ｇ ＡＧＴ ＧＡＧ ＣＡＣ Ｇ−３’）（配列番号８）を用いて、配列をＧＧ
ＧＧＧＧＧに変化させることにより除去した。得られた構築物ｐＨ１９は、７３
２８ｂｐの長さである。

【０１４３】 ４．プラデノ５（ｐｌａｄｅｎｏ５）： プラデノ５は、２９３細胞中にトランスフェクトされる場合、ＡＡＶベクター
産生のためのアデノウイルスヘルパー機能の完全なセットを提供するプラスミド
である。これは、本質的に、アデノウイルス２由来のＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ
ＲＮＡ領域およびプラスミド骨格から構成される。このプラスミドを、以下のよ
うに構築した。

【０１４４】 ｐＢＳＩＩｓ／ｋ＋を、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発および以下のオリ
ゴヌクレオチド： ５’−ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＣＧ ＡＴＡ ＴＣＡ ＧＣＴ Ｃ
ＡＣ ＴＣＡ Ａ−３’（配列番号９） を使用して、ポリリンカーおよび単一のＥｃｏＲＶ部位を有するα相補性カセッ
トをコードする６３７ｂｐ領域を置換するために改変した。制限部位ＢａｍＨＩ
、ＫｐｎＩ、ＳｒｆＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩ、Ｂｓｔｌ１０７Ｉ、ＳａｌＩ、Ｐ
ｍｅＩおよびＮｄｅＩをコードするポリリンカーを、次いでＥｃｏＲＶ部位中に
クローン化した（５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＣＣ ＣＧＧ Ｇ
ＣＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＣＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＣＧ ＴＣＧ ＡＣＧ Ｔ
ＴＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＴＡＴ Ｇ−３’）（配列番号１０）。

【０１４５】 アデノウイルス−２ ＤＮＡを消化し、そしてＥ２Ａ領域（アデノウイルス−
２ゲノムの２２，２３３〜２７，５６８位に対応する５，３３５ｂｐのＫｐｎＩ
−ＳｒｆＩフラグメント）をコードする制限フラグメント、およびＶＡ ＲＮＡ
（アデノウイルス−２ゲノムの１０，４２６〜１１，１５７位に対応する、７３
１ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩフラグメント）をコードする制限フラグメント
を単離した。Ｅ２ＡフラグメントをポリリンカーのＳａｌＩ部位とＫｐｎＩ部位
との間に組込んだ。最初に、アデノウイルス−２の２１，６０６〜３５，４７０
位（遺伝子の５’末端をコードする）に対応する１３，８６４ｂｐのＢａｍＨＩ
−ＡｖｒＩＩフラグメント、およびアデノウイルス−２の３５，３７１〜３５，
８３３位（遺伝子の３’末端をコードする）に対応する４６２ｂｐのＡｖｒＩＩ
およびＳｒｆＩ消化されたＰＣＲフラグメントを、ｐＢＳＩＩ／ｋ＋のＢａｍＨ
Ｉ部位とＳｍａＩ部位との間に連結させることによって、ｐＢＳＩＩ／ｋ＋中で
Ｅ４領域をアセンブリした。ＰＣＲフラグメントを産生するために使用されるオ
リゴヌクレオチドは、Ｅ４プロモーターおよびアデノウイルス末端反復の連結部
にＳｒｆＩ部位を導入するように設計した。その連結部は、配列５’−ＡＧＡ
ＧＧＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＧＴＴ ＴＴＡ ＧＧＧ ＣＧＧ ＡＧＴ ＡＡＣ
ＴＴＧ Ｃ−３’（配列番号１１）および５’−ＡＣＡ ＴＡＣ ＣＣＧ ＣＡ
Ｇ ＧＣＧ ＴＡＧ ＡＧＡ Ｃ−３’（配列番号１２）を有する。インタクト
なＥ４領域を、ＳｒｆＩおよびＳｐｅＩで切断することによって除去し、そして
アデノウイルス−２の３２，６４４〜３５，８３３位に対応する３，１８９ｂｐ
フラグメントを、ＳｒｆＩ部位とＸｂａＩ部位との間のＥ２Ａ中間体中にクロー
ン化した。最終には、ＳａｃＩＩ部位のＴ４ポリメラーゼ媒介平滑末端改変の後
、ＶＡ ＲＮＡフラグメントをＢｓｔｌ１０７部位中に挿入した。プラデノ５中
の遺伝子を、Ｅ２ＡおよびＥ４プロモーターの５’末端が隣接するように整列さ
せ、これは、互いに逆方向で転写する領域を生じる。このＶＡ ＲＮＡ遺伝子は
、Ｅ４遺伝子の３つのプライム末端に位置し、Ｅ４遺伝子の方向へ転写する。こ
のプラスミドは、１１，６１９ｂｐの長さである。

【０１４６】 （ＡＡＶベクター産生） ＨＥＫ２９３細胞株（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．、Ｓｍｉｌｅｙ，Ｊ．，Ｒｕｓ
ｓｅｌ，Ｗ．Ｃ．，およびＮａｉｖａ，Ｒ．（１９７７）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｓｔｉｃｓ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｔｒａｓｎｆｏｒｍ
ｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ
５．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２）を、４．５ｇ／リットルの
グルコース、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、および２ｍＭのグルタミ
ンを含む完全ＤＭＥＭ（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、空気中５％ＣＯ₂
において３７℃で培養した。４０のＴ２２５フラスコにそれぞれ２．５×１０⁶
細胞を播種し、そして３日間増殖させて７０〜８０％のコンフルエンシー（フラ
スコあたり約１．５×１０⁷細胞）までトランスフェクトさせた。

【０１４７】 Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら（Ｍａｔｓｕｄｈｉｔａ，Ｔ．、Ｅｌｌｉｇｅｒ，Ｓ
．、Ｅｌｌｉｇｅｒ，Ｃ．、Ｐｏｄｓａｋｏｆｆ，Ｇ．、Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ
，Ｌ．、Ｋｕｒｔｚｍａｎ，Ｇ．Ｊ．、Ｉｗａｋｉ，Ｙ．、およびＣｏｌｏｓｉ
，Ｐ．（１９９８）「Ａｄｅｎｏ−ａｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔ
ｏｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ
ｏｕｔ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８〜
９４５）によって記載されるトランスフェクション方法および精製方法を、少々
改変して、ＡＡＶベクター産生に用いた。このベクター産生過程は、ＨＥＫ２９
３細胞の、フラスコあたりそれぞれ２０μｇの以下の３つのプラスミド：ＡＡＶ
−ＡＡＤＣプラスミド、ＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＨＬＰ１９、ＡＡＶ ｒ
ｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含む）、およびアデノウイルスヘルパープラス
ミド（プラデノ５、以前ではｐＶＡＥ２ＡＥ４−２（４）として公知であり、そ
してＥ２Ａ、Ｅ４および精製アデノウイルス−２由来のＶＡ ＲＮＡ遺伝子から
構成される）での、リン酸カルシウム法（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍら（１９８０）Ｔｒ
ａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ
ａｎ ａｍｐｌｉｆｉａｂｌｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ−ａｃｔｉｎｇ ｇｅｎｅ
．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７〜３５７０
）を用いた、６時間の同時トランスフェクションを含む。トランスフェクション
の後、培地を交換し、そして３日後に細胞を採集した。次いで、細胞ペレットを
３サイクルの凍結−解凍溶解（断続的にボルテックスしながら、ドライアイス−
エタノール槽と３７℃槽との間で交互にする）に供した。細胞細片を遠心分離で
除去した（１０，０００ｇ、１５分間）。上清を２回遠心分離して、残っている
懸濁物を除去し、そして続いてＢｅｎｚｏｎａｓｅ^R（２００ｕ／ｍｌ）で３７
℃で１時間処理し、細胞ＤＮＡの混入を減少させた。インキュベーションの後、
上清をＣａＣｌ₂ ２５ｍＭにし、そして氷上に１時間置いた。生じた沈殿物を
遠心分離（１０，０００ｇ、１５分間）で除去し、そして廃棄した。次いで、こ
の上清をＰＥＧ（８０００） １０％にし、そして氷上に３時間置いた。この沈
殿物を遠心分離（３０００ｇ、３０分間）で収集し、そして２０ Ｔ２２５フラ
スコあたり５０ｍＭ ＮａＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）の４ｍｌ中に再懸濁した。固体ＣｓＣｌを添加して、１．４
ｇ／ｍｌの密度にし、そしてサンプルをＢｅｃｋｍａｎ Ｔ１７０ローターで、
１５０，０００ｇで２４時間、遠心分離した。ＡＡＶ含有画分をプールし、１．
４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ密度に調整し、そしてＢｅｃｋｍａｎ ＮＶＴ６５ロータ
ーで、３５０，０００ｇで１６時間遠心分離した。次いで、ＡＡＶを含む画分を
濃縮し、そして賦形剤緩衝液（ＰＢＳ中５％ソルビトール）に対してダイアフィ
ルトレートした。精製したＡＡＶ−ＡＡＤＣベクターの力価を、定量的ドットブ
ロット分析を用いて決定し、そしてベクターストックを、−８０℃で保存した。

【０１４８】 （ウイルス注入） 手術室において滅菌野を作り、注入システムを準備した。注入カニューレを生
理食塩水でフラッシュし、針と管材との間の界面の完全性を評価した。滅菌注入
カニューレとローディングラインを、そのシステム中での空気泡の集積を妨げる
ように極度の注意を払って、適切なフィッティングを用いて接続した。非滅菌性
オイル注入ラインを、以前に記載されたように用意し、そしてオイルを満たした
１ｍｌの気密Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを、Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプに取り付
けた。６つの注入カニューレを、微量透析（ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）ホル
ダーにはめ込み（１ホルダーあたり３つのカニューレ）、そして定位タワーにマ
ウントした。オイルラインおよびローディングラインの結合後に、針カニューレ
にＡＡＶをプライムし、そしてこの注入システムを、手術テーブルに移した。最
初の注入速度を、０．１ｐｌ／分に設定し、このラインを視覚的に検査して、こ
のシステムを通る液体のスムースな流れを確実にし、そしてこのカニューレを、
それらの標的部位にまで手動で下げた。最終的な視覚検査を行い、この注入シス
テム中の任意の空気泡についてチェックした。

【０１４９】 このカニューレシステムは、以下の３つの構成からなった：（ｉ）滅菌注入カ
ニューレ；（ｉｉ）ＡＡＶ−ＡＡＤＣまたはＡＡＶ−ＬａｃＺ（コントロール）
を収容した滅菌ローディングライン；および（ｉｉｉ）オリーブオイルを含む非
滅菌注入ライン。各ラインの準備を、簡単に本明細書中に記載する。この注入カ
ニューレは、シリカガラス（外径、．０１６”、内径、．００８”；Ｐｏｌｙｍ
ｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）を備え付けた２
７Ｇ針（外径、．０３”；内径、．０６”；Ｔｅｒｕｍｏ Ｃｏｒｐ．，Ｅｌｋ
ｔｏｎ，ＭＤ）からなり、そしてこれを、そのシリカの遠位端がＴｅｆｌｏｎ管
材（．０３”ＩＤ，Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｅａｔｔｌｅ
，ＷＡ）から約１５ｍｍ延びるように、その管材中に置いた。この針を、スーパ
ーグルー（ｓｕｐｅｒｇｌｕｅ）を用いてその管材に固定し、そしてこのシステ
ムを使用前に漏れについてチェックした。この管材の近位端に、Ｔｅｆｚｅｌフ
ィッティングおよびフェルールを取り付け、隣接するローディングラインを接続
した。

【０１５０】 ローディングラインおよび注入ラインは、Ｔｅｆｚｅｌ １／１ ６”フェル
ール、ユニオン、および雄型Ｌｕｅｒロックアダプター（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）を遠位端に備えた、５０ｃ
ｍに切断したＴｅｆｌｏｎ管材（外径、．０６２”；内径、．０３”）からなっ
た。この滅菌ローディングラインは、１０００ｍｌ容量まで収容し、そして使用
前に生理食塩水をプライムした。

【０１５１】 その動物に、最初にＫｅｔａｍｉｎｅ（Ｋｅｔａｓｅｔ；１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ
．ｍ．）を用いて鎮静させ、挿管し、そして手術の用意をした。静脈ラインを、
橈側皮静脈または伏在静脈に位置付けした２２ゲージのカテーテルを用いて確立
し、等張液を５〜１０ｍｌ／ｋｇ／時間で送達した。イソフルラン（Ａｅｒｒａ
ｎｅ，Ｏｍｅｄａ ＰＰＤ Ｉｎｃ．、Ｌｉｂｅｒｔｙ，ＮＪ）を、その動物が
麻酔の安定な水準を維持するまで、１〜３％で送達した。頭部を、ベースライン
のＭＲＩスキャンの間に得られたプリセット値に従って、ＭＲＩコンパチブル定
位フレーム中に置いた。この動物に、皮下心電図電極、直腸消息子を取り付け、
そして身体を循環水ブランケットで覆い、コア温度を３６〜３８℃に維持した。
心電図および心拍数（Ｓｉｌｏｇｉｃ ＥＣＧ−６０、Ｓｔｅｗａｒｔｓｔｏｗ
ｎ，ＰＡを使用する）、ならびに体温を、この手順の間に連続的にモニタリング
した。頭部を、Ｂｅｔａｄｉｎｅおよび７０％エタノールで前処理し、滅菌野を
作製し、電気焼灼器（Ｓｕｒｇｉｓｔａｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，Ｖ
ａｌｌｅｙｌａｂ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を用いて、皮膚、筋肉お
よび筋膜を通して正中切開を行った。

【０１５２】 筋膜および筋肉の穏やかな収縮は、皮質の侵入部位にわたる頭蓋の露出を可能
にした。片側の開頭術を、Ｄｒｅｍｅｌ歯科用ドリルを用いて行い、標的部位の
上の硬膜の３ｃｍ×２ｃｍの領域を露出させた。ホルダーに取り付けた複数の針
カニューレを、線条体の標的部位に定位的に誘導した。ＩＣＡ ＭＰＴＡ注入と
同側の半球へのＡＡＶの片側注入のための外科的変数を、表２に要約する。

【０１５３】

【表２】

【０１５４】 注入の約１５分後に、このカニューレアセンブリを、１ｍｍ／分の速度で、皮
質を離れるまで上昇させた。この皮質を、生理食塩水でリンスし、骨縁をロンガ
ー（ｒｏｎｇｕｅｒ）で削り取り、そして創傷部位を解剖学的層中に閉じた。鎮
痛薬（Ｎｕｍｏｒｐｈａｎ，１Ｍ）および抗生物質（Ｆｌｏｃｉｌｌｉｎ，１Ｍ
）を、外科的プロトコルの一環として投与した。動物を、麻酔からの十分な回復
についてモニタリングし、それらのホームかご（ｈｏｍｅ ｃａｇｅ）中に置き
、そして手術後約５日間、臨床的に観察（２回／日）した。総神経外科手術時間
は、１動物あたり４．５時間であった。

【０１５５】 線条体内ＡＡＶ投与の後、動物を、異常な行動のいずれかの徴候について評価
した。動物を、獣医学技術者によって、臨床的観察形態を用いて、１日に２回、
観察および評価した。すべてのサルは、手術から２時間以内に回復し、そしてそ
れら自体を維持し得た（栄養補給および毛づくろいを含む）。手術後の全８週間
の間に、いずれの有害な効果の徴候も存在しなかった。

【０１５６】 （磁気共鳴画像法） 標的部位の可視化は、尾状核または被殻内の細胞の正確な配置のために必須で
ある。ＭＲＩと組み合わせた定位的手順を用いて、所望の標的にされた構造内に
カニューレを正確に配置した。すべての動物を、手術前にスキャンして、各個々
の動物についての標的移植部位の正確な定位座標を作成した。ＰＥＴスキャンニ
ングのために使用される同じ基準マーカーを、ＭＲＩ画像およびＰＥＴ画像の相
互重ね合わせ（ｃｏ−ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のためにフレーム上に置いた
。手短には、スキャンニング手順の間、この動物を、ケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ
，７ｍｇ／ｋｇ、ｉｍ）およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ，３ｍｇ／ｋｇ，ｉｍ
）の混合物を用いて鎮静させた。この動物を、ＭＲＩコンパチブル定位フレーム
中に置き、イヤーバーおよびアイバー測定を記録し、そしてＩＶラインを確立し
た。６０の冠状画像（１ｍｍ）および１５の矢状画像（３ｍｍ）を、ＧＥ Ｓｉ
ｇｎａ １．５ Ｔｅｓｌａ機械を用いて撮影した。磁気共鳴画像を、Ｔ１重み
付けし、スポイルグラスシークエンスを、反復時間（ＴＲ）＝７００ｍｓ、エコ
ー時間（ＴＥ）＝２０ｍｓ、およびフリップ角３０’で用いて、３つの平面中に
得た。視野は、１９２マトリックスおよび２ＮＥＸ（シグナル情報あたりの平均
数）で１５ｃｍであった。ベースラインスキャンニング時間は約２０分であった
。標的にされた構造（例えば、尾状核）の前後分布および内側外側分布を、冠状
ＭＲ画像を用いて決定した。外科的座標を、尾状核および被殻の拡大した冠状画
像（１．５×）から決定した。

【０１５７】 （陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）） 全ての４匹の動物は、２つのＰＥＴスキャン、ＭＰＴＰ病変の確立後のベース
ラインスキャン、およびＡＡＶ−ＡＡＤＣまたはＡＡＶ−ＬａｃＺのいずれかの
注入の７〜８週間後での第２のスキャンを受けた。ＰＥＴの前に、各動物は、１
．５Ｔマグネットおよび定位フレーム（これは、外部基準マーカーの使用を通じ
て、ＰＥＴおよびＭＲデータセットの間の相互重ね合わせを可能にした）を用い
る磁気共鳴（ＭＲ）画像法を受けた。ＰＥＴ研究を、ＰＥＴ−６００システム、
平面中で２．６ｍｍの解像度、ならびに遮断ギャップを低減させることによって
、電流研究のために６ｍｍから３ｍｍに増加させた調整可能な軸解像度を有する
シングルスライストモグラフで行った。このトモグラフの特徴は、以前に記載さ
れている（Ｂｕｄｉｎｇｅｒら（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２３
（６）：６５９〜６６７；Ｖａｌｋ．（１９９０）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １７６
（３）：７８３〜７９０）。サルに挿管し、そしてイソフルランで麻酔し、定位
フレーム中に置き、そしてＰＥＴスキャナー中に位置付けし、線条を通過する冠
状脳スライスを画像化した。サルを、定位フレームでの前方−後方スケール、お
よびトモグラフに接続したレーザー光を用いて各研究について同じ方法で位置付
けした。スキャナー中に位置付けした後、５分の透過スキャンを得て、フォトン
減衰について修正し、そして動物の配置をチェックした。次いで、このサルに、
１０〜１５ｍＣｉのＡＡＤＣトレーサー、６−［¹⁸Ｆ］フルロ−Ｌ−ｍ−チロシ
ン（ＦＭＴ）を注射し、そして画像化を開始した。画像化を６０分間続け、その
時間にこのサルを再配置して、最初に対して尾側の第２のスライス６ｍｍを画像
化した。

【０１５８】 ＰＥＴおよびＭＲデータセットを、相互重ね合わせし、そして目的の領域（Ｒ
Ｏ）を、ＭＲに関して５０〜６０分（スライス１）および６５〜７５分（スライ
ス２）で収集したＰＥＴデータ上に、対側の半球（ＩＣＡ ＭＰＴＰ注入と反対
側）中の線条について描いた。ＲＯの鏡像を、同側（ＭＰＴＰ注入の側）の半球
中に作成し、そして放射能カウント（ｃｍ²／秒）を各ＲＯＩについて決定した
。線条体カウントを、各研究について２つのスライスについて平均をとった。Ｆ
ＭＴ取り込み非対称比を、各動物について各時点で算出した。これは、同側（病
変）線条についてのカウントを、対側（非病変）線条についてのカウントから差
し引き、そして同側線条および対側線条についての平均カウントで割ることによ
って算出した。非対称比における動物間の可変性を低減するために、変化スコア
を、各動物についてのベースライン研究についての非対称比から、第２のＰＥＴ
研究からの非対称比を差し引くことによって算出した。不対ｔ検定を用いて、Ａ
ＡＶ−ＡＡＤＣおよびＡＡＶ−ＬａｃＺサルについてのペット非対称比における
変化を比較した。

【０１５９】 予測されるように、すべての４匹のサルは、ベースラインにて、同側線条より
も対側線条（これは、無視できるほどの取り込みを示した）においてより大きな
ＦＭＴ取り込みを示した。第２のＰＥＴ研究の時点で、ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理し
たサルは、同側の線条における増加したＦＭＴ取り込みを示したが、ＡＡＶ−Ｌ
ａｃＺ処理した動物は、ベースラインからの変化を示さなかった（図７）。ベー
スラインから第２のＰＥＴ研究へのＦＭＴ取り込み非対称性における変化は、Ａ
ＡＶ−ＬａｃＺサルについて（これは、両方の時点でより大きな対側ＦＭＴ取り
込みを示した）よりも、ＡＡＶ−ＡＡＤＣサルについて（これは、第２の研究の
時点でほとんど非対称性を示さなかった）有意に大きかった（ｐ＜０．０１）（
図８）。

【０１６０】 （剖検） 動物を、ペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で深く
麻酔し、そしてＡＡＶ投与の８〜９週後、および術後のＰＥＴスキャンの１週間
後に屠殺した。屠殺の日に、血液サンプルを採取し、そして動物を、Ｌ−ドパ／
カルビドパ調製物（Ｓｉｎｅｍｅｔ ２５０／２５）で処理した。血漿および頸
部ＣＳＦを部検の時点で回収した。脳を、Ｓｉｎｅｍｅｔ投与の３０〜４５分後
に取り出し、脳基質中に置き、そして３〜６ｍｍスライスに冠状に切片化した。
各サル由来の１つの３ｍｍ厚線条体脳スライスを、−７０℃のイソペンタン中で
すぐに凍結し、そして生化学分析のために凍結保存した。残りの６ｍｍ厚のスラ
イスを、ホルマリン中に７２時間に後固定し、ＰＢＳ中で１２時間洗浄し、そし
て上行スクロース勾配（１０〜２０〜３０％）で調整し、そして凍結した。

【０１６１】 （組織学的分析） ホルマリン固定した脳スライスを、低温槽中で３０μｍ厚冠状切片に切断した
。凍結した切片を、尾状核の吻端のレベルで始めて、尾〜黒質のレベルまでの様
々の連で回収した。各切片を、７０℃での不凍液中に保存および維持した。連続
切片を、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ドパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ
）またはβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）免疫反応性（ＩＲ）について染色
した。１２番目毎の切片を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そし
て３％ Ｈ₂Ｏ₂中で２０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を
ブロックした。ＰＢＳ中での洗浄の後、この切片をブロッキング溶液（ＴＨにつ
いて１０％の正常なウマ血清、またはＤＤＣおよびβ−ｇａｌについて１０％の
正常なヤギ血清、ならびにＰＢＳ中０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００）中で
３０分間インキュベートし、続いて一次抗体溶液−ＴＨ（マウスモノクローナル
、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，１：１０００）、ＤＤＣ（ウサギｐｏｌｙｇｏｎａｌ，Ｃ
ｈｅｍｉｃｏｎ，１：２０００）、またはβ−ｇａｌ（ウサギｐｏｌｙｇｏｎａ
ｌ，Ｃｏｒｔｅｘ Ｂｌｏｃｈｅｍ，１：５０００）中で２４時間インキュベー
トした。次いで、切片を、ＴＨについてビオチン化抗マウスＩｇＧ二次抗体中で
１時間、またはＤＤＣおよびβ−ｇａｌ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，１：３００
）について抗ウサギＩｇＧ二次抗体中で１時間インキュベートした。抗体結合を
、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，
１：３００）、およびニッケルを含有するＤＡＢ色素原（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ
ｓ）で可視化した。次いで、切片をカバーガラスで覆い、そして光学顕微鏡下で
試験した。組織をパンチングした後、新しく凍結したブロックを、２０ｕｍで切
片化した。切片を、ＤＤＣ−ＩＲについてＨ＆Ｅで染色した。

【０１６２】 尾状核、被殻および淡蒼球内のＡＡＶ感染細胞の総数の定量評価を、光学解像
手順を用いることによって決定した。光学解像系は、Ｐｒｉｏｒ Ｈ１２８コン
ピュータ制御ｘ−ｙ−ｚモーター付ステージに固く連結されたＬｅｉｔｚ Ｏｔ
ｈｏｌｕｘ １１顕微鏡、高感度Ｓｏｎｙ ３ＣＣＤビデオカメラシステム（Ｓ
ｏｎｙ，Ｊａｐａｎ）およびＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｇ−３コンピュータを備える
コンピュータ補助画像解析システムからなった。すべての分析を、ＮｅｕｒｏＺ
ｏｏｍソフトウェア（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行った。各連の測定の
前に、装置を較正した。尾状核、被殻および淡蒼球中のポジティブニューロンの
領域を、低倍率（２．５×対物レンズ）で概略を取った。線条内のＡＡＶ感染し
た細胞の分散した存在のために、概略を取った領域の１％を、０．９５開口数を
有する６３×ＰＬＡＮ−ＮＥＯＦＬＵＡＲ液浸系対物レンズを使用する、ディセ
クターカウンティングフレーム（１ ５０５ １ＩＭ２）の系統的ランダム設計
で測定した。パイロット実験に基づいて、等間隔に置かれた少なくとも４つの切
片をサンプリングした。ディセクター原理を使用することによって、２００まで
のＡＡＤＣポジティブニューロンを、すべての測定について、一定、系統的、お
よびランダムな設計手順を使用することによって、光学的スキャンニングによっ
てサンプリングした。切片の平均厚を、２３ミクロンで測定した。一旦切片の頂
部の焦点が合うと、ｚ−−平面を１〜２ｇｍ下げた。次いで、３つの５ ｌｉｍ
厚ディセクターを通して焦点を下げる間にカウントした。底禁制平面が分析に決
して含められないことを確実にするように注意を払った。構造物の容量を、標準
的な手順に従って算定した。試験された構造物中の陽性細胞の総数を、式Ｎ＝Ｎ
ｖ×Ｖｓ（ここで、Ｎｖは数値密度であり、そしてＶｓは構造物の容量である）
を用いることによって算定した。

【０１６３】 ＴＨ−ＩＲ染色は、全てのサルにおける同側の黒質中の黒質線状体線維および
細胞体の確実な減少を示した。対側は、線条および黒質中においてＴＨおよびＡ
ＡＤＣ−ＩＲの可変性の減少を示した。

【０１６４】 ＤＤＣ−ＩＲは、ＡＡＶ−ＬａｃＺで処理したサルにおいてのみ、ＴＨ−ＩＲ
に類似した。ＡＡＶＡＡＤＣ処理したサルは、同側で強いＡＡＤＣ染色を示した
。この染色は、対側で見られた染色に勝った。高密度のＡＡＤＣ−ＩＲ細胞が、
ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理動物のうちの１匹中の８０％の線条および１００％の淡蒼
球を通じて見られた。立体的解析は、被殻において１ｍｍ³あたり１８，３８４
細胞、尾状核において１ｍｍ³あたり１５，１２６細胞、そして淡蒼球において
１ｍｍ³あたり９，５１１細胞を示した。ＡＡＶ感染細胞の総数は、少なくとも
１６×１０⁶細胞であると評価された。他のＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理したサルにお
いて、ＡＡＤＣ−ＩＲ細胞は、６０％を超える同側線条（尾状核において１ｍｍ ³ あたり７，５１５細胞、そして被殻において１ｍｍ³あたり１５，３５２細胞、
そして淡蒼球において１ｍｍ³あたり３，８５０細胞を有する）中で見られた。
対側線条においては、ＡＡＤＣ細胞は見られなかった。ＡＡＶ／ＬａｃＺ処理し
たサルは、同側線条体でも対側線条体でもＡＡＤＣ−ＩＲを示さなかった。

【０１６５】 ＡＡＶに感染した細胞は、神経形態を有するようであった。感染した細胞の平
均直径は、被殻において９±２．３μｍ、および１４．６±９μｍであった。多
くのＬａｃ−ＺおよびＡＡＤＣ細胞は、典型的な中程度の棘状の神経形態を有し
た。ＡＡＶ感染した細胞は、ニューロンマーカーＮｅｕ−Ｎについて陽性であっ
た。ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処理したサルにおいて、４−６Ｎｅｕ−Ｎ−陽性細胞のう
ちの１つは、尾状核および被殻においてＡＡＤＣ陽性であり、そして３−４Ｎｅ
ｕ−Ｎ−陽性細胞のうちの１つは、淡蒼球においてＡＡＤＣ陽性であった。Ｌａ
ｃ−ＺまたはＡＡＤＣ処理したサル中のＡＡＶ感染した細胞のどれも、ＧＦＡＰ
陽性ではなかった。

【０１６６】 カニューレ路に隣接する領域を、ＮｉｓｓｉおよびＨ＆Ｅ染色で染色した。細
胞傷害性の徴候は観察されなかった。カニューレからの距離にかかわらず、血管
周囲カフィングは観察されなかった。Ｎｅｕ−Ｎ免疫染色を用いて対側と比較し
た場合に、注入部位に近くでニューロン細胞減少の徴候は存在しなかった。ＧＦ
ＡＰ免疫染色は、ＡＡＶ処理した線条内で異常なグリア反応を検出し得なかった
。

【０１６７】 （生化学分析） 脳領域を、マイクロパンチャーを用いて新しく凍結したブロックから取り出し
、Ｌ−ドパおよびドパミン代謝物の組織レベル、ならびにＡＡＤＣの活性および
ＡＡＶ−ベクターの存在を評価した。脳領域は、線条および皮質を含んだ。

【０１６８】 凍結したマイクロパンチを回収し、１％エタノールおよび０．０２％ＥＤＴＡ
（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む０．１Ｍ過塩素酸（Ｆｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の３００ｐｌ中で超音波処理によってホモジナイズ
した。５０ｐｌのホモジネートを、タンパク質分析（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｐｉｅｒｃｅ＃２３２２５）のために取り出し、そして残
りを、最大の速度で１．５分間、微量遠心分離中で遠心分離した。３０〜５０ｐ
ｌのホモジネートを、以下を用いるＨＰＬＣによってカテコールアミン分析のた
めに使用した：Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ Ｃ−１８イオン対、５ｐ、４．６×２
５０ｍｍカラム（Ｂｅｃｋｍａｎ ２３５３２９）；Ｗａｔｅｒｓ ７１７ｐｌ
ｕｓオートサンプラー（４℃）、Ｗａｔｅｒｓ５１０ポンプ（０．９ｍｖ／分）
、および電流滴定電気化学検出器（Ｄｅｃａｄｅ）（Ｅｏｘ．０．８２Ｖに設定
した）。このカラムおよび検出セルを、３１℃に設定した。移動相は、２Ｌ Ｈ
ＰＬＣグレード水、２．２ｇ１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩（Ｆｉｓｈｅ
ｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１７ｇ ＥＤＴＡ、１２ｍｌトリエチルアミ
ン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｐＨを８ｍｌ ８５％リン酸（Ｆ
ｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２．５に調整した、および６０ｍｌアセ
トニトリル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を含んだ。検出器の出力を記録し、Ｗａｔｅ
ｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ ３２ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｎａ
ｇｅｒで分析した。

【０１６９】 （ＡＡＤＣ分析） ＡＡＤＣ活性を、Ｎａｇａｔｓｕら（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１００：１６０〜１６５の方法の適用によって決定した。手短には、組織（１０
ｍｇ／ｍｌ）を、０．０４ｍＭピリキシルホスフェート（ＡＡＤＣ補因子）およ
び０．２ｍＭパルジリンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中でホモジ
ナイズした。サンプルを、３７℃にて５分間プレインキュベートし、そして反応
をＬ−ドパの添加（最終濃度：１００μＭ）によって開始した。インキュベーシ
ョンを２０分間行い、そして０．０２ｍｌの濃縮した過塩素酸の添加によって反
応を停止した。遠心分離の後、上清のドパミン濃度を、電気化学検出を用いるＨ
ＰＬＣを使用して決定した（例えば、Ｂｏｏｍｓａら（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．Ａｃｔａ １７８−５９−６９を参照のこと）。組織ペレット中のタン
パク質濃度を、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ＃
２３２２５）を用いて決定した。結果を、タンパク質のｎＭ／時間／ｍｇとして
表す。凍結した組織パンチは、標準的なプロトコルに従って処理した。

【０１７０】 すべてのサルの皮質領域は、可変のレベルのＬ−ドパを示したが、それらは各
サル内で一致した。予測されるように、皮質内でＬ−ドパからドパミンへの脱カ
ルボキシル化は存在しなかったが、ＭＰＴＰ投与の対側での線条において、Ｌ−
ドパは、ドパミンに変換され、そしてさらにＨＶＡに代謝された。ＡＡＶ−Ｌａ
ｃ−ＺサルのＭＰＴＰ処理した線条において、Ｌ−ドパはドパミンに変換されず
、ＨＶＡにも代謝されなかった。Ｌ−ドパの組織レベルはまた、ＡＡＶ−Ｌａｃ
−Ｚ処理したサルの皮質においてと同じレベルのままであった。ＡＡＶ−ＡＡＤ
Ｃ処理したサルのＭＰＴＰ処理した線条において、Ｌ−ドパは、ドパミンおよび
ＨＶＡに変換され、そしてこの領域中のＬ−ドパの組織レベルは、低減された。

【０１７１】 ＡＡＤＣ活性は、ＡＡＶ−ＬａｃＺ処理したサルの皮質領域において、および
ＭＰＴＰ処理した線条において非常に低かった。Ｌ−ドパは、対側の線条におい
てドパミンに変換され、これは、高レベルのＡＡＤＣ活性を示唆する。ＡＡＶ−
ＡＡＤＣ感染したサルのＭＰＴＰ処理した線条からの組織パンチは、残されたＬ
−ドパのトレースのみを有する非常に高いドパミンレベルを含んだ。

【０１７２】 これらの結果は、注入されたＡＡＶ−ＡＡＤＣベクターおよび全身のＬ−ドパ
の組合せが、ＰＤの処置のための有望な治療であることを実証する。

【０１７３】 従って、本発明は、ＣＮＳ障害（例えば、パーキンソン病）のための新規かつ
効率的な処置方法を提供する。さらに、本発明はまた、インビボでドパミン活性
を決定するための方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１（パネルＡ〜Ｄ）は、頭蓋内注入ポンプ送達後のラットにおける用量応答
（ＡＡＶ−ｔｋ導入遺伝子の発現）を示す。組織容量（図１Ａ）；平均面積（図
１Ｂ）；長さ（図１Ｃ）、および導入遺伝子を発現する細胞の数（図１Ｄ）が示
される。

【図２】 図２は、ＡＡＶベクターの注入後のラット脳組織の標識を示す、ハーフトーン
複写である。

【図３】 図３（パネルＡ〜Ｄ）は、注入ポンプ（ＩＰ）または浸透圧ポンプ（ＯＰ）の
いずれかを介したＡＡＶ−ｔｋの頭蓋内送達を示す。組織容量（図３Ａ）；平均
面積（図３Ｂ）、長さ（図３Ｃ）、および導入遺伝子を発現する細胞の数（図３
Ｄ）が示される。

【図４Ａ】 図４Ａは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す
、ハーフトーン複写である。図４Ａは、ニューロンにおけるｔｋの発現を示す。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す
、ハーフトーン複写である。図４Ｂは、ニューロンにおけるｔｋの発現を示す。

【図４Ｃ】 図４Ｃは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す
、ハーフトーン複写である。図４Ｃは、浸透圧ポンプ注入の部位付近のニューロ
ンおよびグリアにおける発現を示す。

【図４Ｄ】 図４Ｄは、ｔｋ導入遺伝子を保有するベクターを注入されたＣＮＳ組織を示す
、ハーフトーン複写である。図４Ｄは、浸透圧ポンプ注入の部位付近のニューロ
ンおよびグリアにおける発現を示す。

【図５】 図５は、ＡＡＶ−ｔｋベクターを注入された被検体由来の組織の、サザンブロ
ット分析を示す、ハーフトーン複写である。

【図６】 図６は、ＭＰＴＰ病変サルの脳のＡＡＤＣに対する免疫染色を示す。左側（コ
ントロール）は、制限された染色を示し、一方で右側（ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処置）
は、広範なＡＡＤＣ免疫染色を示す。

【図７】 図７は、１側性のＭＰＴＰ病変サルの脳におけるドパミン活性を示すＦＭＴ
ＰＥＴ走査である。左側（基線）は、病変部位における制限された活性を示し、
一方で右側（ＡＡＶ−ＡＡＤＣ投与の８週間後）は、正常なレベルのドパミン活
性を示す。

【図８】 図８（パネルＡ〜Ｃ）は、ＭＰＴＰ病変サルにおけるＬ−ドパレベルの生化学
的分析を示す。パネルＡは、Ｌ−ドパが、ＡＡＣＤ酵素によってドパミンに変換
されることを示す。皮質領域においては、ＭＰＴＰ処置にもかかわらず、Ｌ−ド
パのドパミンへの変換はわずかであるかまたは全くなかった。線条は、ＡＡＤＣ
に富み、従って、Ｌ−ドパの大半がこの領域においてドパミンに変換された。Ｍ
ＰＴＰ投与に対して同側性線条において、ドパミンへのＬ−ドパの変換は損なわ
れ、ＡＡＶ−ＬａｃＺ処置サルにおける皮質活性と類似であった。両方のＡＡＶ
−ＡＡＤＣ処置動物が、ほぼ正常なＬ−ドパのドパミンへの変換を示す。パネル
Ｂは、ＨＶＡ分析を示す。ＨＶＡは、ドパミン異化代謝産物の代謝産物である。
皮質領域は、Ｌ−ドパをドパミンへ変換し得ないので、ＨＶＡレベルは低い。パ
ネルＡにおいて示されるように、線条はＬ−ドパをドパミンへと変換し、従って
、ドパミンは、この領域においてＨＶＡへと異化代謝される。ＡＡＤＣ活性は、
ＡＡＶ−ＬａｃＺ処置サルにおいて回復されなかったので、ＭＴＰＴ同側性線条
におけるＨＶＡレベルは低い。ＨＶＡレベルは、ＭＰＴＰ同側性線条において、
ＡＡＶ−ＡＡＤＣ処置サルにおいて有意に上昇した。パネルＣは、異なるＬ−ド
パ投与後の組織パンチにおいて測定されたＬ−ドパレベルを示す。異なるＬ−ド
パ吸収に起因して、組織レベルではサル間で異なる。しかし、これは、各被検体
間で類似である。Ｌ−ドパの組織レベルは、ＡＡＤＣ酵素が回復されたので、Ａ
ＡＶ−ＡＡＤＣ処置サルのＭＰＴＰ同側性線条において劇的に減少した。この領
域におけるＡＡＤＣの活性は、非常に強力である。なぜなら、Ｌ−ドパの組織レ
ベルが対側性線条におけるレベルよりも低いからである。

【図９】 図９は、インビトロでのＡＡＤＣ酵素の活性を示すグラフである。材料および
方法において記載されるように、組織パンチをＬ−ドパと共にインキュベートし
た。ＡＡＤＣ酵素活性を、Ｌ−ドパのドパミンへの変換の速度を測定することに
よって決定した。皮質領域は、低レベルのＡＡＤＣを含む。対側性線条における
ＡＡＤＣ活性は高い。しかし、脳のこの側にはいくつかのドパミン作用性病変が
存在するので、このレベルは変動し得る。ＭＰＴＰ同側性線条におけるＡＡＤＣ
活性は、ＡＡＶ−Ｌａｃ−Ｚ処置サルにおいて有意に減少されるが、これは、Ａ
ＡＶ−ＤＤＣサルにおいて完全に回復される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｋ 37/48 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 バンキーウィクズ， クライス アメリカ合衆国 メリーランド 20896， ギャレット パーク， オックスフォー ド ストリート 4402 (72)発明者 カニンガム， ジャネット アメリカ合衆国 カリフォルニア 94502， アラメダ， ナカヤマ コート ３ (72)発明者 エバーリング， ジェイミー エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレー， ドロシー プレイス ５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA80 CA01 DA02 EA02 EA04 FA02 GA11 GA12 HA17 4C084 AA02 AA03 AA13 CA53 DC01 NA14 ZA022 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA02 4C206 AA01 AA02 FA56 MA01 MA02 MA04 NA14 ZA02

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検体に組換えＡＡＶビリオンを送達するための方法であっ
   て、該方法は、対流増加送達（ＣＥＤ）を介して該ｒＡＡＶビリオンを該被検体
   のＣＮＳ内に投与する工程を包含し、ここで該ｒＡＡＶビリオンが治療用ポリペ
   プチドをコードする核酸配列を含む、方法。
2. 【請求項２】 前記投与する工程が、浸透圧ポンプを使用して実施される、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記投与する工程が、注入ポンプを使用して実施される、請
   求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記核酸配列が、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡ
   ＤＣ）をコードする、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記被検体がヒトである、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ｒＡＡＶビリオンが、線条内に投与される、請求項１に
   記載の方法。
7. 【請求項７】 ＣＮＳ障害を有する患者に組換えＡＡＶビリオンを送達する
   ための方法であって、該方法は対流増加送達（ＣＥＤ）を介して該ビリオンを該
   被検体のＣＮＳ内に投与する工程を包含し、ここで該ビリオンが治療用ポリペプ
   チドをコードする核酸配列を含む、方法。
8. 【請求項８】 前記ＣＮＳ障害がパーキンソン病であり、前記ｒＡＡＶビリ
   オンが線条内に投与され、ここで前記核酸配列がＡＡＤＣをコードする、請求項
   ７に記載の方法。
9. 【請求項９】 被検体における神経変性疾患を処置するための方法であって
   、該方法は以下： （ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含有する調製物を提
   供する工程であって、ここで前記ビリオンが形質導入される細胞において発現し
   て、該被検体に治療的効果を提供し得る核酸配列を含んでいる、工程；および、 （ｂ）対流増加送達（ＣＥＤ）を使用して該被検体のＣＮＳに該調製物を送達
   する工程であって、ここで該ビリオンが神経細胞を形質導入し、そして該核酸配
   列が発現されて、該神経変性疾患を処置するために適切な治療的効果を該被検体
   において提供する、工程、 を包含する、方法。
10. 【請求項１０】 前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項９に記
    載の方法。
11. 【請求項１１】 形質導入される細胞において発現され得る前記核酸配列が
    、ＡＡＤＣまたはその機能的フラグメントをコードする、請求項９に記載の方法
    。
12. 【請求項１２】 前記被検体に少なくとも１つのさらなる治療用化合物を投
    与する工程をさらに包含する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記少なくとも１つのさらなる治療用化合物が、Ｌ−ドパ
    である、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 Ｌ−ドパ、および必要に応じてカルビドパを前記被検体に
    投与する工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 被検体の脳におけるドパミン活性のレベルを測定する方法
    であって、該方法は、以下； （ａ）該被検体に標識されたトレーサを投与する工程であって、ここで細胞に
    対する該トレーサの結合がドパミン活性の指標である、工程；および、 （ｂ）該標識されたトレーサを結合する細胞の数を測定するために該被検体の
    脳を画像化する工程であって、これによって該被検体の脳におけるドパミン活性
    のレベルを測定する工程、 を包含する、方法。
16. 【請求項１６】 前記標識されたトレーサが、６−［¹⁸Ｆ］−フルオロ−Ｌ
    −ｍ−チロシン（¹⁸Ｆ−ＦＭＴ）である、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記画像化が、陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ）画像化であ
    る、請求項１５に記載の方法。
18. 【請求項１８】 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含む調
    製物を被検体の頭蓋腔に送達するための、対流増加送達（ＣＥＤ）の使用。
19. 【請求項１９】 前記ＣＥＤが浸透圧ポンプまたは注入ポンプである、請求
    項１８に記載の使用。
20. 【請求項２０】 パーキンソン病の処置のための医薬の調製における第１組
    成物および第２組成物の使用であって、ここで該第１組成物が、芳香族アミノ酸
    デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）をコードする導入遺伝子を保有するｒＡＡＶビ
    リオンを含み、そして該第１組成物はパーキンソン病を有する患者の脳にインビ
    ボで送達され、そしてここで該第２組成物がプロドラッグを含む、使用。
21. 【請求項２１】 前記医薬の前記第１組成物が、対流増加送達（ＣＥＤ）を
    使用して送達される、請求項２０に記載の使用。
22. 【請求項２２】 前記プロドラッグがＬ−ドパである、請求項２０または請
    求項２１に記載の使用。
23. 【請求項２３】 前記プロドラッグが全身的に送達される、請求項２０〜２
    ２のいずれか１項に記載の使用。
24. 【請求項２４】 前記プロドラッグがカルビドパをさらに含む、請求項２１
    〜２３のいずれか１項に記載の使用。
25. 【請求項２５】 前記ＣＥＤが、浸透圧ポンプまたは注入ポンプである、請
    求項２１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
26. 【請求項２６】 前記第１組成物が線条に送達される、請求項２１〜２５の
    いずれか１項に記載の使用。