JP7144050B2 - 5’-ホスホロチオラート mRNA 5’-末端(キャップ)類似体、それを含むmRNA、それらを得る方法およびそれらの使用方法 - Google Patents
5’-ホスホロチオラート mRNA 5’-末端(キャップ)類似体、それを含むmRNA、それらを得る方法およびそれらの使用方法 Download PDFInfo
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Description
L1とL2は、OとSを含む基から独立して選択され、L1とL2の少なくとも1つはOではなく;
n=0,1,または2であり;
X1、X2、X3は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、CH2N3、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され;
R4とR5は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、CH2N3、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され;
Y1とY2は、CH2、CHCl、CCl2、CF2、CHF、NH、Oを含む基から独立して選択され;
およびBは、以下の式3、4、5、6、または7に係る基である。
m=0,1であり;
n=0,1,または2であり;
L1はSであり、
X1、X2、X3は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、N3、アルキル、または置換アルキニルを含む基から独立して選択され;
Y1とY2は、CH2、CHCl、CCl2、CHF、CF2、NHおよびOを含む基から独立して選択され;
好ましい5’-干すほろちおらーと類似体は、以下の式13に係る7’-メチルグアノシン 5’-デオキシ-5’-チオグアノシン 5’-ジホスホロチオラートである。
およびBは、以下の式3、4、5、6、または7に係る基である5’-ヨードヌクレオシドは、
m=0,1であり;
n=0,1,または2であり;
L1はOまたはSであり、
X1、X2、X3は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され、
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、N3、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され;
Y1とY2は、CH2、CHCl、CCl2、CHF、CF2、NHおよびOを含む基から独立して選択され;
ここで、n=0およびm=1ならば、X3はSであり、およびX1はOであり;
n=1およびm=0ならば、X2はSである;およびX1はOであり;
n=1およびm=1ならば、X3はSである;およびX1、X2はOであり;
式1に示されるホスホロチオラートキャップ類似体を形成する工程であって、
L1とL2は、OとSを含む群から独立して選択され、L1とL2の少なくとも1つはOではなく;
n=0,1,または2であり;
X1、X2、X3は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、CH2N3、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され;
R4とR5は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、CH2N3、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され;
Y1とY2は、CH2、CHCl、CCl2、CF2、CHF、NH、Oを含む基から独立して選択され;
およびBは、以下の式3、4、5、6、または7に示される基である;工程を含む。
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され;
式2aに示される5’-ホスホロチオラート類似体を形成するために、リン酸トリエチルアンモニウムまたはチオリン酸ナトリウムと反応し、
n=0,1,または2であり;
L1はOまたはSであり、
X1とX2は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、N3、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され;
Y1は、CH2、CHCl、CCl2、CHF、CF2、NHおよびOを含む基から選択される;工程を含む
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、N3、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択される;
イミダゾリド誘導体が、末端チオリン酸部分を含む、式2aに示される5’-ホスホロチオラート類似体に反応し、
N=1であり、
L1はOまたはSであり;
X1とX2は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、N3、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され;
Y1は、CH2、CHCl、CCl2、CHF、CF2、NHおよびOを含む基から独立して選択され、
式1に示される5’-ホスホロチオラートキャップ類似体を形成し;
L1とL2は、OとSを含む群から独立して選択され、L1とL2の少なくとも1つはOではなく;
n=0,1,または2であり;
X1、X2、X3は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、CH2N3、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され;
R4とR5は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、CH2N3、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され;
Y1とY2は、CH2、CHCl、CCl2、CF2、CHF、NH、Oを含む基から独立して選択され;
およびBは、以下の式3、4、5、6、または7に示される基である;工程を含む。
1)イミダゾリドヌクレオチド誘導体((Abrams and Schiff 1973);(Barnes,Waldrop et al.1983);(Kalek,Jemielity et al.2006)および(Kalek,Jemielity et al.2005)を参照)
2)ヌクレオシド誘導体を含むハロゲンによるS-アルキル化((Arakawa,Shiokawa et al.2003)を参照)
3)末端ヌクレオシドβ-チオ-ジおよびγ-チオ-三リン酸塩の合成((Zuberek,Jemielity et al.2003)を参照)
中間物であるヌクレオチドは、脱イオン水中で重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)の直線勾配を使用し、DEAE Sephadex A-25(HCO3-form)におけるイオン交換クロマトグラフィーによって精製された。減圧下での蒸発の間にTEAB緩衝液を分解するために96%のエタノールを数回添加し、その後に中間物はトリエチルアンモニウムの塩として単離された。最終的な生成物(キャップ類似体)は同じ方法で精製され、次にセミ分取HPLCによって精製され、および凍結乾燥を数回受け、アンモニウム塩として単離された。分析逆相HPLC(RP HPLC)はAgilent Technologies Series 1200の装置で、0.05Mの酢酸アンモニウム(pH5.9)中の0%-25%のメタノール(プログラムA)または0.05Mの酢酸アンモニウム(pH5.9)中の0%-50%のメタノール(プログラムB)の直線勾配を備える、Supelcosil LC-18 RPTカラム(4.6ラ250mm、フロー1.3ml/分)を用いて行われた。溶出された化合物は、UV-VIS検出器(260nmで)および蛍光検出器(励起260nm、放射370nm)を使用して検知された。分取RP HPLCは、移動相として0.05Mの酢酸アンモニウム(pH5.9)中のアセトニトリルの直線勾配を使用し、Discovery RP Amide C16カラム(21.2mm×250mm、フロー5.0ml/分)を使用して、同じ装置で行われた。1H NMRおよび31P NMRスペクトルはそれぞれ、399.94MHzおよび161.90MHzの周波数で、Varian UNITY-plusにおいて25℃で記録された。1H NMR化学シフトは、D2O(内部標準)のTSP(3-トリメチルシリル[2,2,3,3-D4]プロピオン酸ナトリウム)に伝えられた。31P NMR化学シフトは、D2O(外部標準)の20%のリン酸塩に伝えられた。陰イオンモード[MS ESI(-)]または陽イオンモード[MS ESI (+)]における高解像度質量スペクトルを、Micromass QToF 1 MSに記録した。蛍光プレート読取り機の読取りを、480nmの励起および535nmの放射で、Tecan Infinit 200(登録商標)PROで行なった。サンプルは黒色96ウェルプレート(Greiner)に置かれた。結晶は、分注ロボットMosquito Crystal(TTp Labtech)を利用して、3つのレンズウェル(Swissci)を備えた96ウェルプレート上で行なわれた。溶媒および他の試薬はシグマ・オールドリッチから購入し、以下で指示されない限り、さらなる精製を行うことなく使用した。GMPとGDPの市販されているナトリウム塩は、Dowex 50 WX8で、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、トリエチルアンモニウム塩に変えられた。トリエチルアンモニウム塩、およびm7GMPとm7GDPのナトリウム塩、m7GMP-Imとm7GDP-Imを、文献に記載のようにして得た(Kalek,Jemielity et al.2005),(Jemielity,Fowler et al.2003)。5’-デオキシ-5’-ヨード-グアノシン、5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-5’-モノチオホスファート、およびトリエチルアミンホスホロチオエートを、文献に記載のようにして得た((Arakawa,Shiokawa et al.2003),(Zuberek,Jemielity et al.2003))。m7GpCH2p トリエチルアンモニウム塩を、文献に記載のように調製した(Kalek,Jemielity et al.2006)。GpCH2ppSを、記載されているように調製した(Kowalska,Ziemniak et al.2008)。
新しいキャップ類似体の合成および単離
5’-ヨードヌクレオシド誘導体(図1、3番、4番)の合成の一般的な方法
ヨウ素(3mmol、M=253.81g/mol)を、室温で、N-メチル-2-ピロリジノン(ヌクレオシド0.25mol/l濃度まで)中の、対応するヌクレオシド(1mmol)、トリフェニルホスフィン(3mmol、M=262.29g/mol)およびイミダゾール(6mmol、M=68.08g/mol)の磁気的に撹拌された懸濁液に、5分以上加えた。その反応は3時間以上行なわれ、反応の進行はRP HPLCを使用してモニタリングされた。次いで、反応混合物をCH2Cl2:H2O(3:1、v/v)の溶液に注ぎ、反応混合物を12回希釈した。白色の結晶性の沈殿物が、2つの層の界面で4℃で24時間のあいだに形成された。沈殿物を減圧下で濾過し、塩化メチレンで洗浄し、P2O5上で真空中で乾燥した。
グアノシン(図1、1番)(10g、35.3mmol)から出発して、一般的な手順に従い、5’-デオキシ-5’-ヨード-グアノシン(図1、3番)、(10.4g、26.5mmol、75%)を得た。tR(B)=12.36分;
1H NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm 10.65(s、1H、H-1)、7.89(s、1H、H-8)、6.47(bs、2H、NH2)、5.68(d、1H、J=6.26、Hz、H-1’)、5.51(d、1H、J=6.26 Hz、2’-OH)、5.35(d、1H、J=4.70Hz、3’-OH)、4.59(q、1H、J=5.48 Hz、H-2’)、4.03(q、1H、J=5.09、3.13 Hz、H-3’)、3.90(dt、1H、J=6.26、3.13 Hz、H-4’)、3.53(dd、1H、J=6.26、5.87 Hz、H-5’)、3.39(dd、1H、J=10.17、6.65 Hz、H-5’);HRMS ESI(-)calcd.m/z for C10H11IN5O4 -、(M-H)-;391.9861、found 391.98610
2’-O-メチルグアノシン(図1、2番)(300mg、1.0mmol)から出発して、一般的な手順に従い、2’-O-メチル-5’-デオキシ-5’-ヨード-グアノシン(図1、4番)、(328.8mg、0.81mmol、80%)を得た。tR(B)=14.44分;
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δppm 7.95(s、1H、H-8)、6.50(bs、2H、NH2)、5.81(d、1H、J=6.41 Hz、H-1’)、5.50(d、1H、J=5.34 Hz、3’-OH)、4.41、4.40(2d、1H、J=6.26、6.41 Hz、H-2’)、4.28-4.25(m、1H、H-3’)、3.97、3.96(2t、1H、J=6.56、3.05 Hz、H-4’)、3.56(dd、1H、J=6.41、10.38 Hz、H-5’)、3.43(dd、1H、J=10.53、6.87、6.71 Hz、H-5’)、3.30(s、3H、CH3);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C11H13IN5O4 - [M-H]-: 406.0090、found 406.0021.
5’-デオキシ-5’-ヨード-グアノシン(図1、3番)(2g、5.09mmol)を無水DMF(20mL)に溶解し、Mel(2.5mL、40.7mmol)を加えた。反応混合物を室温でマグネチックスターラーにて撹拌した。反応の進行をRP HPLCによってモニタリングした。出発物質が観察されなかった場合、水(10mL)を加えることにより反応を停止させ、過剰なヨウ化メチルを真空下で蒸発させ、反応混合物を減圧下で濃縮した。その後、残る粗生成物に、CH2Cl2(100mL)を加え、黄色の沈殿物を形成した。沈殿物を減圧下で濾過し、CH2Cl2(3×20mL)で洗浄し、P4O10上で真空中で24時間乾燥した。収量1.6g(77.0%)。tR(B)=11.94分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 5.98(d、1H、J=3.91 Hz、H-1’)、4.81(dd、1H、J=4.70 Hz、H-2’)、4.31(t、1H、J=5.09、H-3’)、4.15(q、1H、J=5.48、H-4’)、4.07(s、3H、CH3)、3.50-3.62(m、2H、J=4.70、5.87 Hz、H-5’);
HRMS ESI(+) calcd. m/z C11H15IN5O4+ [M+H]+:408.01687、found 408.01163.
5’-デオキシ-5’-ヨード-2’-O-メチルグアノシン(図1、4番)(200.8mg、0.49mmol)を無水DMSO(3.3mL)に溶解し、Mel(0.25mL、3.9mmol)を加えた。反応混合物を室温でマグネチックスターラーにて撹拌した。反応の進行をRP HPLCによってモニタリングした。出発物質が観察されなかった時、水(10mL)を加えることにより反応をクエンチさせ、pHをNaHCO3を用いて中性に調整し、過剰なヨウ化メチルをジエチルエーテルで抽出し、水相をプールし(polled)、続いて混合物を濃縮し、分取HPLCで精製して、45.8mgの化合物(77%)を得た。tR(B)=11.94分;
1H NMR(400 MHz、DMSO-d6)δppm 9.03(s、1H、H-8)、6.39(bs、2H、NH2)、5.95(d、1H、J=4.27 Hz、H-1’)、4.40(t、1H、J=4.58 Hz、H-2’)、4.24(t、1H、J=4.88 Hz、H-3’)、4.08-4.06(m、1H、H-4’)、4.02(s、3H、CH3)、3.59(dd、1H、J=5.19、4.88、10.68 Hz、H-5’)、3.50(dd、1H、J=7.93、7.63、10.68 Hz、H-5’)、3.41(s、3H、CH3);
HRMS ESI(-) calcd. m/z C12H15IN5O4 - [M-H]-: 420.01741、found:420.01758.
100mLのDMF:H2O混合物(1:1、v/v)中の5’-デオキシ-5’-ヨードグアノシン(図2、3番)(2.0g、5.1mmol)の懸濁液に、チオリン酸三ナトリウム(4.6g、25.5mmol)を加えた。反応混合物を室温で24時間撹拌した。沈殿物を濾過によって除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。残留物を50mLの水に溶解し、過剰なチオリン酸三ナトリウムを100mLのメタノールを追加することにより沈殿させた。分離後、粗生成物をSephadexのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。生成物を凍結乾燥した。収量1.9g(64%)。tR(B)=4.24分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.05(s、1H、H-8)、5.89(d、1H、J=5.73 Hz、H-1’)、4.85(dd、1H、J=5.48 Hz、H-2’)、4.51(2d、1H、J=4.98、4.23 Hz、H-3’)、4.33-4.39(m、1H、H-4’)、3.16-3.08(m、2H、Hz、H-5’);
31P NMR(162MHz、D2O)δppm 15.42(s、1P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z C10H13N5O7PS- [M-H]-: 378.02788、found: 378.02828.
100mLのDMF中の5’-デオキシ-5’-ヨード-7-メチルグアノシン(図2、6番)(2.0g、4.92mmol)の懸濁液に、チオリン酸三ナトリウム(4.43g、24.6mmol)を加えた。反応混合物を室温で48時間撹拌した。沈殿物を除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。残留物を50mLの水に溶解し、過剰なチオリン酸三ナトリウムをメタノール(100mL)を追加することにより沈殿させた。分離後、粗生成物をSephadexのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。生成物を凍結乾燥した。収量1.55g(53%)。tR(B)=4.64分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 7.85(s、1H、H-8)、5.89(d、1H、J=3.74 Hz、H-1’)、4.78-4.75(m、1H、H-2’)、4.43-4.39(m、2H、H-3’、H-4’)、4.09(s、3H、CH3)、3.08-2.94(m、2H、Hz、H-5’);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 14.45(s、1P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z C11H15N5O7PS- [M-H]-:392.04353、found: 392.04378.
適切な出発化合物(ヌクレオチドTEA塩)(1mmol)をDMF(ヌクレオチド濃度0.15Mまで)中のイミダゾール(10mmol)および2,2’-ジチオジピリジン(3mmol)と混合した。次に、トリエチルアミン(3mmol)およびトリフェニルホスフィン(3mmol)を加え、混合物を室温で24時間撹拌した。乾燥アセトン(~添加したDMFよりも10倍大きい量)中のNaClO4の無水溶液(リン酸塩部分ごとに4mmol)を添加した結果、反応混合物から生成物が沈殿した。4度まで冷却した後に、沈殿物を濾過し、冷たい乾燥アセトンで洗浄し、P4O10上で真空中で乾燥させた。
5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-5’-モノホスホロチオエート(図2、7番)(500mg、0.86mmol)から出発して、一般的な手順に従って、グアノシン5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-5’-モノホスホロチオエートイミダゾリド(図2、9番)(352mg、0.75mmol、89%)を得た。tR(B)=8.27分;
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 11.69(m、1P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C13H15N7O6PS- [M-H]-:428.05476、 found 428.05452.
5’-デオキシ-5’-チオ-7-メチルグアノシン-5’-モノホスホロチオエート(図2、8番)(500mg、0.84mmol)から出発して、一般的な手順に従って、5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-7-メチルグアノシン-5’-モノホスホロチオエートイミダゾリド(図2、10番)(321mg、0.69mmol、82%)を得た。tR(B)=8.39分;
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C14H17N7O6PS- [M-H]-: 442.07041、found 442.07070.
グアノシン5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-5’-モノホスホロチオエートイミダゾリド(図2、9番)(100mg、0.22mmol)を無水DMF(2mL)に溶解し、トリス(トリエチルアンモニウム)リン酸塩(100mg、0.26mmol)を加え、続いてZnCl2(235.84mg、1.76mmol)を加えた。反応の進行をRP-HPLCで制御した。反応混合物を、出発物質が消失するまで室温で撹拌した。次いで、EDTAの水溶液(513.92mg、1.76mmol、50mL)を加えることにより反応を停止させ、1MのNaHCO3で中和した。粗生成物をDEAE-Sephadexのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、TEA塩類として単離した。収量:108.5mg(0.14mmol、65%);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C10H14N5O10P2S- [M-H]-:457.99421、 found 457.99481.
5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-7-メチルグアノシン-5’-モノホスホロチオエートイミダゾリド(図2、10番)(100mg、0.21mmol)を無水DMF(2mL)に溶解し、トリス(トリエチルアンモニウム)-リン酸塩(100mg、0.26mmol)を加え、続いてZnCl2(224.54mg、1.68mmol)を加えた。反応の進行をRP-HPLCで制御した。反応混合物を、出発物質が消失するまで室温で撹拌した。その後、その反応は、EDTA(490.56mg、1.68mmol、50mL)の水溶液の追加によって止められ、1M NaHCO3で中和された。粗生成物をDEAE-Sephadexのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、TEA塩類として単離した。収量:91mg(0.12mmol、54%)、tR(B)=5.07分、
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.11(s、1H、H-8 ゆっくりと交換可能)、5.97(d、1H、J=3.91 Hz、H-1’)、4.50、4.49(2d、1H、J=5.09 Hz、H-2’)、4.41(q、1H、J=5.48,5.09 Hz、H-3’)、4.07(s、3H、CH3)、3.34-3.13(m、3H、H-4’、H-5’);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 6.71(d、1P、J=30.81 Hz)、8.21(d、1P、J=30.81 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C11H16N5O10P2S- [M-H]-: 472.00986、found 472.00967.
5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-7-メチルグアノシン-5’-モノホスホロチオエートイミダゾリド(図2、10番)(100mg、0.21mmol)を無水DMF(2mL)に溶解し、チオリン酸ナトリウム(47mg、0.26mmol)を加え、続いてZnCl2(224.54mg、1.68mmol)を加えた。反応の進行をRP-HPLCで制御した。反応混合物を、出発物質が消失するまで室温で撹拌した。その後、その反応は、EDTA(490.56mg、1.68mmol、50mL)の水溶液の追加によって止められ、1M NaHCO3で中和された。粗生成物をDEAE-Sephadexのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、単離されたTEA塩類を直ちに共役反応に使用した。収量:110mg(0.13mmol、64%);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C11H16N5O9P2S2- [M-H]-: 487.98702、found 487.98724.
一般的な手順
ヌクレオシド末端のチオリン酸TEA塩(1当量)をDMSO(濃度約0.1-0.2Mまで)中で懸濁させた。次いで、DBU(1,8-ジアザビシクロ(5.4.0)ウンデカ-7-エン)(1当量)および5’-ヨードグアノシン(1当量)の誘導体を加えた。反応の進行をRP HPLCによってモニタリングした。1%酢酸をpH=7まで加えることによって末端チオリン酸塩からのシグナルがなくなった後に反応を停止させ、反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄した。生成物をDEAE-Sephadexのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、トリエチルアンモニウム塩として単離した。生成物を半分取(semi-preparative)RP-HPLCにより精製した。
GDPβS(図3、14番)、(506mOD、0.042mmol)から出発して、一般的な手順に従って、GppSG(207mOD、0.009mmol、24%)を得た。RpHPLC:tR(A)=6.9分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 7.96(s、1 H)、7.81(s、1 H)、5.77(d、1 H、J=5.48 Hz)、5.70(d、1 H、J=5.87 Hz)、4.80-4.70(m、2H、水シグナルと重なる)、4.64(t、1 H、J=5.48 Hz)、4.43(t、1 H、t、J=3.91 Hz)、4.37(t、1 H、J=3.91 Hz)、4.30-4.15(m、4H)、3.30-3.13(m、2 H);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.63(d、1P、J=32.28、12.5 Hz)、-12.02(d、1P、J=30.81 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C20H25N10O14P2S- [M-H]-:723.07531、found 723.07546.
m7GDPβS(図3、17番)、(5830mOD、0.51mmol)から出発して、一般的な手順に従って、m7GppSG(1028mOD、0.045mmol、9%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=5.9分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.98(s、1 H、H-8 m7G)、7,87(s、1 H、H-8 G)、5.88(d、1 H、J=2.0 Hz、H-1’ m7G)、5.73(d、1 H、J=5.7 Hz、H-1’ G)、4.69(t、1 H、J=5.5 Hz、H-2’ G)、4.51(bs.、1 H、H-2’ m7G)、4,32 - 4.44(m、5 H、H-3’ G、H-3’ m7G、H-4’ G、H-4’ m7G、H-5’ m7G)、4.24(dd、1 H、J=11.3、5.4 Hz、H5” m7G)、4.04(s、3 H、CH3)、3.24 - 3.41(m、2 H、H5’、5” G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.38(dt、1P、 J=29.0、11.5 Hz)、-12.00(d、1P、J=32.23 Hz);
HRMS ESI( ) calcd. m/z for C21H27N10O14P2S- [M-H]-: 737.09096、found 737.09052.
GDPβS(図3、14番;2532mOD、0.21mmol)から出発して、一般的な手順に従って、m7GSppG(1660mOD、0.073mmol、35%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=7.75分;
1H NMR(400 MHz, D2O)δppm 7.99(s、1 H、H-8 G)、5.83(d、1 H、J=4,2 Hz、H-1’ m7G)、5.80(d、1 H、J=6.0 Hz、H-1’ G)、4.65-4.70(2 H、m、H-2’ G、H-2’ m7G)、4.45(t、1 H、J=4.1 Hz、H-3’ G)、4.19-4.41(5 H、m、H-3’ m7G、H-4’ G、H-4’ m7G、H5’、5” G)、4.05(s、3 H、CH3)、3.35-3.43(m、2 H、H5’、5” m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.32(dt、1P、J=29.0、11.0 Hz)、-11.84(d、1P、J=29.00 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H27N10O14P2S- [M-H]-:737.09096、found 737.09146.
GTPγS(図3、15番;1233mOD、0.10mmol)から出発して、一般的な手順に従って、GpppSG(1149mOD、0.051mmol、51%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=5.50分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.02(s、1 H、H-8 G)、7.90(s、1 H、H-8 G)、5.82(d、1 H、J=6.0 Hz、H-1’ G)、5.78(d、1 H、J=6.2 Hz、H-1’ G)、4.84(t、1 H、J=5.7 Hz、H-2’ G)、4.74(t、1 H、J=5.7 Hz、H-2’ G)、4.52(t、1 H、J=4.2 Hz、H-3’ G)、4.47(t、1 H、J=4.3 Hz、H-3’ G)、4.30-4.38(m、2 H、H-4’、5’ G)、4.27(m、2 H、H-4’、5” G)、3.25-3.35(m、2 H、H5’、5” G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 8.21(dt、1P、J=27.00、13.3 Hz)、-11.34(d、1P、J=19.30 Hz)、-23.78(dd、1P、J=27.00、19.30 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C20H26N10O17P3S- [M-H]-:803.04164、found 803.04135.
GTPγS(図3、15番;3000mOD、0.25mmol)から出発して、一般的な手順に従って、m7GSpppG(729mOD、0.032mmol、13%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=5.36分;
1H NMR(400 MHz, D2O)δppm 8.92(s、1 H、H-8 m7G)、7.96(s、1 H、H-8 G)、5.78(d、1 H、J=4.30 Hz、H-1’ m7G)、5,74(d、1 H、J=5.87 Hz、H-1’ G)、4.63(m、2 H、H-2’ G、H2’ m7G)、4,48(dd、1 H、J=4.43、3.52 Hz、H-3’ m7G)、4.36-4.26(m、4 H、H-3’ G、H-4’ G、H-4’ m7G、H-5’ G)、4.24 -4.19(m、1H、H-5” G)、4.00(s、3 H、CH3)、3.33-3.24(2 H、m、H-5’、5” m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.57(d、1P、J=27.88 Hz)、-11.68(d、1P、J=20.54 Hz)、-24.00(dd、1P、J=29.35、22.01 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O17P3S- [M-H]- 817.05729、found 817.05494.
m7GTPγS(図3、18番;2616mOD、0.23mmol)から出発して、一般的な手順に従って、m7GpppSG(1582mOD、0.07mmol、32%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=6.06分;
1H NMR(400 MHz, D2O)δppm 9.02(s、1 H、H-8 m7G)、7.87(s、1 H、H-8 G)、5.84(d、1 H、J=3.52 Hz、H1’ m7G)、5.70(d、1 H、J=6.65 Hz、H-1’ G)、4.80-4.67(m、1 H、H-2’ G)、4.52(t、1 H、J=4.30 Hz、H-2’ m7G)、4.41(dd、2 H、J=4.70、4.30 Hz、H3’ G、H3’ m7G)、4.38-4.30(m、2 H、H-4’ G、H-4’ m7G)、4.36-4.31 m、2H、H5’ m7G)、4.02(s、3 H、CH3)、3.30-3.20(m、2 H、J=12.6、6.3 Hz、H5’、5” G); 31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.66(d、1P、J=29.35 Hz)、-11.73(d、1P、J=22.01 Hz)、-23.95(dd、1P、J=22.01、27.88 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O17P3S- [M-H]-: 817.05729、found 817.05748.
GTPγS(図3、15番;1500mOD、0.12mmol)から出発して、一般的な手順に従って、m2 7,2’-OGSpppG(140mOD、0.006mmol、5%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=7.89分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 7.93(s、1H、G)、5.81(d、1H、J=3.91 Hz、H-1’ m7G)、5.72(d、1H、J=6.26 Hz、H-1’ G)、4.65(t、1H、J=5.48 Hz、H-2’ m7G)、4.43-4.40(m、1H、H-2’、G、H-3’ m7G)、4.32-4.18(m、6H、H-3’ G、H-4’、H-5’、G、m7G)、4.01(s、3H、CH3)、3.52(s、3H、OCH3);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.35(d、1P、J=26.41 Hz)、-11.68(d、1P、J=19.07 Hz)、-24.02、-24.18(2d、1P、J=26.41、19.07 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C22H30N10O17P3S- [M-H]- 831.07294、found 831.07477.
m7GpCH2ppγS(図3、16番;717mOD、0.06mmol)から出発して、一般的な手順に従って、m7GSppCH2pG(353mOD、0.016mmol、27%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=6.36分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 9.03(s、1H、H-8、m7G)、8.17(s、1H、G)、5.83(d、1H、J=4.30 Hz、H-1’ m7G)、5.78(d、1H、J=4.48 Hz、H-1’ G)、4.70-4.66(m、2H、H-2’ m7G、H-2’、G)、
4.46(d、1H、J=3.91、5.09 Hz、H-3’、G)、4.38-4.33(m、2H、H-3’、m7G、H-4’、G)、4.32-4.28(m、1H、H-4’、m7G)、4.26-4.20(m、1H、H-5’、G)、4.19-4.13(m、1H、H-5” G)、4.02(s、3H、CH3)、3.34-3.22(m、4H、H-5’、G、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 17.03(d、1P、J=10.27 Hz)、7.47-6.97(m、2P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C22H30N10O16P3S- [M-H]- 815.07803、found 815.07923.
一般的な手順
5’S-GMP-Im(図2、9番)(Na塩、50mg、0.11mmol)、および適切な二リン酸塩(1mmol):
m2 7,2’-OGDP(図4、28番)、m7GpCH2p(図4、27番)、m7-5’S GDP(図2、12番)、m7GSppβS(図2、13番)、またはm7GDPβS(図3、17番)を、無水DMF(1.0mL)中に懸濁させ、続いて、無水ZnCl2(95mg、10eq、0.7mmol)を追加した。試薬が溶解するまで、反応混合物を激しく振盪した。反応の進行をRP HPLCによってモニタリングした。完了(24時間)後、適切な量のEDTA溶液(Na2EDTA、237mg、0.7mmol)を加え、固体のNaHCO3でpHを6に調節し、続いて、DEAE-Sephadexによるイオン交換クロマトグラフィーによる粗生成物を精製し、TEA塩として単離した(または分取HPLCにより直接精製した)。生成物をRP-HPLCによってさらに精製した。
m2 7,2’-OGDP(図4、28番;912mOD、0.08mmol)から出発して、一般的な手順に従って、m2 7,2’-OGpppSG(122mOD、0.005mmol、6%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=6.29分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 9.00(s、1H、H-8 m7G)、7.88(s、1H、G)、5.87(d、1H、J=2.74 Hz、H-1’ m7G)、5.69(d、1H、J=6.65 Hz、H-1’ G)、4.64(t、1H、J=5.48 Hz、H-2’ m7G)、4.48(dd、1H、J=4.48 Hz、H-2’、G)、4.43-4.38(m、2H、H-3’,G、H-3’、m7G)、4.36-4.32(m、1H、H-4’、G)、4.30-4.26(m、1H、H-4’、m7G)、4.25-4.16(m、2H、H-5’、G)、4.03(s、3H、CH3)、3.53(s、3H、OCH3)、3.30-3.22(m、2H、H-5’、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.68(d、1P、J=27.88 Hz)、-11.68(d、1P、J=20.54 Hz)、-23.78、-23.94(2d、1P、J=27.88、19.07Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C22H30N10O17P3S- [M-H]- 831.07294、found 831.07350.
m7GpCH2p(図4、27番;2052mOD、0.18mmol)および5’-S-GMP-Im(122mg、0.27mmol)から出発して、一般的な手順に従い、m7GpCH2ppSG(1002mOD, 0.044mmol、25%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=6.26分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 9.31(s、1H、H-8、m7G)、8.02(s、1H、G)、5.90(d、1H、J=3.13 Hz、H-1’ m7G)、5.75(d、1H、J=5.87 Hz、H-1’ G)、4.80-4.70(m、2H、溶媒シグナルと重なる、H-2’ m7G、H-2’、G)、4.58(dd、1H、J=3.91、3.48 Hz、H-3’、G)、4.48(t、1H、H-3’、m7G)、4.40(dd、1H、J=3.91、4.06、H-4’、G)、4.37-4.29(m、3H、H-4’、m7G、H-5’、G)、4.19-4.13(m、2H、H-5’、G)、4.03(s、3H、CH3)、3.30-3.19(m、2H、H-5’、G、m7G)、2.40(t、2H、J=20.35 Hz、CH2);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 17.11(d、1P、J=8.80 Hz)、7.64-6.76(m、2P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C22H30N10O16P3S- [M-H]- 815.07803、found 815.07906.
m7-5’S-GDP(57mg、0.07mmol)および5’S-GMP-Im(50mg、0.11mmol)から出発して、一般的な手順に従い、m7GSpppSG(768 mOD、32mg、0.028mmol、40%)を得た。RP-HPLC:tR(A)=6.80分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.38(s、1H、H-8 m7G ゆっくりと交換可能)、7.84(s、1H、G)、5.78(d、1H、J=4.70 Hz、H-1’ m7G)、5.69(d、1H、J=6.65 Hz、H-1’ G)、4.64(t、1H、J=4.70 Hz、H-2’ m7G)、4.40、4.39(2d、1H、J=2.74、3.52、4.40 Hz、H-3’、G)、4.36-4.29(m、3H、H-4’ G、H-5’、G)、3.99(s、3H、CH3)、4.37-4.28(m、3H、H-4’、H-5’、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 7.74(t、2P、J=27.88)、-24.61(t、1P、J=29.35 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O16P3S2 - [M-H]- 833.03445、found 833.03550.
m7GSppβS(56mg、0.07mmol)および5’S-GMP-Im(50mg、0.11mmol)から出発して、一般的な手順に従い、m7GSppspG(1080mOD、45mg、0.039mmol、56%)をジアステレオ異性体D1/D2の混合物として得た。ジアステレオ異性体をRP-HPLCを用いて分離し、アンモニウム塩として単離した。D1(図4、30番):
(438mOD、18mg、0.016mmol、23%)RP-HPLC:tR(A)=6.56分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.98(s、1H、H-8、m7G)、8.08(s、1H、G)、5.82(d、1H、J=4.27 Hz、H-1’ m7G)、5.77(d、1H、J=5.80 Hz、H-1’ G)、4.67-4.65(m、2H、H-2’ m7G、H-2’、G)、4.49-4.47(m、1H、H-3’、G)、4.39-4.35(m、1H、H-3’、m7G、H-4’、G)、4.33-4.23(m、3H、H-4’、m7G、H-5’、G)、4.02(s、3H、CH3)、3.38-3.25(m、2H、H-5’、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 29.18(dd、1P、J=34.83、27.37 Hz)、6.96(dt、1P、J=34.83、12.44 Hz)、-12.37(d、1P、J=27.37 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O16P3S2- [M-H]-: 833.03445、found 833.03549;
D2(図4、31番):m7GSppspG D2(380 mOD,16mg,0.014mmol, 20%) RP-HPLC:tR(A)=6.71分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.98(s、1H、H-8、m7G)、8.14(s、1H、G)、5.82(d、1H、J=4.27 Hz、H-1’ m7G)、5.77(d、1H、J=5.49 Hz、H-1’ G)、4.69-4.65(m、2H、H-2’ m7G、H-2’、G),4.49-4.45(m、1H、H-3’、G)、4.40-4.35(m、1H、H-3’、m7G、H-4’、G)、4.34-4.21(m、3H、H-4’、m7G、H-5’、G)、4.03(s、3H、CH3)、3.39-3.24(m、2H、H-5’、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 29.44-28.67(m、1P)、7.17-6.54(m、1P)、-12.09-(-12.72)(m、1P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O16P3S2 - [M-H]-: 833.03445、found 833.03606.
m7GSppβS(56mg、0.07mmol)および5’S-GMP-Im(50mg、0.11mmol)から出発して、一般的な手順に従い、m7GSppspSG(942mOD、39mg、0.003mmol、48%)をジアステレオ異性体D1/D2の混合物として得た。ジアステレオ異性体をRP-HPLCを用いて分離し、アンモニウム塩として単離した。D1(図4、33番)(510mOD、21mg、0.018mmol、26%)RP-HPLC:tR(A)=7.53分;
1H NMR(400 MHz, D2O)δppm 9.00(s、1H、H-8、m7G)、7.99(s、1H、G)、5.83(d、1H、J=4.27 Hz、H-1’ m7G)、5.75(d、1H、J=6.10 Hz、H-1’ G)、4.79-4.68(m、2H、溶媒シグナルと重なる、H-2’ m7G、H-2’、G)、4.44(dd、1H、J=4.58 Hz、H-3’、G)、4.41-4.33(m、3H、H-3’、m7G、H-4’、G、m7G)、4.03(s、3H、CH3)、3.39-3.26(m、4H、H-5’、G、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 28.25(t、1P、J=34.83 Hz)、7.31-6.74(m、2P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O15P3S3 - [M-H]-: 849.01161、found 849.01213.
D2(図4、34番)、RP-HPLC(274 mOD、11mg、0.0098mmol、14%):tR(A)=7.62分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 8.99(s、1H、H-8、m7G)、8.04(s、1H、G)、5.83(d、1H、J=4.58 Hz、H-1’m7G)、5.75(d、1H、J=6.10 Hz、H-1’ G)、4.78-4.66(m、2H、溶媒シグナルと重なる、H-2’ m7G、H-2’、G)、4.46-4.42(m、1H、H-3’、G)、4.41-4.34(m、3H、H-3’、m7G、H-4’、G、m7G)、4.04(s、3H、CH3)、3.39-3.24(m、4H、H-5’、G、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 28.29(t、1P、J=34.83 Hz)、7.32-6.68(m、2P);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O15P3S3 - [M-H]-: 849.01161、found 849.01217.
m7GDPβS(3492mOD、0.31mmol)および5’S-GMP-Im(5550mOD、0.46mmol)から出発して、一般的な手順に従い、m7GppspSG (1941mOD、0.086mmol、28%)をジアステレオ異性体D1/D2の混合物として得た。ジアステレオ異性体をRP-HPLCを用いて分離し、アンモニウム塩として単離した。
D1(図4、35番):(888 mOD、0.039mmol、13%)RP-HPLC:tR(A)=7.12分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 9.07(s、1H、H-8、m7G)、7.95(s、1H、G)、5.88(d、1H、J=3.52 Hz、H-1’ m7G)、5.74(d、1H、J=6.26 Hz、H-1’ G)、4.80-4.70(m、2H、H-2’ m7G、H-2’、G D2Oシグナルと重なる)、4.56(dd、1H、J=4.70、3.52 Hz、H-3’、G)、4.47-4.40(m、2H、H-3’、m7G、H-4’、G)、4.39-4.33(m、3H、H-4’、m7G、H-5’、G)、4.03(s、3H、CH3)、3.35-3.20(m、2H、H-5’、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 29.00(dd、1P、J=33.75、26.41Hz)、6.98(d、1P、J=33.75、Hz)、-12.56(d、1P、J=24.94 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O16P3S-[M-H]-: 833.03445、found 833.03514.;
D2(図4、36番):m7GppspG D2(1053 mOD、0.046mmol、15%) RP-HPLC:tR(A)=7.42分;
1H NMR(400 MHz、D2O)δppm 9.04(s、1H、H-8、m7G)、7.95(s、1H、G)、5.85(d、1H、J=3.52 Hz、H-1’ m7G)、5.73(d、1H、J=6.26 Hz、H-1’ G)、4.80-4.70(m、2H、H-2’ m7G、H-2’、D2Oシグナルと重なるG)、4.54(dd、1H、J=4.30、3.91 Hz、H-3’、G)、4.45(t、1H、J=5.09 Hz、H-3’、m7G)、4.43-4.40(m、1H、H-4’、G)、4.39-4.32(m、3H、H-4’、m7G、H-5’、G)、4.03(s、3H、CH3)、3.37-3.21(m、2H、H-5’、m7G);
31P NMR(162 MHz、D2O)δppm 28.99(dd、1P、J=33.75、26. 41、24.94Hz)、6.94(d、1P、J=35.21、Hz)、-12.48(d、1P、J=24.94 Hz);
HRMS ESI(-) calcd. m/z for C21H28N10O16P3S2 - [M-H]-: 833.03445、found 833.03494.
新しいキャップ類似体の特性
試験1.DcpS酵素による分解に対する類似体の感受性試験
この試験の目標は、新しい5’-チオリン酸塩キャップ類似体が、ヒトDcpS酵素(hDcpS)によって加水分解されるかどうかを調べることであった。DcpS酵素をコードする組換えヒトタンパク質がかつて記述されたように発現された(Kowalska, Lewdorowicz et al. 2008)。新しい類似体のhDcpS加水分解への感受性は、200mM KClおよび0.5mM EDTAを含む50mM Tris-HCl緩衝液中で試験される。反応混合物は、400μlの緩衝液中に、試験したキャップアナログ(20μM)およびhDcpS酵素(100nM)を含む。適切な間隔で、100μlのサンプルを反応混合物から集める。サンプルを2.5分の間98度でインキュベートし、次いで0度まで冷却し、一般的な情報に記載される条件下でRP-HPLCで分析した。試験では、商業的に入手可能なDcpS阻害剤も試験し、化合物RG3039(000番)(https://www.mda.org/quest/fda-approves-phase-1-clinical-trial-rg3039-sma)、GppSG(19番)、GpppSG(20番)を試験し、その上、m7GpppG(0番)およびm7Gpp(00番)を対照として試験した。
得られた典型的な結果は、図5と表5に示される。
試験の目的は、所与の阻害剤が特定の条件下で最大値の50%までDcpS活性を阻害する濃度を判定することであった。この試験および試験1での緩衝液は同一である。同時に10個の混合反応物を調製し、それらの各々は、m7GMPF(60μM)、hDcpS酵素(50nM)、および試験化合物を200μlの緩衝液中0~50μMの範囲の濃度で含有していた。適切な時間の後、基質の30%が阻害剤なしの生成物に変換されたとき、100μlのACNと混合することによって反応を停止させた。分析のために25μlのサンプルを採取し、続いてDMSO中濃度2.5μMのTBDS-フルオレセイン溶液90μlと混合し、60分間インキュベートした。次に、100μlの200mM HEPES緩衝液pH=7.0がサンプルに加えられ、一般的な情報に述べられるように蛍光を測定した。この結果に基づき、阻害剤濃度対蛍光の相関関係をプロットし、理論曲線をデータに当てはめることによってIC50値を決定した。得られた結果は、表5および図5に示される。
この試験の目的は、ヒトDcpS酵素を備えた類似体34番の相互作用のメカニズムを検討することであった。先に記載したようにN末端で切断された組換えヒトDcpS酵素(ΔN37-残基Ala38からSer337)を得た(Singh et al. 2008)。液滴蒸気拡散(drop vapor diffusion)による結晶化を、0.1M 類似体34および7.3mg/mLのDcpS酵素(結晶化セットアップの前に氷上で15分間インキュベートした)および0.2μLのリザーバ溶液を含む0.2μLのサンプルを用いて行った。約1週間後に、29%PEG4000および0.1M Tris-HCl pH7.6を含む混合物中に複合体の結晶が現れた。結晶を含む液滴に、リザーバ溶液とグリセロール(1:1 v/v)との混合物を加え、次いで結晶を採取し、液体窒素中で急速凍結させた。回折データ(diffraction data)を、Dectris PILATUS 6M検出器を用いてシンクロトロンソース(Beamline 14.1、Bessy II、Helmholtz-Zentrum Berlin、Germany)で100Kで収集し、XDSソフトウェア(Kabsch 2010)を用いてデータを処理した。構造を、検索モデルとして、DG157493阻害剤(pdb:3BL9)(Singh、Salciusら 2008)に結合したDcpSの構造を有するPhaserソフトウェア(McCoy、Grosse-Kunstleve et al.2007)を用いる分子交換(Molecular Replacement)によって解明した(solved)。リガンドモデルおよびディクショナリを、ProDRG(Schuttelkopf and van Aalten 2004)を用いて生成した。モデル構築およびリガンド着装を、Cootソフトウェア(Emsley&Cowtan 2004)で行った。構造をphenix.refine(Adams、Afonine et al.2010)を用いて精密化した。
この試験の目的は、選択された5’-ホスホチオエートキャップ類似体の5’末端への取り込みが、Dcp1/2デキャッピング酵素活性に対するこのように調製された転写物の感受性に影響を及ぼし得るかどうかを調べることであった。ヘテロ二量体Dcp1/2の形態のシゾサッカロミセス・ポンベ組換えタンパク質を、以前に記載されたようにして得た(Floor、Jonesら、2010)。このアッセイで利用された転写物は、RNA SP6ポリメラーゼ(New England BioLabs)を用いるインビトロ転写により得られた。アニーリングされたオリゴヌクレオチド:ATACGATTTAGGTGACACTATAGAAGAAGCGGGCATGCGGCCAGCCATAGCCGATCA(SEQ ID NO.:1)およびTGATCGGCTATGGCTGGCCGCATGCCCGCTTCTTCTATAGTGTCACCTAAATCGTAT(SEQ ID NO.:2)をインビトロ転写において鋳型として使用し、SP6ポリメラーゼ(ATTTAGGTGACACTATAGA(SEQ ID NO:3))についてのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドは、GAAGAAGCGGGCAUGCGGCCAGCCAUAGCCGAUCA(SEQ ID NO:4)の配列を有する35nt長のRNAを得ることができるが、5’末端キャップRNA(5’ end capped RNA)は36nt長である。典型的なインビトロ転写反応を容量20μlで行い、40℃で2時間インキュベートし、以下を含有した:1U SP6ポリメラーゼ、1U RiboLock RNase InhibitoR(ThermoFisher Scientific)、0.5mM ATP/CTP/UTP、0.125mM GTP、1.25mMジヌクレオチドキャップ類似体、および、0.1μM鋳型。2時間のインキュベーションに続き、1U DNase I(Ambion)を反応混合物に加え、37℃で30分間インキュベーションを続け、その後、EDTAを最終濃度25mMまで加えた。得られたRNAを、RNA Clean & Concentrator-25(Zymo Research)を用いて精製した。次いで、変性した15%ポリアクリルアミドゲル上で合成RNAの品質を測定した。RNAの濃度を順に分光測光法で評価した。このようにして得られたRNAは、3’末端が実質的に不均一であることを特徴とし、したがって、問題を排除するために、得られたRNAを、DNAzyme 10-23(TGATCGGCTAGGCTAGCTACAACGAGGCTGGCCGC(SEQ ID NO: 5))でインキュベートし、これは25nt長のRNAを得ることにつながる。5’末端にキャップを有するRNAは26nt長であった。3’末端を切断する反応は以下の通りであった:1μMのRNAを、37℃で1時間、50mMmgCl2および50mM Tris-HCl pH8.0を含む混合物中で1μMのDNazyme 10-23と共にインキュベートした(Colemanら、2004)。
この試験の目的は、翻訳効率に対するmRNAの5’末端における新規なキャップ類似体の導入の効果を調べることであった。この目的のために、mRNAをコードし、5’末端におけるキャップ構造が異なる、一連のウミシイタケルシフェラーゼを調製した。この試験に使用した転写物を、SP6 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応によって得た。インビトロ転写のための鋳型として、PCR生成物を使用し、プライマーATTTAGGTGACACTATAGAACAGATCTCGAGCTCAAGCTT(SEQ ID NO: 6)およびGTTTAAACATTTAAATGCAATGA(SEQ ID NO: 7) およびhRLuc-pRNA2(A)128 plasmid(Williams et al. 2010)を用いて調製した。このように行なわれたPCR反応は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする配列の上流のSP6ポリメラーゼのためのプロモーター配列を導入することを可能にした。転写反応自体は、上記(試験4)の短いRNA合成と同様であった。反応は40℃で20μl中で2時間行われ、以下を含有した:1U SP6ポリメラーゼ、1U RiboLock RNase InhibitoR(ThermoFisher Scientific)、0.5mM ATP/CTP/UTP、0.125mM GTP、1.25mMジヌクレオチドキャップ類似体、および100μgの鋳型。2時間のインキュベーションに続き、1U DNase I(Ambion)を加え、インキュベーションを37℃で30分間続け、その後EDTAを最終濃度25mMまで加えた。得られたmRNAをNucleoSpin RNA Clean-up XS(Macherey-Nagel)を用いて精製した。合成されたRNAの品質を、変性15%ポリアクリルアミドゲルで調べた。RNA濃度は分光測光法で決定された。
ヒト子宮頚癌HeLa細胞を、37℃および5%CO2において、10%FBS(Sigma-Aldrich)と、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)と、最終濃度2mMのL-グルタミンと、を補充したDMEM(Gibco)中で成長させた。計画された実験の1日前に、抗生物質を含まない100μlの培地に懸濁した104個の細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞トランスフェクションは以下のとおりであり、0.3μlのLipofectamine Messenger MAXトランスフェクション試薬(Invitrogen)、0.1μgのmRNAおよび10μlのOpti-MEM(Gibco)を各ウェルに添加した。トランスフェクションをインキュベータ中で1時間行った。トランスフェクション後、細胞をPBSで3回洗浄し、抗生物質のない新鮮な培地で補充した。トランスフェクションを始めてから2、3、4.5、6.5、10.5および24時間後、細胞をPBSで3回洗浄し、溶解し、および、Synergy H1マイクロプレートリーダーを用いるルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。例示的なデータを図11に示す。
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Claims (14)
- 式1に記載の5’-ホスホロチオラートキャップ類似体であって、
L1とL2は、OまたはSから独立して選択され、L1とL2の少なくとも1つはOではなく;
n=0,1,または2であり;
X1、X2、X3は、OまたはSから独立して選択され;
R1は、CH2Ph、C1-10アルキルを含む群から選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、N3、C1-10アルキル、C1-10アルケニルまたはC1-10アルキニルを含む群から独立して選択され;
R4とR5は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、CH2COOH、N3、CH2N3、C1-10アルキル、C1-10アルケニルまたはC1-10アルキニルを含む群から独立して選択され;
Y1とY2は、CH2、CHCl、CCl2、CF2、CHF、NH、Oを含む群から独立して選択され;
およびBは、以下の式3、4、5、6、または7に記載の基である、
5’-ホスホロチオラートキャップ類似体。
- 式2に記載の5’-ホスホロチオラート類似体、および薬学的に許容可能な担体を含む組成物であって、
m=0,1であり;
n=0,1,または2であり;
L1はSであり;
X1、X2、X3は、O、Sを含む基から独立して選択され;
R1は、CH3、C2H5、CH2Ph、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され;
R2とR3は、H、OH、OCH3、OC2H5、-COOH、N3、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され;
Y1とY2は、CH2、CHCl、CCl2、CHF、CF2、NHおよびOを含む基から独立して選択され、
ここで、式2に記載の5’-ホスホロチオラート類似体は、式13に記載の5’-デオキシ-5’-チオグアノシン-7-メチルグアノシン 5’-ジホスホロチオラートであり、
- 請求項1-3に記載の化合物および薬学的に許容可能な担体を含む組成物であって、薬剤として使用される、組成物。
- 脊髄筋萎縮症(SMA)の処置および/またはSMAの症状の緩和において薬剤として使用される、請求項4または5に記載の組成物。
- mRNA分解の調整および/またはmRNAスプライシングの調整に使用される薬剤の製造における、請求項1-3に記載の化合物の使用。
- 5’末端に、請求項1-3に記載の5’-ホスホロチオラートキャップ類似体を含むmRNA。
- 前記5’-ホスホロチオラートキャップ類似体は、m7GSpppG(24番)、m7,2’OGSpppG(26番)、m7GSpppSG(32番)、m7GSppspG D1(30番)、m7GSppspG D2(31番)、m7GSppspSG D1(33番)、m7GSppspSG D2(34番)を含む基から選択され、またはm7,2’OGSpppG(26番)である、請求項8に記載のmRNA。
- mRNA分子の5’末端に5’-ホスホロチオラートキャップ類似体を含むmRNAの調製方法であって、請求項1-3に記載の5’-ホスホロチオラートキャップ類似体がmRNA分子の合成中に組み込まれ、mRNAの合成がインビトロ転写を介して進むことを特徴とする、mRNAの調製方法。
- 前記5’-ホスホロチオラートキャップ類似体は、m7GSpppG(24番)、m7,2’OGSpppG(26番)、m7GSpppSG(32番)、m7GSppspG D1(30番)、m7GSppspG D2(31番)、m7GSppspSG D1(33番)、m7GSppspSG D2(34番)を含む基から選択され、またはm7,2’OGSpppG(26番)である、請求項10に記載のmRNAの調製方法。
- 薬剤として使用される請求項8、または請求項9に記載のmRNA。
- 脊髄筋萎縮症(SMA)の処置、および/またはSMAの症状の緩和のための薬剤として使用する、および/または、癌治療の薬剤として、または抗癌免疫療法の薬剤として使用するための、請求項8または請求項9に記載のmRNA。
- a)請求項1-3に記載の化合物、または
b)請求項8、もしくは請求項9に記載のmRNA、および
c)薬学的に許容可能な担体
を含む医薬製剤。
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