CN114076826A

CN114076826A - 一种微球辅助的基于蛋白加热沉淀的药物靶蛋白筛选方法

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Publication number: CN114076826A
Application number: CN202010841731.4A
Authority: CN
Inventors: 叶明亮; 吕佳纹
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2020-08-20
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2022-02-22

Abstract

本发明涉及一种基于微球辅助蛋白沉淀的药物靶蛋白筛选方法。该方法对复杂生物样品施加热沉淀处理，药物靶蛋白在可溶性部分中上调、在不可溶沉淀部分中下调的现象。在蛋白加热沉淀过程中，加入微米尺寸大小的材料颗粒，使得变性的蛋白沉淀到微球表面，再在微球表面进行烷基化、酶解等蛋白质组学样品前处理过程，再结合定量质谱技术，能够实现快速高灵敏度高通量的药物靶蛋白筛选。该方法建立在常规的热稳定性药物靶蛋白筛选方法之上，引入微球辅助蛋白沉淀这一策略，使得热沉淀蛋白样品更有利于后续的蛋白质组学分析，简化样品前处理过程，尽量避免样品损失，降低所需求的初始样品量，实现在次微克级别样品中进行药物靶蛋白筛选实验。

Description

一种微球辅助的基于蛋白加热沉淀的药物靶蛋白筛选方法

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向药物靶蛋白筛选方法领域，具体涉及通过微球辅助的蛋白质加热沉淀来筛选药物靶蛋白，与药物小分子发生结合的靶蛋白的热稳定性增强、不易因热沉淀而沉积到微球表面，从而能将药物靶蛋白从复杂的背景蛋白质组中区分出来。该方法操作简便快速、高通量高灵敏度、可以在次微克级别样品中进行药物靶蛋白筛选。

背景技术

近年来，随着蛋白质组学技术的发展，基于表型筛选的方法重新在新药研发领域展现出优势(文献1：Lee,J.&Bogyo,M.Target deconvolution techniques in modernphenotypic profiling.Current Opinion in Chemical Biology 17,118-126,doi:10.1016/j.cbpa.2012.12.022(2013).；文献2：Wagner,B.K.The resurgence ofphenotypic screening in drug discovery and development.Expert Opinion on DrugDiscovery 11,121-125,doi:10.1517/17460441.2016.1122589(2016).)。即使是在基于靶点的药物发现模式占主流的21世纪早期，表型筛选仍然比基于靶点的筛选方法发现了更多的一线小分子药物(文献3：Swinney,D.C.&Anthony,J.How were new medicinesdiscovered？Nature Reviews Drug Discovery 10,507-519,doi:10.1038/nrd3480(2011).)。因此，科学家们将目光重新投向传统但有效的药物表型筛选方法。尽管表型筛选是一种非常直观有效的药物筛选方法，它最大的瓶颈问题是无法直接指出待研究的药物小分子的靶蛋白(文献4：Heilker,R.,Lessel,U.&Bischoff,D.The power of combiningphenotypic and target-focused drug discovery.Drug Discovery Today 24,526-532,doi:https://doi.org/10.1016/j.drudis.2018.10.009(2019).)。而药物靶蛋白的发现，对于药物的临床应用有着很重要的意义，其参与了用药指导、个性化治疗策略、药物副作用预测等多个临床治疗环节(文献5：Ohki,Y.et al.Perturbation-Based ProteomicCorrelation Profiling as a Target Deconvolution Methodology.Cell ChemicalBiology 26,137-143.e138,doi:10.1016/j.chembiol.2018.10.012(2019).)。随着基于质谱的蛋白质组学技术的飞速发展，药物靶点筛选技术也被加速推进，近二十年来，多种基于蛋白质组学技术的药物筛选方法已被开发出来。根据其工作原理，这些药靶筛选方法大致可分为基于化学蛋白质组学的方法和无标记的方法。基于化学蛋白质组学的方法，顾名思义，需要在待研究的药物小分子上进行化学改造，将药物小分子固定在基质材料上或者在小分子化学结构上接枝一些可富集、可检测的官能团，再通过一系列化学手段将药物小分子及与之结合的靶蛋白富集出来并检测(文献6：Bantscheff,M.et al.Quantitativechemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinaseinhibitors.Nature Biotechnology 25,1035-1044,doi:10.1038/nbt1328(2007).文献7：Barglow,K.T.&Cravatt,B.F.Activity-based protein profiling for the functionalannotation of enzymes.Nature Methods 4,822-827,doi:10.1038/nmeth1092(2007).)。而无标记的药物靶标筛选方法主要是通过检测靶蛋白与药物小分子结合后发生的结构和性质的改变，从而将靶蛋白从成千上万的背景蛋白质中发掘出来(文献8：Lyu,J.,Wang,K.&Ye,M.Modification-free approaches to screen drug targets at proteomelevel.TrAC Trends in Analytical Chemistry 124,115574,doi:https://doi.org/ 10.1016/j.trac.2019.06.024(2020).)。热蛋白质组分析(Thermal protein profiling)是一种无标记的药物靶标筛选方法，其通过研究药物小分子配体的加入与否对靶蛋白的热稳定性影响，从而发现药物的靶蛋白(文献9：Franken,H.et al.Thermal proteomeprofiling for unbiased identification of direct and indirect drug targetsusing multiplexed quantitative mass spectrometry.Nature Protocols 10,1567-1593,doi:10.1038/nprot.2015.101(2015).)。具体来说，蛋白受热后会趋于解开其稳定结构并暴露出疏水腔形成沉淀，当靶蛋白与药物小分子结合后其热稳定性会增强，相比于未结合小分子的游离靶蛋白，溶液中靶蛋白-药物复合物受热后会更不易于生成沉淀。因此，热蛋白质组分析通过研究加药与否的条件下，观测溶液中蛋白在一系列加温度下发生沉淀的程度，通过描绘靶蛋白结合药物后的热稳定性偏移，从而发现药物的靶蛋白。目前，热蛋白质组分析方法已被成功应用于许多药物靶蛋白、脱靶蛋白筛选实例之中(文献10：Becher,I.et al.Thermal profiling reveals phenylalanine hydroxylase as an off-target of panobinostat.Nature Chemical Biology 12,908-910,doi:10.1038/nchembio.2185(2016).文献11：Azimi,A.et al.Targeting CDK2 overcomes melanomaresistance against BRAF and Hsp90 inhibitors.Molecular Systems Biology 14,e7858,doi:10.15252/msb.20177858(2018).文献12：Hashimoto,M.,Girardi,E.,Eichner,R.&Superti-Furga,G.Detection of Chemical Engagement of Solute CarrierProteins by a Cellular Thermal Shift Assay.ACS Chemical Biology 13,1480-1486,doi:10.1021/acschembio.8b00270(2018).文献13：Miettinen,T.P.et al.Thermalproteome profiling of breast cancer cells reveals proteasomal activation byCDK4/6inhibitor palbociclib.The EMBO Journal 37,e98359,doi:10.15252/embj.201798359(2018).)。

对于传统的热蛋白质组分析，随着蛋白受热变性后析出沉淀，可溶部分中蛋白的比例减少，而沉淀部分中蛋白的比例则增加。因此，理论上可溶的上清部分和不可溶的沉淀部分都可以被用作热蛋白质组分析。然而，在实际操作过程中，沉淀部分需要被重新溶解才能进行后续的蛋白质组学样品前处理，操作复杂且可能影响到定量重现性，因此沉淀部分很少被用于热蛋白质组分析，目前主流的热蛋白质组分析主要研究上清溶液中的蛋白热稳定性变化。然而，沉淀部分仍能提供许多上清部分难以展示的信息。某些蛋白被发现即使在很高温度条件下，仍不易发生沉淀。在这种情况下，上清部分中蛋白定量变化程度很温和，蛋白的热稳定性偏移程度也很小，对靶蛋白的发现会造成一定困难。而在沉淀部分中，当蛋白溶液被加热到一定温度时，游离的靶蛋白刚好开始沉淀、可被在沉淀中检测到信号，而与药物小分子结合的靶蛋白因热稳定性增强而仍未发生沉淀、其定量值仍保持为零，因此在沉淀部分中靶蛋白的热稳定性变化的信噪比更好、灵敏度更高、更有利于发现药物靶蛋白(文献14：Peng,H.et al.An Unbiased Chemical Proteomics Method Identifies FabIas the Primary Target of 6-OH-BDE-47.Environmental Science&Technology 50,11329-11336,doi:10.1021/acs.est.6b03541(2016).)。因此，新型的基于沉淀分析的药物靶蛋白筛选方法亟待研究。

传统的热蛋白组分析一般需要10⁵～10⁶细胞(文献15：Gaetani,M.et al.ProteomeIntegral Solubility Alteration:A High-Throughput Proteomics Assay for TargetDeconvolution.Journal of Proteome Research 18,4027-4037,doi:10.1021/acs.jproteome.9b00500(2019).)，对应约超过200μg蛋白。在微量样品的分析过程中，由于传统的基于上清液的热蛋白质组分析所需的操作比较复杂，经过多步样品前处理过程后，蛋白样品受到一定程度的损失，这些不利因素会造成各样品之间蛋白定量不准确，从而导致对药物靶蛋白的捕捉不灵敏。

我们发明了一种基于微球辅助的热沉淀分析方法用于药物靶蛋白筛选。通过结合微球辅助蛋白捕捉和热蛋白质组分析两种技术，溶液中游离蛋白受热发生沉淀时会沉积到微球材料表面，而与药物结合的靶蛋白因热稳定性增强而更难发生沉淀，通过定量比较加药/空白两组之间的微球上蛋白量，能够发现药物的靶蛋白。该方法同时兼具了两种技术的优势，热沉淀分析能够高灵敏度地揭示药物靶蛋白，同时微球辅助的蛋白捕捉技术能够极大程度的提高样品前处理过程的可操作性和定量重现性。本方法实施过程中无需表面活性剂或变性剂的加入，携带有沉淀蛋白的微球材料与含有可溶性蛋白的溶液的分离更容易，微球表面的酶解效率比常规热蛋白质组分析的稀溶液更高。

发明内容

本发明的目的是发展一种高灵敏度、重现性好、操作友好的药物靶蛋白筛选方法；

通过微球辅助的热蛋白沉淀分析，实现次微克级别的药物靶蛋白热稳定性研究，单个样本所需蛋白量可低至20μg；

本发明方法无需对药物小分子进行化学改造，对靶蛋白的筛选是无偏好的；

结合基于质谱的蛋白质组学分析方法，本发明方法实现了高通量、高灵敏度的药物靶蛋白筛选，单次可分析超过2000个蛋白质的热稳定性变化，并从中筛选出药物的靶蛋白。

本发明采用如下的技术方案：

该方法建立在药物靶蛋白因为能与药物分子结合形成结构更加稳定的复合物这一原理之上，对复杂生物样品中的蛋白提取物分别进行加药处理和空白处理，再对两种处理的样品都进行加热处理，使样品中蛋白因加热变性而沉淀。相比空白组，药物靶蛋白在加药组中与药物分子结合而更加稳定，不易发生加热沉淀；

在常规的加热沉淀过程中，蛋白发生解折叠、暴露疏水腔，逐渐从水相析出形成固相沉淀。在本方法中，微球材料被引入来辅助蛋白热沉淀过程，蛋白发生解折叠、结构展开、沉积在微球材料表面；

通过微球辅助捕捉到蛋白沉淀之后，直接在微球表面上进行烷基化、酶解等蛋白质组样品前处理，通过高通量的定量蛋白质组学技术，对加药组和空白组中的全蛋白质组的蛋白丰度进行定量分析。加药组中药物靶蛋白因与药物分子结合形成复合物，其热稳定性增加，沉积在微球表面的蛋白量减少；而空白组的药物靶蛋白呈游离态，其沉积在微球表面的蛋白量相比加药组多，通过这种加药组/空白组之间的蛋白定量差异可以筛选出小分子药物的靶蛋白；

该方法通过微球材料辅助捕捉蛋白热沉淀样品，简化了样品前处理流程，避免了多步处理带来的样品损失问题，在微克级蛋白样品起始量中，结合定量蛋白质组学技术，实现高通量、高灵敏度的药物靶蛋白筛选。其操作流程简单快速、方法重现性好，通过联合使用多通道移液器或自动移液***，能够被应用于大规模的药物靶蛋白筛选试验。

具体过程为：

(1)取蛋白提取液1mL等分为500μL的两份后，分别加入5μL溶解有药物小分子的DMSO溶液(浓度1-10mM)或5μL纯DMSO空白溶剂，重复混合后在25℃下孵育10-60分钟；

(2)将加药组和空白组溶液分别分为多份20μL溶液并转移至PCR管，向PCR管中加入10-100μg Sera-Mag羧基键合的磁性微球材料(GE healthcare)；对于每一对加药组/空白组溶液，同时进行加热处理至某一温度，加热温度范围30-80℃，加热温度间隔1-10℃；加热处理1-10分钟后，将成对样品转移至25℃环境冷却1-10分钟；在加热处理下，蛋白发生解折叠暴露疏水腔结构，从可溶状态转变为不可溶沉淀并且沉积到微球表面。

(3)使用磁力分离手段，将表面沉积有蛋白质沉淀的磁性微球材料与含有可溶性蛋白的上清液分离，移除上清液；向每份样品中加入20-200μL缓冲溶液，静置1分钟后移除上清液，清洗磁性微球表面，这一步骤的目的是除去附着在微球表面的可溶性蛋白，此清洗步骤可重复2-5次；

(4)对于已知感兴趣的蛋白，想要验证其是否为待检测药物的靶蛋白，可使用蛋白质免疫印迹技术，利用特异性抗体检测样品中的感兴趣蛋白的丰度；向每样品中加入1×蛋白上样缓冲液，95℃加热5分钟以将沉积在微球表面的蛋白洗脱下来，将样品上样至聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析，再于250mA下将蛋白转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭PVDF膜后加入一抗4℃孵育过夜(大于等于12小时)，TBST缓冲液洗膜3次后加入二抗室温孵育1小时，TBST缓冲液洗膜3次后进行鲁米诺反应曝光，在加药组和空白组样品之间，待验证的蛋白在连续2个及以上温度点有明显的强度差异(代表蛋白丰度差异)则认为是与药物有结合的靶蛋白；

(5)对于需要进行高通量定量蛋白质组学分析的样品，向经过步骤(3)清洗的样品中加入20-200μL含有10mM三(2-羧乙基)膦、40mM 2-氯乙酰胺的缓冲溶液，加热至95℃处理5分钟，将蛋白序列中的半胱氨酸进行烷基化处理；

(6)微球混悬液冷却至室温后，向每份样品中加入5μL含有1μg胰蛋白酶的缓冲溶液，使用涡旋振荡器将磁性材料充分混悬在溶液中，37℃孵育4-24小时；

(7)使用磁性分离手段，将磁性材料与含有酶解产物肽段的溶液分离，转移上清液至新的PCR管；

(8)对加药/空白样品进行定量蛋白质组学分析，包括但不限于二甲基标记、TMT标记、无标记定量，免疫印迹(western blotting)等。针对进行稳定同位素标记的样品，标记反应终止后将全部样品合并、使用C-18SPE柱除盐、冻干、直接进样质谱分析或保存在-20℃；针对无标记定量的样品，酶解反应结束后，每样品分别使用C-18SPE柱除盐、冻干、直接进样质谱分析后保存在-20℃(所获得的肽段样品经过除盐、冻干等蛋白质组学前处理步骤后，可以在-20度条件下保存1个月左右)；

(9)上述步骤获得的冻干肽段样品用0.1％甲酸复溶，进行RPLC-MS/MS分析。进样1μg肽段样品，有效梯度范围9％-45％乙腈，有效梯度时间30-70分钟。液相色谱预柱：75-300μm内径，2-5cm长度，填充1-5μm C-18填料；液相色谱分析柱：75-300μm内径，10-40cm长度，填充1-5μm C-18填料。质谱仪器类型：含有四级杆和静电场轨道阱的组合质谱。质谱采集模式：Full MS-ddMS.质谱采集参数，full MS resolution，30000-60000；AGC target，1e5-5e6；Max IT，10-200ms；ddMS质谱采集参数：resolution,15000-240000；AGC target,5e4-5e6；Max IT,20-100ms；loop count,1-40；isolation window,0.5-2.0m/z；NCE,23-35.

(10)对于二甲基标记定量样品和无标记定量样品：从UniProt网站下载的人源蛋白质组数据库作为背景蛋白质组数据库，使用MaxQuant软件进行搜库处理，获得的处理结果文件中ProteinGroup.txt文件导入Perseus软件进行t test分析，获得的分析结果中，同时符合-log p value>2和log2 fold change<-1两个条件的蛋白被认为是药物靶蛋白；对于TMT标记定量样品：从UniProt网站下载的人源蛋白质组数据库作为背景蛋白质组数据库，使用MaxQuant软件进行搜库处理，对获得的处理结果中ProteinGroup.txt文件中corrected reporter ion intensity进行归一化处理：以测量的所有温度中correctedreporter ion intensity的最大值作为100％，将其余每个温度下的corrected reporterion intensity做等比例处理。计算每个温度下的加药组/空白组样品的定量值之差，将所有温度的定量差值做求和处理，获得每个蛋白的热稳定性差值。在两次质谱重复/技术重复/生物学重复中，热稳定性差值都小于-0.75的蛋白被认为是药物靶蛋白。对于蛋白免疫印迹的样品：通过比对加药组/空白组的蛋白条带图像深浅，在连续2个以上温度点中两组间灰度值的比值大于2倍或小于0.5倍，可认为是有差异的潜在靶蛋白。

该方法建立在常规的热稳定性药物靶蛋白筛选方法之上，引入微球辅助蛋白沉淀这一策略，使得热沉淀蛋白样品更有利于后续的蛋白质组学分析，简化样品前处理过程，尽量避免样品损失，能够降低所需求的初始样品量，实现在次微克级别样品中进行药物靶蛋白筛选实验。

附图说明

图1为所述微球辅助的基于蛋白加热沉淀的药物靶蛋白筛选方法的工作流程图。

图2a为本发明方法数据处理思路示意图；图2b为实施例1中分别使用传统基于上清液的热蛋白质组分析方法、本发明方法、和基于沉淀的热蛋白质组分析三种方法，研究激酶抑制剂staurosporine的靶蛋白的结果，将两次质谱重复的热稳定性差值都小于-0.75的蛋白被认为是药物靶蛋白；使用传统基于上清液的热蛋白质组分析方法找到17个差异蛋白，其中仅有2个蛋白为蛋白激酶，9个蛋白是常见的污染蛋白；使用本发明方法成功找到40个差异蛋白，其中有32个蛋白为蛋白激酶，即找到已知staurosporine靶蛋白的特异性高达80％；使用基于沉淀的热蛋白质组分析方法，找到16个差异蛋白，其中9个为蛋白激酶。图2c比较了三种方法鉴定到的差异蛋白和已知staurosporine靶蛋白(蛋白激酶)的数目；图2d比较了三种方法鉴定到的差异蛋白和已知staurosporine靶蛋白(蛋白激酶)的重叠情况。

图3为实施例2中使用本发明方法研究四种小分子药物的靶蛋白的结果。四种小分子药物的已知靶蛋白都被鉴定到，靶蛋白的丰度在加药组中比在空白组中显著性降低，并且标注在图中。

图4为使用蛋白质免疫印迹技术，验证已有抗体的感兴趣蛋白DHFR是否为药物MTX的靶蛋白。在上清液中，DHFR蛋白于43℃开始在加药组与空白组之间产生丰度差异；在沉淀中，DHFR蛋白于所有温度点都在加药组与空白组之间有很强的丰度差异。

图5为所述微球辅助的基于蛋白加热沉淀的药物靶蛋白筛选方法的工作概念图。加药后，药物靶蛋白的结构性质变得更加稳定，当向样品施加高温时，与药物发生结合的靶蛋白比游离的靶蛋白更不容易沉淀到微球表面，通过高通量蛋白质组学方法检测这两者之间的蛋白丰度差异，可以快速、高通量、高灵敏度地鉴定药物靶蛋白。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1

(1)取K562细胞(人红白血病细胞系)约10⁷，向细胞样品中加入4℃预冷的1mL PBS溶液并均匀分散细胞，将混合样品投入液氮快速冷冻2分钟，再投入37℃水浴融化2分钟，使得样品刚好从冰水混合物转变为完全融化状态，冻融步骤重复3次，20000g高速离心20分钟，除去不溶解的细胞碎片，保留含有活性蛋白质的上清液；Bradford法测定蛋白质浓度，并用PBS溶液调节蛋白提取液浓度至1mg/mL；蛋白提取液1mL等分为500μL的两份后，分别加入5μL溶解有2mM蛋白激酶抑制剂Staurosporine的DMSO溶液或纯DMSO空白溶剂，重复混合后在25℃下孵育40分钟；

(2)将加药组和空白组溶液分别取出5份20μL溶液并转移至PCR管，向PCR管中分别加入40μg磁性微球材料(Sera-Mag，SpeedBead羧基修饰快速磁珠，直径1μm，GEhealthcare，货号：45152105050250)；对于5对加药组/空白组溶液(每对由一加药组和一空白组构成)，同时进行加热处理，分别加热至46、49、52、55、58℃(每对对应一个加热温度)；加热处理3分钟后，将成对样品转移至25℃环境冷却3分钟；

(3)使用磁力分离手段，将表面沉积有蛋白质沉淀的磁性微球材料与含有可溶性蛋白的上清液分离，使用移液枪吸出上清液并丢弃；向每份样品中加入20μL PBS溶液，静置1分钟后使用移液枪吸出上清液并丢弃，清洗磁性微球表面，除去附着在微球表面的可溶性蛋白，清洗步骤重复2次；

(4)向每份样品中加入20μL含有10mM三(2-羧乙基)膦、40mM2-氯乙酰胺的缓冲溶液，加热至95℃处理5分钟，将蛋白序列中的半胱氨酸进行烷基化处理；

(5)微球混悬液冷却至室温后，向每份样品中加入5μL含有1μg胰蛋白酶的缓冲溶液，使用涡旋振荡器将磁性材料充分混悬在溶液中，37℃孵育16小时；

(6)使用磁性分离手段，将磁性材料与含有酶解产物肽段的溶液分离，使用移液枪吸出上清液并转移至新的PCR管；

(7)对不同温度处理的5对加药组/空白组样品分别进行TMT标记反应，按照ThermoFisher TMT-10plex kit提供的说明书进行TMT标记，TMT1-5分别标记加药组46、49、52、55、58℃样品，TMT6-10分别标记空白组46、49、52、55、58℃样品，终止后将1-10号标记样品合并、使用C-18SPE柱除盐、冻干、高pH反向分级；

(8)高pH反向分级使用2.1×150mm安捷伦色谱柱，流动相A相为5mM乙酸铵(pH10.0)，B相为90％乙腈加5mM乙酸铵(pH 10.0)；TMT标记后合并的样品溶于30μLA相，进样28μL，流速1mL/min，使用的液相色谱梯度和时间如下：5％B at 5min,38％B at 30min,45％Bat45 min,90％B at 53min,90％B at 63min,2％B at 64min,2％B at 70min；从第5分钟开始，每隔一分钟接一个馏分，共接48个馏分；第1、17、33号馏分合并为一个样品，第2、18、34号馏分合并为一个样品，第3、19、35号馏分合并为一个样品……以此类推，每三个样品合并为一个样品，共得到16个样品，冻干后直接进样质谱分析或保存在-20℃；

(9)为了将本发明方法与传统方法进行比较，以相同量的起始蛋白提取液，使用传统的基于上清液的热蛋白质组分析方法和基于沉淀的热蛋白质组分析方法进行对照实验，具体方法简述为：从加药或空白溶剂孵育的蛋白提取液中分别取5份20μL溶液，对于5对加药组/空白组溶液(每对由一加药组和一空白组构成)，同时进行加热处理，分别加热至46、49、52、55、58℃(每对对应一个加热温度)；加热处理3分钟后，将成对样品转移至25℃环境冷却3分钟；25000g离心3分钟，使溶有可溶性蛋白的上清液与不溶于水的蛋白沉淀分离，上清液直接进行FASP酶解，沉淀用含有6M盐酸胍的50mM HEPES溶液溶解后再进行FASP酶解；这两种方法处理得到的样品同样经过TMT-10plex标记合并、高pH反向分级冻干后直接进样质谱分析或保存在-20℃，操作过程参考步骤(7)-(8)；

(10)上述步骤获得的冻干肽段样品用0.1％甲酸复溶，进行LC-MS/MS分析。进样1μg肽段样品，每样品进行2次质谱重复。液相色谱预柱：150μm内径，3cm长度，填充1.9μm C-18填料；液相色谱分析柱：150μm内径，20cm长度，填充1.9μm C-18填料。流动相A相：0.1％甲酸，流动相B相：80％乙腈加0.1％甲酸。液相色谱梯度范围和时间：12％B at 0min,38％Bat 38min,43.5％B at 50min,90％B at 44min,90％B at 50min,2％B at 50.5min,2％Bat 60min.质谱仪器类型：Q-Exactive HF微升液相串联质谱仪。质谱采集模式：Full MS-ddMS.质谱采集参数，full MS resolution，60000；AGC target，3e6；Max IT，120ms；ddMS质谱采集参数：resolution,15000；AGC target,5e4；Max IT,32ms；loop count,20；isolation window,1.6m/z；NCE,27；

(11)对于TMT标记定量样品：从UniProt网站下载的人源蛋白质组数据库作为背景蛋白质组数据库，使用MaxQuant软件进行搜库处理。如图2a，对获得的处理结果中ProteinGroup.txt文件中corrected reporter ion intensity进行归一化处理：5个温度中的最大定量值作为100％，将其余每个温度下定量值按搜库软件给出的原始定量值的比例进行归一化。计算归一化之后每个温度下的加药组/空白组样品的定量值之差，将所有温度的定量差值做求和处理，获得每个蛋白的热稳定性差值，两次质谱重复的热稳定性差值都小于-0.75的蛋白被认为是药物靶蛋白。如图2b所示，通过传统的基于上清液的热蛋白质组分析方法，共找到17个差异蛋白，其中仅有2个是蛋白激酶，药物靶蛋白的阳性鉴定率较低(11.8％)；通过基于沉淀的热蛋白质组分析方法，找到16个差异蛋白，其中9个是蛋白激酶(特异性56.25％)；在相同蛋白起始量条件下(20μg)，通过本发明方法，找到了40个潜在的蛋白激酶抑制剂staurosporine的靶蛋白，其中有32个为蛋白激酶(被人类蛋白激酶数据库KinHub注释)，蛋白激酶鉴定特异性为80％；图2c中，比较了传统热蛋白质组分析方法和本发明方法鉴定到的差异蛋白和蛋白激酶数目；图2d中，比较了传统热蛋白质组分析方法和本发明方法鉴定到的差异蛋白和蛋白激酶的重叠情况。

实施例2

(1)取Hela细胞(人***细胞)约10⁷，向细胞样品中加入4℃预冷的1mLPBS溶液并均匀分散细胞，将混合样品投入液氮快速冷冻2分钟，再投入37℃水浴融化2分钟，使得样品刚好从冰水混合物转变为完全融化状态，冻融步骤重复3次，20000g高速离心20分钟，除去不溶解的细胞碎片，保留含有活性蛋白质的上清液；Bradford法测定蛋白质浓度，并用PBS溶液调节蛋白提取液浓度至1mg/mL；取蛋白提取液2mL等分为500μL的4份后，分别加入5μL溶解有10mM Methotrexate(MTX)/Raltitrexed/Cyclosporin A(CsA)/SHP099药物小分子的DMSO溶液，取2mL蛋白提取液加入20μL纯DMSO空白溶剂，重复混合后在25℃下孵育40分钟；

(2)将上述4种加药孵育溶液分别分为5份20μL溶液并转移至96孔PCR板，将加DMSO孵育溶液分为20份20μL溶液并转移至96孔PCR板。向PCR板每孔中分别加入40μg磁性微球材料(Sera-Mag，SpeedBead羧基修饰快速磁珠，直径1μm，GE healthcare，货号：45152105050250)。对于四种待测试药物，每种药有5对加药组/空白组溶液，共20对(每对由一加药组和一空白组构成)。将4种药的加药组/空白组样品对同时进行加热至43、46、49、52、55℃(每对对应一个加热温度)处理3分钟后，将成对样品转移至25℃环境冷却3分钟；

(3)使用磁力分离手段，将上述表面沉积有蛋白质沉淀的磁性微球材料与含有可溶性蛋白的上清液分离，使用多通道移液枪吸出每孔上清液并丢弃；向每孔中加入20μLPBS溶液，静置1分钟后使用多通道移液枪吸出上清液并丢弃，清洗磁性微球表面，除去附着在微球表面的可溶性蛋白，清洗步骤重复3次；

(4)向每孔中加入20μL含有10mM三(2-羧乙基)膦、40mM 2-氯乙酰胺的HEPES溶液，加热至95℃处理5分钟，将蛋白序列中的半胱氨酸进行烷基化处理；

(5)微球混悬液冷却至室温后，向每孔中加入5μL含有1μg胰蛋白酶的缓冲溶液，使用涡旋振荡器将磁性材料充分混悬在溶液中，在37℃孵箱孵育16小时；

(6)使用磁性分离手段，将磁性材料与含有酶解产物肽段的溶液分离，使用多通道移液枪移除每孔上清液；

(7)对加药组/空白组样品分别进行二甲基标记反应，空白组每样品加入4μL 4％CH₂O溶液(v/v)、4μL 0.6M NaBH₃CN溶液进行二甲基轻标标记，加药组组样品加入4μL 4％CD₂O溶液(v/v)、4μL 0.6M NaBH₃CN溶液进行二甲基重标标记，标记反应在37℃进行50分钟，标记反应用3.2μL 10％氨水(v/v)终止，每样品加入8μL三氟乙酸放气2小时，终止后将轻重标样品合并、使用C-18SPE柱除盐、冻干、直接进样质谱分析或保存在-20℃；

(8)上述步骤获得的冻干肽段样品用体积浓度0.1％甲酸复溶，进行LC-MS/MS分析。进样1μg肽段样品，每样品进行2次质谱重复。液相色谱预柱：150μm内径，3cm长度，填充1.9μm C-18填料；液相色谱分析柱：150μm内径，20cm长度，填充1.9μm C-18填料。流动相A相：0.1％甲酸，流动相B相：80％乙腈加0.1％甲酸。液相色谱梯度范围和时间：9％B at0min,30％B at 58min,45％B at 70min,90％B at 73min,90％B at 81.5min,2％B at82min,2％B at 90min.质谱仪器类型：Q-Exactive HF微升液相串联质谱仪。质谱采集模式：Full MS-ddMS.质谱采集参数，full MSresolution，60000；AGC target，3e6；Max IT，120ms；ddMS质谱采集参数：resolution,15000；AGC target,5e4；Max IT,32ms；loopcount,20；isolation window,1.6m/z；NCE,27；+

(9)采集到的raw数据通过MaxQuant软件进行搜库处理，使用UniProt网站下载的人源蛋白质组数据库作为背景蛋白质组数据库，酶切方式设置为：trypsin，定量方式：2plex(Lys0，Nterm0，Lys4，Nterm4)，其余参数使用默认设置；搜库得到的ProteinGroup.txt文件中，Normalized ratio则是加药组(重标)/空白组(轻标)之间的定量比值，即加药组/空白组之间的定量倍数差异；

(10)Methotrexate(MTX)实验中，DHFR蛋白于43-55℃各个温度点下，在加药组/空白组之间的定量倍数差异都>2倍；Raltitrexed实验中，于49℃处理下，TYMS蛋白在加药组/空白组之间的定量倍数差异>2倍，在其余温度点的定量倍数差异在1-1.2之间；Cyclosporin A(CsA)实验中，于52、55℃处理下，PPIA蛋白、PPIB蛋白都在加药组/空白组之间的定量倍数差异>2倍，其余温度点下定量倍数差异在1-1.5之间；SHP099实验中，于52、55℃处理下，PTPN11蛋白在加药组/空白组之间的定量倍数差异>2倍，其余温度点下定量倍数差异在1-1.5之间；由此，确定了每个药物的潜在靶蛋白和每个靶蛋白对应的具有较大热稳定性差异(加药/空白组之间蛋白定量值的倍数差异>2)的特征温度点，对于有多个特征温度点的药物实验，选择温度最大的那个点，因其沉淀程度更高，更有利于后续的蛋白质组学分析。对于四个药物最终选择研究的最适温度点总结如下：MTX(49℃)，Raltitrexed(49℃)，CsA(55℃)，SHP099(55℃)；

(11)进行技术重复，验证发现的靶蛋白的可靠性：Methotrexate(MTX)/Raltitrexed及其空白对照组加热至49℃，Cyclosporin A(CsA)/SHP099及其空白对照组加热至55℃；加热处理3分钟后，将成对样品转移至25℃环境冷却3分钟；对于每种药物的分析，进行3次技术重复，即使用相同来源的蛋白提取物，将实验重复操作3次，操作流程同(2)～(9)；经过MAXQUANT搜库，将获得的处理结果文件中ProteinGroup.txt文件导入Perseus软件进行one-sample t test分析(n＝3)，获得的分析结果中，符合-logp value>2和log2fold change<-1的蛋白被认为是高可信的药物靶蛋白(显著性p<0.01,可信度高达99％)。如图3所示，Methotrexate(MTX)/Raltitrexed/Cyclosporin A(CsA)/SHP099的靶蛋白DHFR/TYMS/PPIA/PTPN11被标注在图中，这些蛋白都通过了统计学检验，是高可信的药物靶蛋白。

实施例3

(1)取Hela细胞约10⁷，向细胞样品中加入4℃预冷的1mL PBS溶液并均匀分散细胞，将混合样品投入液氮快速冷冻2分钟，再投入37℃水浴融化2分钟，使得样品刚好从冰水混合物转变为完全融化状态，冻融步骤重复3次，20000g高速离心20分钟，除去不溶解的细胞碎片，保留含有活性蛋白质的上清液；Bradford法测定蛋白质浓度，并用PBS溶液调节蛋白提取液浓度至1mg/mL；取蛋白提取液1mL等分为500μL的2份后，分别加入5μL溶解有10mMMethotrexate(MTX)药物小分子的DMSO溶液或纯DMSO空白溶剂，重复混合后在25℃下孵育40分钟；

(2)将上述两种溶液分别分为5份20μL溶液并转移至20μL PCR管，向PCR管中加入40μg磁性微球材料(Sera-Mag，SpeedBead羧基修饰快速磁珠，直径1μm，GE healthcare，货号：45152105050250)。使用PCR扩增仪，将加药组/空白组样品对(每对由一加药组和一空白组构成)同时进行加热至37、40、43、46、49℃(每对对应一个加热温度)处理3分钟后，将全部10个样品转移至25℃环境冷却3分钟；

(3)使用磁力分离手段，将表面沉积有蛋白质沉淀的磁性微球材料与含有可溶性蛋白的上清液分离，使用多通道移液枪吸出每孔上清液约20μL转移至新的PCR管，加入5μL5×蛋白上样缓冲液(Thermo Fisher Scientific，货号26616)，制备成体积约25μL的上清电泳样品；

(4)向每孔中加入20μL PBS溶液，静置1分钟后使用多通道移液枪吸出上清液并丢弃，清洗磁性微球表面，除去附着在微球表面的可溶性蛋白，清洗步骤重复3次；

(5)向每孔中加入20μL 1×蛋白上样缓冲液，均匀分散微球，使用PCR扩增仪加热至95℃处理5分钟，沉积在微球表面的蛋白会溶解在含有大量增溶剂的蛋白上样缓冲液。使用磁力分离手段，将上清液与磁性微球分离，吸取溶解有蛋白的上清液转移至新的PCR管，制备成体积约20μL的沉淀电泳样品；

(6)将上述准备的10个上清电泳样品与10个沉淀电泳样品分别上样15孔10％聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，除此之外，每块胶上样7.5μL预染蛋白marker至泳道作为分子量标尺；60V电泳跑20分钟后，再在120V下跑1小时；

(7)按照marker切取15-55kDa的凝胶区域，使用0.22μm PVDF膜进行WesternBlotting转膜，250mA下进行40分钟；使用含有5％脱脂奶粉的TBST buffer封闭PVDF膜；将PVDF膜按marker剪开分为15-35kDa、35-55kDa两部分，分别孵育一抗：含0.1％DHFR抗体的5％脱脂奶粉溶液用于孵育15-35kDa膜，含0.1％GAPDH(内参蛋白)抗体的5％脱脂奶粉溶液用于孵育35-55kDa膜，4℃摇床孵育过夜；

(8)移除一抗后，使用TBST buffer将PVDF膜清洗3次后，加入含0.01％二抗的5％脱脂奶粉溶液用于孵育两个膜片，室温1小时；使用TBST buffer将PVDF膜清洗3次后，像膜片上滴加化学发光物鲁米诺(Lumino)溶液，并使用成像***进行化学发光成像；在各个温度下，比较MTX的已知靶蛋白DHFR在加药组/空白组之间的化学发光强度，即代表了样品中对应蛋白的丰度。如图4可知，在微球沉淀样品中，5个温度点下加药组中DHFR都非常微弱(浅灰色条带)，而空白组中DHFR的丰度很高(黑色条带)，说明DHFR在加药组中比空白组更抵抗热沉淀，即证明本发明方法能够成功地揭示DHFR是MTX的靶蛋白。而在上清液样品中，两组间的DHFR从43℃开始逐渐表现出丰度差异，说明传统的基于上清液的热蛋白质组分析方法在药物靶蛋白解析的灵敏度方面，不及本方法所发展的微球辅助沉淀法。

Claims

1.一种微球辅助的基于蛋白加热沉淀的药物靶蛋白筛选方法，其特征在于：

1)对蛋白提取物样品分别进行加药处理(加入待筛选靶蛋白的、待研究药物)和空白处理(不加药的处理)，于两种处理的样品组中分别加入微球材料，再对两种处理的样品分别都进行加热处理，使样品中蛋白因加热变性而沉淀；

2)将样品中的微球材料取出，对加药组和空白组中的蛋白丰度进行定量分析；

通过加药组与空白组之间的蛋白定量差异可以筛选出小分子药物的靶蛋白；靶蛋白为空白组微球材料上的沉淀中丰度(沉淀量)大于加药组沉淀中丰度的蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

1)生物样本在保持蛋白活性结构的条件下进行蛋白提取，测定提取液中的蛋白浓度，并调节蛋白浓度至0.5-2mg/mL；

2)使用分散溶剂溶解待研究的小分子药物，小分子药物终浓度1-10mM；将待分析的蛋白提取液等分为两份，一份加入待研究的药物(溶于分散溶剂的药物)、另一份加入与加入药物等体积的空白分散溶剂，然后孵育10～60分钟；加入的药物溶液或空白溶剂的体积比不超过蛋白提取液的10％，优选0.5-2％；

3)于分别为20μL溶液的孵育完成的加药和空白组蛋白溶液中分别加入等量的微球材料，投料量10-100μg将样品进行加热处理，温度区间在30～80摄氏度之间，在加热处理下，蛋白从可溶状态转变为不可溶沉淀并且沉积到微球表面；此时，空白组微球材料上的药物靶蛋白沉淀量大于加药组；

4)分别将加药组和空白组中表面有蛋白沉积的微球与含有未变性的可溶性蛋白的溶液分离，直接在微球表面上对通过微球辅助捕捉到蛋白沉淀进行烷基化、酶解等蛋白质组样品前处理，通过基于质谱的高通量定量蛋白质组学技术，对加药组和空白组中的蛋白丰度进行定量分析；

通过比较沉淀样品中，加药组与空白组之间的蛋白质丰度差异，能够从广泛的背景蛋白中鉴定到待研究药物的靶蛋白；

或者，对于已知的需要验证的蛋白可以使用蛋白质免疫印迹方法(WesternBlotting)，利用感兴趣蛋白的抗体进行蛋白质定量，通过比较加药组与空白组之间的蛋白质丰度差异，从而得知此蛋白是否为待研究药物的靶点。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

在保持蛋白活性结构的条件下进行蛋白提取的方法为液氮研磨组织、冻融破碎细胞等中的一种或二种以上；

所述的“保持蛋白活性结构的条件”，对于组织样品，可以采取液氮研磨的方式进行蛋白提取，将组织在0-4℃条件下剪碎后加入液氮进行研磨；对于细胞样品，可以采用快速冻融法破碎细胞提取蛋白，向10⁴-10⁷细胞样品中加入0-4℃预冷的0.2-1mL缓冲溶液并均匀分散细胞，将混合样品投入液氮快速冷冻1-5分钟，再投入25-37℃水浴融化1-5分钟，使得样品刚好从冰水混合物转变为完全融化状态，注意不要过度加热样品；

无论经过何种蛋白提取方式，蛋白提取液需通过10000-25000g高速离心，除去不溶解的组织、细胞碎片，保留含有活性蛋白质的上清液。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：

所述的“测定提取液中蛋白浓度”，可使用Bradford法或其他蛋白浓度测定方法；

缓冲盐溶液为PBS、HEPES等不含有伯胺基团的缓冲盐溶液中的一种或二种以上

蛋白质水解酶包括但不局限于胰蛋白酶、胃蛋白酶等中的一种或二种以上；

所述的“孵育完成的蛋白溶液(加药或空白)”，指的是加入小分子药物溶液或空白溶剂后孵育一段时间的蛋白溶液，其所孵育时间取决于小分子药物与靶蛋白的亲和力，为了加速二者结合，孵育过程通常在20-25℃条件下进行，因此孵育时间通常不超过60分钟(优选30分钟)以防止溶液中蛋白质的结构和活性改变；

所述的“微球材料”，指的是微米尺寸的球状材料(直径1-5μm)，多种表面性质不同的微球材料都可以被应用到本方法中，包括但不局限于C-18微球、光滑的铁球、表面键合羧基的磁性微球等材料中的一种或二种以上；

分散溶剂为水、二甲基亚砜、缓冲盐溶液、乙腈等剂中的一种或二种以上；

微球与溶液分离的分离手段包括但不局限于离心、磁力分离等中的一种或二种以上。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤3)将孵育完成的蛋白溶液(加药或空白)分别分为2份以上(优选5～10份)20μL溶液(每份对应蛋白质量10～40μg)，分别加入等量的微球材料(投料量10-100μg)；

对于一个加热处理温度点的一对样品(加药和空白组各一个)分别使用PCR仪加热至同一温度，过程1～10分钟，加热温度区间在30～80摄氏度之间；再分别将加药和空白组的样品放置室温(优选25℃)冷却1～10分钟；

或，将2对以上的样品(每一对为加药和空白组各一个)分别在2个以上不同温度下进行加热处理(温度点≥2个，一般5～10个)，每一对样品对应一个温度点，温度区间在30～80摄氏度之间，相邻温度点间隔在1～10摄氏度之间，每个样品使用PCR仪进行热处理过程1～10分钟；再分别将每个样品放置室温(优选25℃)冷却1～10分钟。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤4)的具体过程为：

A、通过磁性分离、过滤、或离心等分离手段，将表面有蛋白沉积的微球与含有未变性的可溶性蛋白的溶液分离，将上清液移除后，向上述含有10-100μg微球材料的样品中加入缓冲溶液20-200μL，清洗微球表面、除去附着在微球材料上的的可溶性蛋白后，弃去上清液；此清洗过程不重复或可重复1-5次；

B、向清洗后的微球材料中加入含有10-100mM三(2-羧乙基)膦、40-100mM2-氯乙酰胺的缓冲盐溶液20-200μL，混悬微球后加热至95-100℃进行烷基化反应；微球混悬液冷却至室温后，加入含有蛋白质水解酶的缓冲盐溶液，在微球材料表面进行蛋白质的原位水解，酶解反应时间4-24小时(优选16-24小时)，反应结束后使用将微球材料和含有酶解产物肽段的溶液分离，所获得的肽段样品经过除盐、冻干；获得的成对的加药/空白样品，可通过定量蛋白质组学方法，对样品中全部蛋白进行定量测定。

7.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于：

所述的“定量蛋白质组学方法”，对于仅进行一个加热处理温度点的实验，即仅需一对加药/空白样品的实验，可以通过二甲基标记方法(稳定同位素标记方法)对两个样品间的蛋白质组进行定量分析或无标记定量技术进行定量分析；

或者，对于需要2个以上加热处理温度点的实验，即需要2对以上加药/空白样品的实验，可以通过TMT多通道标记方法(稳定同位素标记方法)或无标记定量技术对多个样品间的蛋白质组进行定量分析；

或者，对于上述的一个加热处理温度点的实验或2个以上加热处理温度点的实验，在实际操作中，如果已有先验性知识帮助确定感兴趣的待研究蛋白，亦可使用靶向性的方法验证此感兴趣蛋白是否为待分析药物靶蛋白，例如使用基于抗体的蛋白免疫印迹技术(Western Blotting)进行蛋白定量，基于靶向质谱技术的平行反应检测技术(PRM)、多重反应监测技术(MRM)、选择反应监测技术(SRM)及其他基于质谱的靶向蛋白质定量技术亦可应用于本方法。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

本方法可使用基于质谱的高通量定量蛋白质组学技术，检测加药组、空白组之间的蛋白丰度差异；从质谱采集获得的原始文件可使用定量蛋白质组学软件进行搜库(例如MAXQUANT，Proteome Discoverer，Spectronaut，或Comet等等中的一种二种以上)，获得每个样品中全蛋白质组的定量值。

9.根据权利要求2或7所述的方法，其特征在于：

对于一个温度点的样品，可通过统计学检验的方式(例如t检验，ANOVA等统计学检验方法)，判断某个蛋白是否在加药/空白样品之间有显著定量差异(一般控制假阳性率p<0.05)，如果某个蛋白在加药/空白样品之间有能通过统计学检验的显著定量差异(例如t检验，ANOVA等统计学检验方法)，则认为这个蛋白是高可信的药物靶蛋白；

或者，对于2个以上温度点，计算过程：将搜库结果中的蛋白定量值进行归一化处理，以加药组和空白组样品在所有温度中的最大蛋白定量值作为100％，将其余样品在每个温度下的蛋白定量值按比例进行归一化。计算归一化之后每个温度下的加药组/空白组样品的定量值之差，将所有温度的定量差值做求和处理，获得每个蛋白的热稳定性差值，热稳定性差值小于-0.75的蛋白被认为是药物靶蛋白。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤3)：加药组中的药物靶蛋白由于结合了药物分子，其热稳定性增强，发生热致沉淀的程度较低；而空白组的药物靶蛋白因为处于游离状态，其热致沉淀的程度通常高达加药组的数倍(在基于质谱的定量蛋白质组学测定中通常表现为2-10倍)；

蛋白提取物为生物样品中的蛋白提取物，生物样品为细胞、组织等生物学采集样本中的一种或二种以上。